Identyfikacja insercji transpozonów Śpiącej Królewny w guzach litych za pomocą PCR za pośrednictwem łącznikera
1 lutego 2013
Opisano metodę identyfikacji nieznanych czynników powodujących kancerogenezę przy użyciu bezstronnego podejścia. Metoda wykorzystuje transpozon Śpiącej Królewny jako losowy mutagen skierowany do określonych tkanek. Mapowanie genomowe insercji transpozonów, które napędzają powstawanie nowotworów, identyfikuje nowe onkogeny i geny supresorowe nowotworów
Ta procedura pokazuje, jak zidentyfikować nowe onkogeny i geny supresorowe guza poprzez mapowanie transpozycji na insercjach u myszy, które napędzają tworzenie guza. Osiąga się to poprzez najpierw generowanie i zbieranie guzów z transgenicznego modelu myszy. Kolejnymi krokami procedury są wyizolowanie DNA guza, wykonanie PCR za pośrednictwem łącznika, a następnie sekwencjonowanie amplifikowanych próbek DNA i analiza transpozycji przy insercji.
Ostatecznie procedura identyfikuje potencjalne geny odpowiedzialne za nowotwór. Główną zaletą stosowania PCR za pośrednictwem łącznika w połączeniu z bezstronnym badaniem genetycznym przy użyciu transpozonów śpiącej królewny jest to, że możemy łatwo zidentyfikować nowe genetyczne czynniki raka. Zawsze rozpoczynaj sekcję od spryskania zewnętrznej części poświęconej myszy 70% etanolem.
Pobrane tkanki i guzy należy podzielić na cztery sekcje o wielkości od 50 do 100 miligramów. Utrwal jedną sekcję w 10% buforowanej forminie na 18 godzin, a następnie 70% etanolu. Ta sekcja może być używana do barwienia h i e i/lub immunohistochemii.
Zamroź pozostałe sekcje w ciekłym azocie. Można je przechowywać w zamrażarce i używać do izolacji D-N-A-R-N-A i białek w celu pobrania DNA z zamrożonej próbki guza. Najpierw drobno zmiel tkankę żyletką.
Następnie trawić tkankę w 1,5 mililitrowej probówce z jednym mililitrem buforu do lizy komórek i pięcioma mikrolitrami po 20 miligramów na mililitr. Roztwór proteazy K dokładnie odwirować mieszaninę i przystąpić do standardowej ekstrakcji DNA na bazie izopropanolu. Rozpocznij ten protokół od wyżarzania łączników w rurce o pojemności 1,5 mililitra.
Wymieszać 50 mikrolitrów każdego roztworu łącznika z dwoma mikrolitrami stężonego chlorku sodu. Następnie umieść rurkę w bloku grzewczym o temperaturze 95 stopni Celsjusza. Po pięciu minutach wyłącz ogrzewanie i pozwól mu powoli ostygnąć do temperatury pokojowej, co może potrwać godzinę lub dłużej po schłodzeniu.
Łączniki analne można przechowywać w zamrażarce do czasu, gdy będą potrzebne. Przygotuj 2 96-dołkowe płytki przez Aliego, cytując jeden mikrogram DNA z każdej próbki do odpowiednich dołków w obu 96-dołkowych płytkach. Na przykład, umieść jeden mikrogram DNA z próbki pierwszej w studzience A, jednej z obu płytek dołka.
DNA w jednej z 96-dołkowych płytek zostanie strawione przy użyciu enzymu NLA po prawej stronie i strawione przez próbki DNA na drugiej 96-dołkowej płytce przy użyciu enzymu po lewej stronie BFA. Pozwól DNA trawić się przez noc w temperaturze 37 stopni Celsjusza. Następnego dnia zakończ trawienie przez ciepło, dezaktywując enzymy na 20 minut.
Teraz oczyść reakcje trawienia za pomocą mini płytki z łupami 96 dołków. Za pomocą pipety wielokanałowej przenieś każdą próbkę do mini lootu. Płytka 96-dołkowa.
Umieść płytkę mini loot 96 well w kolektorze próżniowym. Zastosuj próżnię do płytki, aż studzienki będą wyglądać na suche. Zazwyczaj 15 minut przez cały ten protokół.
Należy zachować szczególną ostrożność, aby nie zanieczyścić próbek. Podczas pracy z 96 dołkami, płytki dołków utrzymują studzienki przykryte nakrętkami tak bardzo, jak to możliwe i unikaj przepuszczania pipety nad otwartymi studzienkami, ponieważ każda kropla niepożądanej cieczy może zniszczyć próbkę. Wyjmij mini talerz z łupem z kolektora próżniowego i zablokuj spód talerza ręcznikiem papierowym, aż całkowicie wyschnie.
Ponownie zawieś DNA w mini łupie. 96-dołkowej płytce, dodając do każdej z nich 30 mikrolitrów podwójnie destylowanej wody. Cóż, umieść mini talerz z łupami na wytrząsarce orbitalnej ustawionej na wysoki poziom na dwie minuty.
Następnie przenieś zawartość mini płytki z łupami na czystą płytkę 96-dołkową. Aby przeprowadzić reakcje ligacji łącznika. Przygotować reakcję ligacji, mieszając wystarczającą ilość buforu ligacyjnego, klęczących łączników z kroku 3.2 T cztery ligazy DNA i wody w zbiorniku odczynnika.
Użyj pipety wielokanałowej, aby przenieść 10 mikrolitrów strawionego DNA z poprzedniego etapu na nową 96-dołkową płytkę. Następnie użyj pipety wielokanałowej do Eloqua 10 mikrolitrów reakcji ligacji do wszystkich dołków płytki 96-dołkowej. W końcu studnie zostały załadowane odczynnikami DNA i odczynnikami do ligacji.
Inkubuj płytkę przez cztery godziny do nocy w temperaturze 16 stopni Celsjusza. Następnego ranka. Zakończ podwiązanie, dezaktywując ligazę T four w temperaturze 65 stopni Celsjusza przez 10 minut.
Tak jak poprzednio, oczyść reakcję podwiązywania za pomocą mini płytek łupowych i kolektora próżniowego, aby wysuszyć płytkę, a następnie osusz spód płytki, aż całkowicie wyschnie. Ponownie zawiesić DNA w 30 mikrolitrach podwójnie destylowanej wody. Umieść na wytrząsarce orbitalnej na dwie minuty, a następnie przenieś zawartość mini płytki z łupami na czystą płytkę.
Następnie wykonaj drugie trawienie DNA za pomocą bam H one, aby zniszczyć pozostałe transpozony concat. Trawić DNA w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez trzy do sześciu godzin lub przez noc, a następnie trawienie jest oczyszczane za pomocą mini talerzy z łupami, postępując zgodnie z tą samą procedurą, co poprzednio. Wykonaj 30-cyklowy PCR przy użyciu startera specyficznego dla transpozycji i startera specyficznego dla łącznika.
Reakcja powinna zawierać trzy mikrolitry strawionego DNA z łącznikami. Następnie wyczyść reakcję PCR za pomocą mini loota. 96 płytek dołkowych i kolektor próżniowy, jak wykonano wcześniej.
Ponownie zawiesić DNA w 30 mikrolitrach wody i przenieść zawiesiny do czystego 96. Dobrze rozegrane kontynuuj rozcieńczanie dwóch mikrolitrów produktów reakcji PCR w 148 mikrolitrach podwójnie destylowanej wody, używając tylko dwóch mikrolitrów rozcieńczonych produktów. Wykonaj 30 cykli PCR, używając zagnieżdżonych wersji starterów w objętościach 100 mikrolitrów.
Te podkłady są przeznaczone do maszyny Illumina GA two X. Każda próbka będzie miała unikalny kod kreskowy 12 par zasad z serii PCR, 45 mikrolitrów każdego produktu na 1% żelu z bromkiem AUM. Powinien być rozmazany produkty PCR reprezentujące amplikony wielu różnych insercji transpozonów w guzie.
Użyj opisanej wcześniej metody mycia próżniowego, aby oczyścić pozostałe 50 mikrolitrów PCR, a następnie ponownie zawieś DNA w 50 mikrolitrach wody i ponownie wykonaj pranie próżniowe. Teraz Resus zawiesić DNA w 30 mikrolitrach TE i przenieść je na czystą 96-dołkową płytkę. Określić stężenie DNA w każdej próbce.
Następnie połącz równe ilości DNA z każdej próbki w jednej probówce. Możliwe jest sekwencjonowanie kilkuset próbek DNA na jednym torze przebiegu Illumina, o ile każda próbka została wygenerowana przy użyciu odrębnego startera z kodem kreskowym przy użyciu protokołu. Udany L-M-P-C-R powinien amplifikować setki transpozycji przy insercjach w pojedynczym guzie po uruchomieniu połowy wtórnego produktu PCR na 1% żelu, rozmaz DNA reprezentuje tę amplifikację.
Jeśli LM PCR nie powiedzie się, nie będzie rozmazu DNA. Zamiast tego zobaczysz ostateczne pasma DNA sekwencjonujące od jednego do 200 guzów w jednym pasie platformy Illumina GA two X powinny wytworzyć ponad 30 milionów sekwencji po 100 par zasad każda Podczas próby tej procedury. Ważne jest, aby pamiętać, aby pracować powoli i ostrożnie, aby upewnić się, że po tej procedurze nie dojdzie do zanieczyszczenia.
Analiza nowo odkrytych genetycznych czynników powodujących raka może być przeprowadzona w celu uzyskania odpowiedzi na dodatkowe pytania, takie jak: które z tych czynników mogą być celem terapii?
Wyświetl pełny transkrypt i uzyskaj dostęp do tysięcy filmów naukowych
Przegląd
Ten artykuł opisuje metodę identyfikacji nowych onkogenów i genów supresorowych nowotworów poprzez mapowanie wstawień transpozonu w modelu mysiej. Podejście wykorzystuje transpozon Sleeping Beauty jako losowy mutagen, umożliwiając odkrycie genetycznych czynników raka.
Kluczowe komponenty badania
Obszar nauki
- Karcynogeneza
- Mapowanie genomowe
- Biologia transpozonu
Tło
- Karcynogeneza wiąże się ze złożonymi zmianami genetycznymi.
- Transpozony mogą służyć jako narzędzia do mutagenezy.
- Identyfikowanie genów sterujących jest kluczowe dla zrozumienia raka.
- PCR pośredniczona linkerem zwiększa wykrywalność wstawień transpozonu.
Cel badania
- Zidentyfikować nieznane czynniki formowania nowotworów.
- Wykorzystać bezstronne podejście do badań genetycznych.
- Zmapować wstawienia transpozonu w DNA nowotworowym.
Zastosowane metody
- Generowanie nowotworów w transgenicznym modelu mysim.
- Izolacja DNA nowotworowego z zebranych guzów.
- PCR pośredniczona linkerem do amplifikacji próbek DNA.
- Sekwencjonowanie i analiza wstawień transpozonu.
Główne wyniki
- Identyfikacja kandydatów do genów sterujących nowotworami.
- Odkryto nowe onkogeny i geny supresorowe nowotworów.
- Metoda okazała się skuteczna w mapowaniu zmian genetycznych.
Wnioski
- Transpozon Sleeping Beauty jest cennym narzędziem w badaniach nad rakiem.
- Ta metoda pozwala na bezstronne identyfikowanie genetycznych czynników.
- Przyszłe badania mogą opierać się na tych odkryciach, aby zbadać mechanizmy raka.
Często zadawane pytania
Executive Industry Relevance
Identifying genetic drivers of cancer remains a critical challenge in early discovery due to high background noise from passenger mutations. The Sleeping Beauty transposon system combined with linker-mediated PCR enables unbiased forward genetic screens in mice to pinpoint candidate oncogenes and tumor suppressor genes. This approach supports target validation by reducing mechanistic ambiguity and improving predictive confidence in preclinical models.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of therapeutic hypotheses through functional mutagenesis in vivo.
- Operational Value: Directs transposition to specific cell types using Cre-lox systems for tissue-specific target validation.
- Predictive Value: Identifies genes within common insertion sites as high-confidence cancer drivers for portfolio triage.
Screening & Assay Development
- Assay Readiness: Generates hundreds of distinct amplicons per tumor representing transposon insertion sites for downstream analysis.
- Reproducibility: Uses standardized linker-mediated PCR and nested PCR steps to ensure consistent detection across samples.
- Scalability: Supports multiplexed sequencing of hundreds of tumor samples in a single Illumina lane via barcoded primers.
Translational & Preclinical Research
- Disease Relevance: Models genetic heterogeneity observed in human tumors by capturing diverse insertion profiles across multiple tumors.
- Translational Continuity: Links discovery-phase mutagenesis to preclinical validation by identifying genes amenable to therapeutic targeting.
- Mechanistic De-risking: Distinguishes driver from passenger mutations through statistical analysis of common insertion sites.
Pipeline & Workflow Integration
The method fits within the discovery continuum from target hypothesis generation through lead identification by providing genetically validated targets from in vivo screens.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing via unbiased forward genetic screens that reduce background noise from passenger mutations.
- Screening: Delivers assay-ready DNA samples with quantitative outputs suitable for insertion site mapping and sequencing.
- Analytics: Enables statistical identification of common insertion sites to prioritize candidate cancer genes.
- Translational Research: Connects in vivo mutagenesis to target validation by revealing genes with potential therapeutic relevance.
- Enterprise Reuse: Establishes a reusable platform for genetic screening across multiple cancer models and tissue types.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Improves target validation confidence by linking transposon insertions to tumorigenic potential.
- Operational Value: Standardizes detection of transposon insertions through optimized linker-mediated PCR workflows.
- Strategic Value: Enhances go/no-go decisions by providing in vivo functional evidence for target prioritization.
- Portfolio Impact: Supports risk-adjusted advancement by distinguishing driver genes from genomic background.
Implementation Considerations
- Requires expertise in mouse genetics, transposon biology, and molecular biology techniques.
- Dependent on access to PCR instrumentation, gel electrophoresis, and sequencing platforms.
- Necessitates standardized protocols for DNA isolation, linker annealing, and enzymatic digestion across sample sets.
- Involves adaptation considerations when applying the system to different Cre driver lines or tumor models.
- Includes practical limitations such as the need for sufficient tumor yield and careful avoidance of cross-contamination during multi-step processing.
