Name: Identyfikacja insercji transpozonów Śpiącej Królewny w guzach litych za pomocą PCR za pośrednictwem łącznikera (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-02-01T13:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 34 s
Description: Poznaj metodę identyfikacji nowych genów onkogennych i supresorowych poprzez mapowanie insercji transpozonu Śpiącej Królewny w guzach myszy z wykorzystaniem PCR za pośrednictwem łącznika.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Autorzy chcieliby podziękować Brandenowi Moriarity, Davidowi Largaespada i Vincentowi Kengowi z University of Minnesota, oraz Adamowi Dupuyowi z University of Iowa za pomoc w opracowaniu protokołu opisanego powyżej.

1. Hodowla i starzenie się zwierząt transgenicznych
<ol>
 <li>Wybierz szczepy myszy transgenicznych odpowiednie do swojego eksperymentu. W typowym eksperymencie wykorzystane zostaną trzy linie transgeniczne; mysz z warunkową transpozazą, mysz z konkatamerem transpozonów i mysz wykazująca ekspresję rekombinazy Cre w komórkach uważanych za komórki pochodzenia pożądanego nowotworu. Jeśli modelowany nowotwór ma znaną mutację u dużego odsetka pacjentów, pożądane może być uwzględnienie tej mutacji na początku. Przykładami tych "predysponujących" mutacji są aktywowany Kras, dominujący ujemny Tp53 lub floksowany allel Pten. Dodając mutację predysponującą, model może lepiej reprezentować ludzki nowotwór (patrz 1.3). Kilka myszy transpozazowych i transpozonów Śpiącej Królewny jest dostępnych w repozytorium myszy National Cancer Institute (<a href="http://mouse.ncifcrf.gov/" target="_blank">http://mouse.ncifcrf.gov/</a>).</li>
 <li>Hoduj myszy z warunkową transpozazą z myszami zawierającymi transpozony, aby ostatecznie uzyskać myszy homozygotyczne pod względem obu alleli, jeśli to możliwe. Wyhoduj homozygotyczne potomstwo z myszami wykazującymi ekspresję rekombinazy Cre, aby wygenerować potrójne transgeniczne myszy eksperymentalne (ryc. 2). Uwaga: Uzyskanie myszy homozygotycznych nie zawsze jest możliwe lub idealne. Na przykład homozygotyczne myszy z dominacją p53 są znacznie trudniejsze do rozmnażania niż myszy heterozygotyczne. Ponadto pomocne jest upewnienie się, że mioty są zgodne z genetyką mendlowską, aby potwierdzić, że schemat hodowlany jest udany.</li>
 <li>Jeśli używasz predysponowanego tła, najpierw wyhoduj myszy z transpozazą z myszami z predysponującym allelem. Jednocześnie hoduj myszy wykazujące ekspresję rekombinazy Cre z myszami przenoszącymi transpozony. Jeśli to możliwe, stwórz myszy homozygotyczne dla każdego allelu. Na koniec wyhoduj homozygotyczne potomstwo z poprzednich dwóch schematów hodowlanych, aby wygenerować poczwórne transgeniczne zwierzęta doświadczalne.</li>
 <li>Oprócz zwierząt doświadczalnych należy wygenerować kohorty kontrolne myszy. Grupa kontrolna zwykle składa się z rodzeństwa z miotu z hodowli eksperymentalnej, które dziedziczą tylko dwa z trzech alleli (ryc. 2). W przypadku predysponowanego tła konieczne będą również myszy zawierające trzy z czterech alleli.</li>
 <li>Codziennie monitoruj myszy eksperymentalne i kontrolne pod kątem rozwoju guza i/lub umierania. Postępuj zgodnie z wymaganiami instytucjonalnego komitetu ds. opieki nad zwierzętami i ich wykorzystania (IACUC) w zakresie hodowli zwierząt. Typowe jest również określenie wieku, w którym złoży się zwierzę w ofierze, jeśli jeszcze nie stało się w stanie agonalnym. Osiemnaście miesięcy to typowy wiek, w którym myszy są poddawane eutanazji.</li>
</ol>
2. Sekcja zwłok zwierząt transgenicznych
<obramowanie tabeli="1">
 <tbody>
 <tr>
 <td>Nazwa odczynnika</td>
 <td>firma</td>
 <td>Numer katalogowy</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Komora indukcyjna Sure-Seal</td>
 <td>Drzewo mózgu Naukowe</td>
 <td>EZ-177</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Kriowialny</td>
 <td>Ekspres biologiczny</td>
 <td>Silnik C-3355-2</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>10% buforowana formalina</td>
 <td>Sigma Aldrich</td>
 <td>HT501128-4L</td>
 </tr>
 </tbody>
</table>
Tabela 1. Wymagane odczynniki.
<ol>
 <li>Kiedy mysz jest w stanie agonalnym lub osiągnęła koniec ustalonego okresu życia, należy poddać zwierzę eutanazji za pomocą komory CO2 zgodnie z wytycznymi IACUC. Ogólnie rzecz biorąc, umieść zwierzę w komorze czystego gazu, otwórz zbiornik gazu i wyreguluj regulator tak, aby wskazywał nie więcej niż 5 funtów na cal kwadratowy. Napełniaj powoli, aby zminimalizować podrażnienie nosa i oczu oraz niechęć do CO2 . Upewnij się, że serce zwierzęcia już nie bije i nie reaguje na dotyk w oko.</li>
 <li>Spryskaj zewnętrzną część poświęconej myszy 70% etanolem.</li>
 <li>Umieść mysz na tablicy do sekcji zwłok i zabezpiecz szpilkami preparacyjnymi. Użyj nożyczek i pęsety, aby otworzyć mysz i usunąć narządy. Określenie, które narządy powinny zostać pobrane, zależy od projektu. Zaleca się jednak, aby zawsze zbierać śledzionę i wątrobę, ponieważ narządy te często dają ważny wgląd w to, dlaczego mysz była w stanie agonalnym. Zbierz również mostek do potencjalnej analizy szpiku kostnego. Ponadto zawsze korzystne jest pobranie wszelkich narządów lub tkanek, które wydają się nieprawidłowe.</li>
 <li>Tkanki i guzy, które są pobierane, należy podzielić na cztery sekcje. Jedna sekcja jest utrwalana w 10% buforowanej formalinie przez 18 godzin, a następnie 70% etanolu. Ta sekcja może być używana do barwienia H&E i/lub IHC. Pozostałe trzy sekcje, które mają zwykle wielkość od 50 do 100 mg, są zamrażane w ciekłym azocie. Można je wykorzystać do izolacji DNA, RNA i białek.</li>
 <li>Tuszę i pozostałe tkanki należy usunąć zgodnie z wytycznymi IACUC.</li>
</ol>
3. Izolowanie genomowego DNA z nowotworów
<obramowanie tabeli="1">
 <tbody>
 <tr>
 <td>Nazwa odczynnika</td>
 <td>firma</td>
 <td>Numer katalogowy</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Roztwór do wytrącania białek</td>
 <td>Qiagen powiedział:</td>
 <td>Numer katalogowy: 158910</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Bufor do lizy komórek</td>
 <td>Qiagen powiedział:</td>
 <td>158906</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Proteinaza K</td>
 <td>Qiagen powiedział:</td>
 <td>Numer katalogowy: 158920</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>RNaza A</td>
 <td>Qiagen powiedział:</td>
 <td>158924</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Bufor TE</td>
 <td>Preparat Promega</td>
 <td>Zobacz materiał V6232</td>
 </tr>
 </tbody>
</table>
Tabela 2. Wymagane odczynniki.
<ol>
 <li>Drobno zmielić zamrożoną próbkę guza (50 do 100 mg) za pomocą czystej żyletki.</li>
 <li>Umieścić tkankę mieloną w probówce do mikrowirówek o pojemności 1,5 ml i dodać 1 ml buforu do lizy komórek zawierającego 5 μl roztworu proteinazy K (20 mg/ml).</li>
 <li>Dokładnie wymieszaj.</li>
 <li>Inkubować w wytrząsarce o temperaturze 55 °C ustawionej na 250 obr./min przez co najmniej 4 godziny, najlepiej przez noc.</li>
 <li>Dodać 1 μl roztworu RNazy A (10 mg/ml) i odwrócić probówkę 25 razy.</li>
 <li>Inkubować w temperaturze 37 °C przez 30 minut.</li>
 <li>Schłodzić do temperatury pokojowej, umieszczając na lodzie na 3 minuty.</li>
 <li>Dodać 333 μl roztworu do wytrącania białek i energicznie wirować.</li>
 <li>Wirować z prędkością 14 000 obr./min 10 min. Białka powinny się osadzać. Jeśli osad jest bardzo mały, ponownie przeprowadź wir, inkubuj na lodzie przez 5 minut, a następnie ponownie odwiruj.</li>
 <li>Odlać supernatant zawierający DNA do czystej probówki wirówkowej o pojemności 15 ml.</li>
 <li>Dodaj równą objętość 100% izopropanolu i wymieszaj, delikatnie odwracając 50 razy.</li>
 <li>Wirować z prędkością 3 500 obr./min przez 3 min.</li>
 <li>Odrzucić supernatant.</li>
 <li>Dodaj 1 ml 70% etanolu i kilkakrotnie odwróć probówkę, aby umyć osad.</li>
 <li>Przenieś umyty granulat wraz z etanolem do probówki mikrowirówkowej o pojemności 1,5 ml.</li>
 <li>Wirować z prędkością 14 000 obr./min przez 5 minut w temperaturze 4 °C.</li>
 <li>Odlej etanol i odwróć rurkę do wyschnięcia na powietrzu (około 5 do 30 minut).</li>
 <li>Zawiesić osad DNA w 50 do 500 μl TE, w zależności od wielkości osadu DNA.</li>
 <li>Fakultatywna inkubacja w temperaturze 37 °C w celu ponownego zawieszenia DNA.</li>
 <li>Przechowywać w temperaturze 4 °C lub -20 °C do długotrwałego przechowywania.</li>
</ol>
4. PCR za pośrednictwem łącznika z wykorzystaniem genomowego DNA z nowotworów
<obramowanie tabeli="1">
 <tbody>
 <tr>
 <td>Nazwa odczynnika</td>
 <td>firma</td>
 <td>Numer katalogowy</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>BfaI</td> powiedział:
 <td>Laboratoria biologiczne w Nowej Anglii</td>
 <td>Przekaźnik R0568S</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Liga NlaIII</td>
 <td>Laboratoria biologiczne w Nowej Anglii</td>
 <td>Czynnik R0125S</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Płytki 96-dołkowe MinElute</td>
 <td>Qiagen powiedział:</td>
 <td>Numer katalogowy 28051</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>QIAvac 96 Kolektor próżniowy</td>
 <td>Qiagen powiedział:</td>
 <td>Rocznik 19504</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Multi-MicroPlate Genie, 120V</td>
 <td>Przemysł naukowy, Inc.</td>
 <td>SI-4000</td> powiedział:
 </tr>
 <tr>
 <td>Ligaza DNA T4 z 5-krotnym buforem ligacyjnym</td>
 <td>Invitrogen</td>
 <td>Numer katalogowy: 15224-041</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>BamHI powiedział:</td>
 <td>Laboratoria biologiczne w Nowej Anglii</td>
 <td>Czynnik R0136S</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>25 mM dNTP</td>
 <td>Ekspres biologiczny</td>
 <td>Silnik C-5014-200</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Platynowy Taq</td>
 <td>Invitrogen</td>
 <td>Numer katalogowy: 10966-034</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Polimeraza DNA FastStart Taq</td>
 <td>Roche</td>
 <td>12032929001</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Agarozy</td>
 <td>Preparat Promega</td>
 <td>Zobacz materiał V3121</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Bufor TAE</td>
 <td>Preparat Promega</td>
 <td>Zobacz materiał V4271</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Bufor TE</td>
 <td>Preparat Promega</td>
 <td>Zobacz materiał V6232</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Bromek etydyny</td>
 <td>Preparat Promega</td>
 <td>Zobacz materiał H5041</td>
 </tr>
 </tbody>
</table>
Tabela 3. Wymagane odczynniki.
Sekwencje linkera
Łącznik BfaI + 5' GTAATACGACTCACTATAGGGCTCCGCTTAAGGGAC 3'
Łącznik BfaI- 5' Phos-TAGTCCCTTAAGCGGAG 3'NH2
Łącznik NlaIII+ 5'GTAATACGACTCACTATAGGGCTCCGCTTAAGGGATG 3'
Łącznik NlaIII- 5' Phos-GTCCCTTAAGCGGAGCC 3'
Sekwencje starterów
Primary PCR forward right side (NlaIII): Spl IRDR R1 1 GCTTGTGGAAGGCTCTCGAAATGTTTGACCC
Primary PCR forward left side (BfaI): Spl IRDR L1 1 CTGGAATTTTCCAAGCTGTTTAAAGGCACAGTCAAC
Główny odwrócony PCR zarówno dla prawej, jak i lewej strony: Spl Link1 1 GTAATACGACTCACTATAGGGC
Wtórny prawy PCR do przodu: Przykład wtórnego startera Illumina z kodem kreskowym 5' AATGATACGGCGACCGAGATCTACACTCTTTCCCTACACACGACCCTCTTCCGATCTNNNNNNNNNNNNaGgtgtatgtaaacttccgacttccgacttcaa (N reprezentują kod kreskowy 12 pz, sekwencja pisana wielkimi literami jest wymagana dla platformy Illumina, a sekwencja pisana małymi literami wiąże się z transpozonem.)
Wtórny PCR z przodu po lewej stronie: Przykład wtórnego startera Illumina z kodem kreskowym 5'AATGATACGGCGACCACCGAGATCTACACTCTTTCCCTACACACGACGCTCTTCCGATCTNNNNNNNNNNNNaAAgtgtatgtaaacttccgacttcaa (N reprezentują kod kreskowy 12 pz, sekwencja pisana wielkimi literami jest wymagana dla platformy Illumina, a sekwencja pisana małymi literami wiąże się z transpozonem.)
Wtórny odwrócony PCR zarówno dla prawej, jak i lewej strony: linker zagnieżdżony odwrotny starter 5' CAAGCAGAAGACGGCATACGAGCTCTTCCGATCTAGGGCTCCGCTTAAGGGAC
<ol>
 <li>Wyżarzać łączniki + i - zarówno dla łączników BfaI, jak i łączników NlaII, mieszając 50 μl łącznika+ (100 μM) z 50 μl łącznika- (100 μM) i dodając 2 μl NaCl (5 M) do probówki mikrowirówkowej o pojemności 1,5 ml. Umieść w bloku grzewczym o temperaturze 95 ° C na 5 min. Wyłącz blok grzewczy i pozwól powoli ostygnąć do temperatury pokojowej (trwa to godzinę lub dłużej). Po schłodzeniu, wyżarzane łączniki można przechowywać w zamrażarce o temperaturze -20 °C do czasu, gdy będą potrzebne.</li>
 <li>Przygotuj dwie porcje DNA guza, z których każda zawiera 1 μg DNA. Jedna porcja zostanie strawiona przez enzym restrykcyjny, który przetnie się blisko "prawego" końca transpozonu. Druga porcja zostanie strawiona przez enzym restrykcyjny, który przecina blisko "lewego" końca transpozonu. Ma to na celu maksymalizację szans na wzmocnienie każdego miejsca wprowadzenia transpozonu.</li>
 <li>Trawić DNA guza w jednej podwielokrotności za pomocą enzymu "po prawej" stronie NlaII i trawić DNA guza w drugiej podwielokrotności za pomocą enzymu "po lewej" stronie BfaI: połączyć 1 μl enzymu, 5 μl 10x bufor NEB #4, DNA (1 μg) i ddH2O do całkowitej objętości 50 μl. Trawić DNA przez noc w temperaturze 37 ° C w łaźni wodnej lub inkubatorze.</li>
 <li>Ogrzewać enzymy dezaktywujące (BfaI = 80 °C przez 20 min, NlaIII = 65 °C przez 20 min).</li>
 <li>Oczyścić strawione próbki, umieszczając je w płytce MinElute 96 dołków, umieścić płytkę w kolektorze próżniowym i odkurzać przez około 15 minut, aż studzienki będą wyglądać na suche.</li>
 <li>Wyjmij płytkę z kolektora próżniowego i osusz dno płytki 96-dołkowej ręcznikiem papierowym, aby usunąć cały płyn</li>
 <li>Dodać 30 μl ddH2O do każdego dołka i wstrząsnąć na wytrząsarce orbitalnej ustawionej na wysokim poziomie przez 2 minuty lub pipetować w górę i w dół 20 do 40 razy.</li>
 <li>Przenieść całą objętość do studzienek (30 μl) z płytki MinElute 96-dołkowej do czystych płytek 96-dołkowych.</li>
 <li>Wykonaj reakcje ligacji łączników z strawionym DNA z kroku 4.8 i łącznikami z kroku 4.1. Wymieszać 10 μl strawionego DNA, 4 μl 5x buforu ligacyjnego, 5,5 μl wyżarzonych łączników (950 μg/μl), 0,5 μl ligazy T4 (5 U/μl).</li>
 <li>Inkubować przez 4 godziny do nocy w temperaturze 16 °C.</li>
 <li>Podgrzewać inaktywację ligazy DNA T4 w temperaturze 65 °C przez 10 min.</li>
 <li>Oczyść ligację za pomocą płytek MinElute 96 dołków i kolektora próżniowego, jak opisano w krokach 4.5 - 4.6.</li>
 <li>Zawiesić ponownie w 30 μl H2O i przenieść na czystą płytkę 96-dołkową.</li>
 <li>Wykonaj drugie trawienie DNA w celu zniszczenia pozostałych transpozonów konkatameru. Osiąga się to poprzez przecięcie DNA po raz drugi za pomocą enzymu, który przecina wektor plazmidowy DNA, który został użyty do stworzenia transgenicznych myszy zawierających konkatamer transpozonowy.</li>
 <li>Trawienie DNA za pomocą BamHI (zarówno po lewej, jak i po prawej stronie): Wymieszaj 25 μl DNA ligowanego łącznikiem z kroku 4.13, 5 μl 10x bufor NEB #3, 0,5 μl BamHI (20 U/μl), 0,5 μl BSA (10 mg/ml) i 19 μl ddH2O.</li>
 <li>Trawić 3-6 godzin lub przez noc w temperaturze 37 °C.</li>
 <li>Wykonaj pierwotną PCR przy użyciu startera specyficznego dla transpozonu i startera specyficznego dla łącznika. Będą się one różnić w zależności od używanego transpozonu i konsolidatora. Startery wymienione w powyższej tabeli starterów działają dla transpozonów T2/Onc i T2/Onc2.</li>
 <li>Primary PCR: 5 μl 10x bufor, 2,0 μl MgCl2 (50 mM), 4 μl dNTPs (2,5 nM), 1 μl Primer 1 (20 μM), 1 μl Primer 2 (20 μM), 0,25 μl Platinum Taq (5 U/μl), 3 μl Strawione DNA z łącznikami (ilość może się różnić), do 50 μl ddH2O.</li>
 <li>Program PCR: 94 °C przez 5 min, 30 cykli 94 °C przez 30 sekund, 60 °C przez 30 sekund, 72 °C przez 90 sekund. Końcowe przedłużenie w temperaturze 72 °C przez 5 min.</li>
 <li>Oczyść produkt PCR za pomocą 96-dołkowych płytek MinElute i kolektora próżniowego, jak opisano powyżej.</li>
 <li>Zawiesić ponownie w 30 μl H2O i przenieść na czystą płytkę 96-dołkową.</li>
 <li>Wykonać rozcieńczenie 1 ° PCR w stosunku 1:75, rozcieńczając 2 μl DNA z kroku 4.21 do 148 μl ddH2O</li>
 <li>Wykonaj wtórny PCR przy użyciu zagnieżdżonych wersji starterów, które mają również wymaganą sekwencję dla maszyny Illumina GAIIx, a także kod kreskowy z 12 parami zasad, który jest unikalny dla każdej przetwarzanej próbki guza (patrz tabela starterów powyżej, aby zapoznać się z przykładami tych starterów).</li>
 <li>Wtórny PCR: 10 μl 10x bufor z MgCl2, 8 μl dNTP (2,5 mM), 1 μl wtórnego startera Illumina z kodem kreskowym (20 μM), 1 μl startera wtórnego Illumina Nest 1 (20 μM), 0,25 μl FastStart Taq (5 U/μl), 2 μl DNA z pierwotnego PCR rozcieńczone 1:75, do 100 μl ddH2O.</li>
 <li>Program PCR: 94 °C przez 2 min, 30 cykli po 94 °C przez 30 sekund, 53 °C przez 45 sekund, 72 °C przez 90 sekund. Końcowe przedłużenie w temperaturze 72 °C przez 5 min.</li>
 <li>Przeprowadzić 45 μl tej reakcji PCR na 1% żelu agarozowym zawierającym bromek etydyny (0,5 μg/ml). Powinien być "rozmaz" produktów PCR reprezentujących amplikony wielu różnych insercji transpozonów w guzie (ryc. 3).</li>
 <li>Oczyść pozostałe 50 μl produktu PCR za pomocą 96-dołkowych płytek MinElute i kolektora próżniowego, jak opisano powyżej. Umyć jeden raz, umieszczając 50 μl ddH2O w studzienkach i ponownie odkurzając.</li>
 <li>Zawiesić ponownie w 30 μl TE i przenieść na czystą płytkę 96-dołkową.</li>
 <li>Określić stężenie DNA w każdej próbce. Połącz równe ilości DNA w jednej probówce o pojemności 1,5 ml do mikrofuge. Będzie to biblioteka, która jest sekwencjonowana w jednym pasie maszyny Illumina HiSeq 2000. Możliwe jest sekwencjonowanie kilkuset guzów na jednym pasie biegu Illumina.</li>
 <li>Prześlij pojedynczą probówkę zawierającą równe ilości DNA ze wszystkich guzów do sekwencjonowania. Może to być zrobione przez Twoją instytucję lub komercyjnie.</li>
</ol>
5. Analiza insercji transpozonów
<ol>
 <li>Oprogramowanie do analizy danych dotyczących wstawiania transpozonów jest dostępne do bezpłatnego pobrania za pośrednictwem SourceForge (<a href="http://sourceforge.net/projects/tapdancebio/" target="_blank">http://sourceforge.net/projects/tapdancebio/</a>). Program o nazwie TapDance wymaga pliku sekwencji z platformy Illumina oraz pliku tekstowego z kodem kreskowym do biblioteki mapy.</li>
</ol>

<ol><li>Fearon, E. R., Vogelstein, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+genetic+model+for+colorectal+tumorigenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">A genetic model for colorectal tumorigenesis.</a> Cell. 61, 759-767 (1990).</li>
<li>Wood, L. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Genomic+Landscapes+of+Human+Breast+and+Colorectal+Cancers%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">The Genomic Landscapes of Human Breast and Colorectal Cancers.</a> Science. 318, 1108-1113 (2007).</li>
<li>Ivics, Z., Hackett, P. B., Plasterk, R. H., Izsvák, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+Reconstruction+of+Sleeping+Beauty%2C+a+Tc1-like+Transposon+from+Fish%2C+and+Its+Transposition+in+Human+Cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Molecular Reconstruction of Sleeping Beauty, a Tc1-like Transposon from Fish, and Its Transposition in Human Cells.</a> Cell. 91, 501-510 (1997).</li>
<li>Starr, T. K., Largaespada, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cancer+gene+discovery+using+the+Sleeping+Beauty+transposon%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Cycle%22%5BJournal%5D)">Cancer gene discovery using the Sleeping Beauty transposon.</a> Cell Cycle. 4, 1744-1748 (2005).</li>
<li>Mueller, P. R., Wold, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+Vivo+Footprinting+of+a+Muscle+Specific+Enhancer+by+Ligation+Mediated+PCR%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">In Vivo Footprinting of a Muscle Specific Enhancer by Ligation Mediated PCR.</a> Science. 246, 780-786 (1989).</li>
<li>Bergemann, T. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((New+methods+for+finding+common+insertion+sites+and+co-occurring+common+insertion+sites+in+transposon-+and+virus-based+genetic+screens%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+acids+research%22%5BJournal%5D)">New methods for finding common insertion sites and co-occurring common insertion sites in transposon- and virus-based genetic screens.</a> Nucleic acids research. 40, 3822-3833 (2012).</li>
<li>Copeland, N. G., Jenkins, N. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Harnessing+transposons+for+cancer+gene+discovery%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Cancer%22%5BJournal%5D)">Harnessing transposons for cancer gene discovery.</a> Nature Reviews Cancer. 10, 696-706 (2010).</li>
<li>Collier, L. S., Carlson, C. M., Ravimohan, S., Dupuy, A. J., Largaespada, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cancer+gene+discovery+in+solid+tumours+using+transposon-based+somatic+mutagenesis+in+the+mouse%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Cancer gene discovery in solid tumours using transposon-based somatic mutagenesis in the mouse.</a> Nature. 436, 272-276 (2005).</li>
<li>Starr, T. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+transposon-based+genetic+screen+in+mice+identifies+genes+altered+in+colorectal+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">A transposon-based genetic screen in mice identifies genes altered in colorectal cancer.</a> Science. 323, 1747-1750 (2009).</li>
<li>Keng, V. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+conditional+transposon-based+insertional+mutagenesis+screen+for+genes+associated+with+mouse+hepatocellular+carcinoma%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">A conditional transposon-based insertional mutagenesis screen for genes associated with mouse hepatocellular carcinoma.</a> Nature. 27, 264-274 (2009).</li>
<li>Dupuy, A. J., Akagi, K., Largaespada, D. A., Copeland, N. G., Jenkins, N. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mammalian+mutagenesis+using+a+highly+mobile+somatic+Sleeping+Beauty+transposon+system%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Mammalian mutagenesis using a highly mobile somatic Sleeping Beauty transposon system.</a> Nature. 436, 221-226 (2005).</li>
</ol>

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Przesiewowe badanie genetyczne z wykorzystaniem systemu transpozonów Śpiącej Królewny zapewnia metodę identyfikacji mutacji powodujących raka. Wybierając odpowiedni promotor do kontrolowania rekombinazy Cre oprócz wszelkich mutacji predysponujących, badanie przesiewowe SB pozwoli zidentyfikować znane i nowe geny kandydujące na raka. 
Sukces ekranu SB zależy w dużej mierze od myszy wybranych do stworzenia ekranu. Do transpozonu zalecamy użycie dwóch różnych szczepów myszy prze...

<table><tbody><tr><td>Komora indukcyjna Sure-Seal</td><td>Brain Tree Scientific</td><td>EZ-177</td><td></td></tr><tr><td>Cryovial</td><td>Bioexpress</td><td>C-3355-2</td><td></td></tr><tr><td>10% buforowana formalina</td><td>Sigma Aldrich</td><td>HT501128-4L</td><td></td></tr><tr><td>Roztwór do wytrącania białek</td><td>Qiagen</td><td>158910</td><td></td></tr><tr><td>Bufor do lizy komórek</td><td>Qiagen</td><td>158906</td><td></td></tr><tr><td>Proteinaza K</td><td>Qiagen</td><td>158920</td><td></td></tr><tr><td>RNaza A</td><td>Qiagen</td><td>158924</td><td></td></tr><tr><td>TE Buffer</td><td>Promega</td><td>V6232</td><td></td></tr><tr><td>BfaI</td><td>New England Biolabs</td><td>R0568S</td><td></td></tr><tr><td>NlaIII</td><td>New England Biolabs</td><td>R0125S</td><td></td></tr><tr><td>MinElute 96 dołków</td><td>Qiagen</td><td>28051</td><td></td></tr><tr><td>QIAvac 96 Kolektor próżniowy</td><td>Qiagen</td><td>19504</td><td></td></tr><tr><td>Multi-MicroPlate Genie, 120V</td><td>Scientific Industries, Inc.</td><td>SI-4000</td><td></td></tr><tr><td>Ligaza DNA T4 z 5-krotnym buforem ligacyjnym</td><td>Invitrogen</td><td>15224-041</td><td></td></tr><tr><td>BamHI</td><td>New England Biolabs</td><td>R0136S</td><td></td></tr><tr><td>25mM dNTPs</td><td>Bioexpress</td><td>C-5014-200</td><td></td></tr><tr><td>Platinum Taq</td><td>Invitrogen</td><td>10966-034</td><td></td></tr><tr><td>FastStart Taq DNA Polimeraza Roche</td><td></td><td>12032929001</td><td></td></tr><tr><td>Agaroza</td><td>Bufor Promega</td><td>V3121</td><td></td></tr><tr><td>TAE</td><td>Bufor Promega</td><td>V4271</td><td></td></tr><tr><td>TE Bufor</td><td>Promega</td><td>V6232</td><td></td></tr><tr><td>Bromek etydyny</td><td>Promega</td><td>H5041</td><td></td></tr></tbody></table>

identyfikacja insercji transpozonów Śpiącej królewny w guzach litych za pomocą pcr za pośrednictwem łącznikera

Identification of Sleeping Beauty Transposon Insertions in Solid Tumors using Linker-mediated PCR

Analizy genomiczne, proteomiczne, transkryptomiczne i epigenomiczne ludzkich nowotworów wskazują, że w każdym genomie nowotworu występują tysiące anomalii w porównaniu z dopasowaną normalną tkanką. Na podstawie tych analiz oczywiste jest, że istnieje wiele nieodkrytych genetycznych czynników powodujących raka1. Niestety, czynniki te są ukryte w znacznie większej liczbie anomalii pasażerów w genomie, które nie przyczyniają się bezpośrednio do powstawania nowotworu. Innym aspektem genomu raka jest to, że istnieje znaczna heterogeniczność genetyczna w podobnych typach nowotworów. Każdy guz może zawierać różne mutacje, które zapewniają selektywną przewagę w tworzeniu guza2. Przeprowadzenie bezstronnego badania genetycznego u myszy dostarcza narzędzi do generowania guzów i analizy ich składu genetycznego, przy jednoczesnym zmniejszeniu tła mutacji pasażerów. System transpozonów Śpiącej Królewny (SB) jest jedną z takich metod3. System SB wykorzystuje wektory ruchome (transpozony), które mogą być wprowadzane do całego genomu przez enzym transpozazy. Mutacje są ograniczone do określonego typu komórki poprzez zastosowanie warunkowego allelu transpozazy, który jest aktywowany przez rekombinazę Cre. Istnieje wiele linii myszy, które wyrażają rekombinazę Cre w określonych tkankach. Poprzez przekroczenie jednej z tych linii do warunkowego allelu transpozazy (np. Lox-stop-Lox-SB11), układ SB jest aktywowany tylko w komórkach, które wyrażają rekombinazę Cre. Rekombinaza Cre wytnie kasetę zatrzymania, która blokuje ekspresję allelu transpozazy, aktywując w ten sposób mutagenezę transpozonów w obrębie wyznaczonego typu komórki. Badanie przesiewowe SB jest inicjowane przez hodowlę trzech szczepów myszy transgenicznych, tak aby myszy eksperymentalne były nosicielami warunkowego allelu transpozazy, konkatameru transpozonów i specyficznego tkankowo allelu rekombinazy Cre. Myszom tym pozwala się starzeć, dopóki nie utworzą się guzy i nie staną się w stanie agonalnym. Myszy są następnie poddawane sekcji zwłok, a genomowe DNA jest izolowane z guzów. Następnie genomowe DNA poddaje się procesowi PCR Z POŚREDNICTWEM ŁĄCZNIKA (LM-PCR), w wyniku którego dochodzi do amplifikacji loci genomowych zawierających transpozon SB. LM-PCR przeprowadzony na pojedynczym guzie spowoduje powstanie setek odrębnych amplikonów reprezentujących setki loci genomowych zawierających inserpozycje transpozonów w pojedynczym guzie4. Insercje transpozonów we wszystkich nowotworach są analizowane, a wspólne miejsca insercji (CIS) są identyfikowane przy użyciu odpowiedniej metody statystycznej5. Geny w WNP z dużym prawdopodobieństwem są onkogenami lub genami supresorowymi nowotworów i są uważane za geny kandydujące na raka. Zalety stosowania systemu SB do identyfikacji genów kandydujących na raka to: 1) transpozon można łatwo zlokalizować w genomie, ponieważ jego sekwencja jest znana, 2) transpozycja może być skierowana do prawie każdego typu komórki oraz 3) transpozon jest zdolny do wprowadzania mutacji zarówno zyskujących, jak i tracących funkcję6. Poniższy protokół opisuje, w jaki sposób opracować i przeprowadzić przesiewowe badanie genetyczne przy użyciu systemu transpozonów SB w celu identyfikacji potencjalnych genów raka (ryc. 1).

Po ustaleniu schematu hodowli hodowcy powinni uzyskiwać mioty co 19-21 dni. Wielkość miotu będzie wahać się od 5 do 12 szczeniąt, w zależności od wieku rodziców i tła genetycznego. Ponadto należy upewnić się, że genotyp miotu jest zgodny z prawami genetyki mendlowskiej, aby potwierdzić, że schemat hodowli jest prawidłowy i skuteczny.
Aby eksperyment zakończył się sukcesem, częstość występowania nowotworów u zwierząt doświadczalnych powinna być znacznie wyższa niż częstość występowania nowotwor...

Opisano metodę identyfikacji nieznanych czynników powodujących kancerogenezę przy użyciu bezstronnego podejścia. Metoda wykorzystuje transpozon Śpiącej Królewny jako losowy mutagen skierowany do określonych tkanek. Mapowanie genomowe insercji transpozonów, które napędzają powstawanie nowotworów, identyfikuje nowe onkogeny i geny supresorowe nowotworów

Identyfikacja insercji transpozonów Śpiącej Królewny w guzach litych za pomocą PCR za pośrednictwem łącznikera

Genomic, proteomic, transcriptomic, and epigenomic analyses of human tumors indicate that there are thousands of anomalies within each cancer genome ...

Ta procedura pokazuje, jak zidentyfikować nowe onkogeny i geny supresorowe guza poprzez mapowanie transpozycji na insercjach u myszy, które napędzają tworzenie guza. Osiąga się to poprzez najpierw generowanie i zbieranie guzów z transgenicznego modelu myszy. Kolejnymi krokami procedury są wyizolowanie DNA guza, wykonanie PCR za pośrednictwem łącznika, a następnie sekwencjonowanie amplifikowanych próbek DNA i analiza transpozycji przy insercji.Ostatecznie procedura identyfikuje potencjalne geny odpowiedzialne za nowotwór. Główną zaletą stosowania PCR za pośrednictwem łącznika w połączeniu z bezstronnym badaniem genetycznym przy użyciu transpozonów śpiącej królewny jest to, że możemy łatwo zidentyfikować nowe genetyczne czynniki raka. Zawsze rozpoczynaj sekcję od spryskania zewnętrznej części poświęconej myszy 70% etanolem.Pobrane tkanki i guzy należy podzielić na cztery sekcje o wielkości od 50 do 100 miligramów. Utrwal jedną sekcję w 10% buforowanej forminie na 18 godzin, a następnie 70% etanolu. Ta sekcja może być używana do barwienia h i e i/lub immunohistochemii.Zamroź pozostałe sekcje w ciekłym azocie. Można je przechowywać w zamrażarce i używać do izolacji D-N-A-R-N-A i białek

identification-sleeping-beauty-transposon-insertions-solid-tumors

Research

JoVE Journal

Medicine

Medycyna

Identyfikacja wstawień transpozonów Śpiącej Królewny w guzach stałych z wykorzystaniem PCR z mediatorami łączącymi

Wzbogacanie gDNA do sekwencjonowania NGS jest łatwym i potężnym narzędziem do badania mutacji konstytucyjnych. W tym artykule przedstawiamy procedurę analizy w prosty sposób pełnej sekwencji 11 genów biorących udział w naprawie uszkodzeń DNA.

Wzbogacanie gDNA za pomocą technologii opartej na transpozazie do analizy NGS całej sekwencji genów BRCA1, BRCA2 i 9 biorących udział w naprawie uszkodzeń DNA

Tutaj opisujemy skuteczny i wszechstronny protokół do indukcji, monitorowania i analizy nowych glejaków (GBM) za pomocą transpozonu DNA wstrzykiwanego do komór noworodków myszy. Komórki strefy podkomorowej, które pobierają plazmid, przekształcają się, namnażają i generują guzy o histopatologicznej charakterystyce ludzkiego GBM.

Integracja plazmidowego DNA za pośrednictwem transpozonu ze strefą podkomorową noworodków myszy w celu wygenerowania nowych modeli glejaka

Tutaj prezentujemy szczegółowy protokół identyfikacji zdarzeń rekombinacji homologicznej, które wystąpiły w embrionalnych komórkach macierzystych myszy za pomocą Southern blotting i/lub PCR. Przykładem tej metody jest generowanie modeli myszy zastępujących genetyczną miozynę II bez mięśni przy użyciu tradycyjnej technologii celowania opartej na embrionalnych komórkach macierzystych opartej na rekombinacji homologicznej.

Identyfikacja zdarzeń rekombinacji homologicznej w embrionalnych komórkach macierzystych myszy przy użyciu Southern blotting i reakcji łańcuchowej polimerazy

Tutaj prezentujemy protokół generowania klonów komórek rakowych zawierających znacznik sekwencji MS2 na pojedynczym subtelomerze. Podejście to, oparte na systemie MS2-GFP, umożliwia wizualizację endogennych transkryptów telomerowego RNA zawierającego powtórzenia (TERRA) wyrażonego z pojedynczego telomeru w żywych komórkach.

Generowanie klonów komórek rakowych w celu wizualizacji telomerowego RNA TERRA zawierającego powtórzenia wyrażonego z pojedynczego telomeru w żywych komórkach

W artykule opisano metodę identyfikacji zmian klonalnych i subklonalnych wśród różnych próbek od danego pacjenta. Chociaż opisane tutaj eksperymenty koncentrują się na określonym typie nowotworu, podejście to ma szerokie zastosowanie do innych guzów litych.

Analiza porównawcza zmian chorobowych za pomocą ukierunkowanego podejścia sekwencjonowania

Ten artykuł przedstawia prosty test oparty na PCR do monitorowania aktywności aktywnej retrotranspozonu LINE-1 i mapowania retrotranspozycji de novo w danym genomie. Korzystając z linii komórkowej MCF7, pokazujemy tutaj, w jaki sposób można zastosować tę metodę do wykrywania aktywności LINE-1 zlokalizowanej w 22q12.1.

Wykrywanie aktywności retrotranspozycyjnej gorącej linii-1 za pomocą długodystansowego odwrotnego PCR

Ta praca wstępnie ustawia zaawansowany protokół do dokładnej oceny obciążenia guza poprzez detekcję zielonego białka fluorescencyjnego i sygnałów bioluminescencji, a także integrację ilościowej techniki wykrywania molekularnego.

Badanie potrójnie ujemnego raka piersi przy użyciu ortotopowego modelu raka piersi

Tutaj prezentujemy protokół do testowania skuteczności terapii celowanych, wybranych na podstawie składu genomowego guza. Protokół opisuje identyfikację i walidację strukturalnych rearanżacji DNA, wszczepianie guzów pacjentów myszom oraz testowanie odpowiedzi na odpowiednie leki.

Testowanie terapii celowanych w nowotworach z wykorzystaniem analizy zmian strukturalnych DNA i ksenoprzeszczepów pochodzących od pacjentów

Mikrodysekcja laserowa (LMD) jest czułą i wysoce powtarzalną techniką, która może być wykorzystana do odkrycia ścieżek pośredniczących w heterogeniczności i inwazji glejaka. W tym miejscu opisujemy zoptymalizowany protokół izolacji dyskretnych obszarów z tkanki glejaka za pomocą laserowego LMD, a następnie analizy transkryptomicznej.

Mikrodysekcja podregionów glejaka do wychwytywania laserowego w celu przestrzennej i molekularnej charakterystyki heterogeniczności wewnątrznowotworowej, onkostrumieni i inwazji

Wykorzystanie immunokompetentnego, autochtonicznego modelu nowotworu napędzanego przez typowe mutacje pacjentów do testów przedklinicznych jest kluczowe dla testów immunoterapeutycznych. Protokół ten opisuje metodę generowania mysich modeli guza mózgu przy użyciu opartego na elektroporacji dostarczania plazmidowego DNA, które reprezentują typowe mutacje pacjentów, zapewniając w ten sposób dokładny, powtarzalny i spójny model myszy.

Modelowanie guzów mózgu in vivo przy użyciu opartego na elektroporacji dostarczania plazmidowego DNA reprezentującego sygnatury mutacji pacjenta

Poznaj metodę identyfikacji nowych genów onkogennych i supresorowych poprzez mapowanie insercji transpozonu Śpiącej Królewny w guzach myszy z wykorzystaniem PCR za pośrednictwem łącznika.

Identyfikacja insercji transpozonów Śpiącej Królewny w guzach litych za pomocą PCR za pośrednictwem łącznikera

Przeglądaj więcej filmów