Name: Ustanowienie pokrytej cieczą hodowli spolaryzowanych ludzkich komórek nabłonka nabłonka dróg oddechowych Calu-3 w celu zbadania odpowiedzi komórek gospodarza na patogeny układu oddechowego in vitro (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-02-07T13:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 9 s
Description: Poznaj metodę hodowli spolaryzowanych komórek nabłonka dróg oddechowych Calu-3 w systemie Transwell. Protokół obejmuje pomiar TEER i test fluoresceiny sodowej w celu oceny polaryzacji.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Autorzy pragną podziękować Elisabeth Blanchard za jej pomoc techniczną. Ustalenia i wnioski zawarte w tym raporcie są ustaleniami i wnioskami autorów i niekoniecznie reprezentują poglądy Centrów Kontroli i Prewencji Chorób.

1. Hodowla komórek Calu-3 do wykorzystania w hodowlach Transwell
Środki bezpieczeństwa: Wykonuj wszystkie procedury w komorze bezpieczeństwa biologicznego, używając techniki sterylnej hodowli.
<ol>
 <li>Aby rozmrozić komórki z zamrożonego przechowywania:
 <ol>
 <li>Przygotuj Minimum Niezbędne Pożywki Eagle's zawierające 20% inaktywowanej termicznie płodowej surowicy bydlęcej (FBS), 0,1 mM aminokwasów endogennych, 2 mM L-glutaminy i 10 mM HEPES pH 7,4 (EMEM-20%+S). Przygotowane podłoże należy sterylnie przefiltrować za pomocą filtra o wielkości porów 0,2 μm i ogrzać w łaźni wodnej do temperatury 37 °C. Aby lepiej odzwierciedlać środowisko nabłonka dróg oddechowych in situ, pożywka nie jest uzupełniana antybiotykami ani lekami przeciwgrzybiczymi.</li>
 <li>Szybko (< 1 min) rozmrozić zamrożony kriowial komórek Calu-3 w łaźni wodnej o temperaturze 37 °C.</li>
 <li>Przenieś rozmrożone komórki do sterylnej stożkowej probówki o pojemności 50 ml i dodaj 30 ml podgrzanego EMEM-20%+S.</li>
 <li>Granulować komórki przez odwirowanie przez 5 minut w temperaturze 1 000-1 200 × g, bez chłodzenia i przy niskiej prędkości hamowania.</li>
 <li>Delikatnie zdekantować supernatant i ponownie zawiesić komórki w 5 ml ogrzanego EMEM-20%+S, delikatnie pipetując w górę i w dół. Wysiewaj od 2 do 5 × 106 komórek na studzienkę na 6-dołkową płytkę do hodowli tkankowej i inkubuj w temperaturze 37 °C, 7% CO2 w atmosferze powietrza, aż komórki zlewają się w 75% - 80%. Sprawdzaj codziennie; Może być wymagane do 7 dni. Co 3-4 dni odsysaj pożywkę z komórek i zastępuj ją świeżym EMEM-20%+S.</li>
 </ol>
 </li>
 <li>Do komórek subkulturowych:
 <ol>
 <li>Ciepła 0,05% trypsyna - 0,02% EDTA w łaźni wodnej o temperaturze 37 °C. Odessać pożywkę z komórek i raz umyć komórki podgrzaną 0,05% trypsyną - 0,02% EDTA, aby usunąć nadmiar pożywki i surowicy. Usuń płukanie i dodaj 1 ml podgrzanej trypsyny na studzienkę do komórek.</li>
 <li>Inkubować w temperaturze 37 °C i 7% CO2 i monitorować pod mikroskopem co 5 minut, aż co najmniej 75 % komórek oderwie się od studzienki (studzienek) płytki do hodowli tkankowej. Może to potrwać od 5 do 30 minut.</li>
 <li>Umyj komórki w EMEM-20%+S, aby usunąć nadmiar trypsyny. Przenieś trypsynizowane komórki do sterylnej stożkowej probówki o pojemności 50 ml. Wiele dołków komórek z jednej 6-dołkowej płytki hodowlanej można połączyć w jedną sterylną probówkę stożkową o pojemności 50 ml. Dodać 30 ml EMEM-20%+S i zagnieździć komórki przez odwirowanie w stężeniu 1,000-1,200 × g, bez chłodzenia i przy niskiej prędkości hamowania.</li>
 <li>Delikatnie zdekantować supernatant i ponownie zawiesić komórki w świeżym EMEM-20%+S, delikatnie pipetując w górę i w dół. Korzystając z kroków od 1.2.1 do 1.2.3 powyżej, aby trypsynizować komórki, kontynuuj subhodowlę komórek na szalkach do hodowli tkankowej, jak opisano w krokach od 1.2.5 do 1.2.7, gdy zlewają się one w 75 - 80%.</li>
 <li>Subhodowla z jednego dołka płytki 6-dołkowej do jednej kolby T-25 cm2 w końcowej objętości 5 ml EMEM-20%+S, wysiewając od 0,5 do 1 × 106 komórek/kolbę.</li>
 <li>Używając 5 ml podgrzanej trypsyny na kolbę T-25 cm2 w celu odłączenia komórek, subkulturuj z jednej kolby T-25 cm2 do jednej kolby T-75 cm2 w końcowej objętości 10 ml EMEM-20%+S, wysiewając od 1 do 5 × 106 komórek/kolbę.</li>
 <li>Używając 8 ml podgrzanej trypsyny na kolbę T-75 cm2 w celu odłączenia komórek, subkulturuj z jednej kolby T-75 cm2 do 2 kolb T-75 cm2. W celu optymalnego wzrostu komórek nie należy hodować komórek w kolbach większych niż T-75 cm2 lub subkulturach w stosunku większym niż 1 kolba macierzysta: 3 nowe kolby.</li>
 </ol>
 </li>
 <li>Po subhodowli komórek całkowicie usuwaj i wymieniaj pożywkę co 2 do 3 dni, aż osiągną 75-90% konfluencji. Komórki mogą potrzebować do 3 tygodni, aby osiągnąć 75-90% konfluencji. Aby uzyskać optymalne generowanie spolaryzowanych kultur, subkulturuj komórki, zanim osiągną ponad 90% konfluencji, jako monowarstwa.</li>
 <li>Kontynuuj subhodowlę komórek, aż wyrośnie wystarczająca liczba komórek, aby zasiać pożądaną liczbę wkładek Transwell. Każda wkładka Transwell wymaga 2 × 105 komórek. Aby uzyskać optymalną wydajność generowania kultur spolaryzowanych, użyj komórek, które przeszły nie więcej niż 10 subkultur.</li>
</ol>
2. Uprawa spolaryzowanych kultur pokrytych płynem Calu-3 (LCC)
Środki bezpieczeństwa: Wykonuj wszystkie procedury w komorze bezpieczeństwa biologicznego, używając techniki sterylnej hodowli.
<ol>
 <li>Przygotować EMEM zawierający 10% FBS (EMEM-10%) i ogrzać w łaźni wodnej do temperatury 37 °C.</li>
 <li>Przygotuj 24-dołkową płytkę Transwell do wysiewu. Za pomocą sterylnych kleszczy przenieś wkładki Transwell z wnętrza do zewnętrznych rzędów płytki bez dotykania membrany wkładki. Komórki powinny być hodowane tylko w studzienkach na zewnętrznych rzędach płytki. Aby zapobiec wprowadzaniu się pęcherzyków powietrza do komór podstawno-bocznych, należy dodać 600 μl EMEM-10% do każdej z nich, ustawiając pipetę pod kątem przy ściance każdej komory i powoli uwalniając pożywkę do studzienki.</li>
 <li>Odłącz komórki od tkanki T-75 cm2. Kolby do subkultury przy użyciu podgrzanej trypsyny i przemyć w 30 ml EMEM-20%+S na każde 2 kolby komórek trypsynizowanych, jak opisano w kroku 1.2.</li>
 <li>Dokładnie zawiesić umyte komórki w 5 ml EMEM-10%, delikatnie pipetując w górę i w dół.</li>
 <li>Określić żywotną i całkowitą liczbę komórek metodą wykluczania błękitu trypanowego. Kontynuuj tylko wtedy, gdy 80% - 90% jest wykonalne.</li>
 <li>W sterylnej stożkowej probówce o pojemności 50 ml rozcieńczyć komórki do stężenia 2 × 106 żywotnych komórek/ml za pomocą EMEM-10%.</li>
 <li>Dodaj komórki do komory wierzchołkowej każdego Transwella. Do studzienek A1 i D1, które będą studzienkami kontrolnymi bezkomórkowymi, czyli ślepymi próbami, dodaj 100 μl EMEM-10% bez komórek. Do każdej z pozostałych studzienek dodać 100 μl ponownie zawieszonych komórek Calu-3, delikatnie ustawiając pipetę pod kątem względem wewnętrznego kanału prowadzącego ścianki wkładu i powoli uwalniając komórki. Nie dotykaj pipety do membrany wkładu. Aby utrzymać jednorodną zawiesinę komórek Calu-3, delikatnie mieszaj zawiesinę komórkową podczas tego etapu wysiewu.</li>
 <li>Inkubować płytkę Transwell w temperaturze 37 °C i 7% CO2 w atmosferze powietrza. Umieścić płytkę w inkubatorze, w którym zakłócenia fizyczne będą minimalne. Aby poprawić wydajność polaryzacji, nie należy układać płytek jedna na drugiej.</li>
 <li>Aby utrzymać kultury do czasu polaryzacji i gotowości do użycia w eksperymentach, należy całkowicie zastąpić pożywkę w Transwells, jak opisano w krokach od 2.10 do 2.13 poniżej. Pożywka powinna być całkowicie wymieniona trzy dni po subhodowli do Transwells, a następnie w cyklu na przemian od czwartego do trzeciego dnia po poprzednim karmieniu, aż komórki będą w pełni spolaryzowane.</li>
 <li>Ogrzej EMEM-10% w łaźni wodnej do temperatury 37 °C.</li>
 <li>Delikatnie zassać podłoże z wkładów Transwell. Za pomocą pipety kapilarnej podłączonej do pułapki próżniowej z delikatnym podciśnieniem lub za pomocą standardowej pipety o pojemności 1 ml, odessać pożywkę z bezkomórkowych studzienek A1 i D1, a następnie z dołków z nasionami, najpierw usuwając pożywkę wierzchołkową ze wszystkich studzienek, a następnie usuwając podłoże podstawno-boczne ze wszystkich studzienek. Nie dotykać membran wkładek podczas zasysania medium.</li>
 <li>Dodać 200 μl EMEM-10% do komory wierzchołkowej studzienek bezkomórkowych A1 i D1, a następnie do dołków z nasionami, kierując pożywkę do komory wierzchołkowej, używając boku wkładki do prowadzenia końcówki pipety. Nie dodawaj pożywki bezpośrednio na komórki i nie dotykaj membrany wkładki.</li>
 <li>Dodać 600 μl EMEM-10% do komór podstawno-bocznych. Aby zapobiec wprowadzaniu się pęcherzyków powietrza do komór podstawno-bocznych, dodaj pożywkę do każdej z nich, ustawiając pipetę pod kątem przy ściance każdej komory i powoli uwalniając pożywkę do studzienki.</li>
</ol>
3. Ocena rozwoju odporności Calu-3 LCC
Środki bezpieczeństwa: Wykonuj wszystkie procedury w komorze bezpieczeństwa biologicznego, używając techniki sterylnej hodowli.
<ol>
 <li>Oceń przeznabłonkową rezystancję elektryczną (TEER) Calu-3 LCC 30 min po zmianie podłoża; w razie potrzeby ocenę można przeprowadzić po każdej zmianie podłoża. Wykonuj pomiary w sterylnych warunkach. Rozpocznij pomiary od bezkomórkowych studzienek kontrolnych A1 i D1 (ślepe próby), aby uzyskać pomiary podstawowe, i kontynuuj pomiary dla każdej studzienki.
 <ol>
 <li>W sterylnych warunkach przenieś elektrodę STX2 do probówki wirówkowej o pojemności 50 ml zawierającej 70% etanolu w sterylnej wodzie i sterylizuj przez 15 minut.</li>
 <li>Skalibruj i przetestuj woltoomomierz pod kątem użytkowania zgodnie ze wskazówkami producenta.</li>
 <li>Wyjmij elektrodę z etanolu, wysusz na powietrzu 5-10 sekund i przepłucz elektrodę sterylnym EMEM-10%.</li>
 <li>Ustaw przełącznik trybu woltoomomierza na ustawienie REZYSTANCJA i włącz zasilanie.</li>
 <li>Delikatnie umieść elektrodę w jednym z 3 portów, które umożliwiają dostęp do podstawno-bocznej komory jednej hodowli Transwell. Umieść elektrodę tak, aby dłuższy przewód tylko lekko dotykał dna zewnętrznej studzienki i pozostawał pionowy, a krótszy przewód znajdował się w pożywce do hodowli tkankowej komory wierzchołkowej, nie dotykając membrany wkładki.</li>
 <li>Naciśnij przycisk "Zmierz R" i poczekaj, aż odczyt się ustabilizuje. Powtórz dla pozostałych 2 portów dla każdej studzienki i zapisz pomiary ze wszystkich trzech portów, co daje w sumie trzy pomiary na studzienkę. Kontynuuj pomiar rezystancji dla wszystkich studzienek komórek.</li>
 <li>Wyczyść elektrodę, mocząc 5-10 minut w 70% etanolu, spłukując w sterylnymdH2Oi dokładnie wysuszając. Przechowywać w oryginalnym opakowaniu.</li>
 <li>Oblicz rezystancję każdej studzienki, korzystając z równania 1. 
 Ω rzeczywista = próbka Ω - Ω ślepa , Równanie 1 
 gdzie próbka Ω jest średnim pomiarem z dołka z nasionami, a Ω ślepa próba jest średnim pomiarem z 2 studzienek, A1 i D1, zawierających wstawki i pożywkę, ale bez komórek.</li>
 <li>Oblicz jednostkę oporu powierzchniowego, korzystając z równania 2. 
 Ω rzeczywista× efektywna powierzchnia membrany = Ω × cm2, równanie 2 
 gdzie efektywna powierzchnia membrany wynosi 0,33cm2 dla 24-dołkowych wkładów Transwell.</li>
 </ol>
 </li>
 <li>Sprawdź, czy polaryzacja jest kompletna, wykonując test wtórny, mierzący pasywną dyfuzję fluoresceiny sodu między przedziałami wierzchołkowymi i podstawno-bocznymi, na jednej do trzech kultur Transwell. Studzienki użyte do oznaczania fluoresceiny sodu należy wyrzucić natychmiast po zakończeniu testu.
 <ol>
 <li>Przygotować bufor niefluorescencyjny (118 mM NaCl; 4,75 mM KCl; 2,53 mM CaCl2,2H 2O; 2,44 mMMgSO4; 1,19 mM KH2PO4; 25 mMNaHCO3 w sterylnej wodzie; sterylny filtr z urządzeniem filtrującym 0,45 μm). Przygotować fluoresceinę sodu w stężeniu 1 mg/ml w niefluorescencyjnym buforze, sterylnym filtrze, zawinąć w folię aluminiową i przechowywać w temperaturze 4 °C, chronić przed światłem. Przed użyciem ogrzać do temperatury pokojowej.</li>
 <li>Po zakończeniu pomiarów rezystancji ostrożnie usuń pożywkę zarówno z przedziałów podstawno-bocznych, jak i wierzchołkowych od jednej do trzech indywidualnych kultur Transwell.</li>
 <li>Płukać kultury Transwell. Delikatnie dodać 600 μl sterylnego PBS (D-PBS) firmy Dulbecco w temperaturze pokojowej do komór podstawno-bocznych i 100 μl sterylnego D-PBS w temperaturze pokojowej do komór wierzchołkowych.</li>
 <li>Delikatnie usuń D-PBS ze studzienek. Dodać 600 μl sterylnego buforu niefluorescencyjnego do komór podstawno-bocznych. Dodać 100 μl sterylnej 1 mg/ml fluoresceiny sodu do komór wierzchołkowych.</li>
 <li>Inkubować płytkę w temperaturze 37 °C przez 1 godzinę. CO2 nie jest wymagany podczas tej inkubacji.</li>
 <li>Podczas inkubacji należy przygotować wzorcową krzywą fluoresceiny sodu w zakresie od 20 μg/ml do 0 μg/ml, używając niefluorescencyjnego buforu do rozcieńczenia fluoresceiny sodu. Przygotować co najmniej 8 różnych stężeń fluoresceiny sodu, każde w końcowej objętości co najmniej 600 μl. Rozcieńczenia krzywej wzorcowej należy chronić przed światłem do czasu, gdy będą gotowe do pomiaru absorbancji.</li>
 <li>Przenieść niefluorescencyjną próbkę buforową z podstawno-bocznego przedziału każdego testu Transwell do oddzielnej czystej probówki w celu analizy. Usunąć z płytki test Transwells używany do badania biernej dyfuzji fluoresceiny sodu i wyrzucić. Włożyć płytkę z pozostałymi Transwellami do inkubatora.</li>
 <li>Umieścić 100 μl każdego roztworu wzorcowego w trzech egzemplarzach na 96-dołkowej płytce z płaskim dnem.</li>
 <li>Przygotować trzy rozcieńczenia każdej próbki podstawno-bocznej (1:2, 1:20 i 1:50) w buforze niefluorescencyjnym i dodać 100 μl każdej nierozcieńczonej próbki i każdego rozcieńczenia, dwukrotnie, do 96-dołkowej płytki z płaskim dnem.</li>
 <li>Zmierzyć absorbancję próbki na czytniku płytek ELISA przy długości fali 486 nm lub 490 nm.</li>
 <li>Oznaczyć stężenie fluoresceiny sodu w kompartmencie podstawno-bocznym, porównując absorbancję próbek z wartościami absorbancji dla krzywej wzorcowej fluoresceiny sodu.</li>
 </ol>
 </li>
</ol>
4. Zakażenie spolaryzowanego Calu-3 LCC wirusem układu oddechowego
Środki bezpieczeństwa: Wykonuj wszystkie procedury w komorze bezpieczeństwa biologicznego, używając techniki sterylnej hodowli, na poziomie bezpieczeństwa biologicznego odpowiednim dla używanego wirusa.
<ol>
 <li>Rozcieńczyć wirusa w EMEM bez surowicy, tak aby pożądana inokulkulacja znajdowała się w 100 μl.</li>
 <li>Umyj komórki w EMEM bez surowicy. Delikatnie odessać pożywkę ze wszystkich studzienek, usuwając podłoże wierzchołkowe, a następnie podłoże podstawno-boczne. Za pomocą pipety kapilarnej podłączonej do pułapki próżniowej z delikatnym podciśnieniem lub za pomocą standardowej pipety o pojemności 1 ml odessać pożywkę z bezkomórkowych studzienek A1 i D1, a następnie z dołków z nasionami, najpierw usuwając pożywkę wierzchołkową ze wszystkich studzienek, a następnie usuwając podłoże podstawno-boczne ze wszystkich studzienek. Nie dotykać membran wkładek podczas zasysania medium.
 <ol>
 <li>Dodać 100 μl EMEM bez surowicy do komory wierzchołkowej studzienek bezkomórkowych A1 i D1, a następnie do studzienek z nasionami, kierując pożywkę do komory wierzchołkowej za pomocą boku wkładki do prowadzenia końcówki pipety. Nie dodawaj pożywki bezpośrednio na komórki i nie dotykaj membrany wkładki.</li>
 <li>Dodać 600 μl EMEM bez surowicy do przegródek podstawno-bocznych. Dodaj pożywkę do każdego Transwell, ustawiając pipetę pod kątem przy ściance komory i powoli uwalniając pożywkę do studzienki.</li>
 <li>Delikatnie odessać pożywkę bez surowicy z dołków.</li>
 </ol>
 </li>
 <li>Zaczynając od studni niezainfekowanych lub pozorowanych zainfekowanych, dodaj odpowiednie rozcieńczenia wirusa do komory wierzchołkowej Transwells. Dla studzienek niezakażonych, dodać 100 μl EMEM wolnego od surowicy do komory wierzchołkowej odpowiednich baselitów Transwell, dla studzienek pozorowanych dodać 100 μl preparatu wolnego od wirusów rozcieńczonego w EMEM bez surowicy do komory wierzchołkowej odpowiedniego Transwell, a w przypadku infekcji wirusowej, rozcieńczyć wirusa w EMEM bez surowicy i dodać 100 μl do komór wierzchołkowych odpowiednich Transwells.</li>
 <li>Dodać 600 μl EMEM bez surowicy do wszystkich komór podstawno-bocznych.</li>
 <li>Inkubować w temperaturze 37 °C i 7% CO2 przez 2 godziny.</li>
 <li>Odessać pożywkę ze studni, najpierw z studni niezainfekowanych i pozorowanych, a następnie z zainfekowanych studni. Najpierw usuń supernatanty wierzchołkowe, a następnie supernatanty podstawno-boczne.</li>
 <li>Zastąp pożywkę 200 μl EMEM-10% w komorach wierzchołkowych i 600 μl EMEM-10% w komorach podstawno-bocznych.</li>
</ol>

<ol><li>Zhu, Y., Chidekel, A., Shaffer, T. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cultured+human+airway+epithelial+cells+%28calu-3%29%3A+a+model+of+human+respiratory+function%2C+structure%2C+and+inflammatory+responses%5BTitle%5D)+AND+%22Critical+care+research+and+practice%22%5BJournal%5D)">Cultured human airway epithelial cells (calu-3): a model of human respiratory function, structure, and inflammatory responses.</a> Critical care research and practice. 2010, (2010).</li>
<li>Mukherjee, M., Pritchard, D. I., Bosquillon, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evaluation+of+air-interfaced+Calu-3+cell+layers+for+investigation+of+inhaled+drug+interactions+with+organic+cation+transporters+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22International+journal+of+pharmaceutics%22%5BJournal%5D)">Evaluation of air-interfaced Calu-3 cell layers for investigation of inhaled drug interactions with organic cation transporters in vitro.</a> International journal of pharmaceutics. 426, 7-14 (2012).</li>
<li>Baginski, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Investigations+into+the+fate+of+inhaled+salmon+calcitonin+at+the+respiratory+epithelial+barrier%5BTitle%5D)+AND+%22Pharmaceutical+research%22%5BJournal%5D)">Investigations into the fate of inhaled salmon calcitonin at the respiratory epithelial barrier.</a> Pharmaceutical research. 29, 332-341 (2012).</li>
<li>Vllasaliu, D., Alexander, C., Garnett, M., Eaton, M., Stolnik, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fc-mediated+transport+of+nanoparticles+across+airway+epithelial+cell+layers%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+controlled+release+%3A+official+journal+of+the+Controlled+Release+Society%22%5BJournal%5D)">Fc-mediated transport of nanoparticles across airway epithelial cell layers.</a> Journal of controlled release : official journal of the Controlled Release Society. , (2011).</li>
<li>Vinhas, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pollen+proteases+compromise+the+airway+epithelial+barrier+through+degradation+of+transmembrane+adhesion+proteins+and+lung+bioactive+peptides%5BTitle%5D)+AND+%22Allergy%22%5BJournal%5D)">Pollen proteases compromise the airway epithelial barrier through degradation of transmembrane adhesion proteins and lung bioactive peptides.</a> Allergy. 66, 1088-1098 (2011).</li>
<li>Hein, S., Bur, M., Schaefer, U. F., Lehr, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+new+Pharmaceutical+Aerosol+Deposition+Device+on+Cell+Cultures+%28PADDOCC%29+to+evaluate+pulmonary+drug+absorption+for+metered+dose+dry+powder+formulations%5BTitle%5D)+AND+%22European+journal+of+pharmaceutics+and+biopharmaceutics+%3A+official+journal+of+Arbeitsgemeinschaft+fur+Pharmazeutische+Verfahrenstechnik+e%22%5BJournal%5D)">A new Pharmaceutical Aerosol Deposition Device on Cell Cultures (PADDOCC) to evaluate pulmonary drug absorption for metered dose dry powder formulations.</a> European journal of pharmaceutics and biopharmaceutics : official journal of Arbeitsgemeinschaft fur Pharmazeutische Verfahrenstechnik e. 77, 132-138 (2011).</li>
<li>Huttunen, S., Toivanen, M., Arkko, S., Ruponen, M., Tikkanen-Kaukanen, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inhibition+activity+of+wild+berry+juice+fractions+against+Streptococcus+pneumoniae+binding+to+human+bronchial+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Phytotherapy+research%3A+PTR%22%5BJournal%5D)">Inhibition activity of wild berry juice fractions against Streptococcus pneumoniae binding to human bronchial cells.</a> Phytotherapy research: PTR. 25, 122-127 (2011).</li>
<li>Elm, C., Rohde, M., Vaerman, J. P., Chhatwal, G. S., Hammerschmidt, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+of+the+interaction+of+the+pneumococcal+surface+protein+SpsA+with+the+human+polymeric+immunoglobulin+receptor+%28hpIgR%29%5BTitle%5D)+AND+%22The+Indian+journal+of+medical+research%22%5BJournal%5D)">Characterization of the interaction of the pneumococcal surface protein SpsA with the human polymeric immunoglobulin receptor (hpIgR).</a> The Indian journal of medical research. 119, 61-65 (2004).</li>
<li>Sutherland, T. C., Quattroni, P., Exley, R. M., Tang, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transcellular+passage+of+Neisseria+meningitidis+across+a+polarized+respiratory+epithelium%5BTitle%5D)+AND+%22Infection+and+immunity%22%5BJournal%5D)">Transcellular passage of Neisseria meningitidis across a polarized respiratory epithelium.</a> Infection and immunity. 78, 3832-3847 (2010).</li>
<li>Grantham, M. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Palmitoylation+of+the+influenza+A+virus+M2+protein+is+not+required+for+virus+replication+in+vitro+but+contributes+to+virus+virulence%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of%22%5BJournal%5D)">Palmitoylation of the influenza A virus M2 protein is not required for virus replication in vitro but contributes to virus virulence.</a> Journal of. 83, 8655-8661 (2009).</li>
<li>Saedisomeolia, A., Wood, L. G., Garg, M. L., Gibson, P. G., Wark, P. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lycopene+enrichment+of+cultured+airway+epithelial+cells+decreases+the+inflammation+induced+by+rhinovirus+infection+and+lipopolysaccharide%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+nutritional+biochemistry%22%5BJournal%5D)">Lycopene enrichment of cultured airway epithelial cells decreases the inflammation induced by rhinovirus infection and lipopolysaccharide.</a> The Journal of nutritional biochemistry. 20, 577-585 (2009).</li>
<li>Yoshikawa, T., Hill, T., Li, K., Peters, C. J., Tseng, C. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Severe+acute+respiratory+syndrome+%28SARS%29+coronavirus-induced+lung+epithelial+cytokines+exacerbate+SARS+pathogenesis+by+modulating+intrinsic+functions+of+monocyte-derived+macrophages+and+dendritic+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+virology%22%5BJournal%5D)">Severe acute respiratory syndrome (SARS) coronavirus-induced lung epithelial cytokines exacerbate SARS pathogenesis by modulating intrinsic functions of monocyte-derived macrophages and dendritic cells.</a> Journal of virology. 83, 3039-3048 (2009).</li>
<li>Yoshikawa, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dynamic+innate+immune+responses+of+human+bronchial+epithelial+cells+to+severe+acute+respiratory+syndrome-associated+coronavirus+infection%5BTitle%5D)+AND+%22PloS+one%22%5BJournal%5D)">Dynamic innate immune responses of human bronchial epithelial cells to severe acute respiratory syndrome-associated coronavirus infection.</a> PloS one. 5, e8729(2010).</li>
<li>Hsu, A. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Critical+role+of+constitutive+type+I+interferon+response+in+bronchial+epithelial+cell+to+influenza+infection%5BTitle%5D)+AND+%22PloS+one%22%5BJournal%5D)">Critical role of constitutive type I interferon response in bronchial epithelial cell to influenza infection.</a> PloS one. 7, e32947(2012).</li>
<li>Harcourt, J. L., Caidi, H., Anderson, L. J., Haynes, L. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evaluation+of+the+Calu-3+cell+line+as+a+model+of+in+vitro+respiratory+syncytial+virus+infection%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+virological+methods%22%5BJournal%5D)">Evaluation of the Calu-3 cell line as a model of in vitro respiratory syncytial virus infection.</a> Journal of virological methods. 174, 144-149 (2011).</li>
<li>Zhang, L., Peeples, M. E., Boucher, R. C., Collins, P. L., Pickles, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Respiratory+syncytial+virus+infection+of+human+airway+epithelial+cells+is+polarized%2C+specific+to+ciliated+cells%2C+and+without+obvious+cytopathology%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+virology%22%5BJournal%5D)">Respiratory syncytial virus infection of human airway epithelial cells is polarized, specific to ciliated cells, and without obvious cytopathology.</a> Journal of virology. 76, 5654-5666 (2002).</li>
<li>Geys, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vitro+study+of+the+pulmonary+translocation+of+nanoparticles%3A+a+preliminary+study%5BTitle%5D)+AND+%22Toxicology+letters%22%5BJournal%5D)">In vitro study of the pulmonary translocation of nanoparticles: a preliminary study.</a> Toxicology letters. 160, 218-226 (2006).</li>
<li>Geys, J., Nemery, B., Hoet, P. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optimisation+of+culture+conditions+to+develop+an+in+vitro+pulmonary+permeability+model%5BTitle%5D)+AND+%22Toxicology+in+vitro+%3A+an+international+journal+published+in+association+with+BIBRA%22%5BJournal%5D)">Optimisation of culture conditions to develop an in vitro pulmonary permeability model.</a> Toxicology in vitro : an international journal published in association with BIBRA. 21, 1215-1219 (2007).</li>
<li>Grainger, C. I., Greenwell, L. L., Lockley, D. J., Martin, G. P., Forbes, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Culture+of+Calu-3+cells+at+the+air+interface+provides+a+representative+model+of+the+airway+epithelial+barrier%5BTitle%5D)+AND+%22Pharmaceutical+research%22%5BJournal%5D)">Culture of Calu-3 cells at the air interface provides a representative model of the airway epithelial barrier.</a> Pharmaceutical research. 23, 1482-1490 (2006).</li>
</ol>

Nie stwierdzono konfliktu interesów.

Podczas ustanawiania Calu-3 LCC we wkładkach Transwell, komórki mogą w ogóle nie polaryzować się lub mogą nie być w pełni polaryzowane, zgodnie z definicją TEER ≥ równowagi barwnika fluoresceiny 1,000 Ω×cm2 i ≤ 1% sodu między przedziałami wierzchołkowymi i podstawnymi. Ponadto komórki Calu-3 w LCC mogą być w pełni spolaryzowane, ale TEER może być niespójny między pomiarami. Chociaż wahania w pomiarach TEER Calu-3 LCC są normalne z dnia na dzień, po pełnej polaryzacji nie oczekuje się dramatycznych wahań TEER, dopóki kultura nie zaniknie naturalnie wraz z wiekiem, co może wynosić zaledwie 5 tygodni lub nawet 12 tygodni po wysiewie.
Zdolność Calu-3 LCC do polaryzacji zależy częściowo od tego, w jaki sposób komórki są utrzymywane i subhodowane przed użyciem w systemie Transwell. Komórki, które urosły powyżej 90% konfluencji jako monowarstwa podczas subhodowli, które były subhodowane więcej niż 10 razy z zamrożonego materiału lub które nie były regularnie dostarczane ze świeżą pożywką, mają mniejsze szanse na pełną polaryzację, a każda polaryzacja prawdopodobnie szybko spadnie. Niepełny lub całkowity brak polaryzacji może być również przypisany różnicom w materiale i wielkości porów Transwelli stosowanych do Calu-3 LCC, a zmienność między partiami Transwelli o podobnym składzie i wielkości porów może również wpływać na polaryzację. Większe rozmiary porów mogą pozwolić Calu-3 na przerost przez błonę Transwell do przedziału podstawno-bocznego, zapobiegając polaryzacji kultury. Brak polaryzacji może być również spowodowany wzrostem bakterii, na co wskazuje mętna pożywka hodowlana, co prowadzi do późniejszego rozpadu ścisłych połączeń między komórkami Calu-3.
Zmienne pomiary TEER Calu-3 LCC mogą być spowodowane mechanicznymi zakłóceniami monowarstw ogniw Calu-3 LCC, wkładek lub samych płytek. Zmiany podłoża i pomiary TEER powinny być wykonywane tak, aby końcówki pipet lub przewody elektrod nie stykały się z celami. Podczas wykonywania tych czynności należy uważać, aby nie wprowadzać pęcherzyków powietrza do przedziałów wierzchołkowych i podstawno-bocznych, co zakłóci zdolność woltoomomierza do wykrywania oporu. Zdolność woltoomomierza do wykrywania rezystancji w kulturze, która jest faktycznie spolaryzowana, może być również ograniczona przez gromadzenie się białka na przewodach elektrod. Nalot ten można usunąć za pomocą delikatnego szlifowania lub skorygować poprzez wymianę elektrody.
Gdy Calu-3 LCC całkowicie się spolaryzuje, a TEER przestanie rosnąć, Calu-3 LCC są gotowe do użycia jako model in vitro do charakteryzowania odpowiedzi komórek nabłonka płuc gospodarza na infekcję dróg oddechowych. System ten pozwala na lepszą charakterystykę kierunkowych odpowiedzi na patogeny w porównaniu z jednowarstwowymi liniami komórkowymi płuc tradycyjnie stosowanymi do badania patogenów układu oddechowego, takich jak komórki A549 i HEp-2, przy czym dodatkowymi zaletami Calu-3 LCC jest szybszy rozwój, łatwiejszy do uzyskania i tańszy w generowaniu niż pierwotny, spolaryzowany, zróżnicowany NHBE. Podobnie jak NHBE, spolaryzowane Calu-3 wykazują tworzenie ścisłych połączeń i wytwarzają mucyny. Jednak w przeciwieństwie do NHBE, spolaryzowane komórki Calu-3 nie różnicują się w warstwy komórek podstawnych i rzęskowych komórek nabłonka walcowego, a niewiele spolaryzowanych komórek Calu-3 rozwija projekcje podobne do rzęsek19. Tak więc, chociaż przydatne do badania spolaryzowanych odpowiedzi komórek nabłonka dróg oddechowych na urazę układu oddechowego, spolaryzowane Calu-3 LCC nie są idealnym modelem do badania rozwoju lub przebudowy dróg oddechowych w odpowiedzi na uraz lub uraz układu oddechowego. Produkcja śluzu przez hodowane komórki in vitro może wpływać na zakaźność komórkową, a także na uwalnianie zakaźnego wirusa i rozprzestrzenianie się wirusa w modelu spolaryzowanym, a bezpośrednie porównanie produkcji śluzu między spolaryzowanym Calu-3 LCC a spolaryzowanym, zróżnicowanym NHBE nie zostało zgłoszone. Komórki A549 i HEp-2 są łatwiejsze do hodowli niż komórki Calu-3, jednak w przeciwieństwie do Calu-3 LCC, nie tworzą spolaryzowanych kultur podczas hodowli na wkładkach Transwell, a zatem nie są idealnymi modelami do badania in vitro odpowiedzi spolaryzowanych komórek nabłonka na infekcję wirusem układu oddechowego.

<table><tbody><tr><td colspan="4">ODCZYNNIKI</td></tr><tr><td>Calu-3</td><td>ATCC</td><td>HTB-55</td><td></td></tr><tr><td>0.05% Trypsyna - 0.02% EDTA</td><td>Gibco/Invitrogen</td><td>25300</td><td></td></tr><tr><td>Eagle's Minimum Essential Medium (EMEM)</td><td>Gibco/Invitrogen</td><td>07-00100DK</td><td></td></tr><tr><td>Płodowa surowica bydlęca (FBS)</td><td>HyClone</td><td>SH30070.03</td><td>Inaktywacja termiczna, 56 &deg; C, 30 min</td></tr><tr><td>Aminokwasy endogenne 100X (10 mM)</td><td>Gibco/Invitrogen</td><td>11140</td><td>Przechowywać w temperaturze 4 stopni; C w ciemności</td></tr><tr><td>L-glutamina</td><td>Gibco/Invitrogen</td><td>25030</td><td></td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Gibco/Invitrogen</td><td>15630</td><td></td></tr><tr><td>EMEM-10% FBS (EMEM-10%)</td><td></td><td></td><td>Uzupełnij EMEM o inaktywowany termicznie FBS do 10% surowicy, sterylny-filtr</td></tr><tr><td>EMEM-20% FBS + suplementy (EMEM-20%+S)</td><td></td><td></td><td>Suplement EMEM do stężeń końcowych: FBS inaktywowany termicznie, 20%; 1X aminokwasy; 2 mM L-glutamina; 10 mM HEPES; sterylne płytki </td></tr><tr><td>Transwell 24-dołkowe</td><td>Corning Costar</td><td>3472</td><td>3 &mu; m wielkość porów, poliester</td></tr><tr><td>Trypan niebieski</td><td>Gibco/Invitrogen</td><td>15250</td><td></td></tr><tr><td>Etanol</td><td>Sigma</td><td>E7023</td><td>Przygotować do 70% przy użyciu sterylnego dH2O</td></tr><tr><td>Dulbecco's PBS (D-PBS)</td><td>Invitrogen</td><td>14040</td><td></td></tr><tr><td>Bufor</td><td></td><td></td> <td>niefluorescencyjny118 mM NaCl; 4,75 mM KCl; 2,53 mM CaCl2&#215; H2O; 2,44 mM MgSO4; 1,19 mM KH2PO4; 25 mM NaHCO3 w sterylnej wodzie; filtr sterylny</td></tr><tr><td>Fluoresceina sodu</td><td>Sigma</td><td>6377</td><td>1 mg/ml w sterylnym buforze niefluorescencyjnym; sterylny filtr, chronić przed światłem; przechowywać w temperaturze 4 &; C do 6 miesięcy</td></tr><tr><td colspan="4">EQUIPMENT </td></tr><tr><td>Voltohmmeter</td><td>World Precision Instruments</td><td></td><td></td></tr><tr><td>STX2 electrode</td><td>World Precision Instruments</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Czytnik</td><td></td><td></td> płytek ELISA <td>Możliwość pomiaru A486 lub A490</td></tr></tbody></table>

ustanowienie pokrytej cieczą hodowli spolaryzowanych ludzkich komórek nabłonka nabłonka dróg oddechowych calu-3 w celu zbadania odpowiedzi komórek gospodarza na patogeny układu oddechowego in vitro

Establishing a Liquid-covered Culture of Polarized Human Airway Epithelial Calu-3 Cells to Study Host Cell Response to Respiratory Pathogens In vitro

Wierzchołkowe i podstawno-boczne powierzchnie komórek nabłonka dróg oddechowych wykazują kierunkowe reakcje na ekspozycję na patogeny in vivo. W ten sposób idealne modele in vitro do badania odpowiedzi komórkowych na patogeny układu oddechowego polaryzują się, tworząc powierzchnie wierzchołkowe i podstawno-boczne. Jednym z takich modeli są zróżnicowane normalne ludzkie komórki nabłonka oskrzeli (NHBE). Jednak system ten wymaga próbek tkanki płucnej, wiedzy specjalistycznej w izolowaniu i hodowli komórek nabłonka z tkanek oraz czasu na wygenerowanie kultury granicy faz powietrze-ciecz.
Komórki Calu-3, pochodzące z ludzkiego gruczolakoraka oskrzeli, są alternatywnym modelem do badania odpowiedzi komórek nabłonka proksymalnych dróg oddechowych na urazę układu oddechowego1, związki farmakologiczne2-6 oraz bakteryjne7-9 i patogeny wirusowe, w tym wirus grypy, rinowirus i zespół ciężkiej ostrej niewydolności oddechowej - powiązany koronawirus10-14. Niedawno wykazaliśmy, że komórki Calu-3 są podatne na zakażenie syncytialnym wirusem oddechowym (RSV) w sposób zgodny z NHBE15,16 . W tym miejscu szczegółowo opisujemy ustanowienie spolaryzowanej, pokrytej cieczą hodowli (LCC) komórek Calu-3, koncentrując się na szczegółach technicznych uprawy i hodowli komórek Calu-3, utrzymania komórek, które zostały wyhodowane w LCC, oraz przedstawiamy metodę przeprowadzania infekcji wirusem układu oddechowego spolaryzowanych komórek Calu-3.
Aby konsekwentnie uzyskiwać spolaryzowane LCC Calu-3, komórki Calu-3 muszą być starannie hodowane przed hodowlą we wkładkach Transwell. Kultury jednowarstwowe Calu-3 powinny pozostawać poniżej 90% konfluencji, powinny być hodowane rzadziej niż 10 razy z zamrożonego materiału i powinny być regularnie zaopatrywane w świeżą pożywkę. Po wyhodowaniu w Transwells, Calu-3 LCC musi być traktowany z ostrożnością. Nieregularne zmiany pożywki oraz mechaniczne lub fizyczne rozerwanie warstw lub płytek komórkowych negatywnie wpływają na polaryzację przez kilka godzin lub dni. Polaryzacja jest monitorowana przez ocenę przeznabłonkowego oporu elektrycznego (TEER) i jest weryfikowana przez ocenę biernej równowagi fluoresceiny sodu między przedziałami wierzchołkowymi i podstawno-bocznymi17,18 . Gdy TEER osiągnie poziom 1000 Ω×cm2 lub wyższy, Calu-3 LCC są gotowe do użycia do badania odpowiedzi komórkowych na patogeny układu oddechowego.

W przypadku hodowli w formie kultur pokrytych cieczą (LCC) w systemach hodowlanych Transwell, jak zilustrowano na Rysunku 1, komórki Calu-3 ulegają polaryzacji, tworząc wyraźne powierzchnie apikalną i bazolateralną. Zastosowanie opisanej tutaj metody sprawia, że transepitelna oporność elektryczna (TEER) Calu-3 LCC osiąga plateau na poziomie 1 000 Ω×cm2 lub wyżej w ciągu 3 tygodni od wysiania, czego przykład przedstawiono na Rysunku 2. Tight junctions (zczelne połączenia) utworzone między spolaryzowanymi komórkami zapobiegają pasywnej ekwilibracji małych cząsteczek między przedziałem apikalnym a bazolateralnym. W związku z tym, w celu potwierdzenia polaryzacji Calu-3 LCC stosuje się zmodyfikowany test ekwilibracji fluoresceiny sodowej 15,17,18. Wraz ze wzrostem TEER monowarstw komórek Calu-3 w LCC, ilość fluoresceiny, która pasywnie przenika do przedziału bazolateralnego, maleje. Gdy TEER osiągnie wartość 1 000 Ω×cm2, ilość fluoresceiny ekwilibrującej do przedziału bazolateralnego wynosi ≤ 1%, co pokazano na Rysunku 3; zatem Calu-3 LCC uznaje się za w pełni spolaryzowane, gdy TEER wynosi ≥ 1 000 Ω×cm2. Maksymalny pomiar TEER dla Calu-3 LCC może różnić się w zależności od eksperymentu. Jednakże, po osiągnięciu poziomu plateau wartości TEER w danym doświadczeniu, w pełni spolaryzowane, niezakażone Calu-3 LCC mogą pozostawać stabilne od 5 do 12 tygodni po wysianiu. Brak wzrostu oporności w hodowlach Calu-3 w Transwell może być spowodowany kilkoma czynnikami, które wyszczególniono w Tabeli 1. Gdy TEER dla Calu-3 LCC osiągnie plateau na poziomie 1 000 Ω×cm2 lub wyżej, model jest gotowy do badania odpowiedzi komórek nabłonka dróg oddechowych na patogeny układu oddechowego, w tym wirusa RSV (respiratory syncytial virus). Ekspozycja na RSV skutkuje szybszym spadkiem integralności spolaryzowanej hodowli w porównaniu do komórek poddanych infekcji pozorowanej (Rysunek 4).
<img alt="Schemat wkładki do hodowli komórkowej; przedziały apikalny i bazolateralny; układ błony do badań przepuszczalności." src="/files/ftp_upload/50157/50157fig1.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Rycina 1"> 
 Rycina 1. Przekrój poprzeczny komórek hodowanych w systemie Transwell. Komórki są hodowane na powierzchni apikalnej membrany wkładki.
<img alt="Wykres oporu w funkcji dni po wysiewie; analiza danych dotycząca wpływu wzrostu na opór." fo:content-width="4in" fo:src="/files/ftp_upload/50157/50157fig2highres.jpg" src="/files/ftp_upload/50157/50157fig2.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Rycina 2"> 
 Rycina 2. Rozwój transepitelialnego oporu elektrycznego (TEER) i polaryzacja komórek Calu-3 po wysianiu do wkładów Transwell. W każdym punkcie czasowym TEER przedstawiono jako medianę Ω x cm2 ± SEM dla 32 niezależnych studni z jednego reprezentatywnego eksperymentu.
<img alt="Wykres równowagi statycznej; % przecieku w funkcji oporu; wynik analizy danych w pomiarze elektrycznym." fo:content-width="4in" fo:src="/files/ftp_upload/50157/50157fig3highres.jpg" src="/files/ftp_upload/50157/50157fig3.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Rycina 3"> 
Rycina 3. Pasywna równowaga fluoresceiny sodowej w przedziale bazolateralnym monowarstw komórek Calu-3 jest hamowana w miarę polaryzacji komórek. Przedstawiono skumulowane dane z czterech niezależnych eksperymentów. Każdy punkt danych reprezentuje pojedynczy pomiar.
<img alt="Wykres oporu w funkcji dni po infekcji; RSV-A2 w stosunku do infekcji pozorowanej; analiza trendu." fo:content-width="4in" fo:src="/files/ftp_upload/50157/50157fig4highres.jpg" src="/files/ftp_upload/50157/50157fig4.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Rycina 4"> 
 Rycina 4. Infekcja RSV spolaryzowanych komórek Calu-3 LCC przyspiesza spadek integralności monowarstwy. Spolaryzowane komórki Calu-3 zainfekowano wirusem RSV-A2 przy MOI=1 w dniu 0, a polaryzację monitorowano przez 8 tygodni po infekcji. Przedstawiono jeden reprezentatywny eksperyment. Dane przedstawiono jako medianę oporu z 8 niezależnych studni na infekcję ± SEM dla każdego punktu czasowego. *p&lt;0.05 pomiędzy kulturami z infekcją pozorowaną a zainfekowanymi RSV-A2, wyznaczone za pomocą testu t Studenta.
<table border="1" fo:keep-together.within-page="always">
 <tbody>
 <tr>
 <td>Problem</td>
 <td>Rozwiązanie(ia)</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Opór nie jest mierzalny</td>
 <td>
 <ul>
 <li>Usuń wszelkie pęcherzyki powietrza z dołków</li>
 <li>Używaj komórek Calu-3, które zostały podpasażowane z zamrożonego banku mniej niż 10 razy</li>
 <li>Nie dopuszczaj do osiągnięcia przez komórki Calu-3 100% konfluencji w hodowli monowarstwy</li>
 <li>Sprawdź, czy komórki nie rosną na plastikowym dnie dołka poniżej wkładki (co może wskazywać, że komórki przrosły przez pory wkładki)</li>
 <li>Odczekaj 2-3 tygodnie po wysianiu do pełnego rozwoju oporu</li>
 <li>Sprawdź skład i wielkość porów stosowanych wkładek, w razie potrzeby je zmień (zalecana wkładka poliestrowa, wielkość porów 0.3 μm, bez powłok, szczegóły w sekcji materiały)</li>
 <li>Sprawdź jakość elektrody, delikatnie szlifując końcówkę w celu usunięcia nagromadzonych białek, i w razie potrzeby wymień ją</li>
 <li>Sprawdź, czy w pożywce nie rozwinął się wzrost bakterii</li>
 </ul>
 </td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Opór narasta, ale pełna polaryzacja (≥1,000 Ω×cm2) nie zostaje osiągnięta</td>
 <td>
 <ul>
 <li>Odczekaj dodatkowy czas na rozwój polaryzacji (sporadycznie może to zająć do 4 tygodni)</li>
 <li>Używaj komórek Calu-3, które zostały podpasażowane z zamrożonego banku mniej niż 10 razy</li>
 <li>Nie dopuszczaj do osiągnięcia przez komórki Calu-3 100% konfluencji w hodowli monowarstwy</li>
 <li>Regularnie wymieniaj pożywkę w hodowlach Transwell, naprzemiennie w trzecim, a następnie czwartym dniu po poprzednim karmieniu</li>
 <li>Hoduj komórki wyłącznie na wkładkach umieszczonych w zewnętrznych rzędach płytek</li>
 <li>Użyj innej partii wkładek Transwell</li>
 </ul>
 </td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Komórki są w pełni spolaryzowane, ale opór nie jest spójny między kolejnymi pomiarami</td>
 <td>
 <ul>
 <li>Nie przesuwaj i nie układaj płytek w stosy w inkubatorze</li>
 <li>Unikaj powodowania wibracji w komorze z laminarnym przepływem powietrza podczas pracy z płytkami Transwell</li>
 <li>Usuń wszelkie pęcherzyki powietrza z dołków</li>
 <li>Nie naruszaj warstwy komórek końcówkami pipet podczas wymiany pożywek lub pomiarów TEER</li>
 <li>Używaj 200 μl pożywki w komorze apikalnej; mniejsza objętość może prowadzić do niestabilnych odczytów TEER</li>
 <li>Sprawdź jakość elektrody, delikatnie szlifując końcówkę w celu usunięcia nagromadzonych białek, i w razie potrzeby wymień ją</li>
 </ul>
 </td>
 </tr>
 </tbody>
</table>
Tabela 1. Rozwiązywanie problemów, które mogą wystąpić podczas hodowli komórek Calu-3 w Transwellach. Na pełną polaryzację komórek Calu-3 w hodowlach pokrytych cieczą wpływa wiele czynników, z których najbardziej prawdopodobne zostały wyróżnione w tej tabeli.

Wnioski zawarte w tym raporcie są ustaleniami autorów i niekoniecznie reprezentują poglądy Centrów Kontroli i Prewencji Chorób.

Ustanowienie pokrytej cieczą hodowli spolaryzowanych ludzkich komórek nabłonka nabłonka dróg oddechowych Calu-3 w celu zbadania odpowiedzi komórek gospodarza na patogeny układu oddechowego in vitro

The  apical and basolateral surfaces of airway epithelial cells demonstrate  directional responses to pathogen exposure in  vivo. Thus, ideal in vitro ...

Ogólnym celem tej procedury jest ustanowienie spolaryzowanej, pokrytej cieczą hodowli trzech komórek Calu przy użyciu systemu hodowli Transwell w celu skonfigurowania systemu hodowli Transwell. Najpierw przygotuj płytkę transwell, przesuwając wkładki do zewnętrznych rzędów płytki i dodając pożywkę do podstawno-bocznych komór każdej studzienki. Drugim krokiem jest przygotowanie jednowarstwowych komórek hodowlanych do zawiesin pojedynczych komórek.Następnie zawieszone komórki są umieszczane w przedziałach wierzchołkowych wkładów transwell. Ostatnim krokiem jest całkowita wymiana ośrodkowego wierzchołkowego i podstawnego bocznego. W hodowli wstawia się w cyklu trzydniowym, a następnie czterodniowym przez dwa do trzech tygodni, aż komórki będą w pełni spolaryzowane.Ostatecznie, trans-nabłonkowy opór elektryczny i pasywny test równowagi fluoresceiny sodu są wykorzystywane do wykazania polaryzacji pokrytych cieczą kultur calu three. Główną zaletą stosowania tej techniki w porównaniu z normalnymi ludzkimi komórkami nabłonka oskrzeli jest to, że Calor trzy są bardziej dostępne i szybciej rozwijają się w spolaryzowane kultury Gotowe do użycia Wszystkie procedury hodowli spolaryzowanego calu. Trzy hodowle pokryte cieczą lub LCC są wykonywane w komorze bezpieczeństwa biologicznego przy użyciu sterylnych technik hodowli.Zacznij od przygotowania 24-dołkowej płytki trans-dołkowej. W przypadku wysiewu za pomocą sterylnych kleszczyków, należy przesunąć wkładki transwell od wewnątrz do zewnętrznych rzędów płytki bez dotykania wkładki. Komórki błonowe powinny być hodowane tylko w studzienkach na zewnętrznych rzędach płytki.W 600 mikrolitrach EMEM zawierającego 10% FBS, zwanego dalej EMEM 10%, do każdego komory podstawno-bocznej. Aby zapobiec wprowadzaniu się pęcherzyków powietrza, ustaw pipetę pod kątem przy ściance każdej komory i powoli uwalniaj pożywkę do studzienki. Następnie odłącz trzy komórki Colu od kolb do hodowli tkankowych i komórek subhodowli, jak opisano w tekście protokołu, dokładnie ponownie zawieś umyte komórki w pięciu mililitrach EMEM 10%, delikatnie pipetując w górę iw dół, określ żywotną i całkowitą liczbę komórek metodą wykluczenia błękitu trianowego i kontynuuj tylko wtedy, gdy 80% do 90% jest zdolnych do życia.Następnie w sterylnej stożkowej probówce o pojemności 50 mililitrów rozcieńczyć komórki do stężenia dwa razy 10 do sześciu żywotnych komórek na mililitr. Za pomocą EMEM 10% dodać 100 mikrolitrów ponownie zawieszonych trzech komórek calu do komory wierzchołkowej każdej transwell, z wyjątkiem studzienek A jeden i D jeden. Delikatnie przyłóż pipetę do wewnętrznego kanału prowadzącego ścianki wkładu i powoli uwalniaj komórki.Nie dotykaj pipety do membrany wkładu. Delikatnie wstrząsnąć zawiesiną trzykomórkową CALU podczas tego etapu osadzania, aby utrzymać jednorodną zawiesinę komórek do studzienek A jeden i D, które będą bezkomórkowymi studzienkami kontrolnymi lub ślepymi próbami przy 100 mikrolitrach EMEM 10% bez komórek. Inkubuj płytkę transdołkową w temperaturze 37 stopni Celsjusza i 7% dwutlenku węgla w atmosferze powietrza w inkubatorze, w którym zakłócenia fizyczne będą minimalne, aby poprawić wydajność polaryzacji.Nie układaj płytek jedna na drugiej trzy dni po subkulturze i wmasuj trzy komórki do transwelli, całkowicie zastąp pożywkę, delikatnie zasysaj pożywkę z wkładek transwell za pomocą pipety kapilarnej podłączonej do pułapki próżniowej z delikatnym próżnią. Najpierw usuń podłoże wierzchołkowe ze wszystkich studzienek, a następnie usuń podłoże podstawno-boczne ze wszystkich studzienek. Nie dotykaj membran wkładu podczas zasysania medium.Dodać 200 mikrolitrów EMEM 10% do komory wierzchołkowej studzienek bezkomórkowych A i D. Następnie do studzienek osadzonych, kierując pożywkę do komory wierzchołkowej, używając boku wkładki do prowadzenia końcówki pipety. Nie dodawaj pożywki bezpośrednio na komórki i nie dotykaj wkładki membranowej.Następnie dodać 600 mikrolitrów EMEM 10% do podstawowych przedziałów bocznych, aby zapobiec wprowadzaniu pęcherzyków powietrza do podstawowych przedziałów bocznych. Dodaj pożywkę do każdej z nich, ustawiając pipetę pod kątem przy ściance każdej komory i powoli uwalniając pożywkę do studzienki. Po tym pierwszym podłożu umieścić płytkę transwell z powrotem w inkubatorze. Zastępstwo.Pożywkę należy wymieniać w cyklu na przemian między czwartym, a następnie trzecim dniem po poprzednim karmieniu, aż komórki będą w pełni spolaryzowane. Polaryzacja jest monitorowana poprzez ocenę transnabłonkowej rezystancji elektrycznej lub rozdarcia CALU three LCC za pomocą woltera, który został skalibrowany i przetestowany. Aby rozpocząć tę procedurę, wyjmij elektrodę z etanolu na sucho przez pięć do 10 sekund i przepłucz elektrodę sterylnym EMEM 10%Ustaw przełącznik trybu woltera na ustawienie rezystancji i włącz zasilanie.Rozpocznij pomiary od studzienek kontrolnych bez komórek, aby uzyskać pomiary podstawowe, a następnie kontynuuj pomiary dla każdej z nich. Dobrze, delikatnie umieść elektrodę w jednym z trzech portów, które umożliwiają dostęp do podstawno-bocznej komory hodowli transwell. Umieść elektrodę tak, aby dłuższy przewód tylko lekko dotykał dna zewnętrznej studzienki i pozostał pionowy.A krótszy przewód znajduje się w pożywce do hodowli tkankowej komory wierzchołkowej bez dotykania membrany wkładki, naciśnij przycisk miarki R i poczekaj, aż odczyt się ustabilizuje. Powtórz dla pozostałych dwóch portów dla każdej studzienki i zapisz pomiary ze wszystkich trzech portów, co daje w sumie trzy pomiary na studzienkę, aby sprawdzić, czy polaryzacja jest zakończona. Wtórny test mierzący pasywną dyfuzję fluoresceiny sodu między przedziałami wierzchołkowymi i podstawno-bocznymi przeprowadza się na jednej do trzech kultur transwell.Ostrożnie usunąć pożywkę zarówno z podstawowego bocznego, jak i wierzchołkowego przedziału kultur transwell, które będą testowane. Przepłukać kultury transwell, delikatnie dodając 600 mikrolitrów o temperaturze pokojowej, sterylnego DPBS do komór podstawno-bocznych i 100 mikrolitrów sterylnego DPBS w temperaturze pokojowej do komór wierzchołkowych. Delikatnie usuń DPBS ze studzienek.Dodać 600 mikrolitrów sterylnego niefluorescencyjnego buforu do przedziałów podstawno-bocznych, a następnie 100 mikrolitrów sterylnego fluoresceiny sodu do przedziałów wierzchołkowych. Inkubować płytkę w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez godzinę. Po godzinie.Przenieść niefluorescencyjną próbkę buforową z podstawno-bocznego przedziału każdej badanej osłony do oddzielnej czystej probówki. Do analizy należy usunąć z płytki transwelle testowe używane do badania pasywnej dyfuzji fluoresceiny sodu i wyrzucić. Włożyć płytkę z pozostałymi transwellami do inkubatora.Umieścić 100 mikrolitrów każdego wcześniej przygotowanego roztworu wzorcowego fluoresceiny sodu w trzech egzemplarzach na 96-dołkowej płaskiej płytce dennej. Przygotować trzykrotne rozcieńczenie każdej podstawowej próbki bocznej w buforze niefluorescencyjnym. Do każdej próbki dodać 100 mikrolitrów nierozcieńczonej próbki i 100 mikrolitrów każdego rozcieńczenia w dwóch egzemplarzach do 96-dołkowej płytki z płaskim dnem.Zmierzono absorbancję próbki na czytniku płytek EISA przy 486 nanometrach lub 490 nanometrach. Aby rozpocząć tę procedurę, najpierw umyj komórki i EMEM wolne od surowicy za pomocą pipety kapilarnej przymocowanej do pułapki próżniowej z delikatnym podciśnieniem delikatnie zassaj pożywkę ze wszystkich studzienek, usuwając pożywkę wierzchołkową, a następnie pożywkę podstawno-boczną, odessać pożywkę z bezkomórkowych studzienek A i D, a następnie z dołków z nasionami. Nie dotykać membran wkładek podczas zasysania medium.Dodać 100 mikrolitrów EMEM wolnego od surowicy do komory wierzchołkowej studzienek bezkomórkowych A i D, a następnie do studzienek osadzonych, kierując pożywkę do komory wierzchołkowej. Używanie boku wkładki do prowadzenia końcówki pipety. Nie dodawaj pożywki bezpośrednio na komórki i nie dotykaj wkładki membranowej.Następnie w 600 mikrolitrach surowicy wolnej EMEM do przedziałów podstawno-bocznych. Dodaj pożywkę do każdej studzienki trans, ustawiając pipetę pod kątem przy ścianie komory i powoli uwalniając pożywkę do dołka Delikatnie odessać wolne podłoże surowicy z dołków. Zaczynając od studzienek niezakażonych lub pozorowanych zainfekowanych, dodać następujące rozcieńczenia wirusa do komory wierzchołkowej odpowiednich studzienek trans.100 mikrolitrów surowicy wolnej od EMEM dla studni niezakażonych. 100 mikrolitrów preparatu wolnego od wirusów rozcieńczonego w surowicy wolnej od EMEM do pozorowanych zainfekowanych studzienek i 100 mikrolitrów wirusa rozcieńczonego w surowicy wolnej od EMEM dla wirusa. Następnie, w ilości 600 mikrolitrów surowicy wolnej od EMEM do wszystkich przedziałów podstawno-bocznych, inkubować w temperaturze 37 stopni Celsjusza i 7% dwutlenku węgla przez dwie godziny.Po dwóch godzinach odessać pożywkę ze studzienek najpierw z dołków niezainfekowanych i pozorowanych zainfekowanych, a następnie z zainfekowanych studzienek. Najpierw usunąć supernatanty wierzchołkowe, a następnie supernatanty boczne podstawowe. Na koniec zastąp pożywkę 200 mikrolitrami EMEM, 10% w przedziałach wierzchołkowych i 600 mikrolitrami EMEM 10% w komorach podstawno-bocznych, postępując zgodnie z metodą pokazaną na tym filmie.Przeznabłonkowy opór elektryczny lub rozdarcie kultur pokrytych cieczą osiąga plateau na poziomie lub powyżej 1000 M na centymetr kwadratowy w ciągu trzech tygodni po wysianiu. Przykład tego jest pokazany na tym rysunku, ponieważ ścisłe połączenia utworzone między spolaryzowanymi komórkami uniemożliwiają pasywną równowagę małych cząsteczek między przedziałami wierzchołkowymi i podstawnymi. Zmodyfikowany test równowagi fluorescencji sodu stosuje się w celu potwierdzenia polaryzacji trzech kultur pokrytych cieczą.Wraz ze wzrostem poziomu monowarstw calu trzykomórkowych i kultur płynnych, ilość fluoresceiny, która pasywnie równoważy się w przedziale podstawno-bocznym, zmniejsza się, przedstawiono tutaj skumulowane dane z czterech niezależnych eksperymentów, a każdy punkt danych reprezentuje indywidualny pomiar. Gdy rozdarcie wynosi 1000 posiadanych na centymetr kwadratowy, ilość fluoresceiny, która równoważy się z przedziałem podstawno-bocznym BA, jest mniejsza lub równa 1%Dlatego uważa się, że kultury pokryte cieczą calu trzy są w pełni spolaryzowane, gdy poziom jest większy lub równy 1000 posiadany na centymetr kwadratowy. Gdy poziom trzech kultur pokrytych cieczą osiągnie poziom 1000 lub powyżej 1000 centymetrów kwadratowych, model jest gotowy do wykorzystania do zbadania odpowiedzi komórek nabłonka dróg oddechowych na patogeny układu oddechowego, w tym syncytialny wirus oddechowy lub RSV, jak pokazano.W tym przykładzie narażenie na RSV reprezentowane na czerwono powoduje szybszy spadek spolaryzowanej kultury. Integralność w porównaniu z pozorowaną infekcją komórek reprezentowanych w niebieskich danych jest przedstawiona jako mediana oporności ośmiu niezależnych studzienek na infekcję, plus lub minus SEM na punkt czasowy. Gwiazdka oznacza P mniejsze niż 0,05 między dwiema zakażonymi kulturami pozorowanymi i RSVA, zgodnie z testem T-testu ucznia.Nie zapominaj, że podczas pracy z czynnikami zakaźnymi może to być niebezpieczne i podczas wykonywania tych procedur należy nosić odpowiednie środki ochrony osobistej i stosować dobre praktyki laboratoryjne.

establishing-liquid-covered-culture-polarized-human-airway-epithelial

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Immunologia i infekcje

Ustanowienie kultury pokrytej środkiem Liquid polaryzowanych ludzkich komórek nabłonkowych dróg oddechowych Calu-3 do badania reakcji komórek gospodarza na chorobotwórcze dróg oddechowych in vitro

Source: Montefusco-Pereira, C. V. et al. P. aeruginosa Infected 3D Co-Culture of Bronchial Epithelial Cells and Macrophages at Air-Liquid Interface for Preclinical Evaluation of Anti-Infectives. J. Vis. Exp.(2020)This video demonstrates a co-culture model of bronchial epithelial cells and macrophage-like cells at the air-liquid interface to study host-pathogen interactions. Pathogenic bacterial infection compromises epithelial membrane integrity, triggering macrophage-like cell activation and...

Establishing a Co-Culture Model to Study Host-Pathogen Interactions at the Air-Liquid Interface

Komórki nabłonka nosa, uzyskane poprzez powierzchowną biopsję zeskrobaną ludzkich ochotników, są rozszerzane i przenoszone do wkładek do hodowli tkankowych. Po osiągnięciu konfluencji komórki są hodowane na granicy faz powietrze-ciecz, dając kultury komórek rzęskowych i nierzęskowych. Zróżnicowane hodowle komórek nabłonka nosa dostarczają realnych modeli eksperymentalnych do badania błony śluzowej układu oddechowego.

Hodowla ludzkich komórek nabłonka nosa na granicy faz powietrza i cieczy

Opisujemy protokół dla trójwymiarowego modelu kohodowli zakażonych dróg oddechowych, wykorzystującego komórki CFBE41o, makrofagi THP-1 i Pseudomonas aeruginosa, ustalony na granicy powietrze-ciecz. Model ten zapewnia nową platformę do jednoczesnego testowania skuteczności antybiotyków, funkcji bariery nabłonkowej i markerów stanu zapalnego.

P. aeruginosa (P. aeruginosa) Zakażona kohodowla 3D komórek nabłonka oskrzeli i makrofagów na granicy faz powietrze-ciecz w celu przedklinicznej oceny środków przeciwinfekcyjnych

Opisana jest metoda hodowli komórkowej i ekspozycji modelu oskrzelowego in vitro dla realistycznej, powtarzającej się ekspozycji inhalacyjnej na cząstki do testów toksyczności.

Model nabłonka oskrzeli na granicy faz powietrze-ciecz do realistycznego, powtarzającego się narażenia inhalacyjnego na cząstki unoszące się w powietrzu do testów toksyczności

Ten protokół szczegółowo opisuje badanie wczesnych interakcji między wirusowo zakażonymi komórkami nabłonka nosa a aktywacją komórek wrodzonych. Poszczególne podzbiory komórek odpornościowych można rozróżnić na podstawie ich aktywacji w odpowiedzi na infekcje wirusowe. Następnie można je dalej badać w celu określenia ich wpływu na wczesne odpowiedzi przeciwwirusowe.

Bezkontaktowy model kohodowli do badania aktywacji wrodzonych komórek odpornościowych podczas infekcji wirusem układu oddechowego

Obecny protokół opisuje ludzkie indukowane pluripotencjalne komórki nabłonkowe typu 2 z pęcherzyków płucnych typu 2 (iAT2). Komórki te mogą być hodowane jako samoodnawiające się kulki w hodowli 3D lub przystosowane do hodowli na granicy faz powietrze-ciecz (ALI).

Generowanie sfer 3D i kultur 2D granicy faz powietrze-ciecz indukowanych przez człowieka pluripotencjalnych komórek nabłonka pęcherzyków płucnych typu 2 pochodzących z ludzkich komórek macierzystych

Ostatnie postępy w protokołach różnicowania ludzkich pluripotencjalnych komórek macierzystych pozwalają na stopniowe wyprowadzanie typów komórek specyficznych dla narządów. W tym miejscu przedstawiamy szczegółowe kroki dotyczące utrzymania i ekspansji komórek podstawnych dróg oddechowych pochodzących z iPSC oraz ich różnicowania w nabłonek śluzowo-rzęskowy w kulturach na granicy faz powietrze-ciecz.

Wytwarzanie kultur komórek nabłonka dróg oddechowych na granicy faz powietrze-ciecz z ludzkich pluripotencjalnych komórek macierzystych

Nabłonek nosa jest główną barierą, z którą spotykają się wszystkie patogeny układu oddechowego. W tym miejscu przedstawiamy metody wykorzystania pierwotnych komórek nabłonka nosa hodowanych jako kultury interfejsu powietrze-ciecz (ALI) w celu scharakteryzowania interakcji człowieka między koronawirusem a gospodarzem w fizjologicznie istotnym systemie.

Zakażenie pierwotnych komórek nabłonka nosa hodowanych na granicy faz powietrze-ciecz w celu scharakteryzowania interakcji między człowiekiem a koronawirusem

Przedstawiona tutaj jest powtarzalna, przystępna cenowo i solidna metoda izolacji i ekspansji pierwotnych komórek nabłonka oskrzeli do długoterminowego biobankowania i generowania zróżnicowanych komórek nabłonkowych przez hodowlę na granicy powietrze-ciecz.

Izolowanie komórek nabłonka oskrzeli z wyciętej tkanki płucnej w celu biobankowania i tworzenia dobrze zróżnicowanych kultur granicy faz powietrze-ciecz

Kultura interfejsu powietrze-ciecz jest powszechnie stosowana do tworzenia pseudostratyfikowanego nabłonka dróg oddechowych poprzez różnicowanie pierwotnych normalnych ludzkich komórek nabłonka oskrzeli, które naśladują wierzchołkową stronę drogi oddechowej płuc. W tym miejscu opisujemy prosty protokół określania jego jakości poprzez monitorowanie jego właściwości biofizycznych, takich jak funkcja rzęsek i integralność błony.

Określanie funkcji rzęsek i nieprzepuszczalności błony pseudostratyfikowanego nabłonka dróg oddechowych płuc

Ten artykuł opisuje generowanie złożonego, wielokomórkowego modelu bariery dróg oddechowych, składającego się z nabłonka płuc pochodzącego z indukowanych pluripotencjalnych komórek macierzystych (iPSC), mezenchymów, komórek śródbłonka i makrofagów w hodowli na granicy powietrza i cieczy.

Hodowla komórek nabłonkowych, mezenchymalnych, śródbłonkowych i odpornościowych pochodzących z iPSC w celu modelowania integralności bariery dróg oddechowych w zdrowiu i chorobie płuc

Poznaj metodę hodowli spolaryzowanych komórek nabłonka dróg oddechowych Calu-3 w systemie Transwell. Protokół obejmuje pomiar TEER i test fluoresceiny sodowej w celu oceny polaryzacji.

Ustanowienie pokrytej cieczą hodowli spolaryzowanych ludzkich komórek nabłonka nabłonka dróg oddechowych Calu-3 w celu zbadania odpowiedzi komórek gospodarza na patogeny układu oddechowego in vitro (Wideo) | JoVE Journal

Ustanowienie pokrytej cieczą hodowli spolaryzowanych ludzkich komórek nabłonka nabłonka dróg oddechowych Calu-3 w celu zbadania odpowiedzi komórek gospodarza na patogeny układu oddechowego in vitro

Przeglądaj więcej filmów