Platforma do produkcji kompleksu białkowego MultiBac w EMBL

Ogólnym celem tej procedury jest wytworzenie kompleksów białkowych przy użyciu systemu komórek owadów wirusa multi back baula. Osiąga się to poprzez najpierw wygenerowanie konstruktu wielogenowego, kodującego wybrany kompleks białkowy. Drugim krokiem jest stworzenie złożonego wirusa baula, który zawiera konstrukt wielogenowy poprzez transformację komórek bakteryjnych i badanie przesiewowe pod kątem prawidłowego powrotu środkowego.

Następnie wyizoluj genom wirusa baula i użyj go do infekowania komórek owadów na małą skalę na sześciodołkowej płytce po przetestowaniu produkcji białka. Wybrany kompleks białkowy jest wyrażany na większą skalę i oczyszczany. Ostatecznie oczyszczony kompleks białkowy jest wykorzystywany do odkrywania jego struktury i funkcji oraz potencjalnie do odkrywania leków.

Główne zalety tej techniki w porównaniu z istniejącymi systemami echowirusowymi są dwojakie. Kompleksy MultiPro mogą być produkowane z niespotykaną dotąd wydajnością. Ponadto wyprodukowany materiał jest znacznie wyższej jakości, ponieważ projektujemy echowirusa w celu uzyskania optymalnej produkcji białka.

Implikacje tej techniki wykraczają daleko poza podstawowe pytania biologiczne. Nasza platforma wieloworkowa została z powodzeniem wykorzystana do produkcji białek, które są obiecującymi nowymi kandydatami na szczepionki przeciwko różnym chorobom i katalizowania badań nad rakiem poprzez wytwarzanie kluczowych zestawów białek, które powodują wzrost guza. Ogólnie rzecz biorąc, osoby, które są nowe w tej metodzie, będą miały trochę problemów z procesami i potrzebą bezpłodności.

Dlatego bardzo ciężko pracowaliśmy nad ustanowieniem standardowych procedur operacyjnych, aby korzystanie z usług wielu banków było jak najłatwiejsze dla użytkowników niebędących specjalistami. Wizualna demonstracja tej metody ma kluczowe znaczenie, ponieważ kroki robota są znacznie łatwiejsze do zrozumienia, gdy proces jest pokazany w ruchu. Nie można tego wydobyć, patrząc tylko na protokoły, które są spisane, bez względu na to, jak szczegółowe.

Przed rozpoczęciem tej procedury ważne jest, aby dokładnie zaplanować strategię koekspresji. Zaleca się, aby eksperyment został najpierw zasymulowany. In silico.

Geny muszą być rozmieszczone na plazmidach akceptora i dawcy. Najlepiej sprawdza się grupowanie podjednostek, które mogą tworzyć podmoduły fizjologiczne. Ponieważ duże kompleksy mają wiele podjednostek białkowych, wiele genów musi być wyrażanych jednocześnie.

System multi back znacznie upraszcza klonowanie genów poprzez wykorzystanie zautomatyzowanych procedur do umieszczania genów w małych cząsteczkach progenitorowych DNA, które zawierają krótką sekwencję DNA zwaną zamkami P, która jest rozpoznawana przez enzym rekombinazy Cree. Te progenitory są następnie łączone w jednoetapowej reakcji poprzez dodanie prerekombinazy, która łączy wszystko, co ma miejsce lox P, w jeden duży plazmid DNA. Ten wielogenowy konstrukt jest następnie wprowadzany do genomu wirusa wielogrzbietowego bula.

Jeśli ma zostać wygenerowana duża liczba konstrukcji, zaleca się użycie skryptów robotycznych i stacji roboczej do obsługi cieczy. Stacja robocza wyposażona jest w odkurzacz do mini przygotowań i czyszczenia PCR, EEL do automatycznego załadunku próbek PCR. Termocykler do PCR i inkubacji stopni, wytrząsarka do komórek zawieszających resus i zimnych bloków.

W przypadku enzymów geny będące przedmiotem zainteresowania są wprowadzane do wybranych dawców i akceptorów za pomocą enzymów restrykcyjnych i ligazy lub alternatywnie, za pomocą metod niezależnych od ligacji, które walidują wszystkie konstrukty dawcy i akceptora, sklonowane przez mapowanie restrykcyjne i sekwencjonowanie. Kontynuuj rozproszone kombinacje akceptorów donorów za pomocą rekombinacji CRE LAX P w celu wygenerowania wybranych konstruktów ekspresji wielogenowej. Złożone konstrukty wielogenowe są weryfikowane za pomocą analitycznych reakcji PCR ze specjalnie zaprojektowanymi zestawami starterów.

Poniżej przedstawiono migawki procesu TR wspomaganego przez robota. Obejmują one przygotowanie reakcji PCR na płytkach wielodołkowych, dostarczenie matrycowego DNA i starterów, amplifikację DNA metodą PCR oraz przygotowanie konstruktów wielogenowych hodowanych w kulturze bakteryjnej przez lizę alkaliczną na płytkach wielodołkowych. Aby rozpocząć tę procedurę, należy zintegrować wielogenowe wektory transferowe z genomem wirusa wieloskładnikowego poprzez przekształcenie w komórki DH 10, zawierające genom wirusa i funkcje wymagane do transpozycji TN siódemki.

Po TN siedem komórek transpozycyjnych ze złożonym wirusem baula zawierającym interesujące geny jest wybieranych przez badanie przesiewowe w kolorze niebiesko-białym, a udana transpozycja TN siedem powoduje utratę komplementacji alfa beta galakto. Dlatego kolonie z prawidłową transpozycją TN seven pozostają białe na selektywnych APL zawierających xal. Przygotuj kultury bakteryjne z białych kolonii i wyizoluj backinę przez lizę alkaliczną i wytrącanie izopropanolu etanolowego.

Następnie transfekcja komórek owadów z oczyszczonym genomem wirusa bao pracująca w sterylnych podwielokrotnościach nasiennych kaptura komórek owadów SF 21 w fazie logarytmicznej na sześciodołkowej płytce do hodowli tkankowej. Do każdego z nich dobrze dodaj oczyszczony genom wirusa bao i odczynnik do transfekcji zmieszany z pożywką hodowlaną. Inkubować transfekowane komórki w temperaturze 27 stopni Celsjusza bez ruchu przez 48 do 60 godzin.

Po 48 do 60 godzinach zbierz początkowego wirusa lub V zero, usuwając pożywkę, uzupełnij świeżą pożywką i włóż płytkę z powrotem do inkubatora dwa do trzech dni później, przetestuj produkcję białka. A jeśli obecny jest marker YFP, przetestuj fluorescencję w celu amplifikacji wirusa. Użyj V zero, początkowego wirusa, aby zainfekować od 25 do 50 mililitrów komórek w fazie logarytmicznej w małych kolbach Erlenmeyera mieszanych na platformie orbitalnej.

Shaker liczy komórki i dzieli je co 24 godziny, aż przestaną się podwajać. Postępuj zgodnie z małą wielokrotnością infekcji lub schematem MOI, komórki muszą podwoić się co najmniej raz, w przeciwnym razie powtórz eksperyment z mniejszą objętością dodanego V zero. Zdjęcie po lewej stronie przedstawia niezakażone komórki owadów po zakażeniu wirusem multi back baula.

Zainfekowane komórki owadów przestały się namnażać i zwiększyły swój rozmiar, jak pokazano na obrazie po prawej stronie. Po 48 do 60 godzinach zbierz V jednego wirusa przez granulowanie komórek. Usuń i przechowuj nośnik zawierający wirusa.

Resus zawiesić komórki za pomocą świeżej pożywki i przenieść je z powrotem do kolby Erlenmeyera. Usuwać od 10 do sześciu komórek co 12 lub 24 godziny przez granulowanie i testować produkcję białka i sygnał białka markerowego, jeśli pożądane są większe objętości ekspresji. Dalsze namnażanie wirusa poprzez infekowanie do 400 mililitrów komórek w dwulitrowych kolbach wytrząsarki wirusem V.

Zgodnie ze schematem niskiego MOI, zdecydowanie zalecamy, aby wirus V one był przechowywany jako wirus produkcyjny przy użyciu komórek owadów zakażonych wirusem umięśnionym lub metod VIC, aby zapobiec modyfikacjom rekombinowanego wirusa i zachować wysoki poziom ekspresji. 24 godziny po zatrzymaniu proliferacji obserwuje się komórki zakażone osadkami. Na tym etapie komórki zawierają kompletne cząsteczki wirusa tuż przed ich uwolnieniem do pożywki.

Usunąć pożywkę, ponownie zawiesić osad komórkowy w roztworze zamrażającym i przeprowadzić zamrażanie BIIC w krioprobówkach do produkcji białka. Użyj podwielokrotności V, jeden, V, dwa lub zamrożone podwielokrotności BIC, aby zainfekować większe kultury komórkowe. Zazwyczaj 400 mililitrów w dwulitrowych kolbach przestrzega reżimu niskiego MOI.

Dostosowanie objętości wirusa użytego do infekcji w taki sposób, aby zakażona kultura podwoiła się co najmniej raz. Jeśli obecne jest białko markerowe YFP, należy pobrać jedną porcję razy 10 do sześciu komórek w określonych odstępach czasu, poddać sonikacji i odwirować komórki, a następnie przenieść na 96-dołkową płytkę, zmierzyć poziomy YFP w standardowym 96-dołkowym czytniku płytkowym zdolnym do rejestrowania sygnałów fluorescencyjnych, monitorować ewolucję sygnału YFP, aż do osiągnięcia plateau, wskazujące na maksymalną produkcję białka rekombinowanego. Na tym etapie należy zebrać komórki, przechowywać granulki komórkowe w temperaturze minus 20 stopni Celsjusza przez krótki czas lub minus 80 stopni Celsjusza przez długi czas, komórki powinny być kłamane metodą dostosowaną do wymagań białka, a następnie cytozolu i jąder.

Frakcjonowane białka jądrowe zwykle znajdują się w pastylce jądrowej. Podczas gdy białka cytozolowe pozostają w cytozolu. Oczyszczanie białek jest znacznie uproszczone przez frakcjonowanie.

Ponieważ wiele zanieczyszczeń można usunąć w jednym etapie wirowania. Kompleksy białkowe można wygodnie oczyszczać z początkowych kultur komórkowych na małą skalę, wykorzystując zminiaturyzowane metody oczyszczania, takie jak oczyszczanie wielodołkowe lub oparte na mikrokońcówkach. W połączeniu z systemami chromatografii małoobjętościowej, takimi jak ACTA micro, przyszłym krokiem będzie miniaturyzacja i zintegrowanie całego zestawu eksperymentalnego z małą aplikacją stołową, która jest połączona ze stacją roboczą do klonowania.

Na zdjęciu przedstawiono obecnie opracowywanego robota wsadowego w mikroskali, który będzie wykorzystywany do tego celu. Silną koekspresję białek heterologicznych osiąga się za pomocą systemu multi back, jak pokazano tutaj. Nadekspresja białka jest wyraźnie zauważalna w ekstrakcie z całych komórek, WCE i oczyszczonym lizacie.

Jakość i ilość wyprodukowanego materiału białkowego jest często wystarczająca. Umożliwia ustrukturyzowane oznaczanie kompleksów białkowych, takich jak kompleks mitotycznych punktów kontrolnych MCC pokazany na tym diagramie. Często wydajność tych analitycznych serii oczyszczania jest wystarczająca do analizy struktury i funkcji oczyszczonego kompleksu za pomocą różnych środków, w tym mikroskopii elektronowej.

Opracowane przez nas standardowe procedury operacyjne pozwalają użytkownikom niebędącym specjalistami z łatwością zastosować nasze podejście, a nasza technologia może być stosowana w wielu laboratoriach zainteresowanych dużymi kompleksami białkowymi, podobnie jak ma to miejsce obecnie w przypadku małych białek w Nikoli. Po obejrzeniu tego filmu powinieneś dobrze zrozumieć, jak używać wielu worków, aby wyprodukować interesujące Cię kompleksy białkowe w niezrównanej ilości i jakości dla Twoich ambitnych celów badawczych. Praca z naszymi systemami nie wymaga specjalnych warunków bezpieczeństwa.

Pamiętaj jednak, że wirus zainfekuje cię, jeśli będziesz niechlujny, nawet jeśli nie będzie się replikował w twoich komórkach. W związku z tym, ostrożne obchodzenie się z warunkami sterydowymi jest koniecznością podczas wykonywania tej procedury. Nasza metoda stała się dość popularna już w ponad 600 laboratoriach na całym świecie.

Skorzystaj z naszej techniki. Wierzymy, że w przyszłości nasza metoda stanie się integralną częścią zakrojonych na szeroką skalę działań w zakresie genomiki strukturalnej, które dotyczą strefy kompleksu ludzkiego. Może to pomóc w ujawnieniu podstaw chorób, a w dłuższej perspektywie doprowadzić do opracowania nowych i lepszych leków i terapii.