Name: Platforma do produkcji kompleksu białkowego MultiBac w EMBL (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-07-11T12:00:00.000+00:00
Duration: 13 min 51 s
Description: Poznaj produkcję kompleksów białkowych za pomocą systemu MultiBac w komórkach owadzich. Ta metoda umożliwia ekspresję i oczyszczanie białek eukariotycznych do badań strukturalnych oraz odkrywania leków.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Dziękujemy Christophowi Bieniossekowi, Simonowi Trowitzschowi, Danielowi Fitzgeraldowi, Yuichiro Takagi, Christiane Schaffitzel, Yvonne Hunziker, Timothy'emu Richmondowi i wszystkim byłym i obecnym członkom laboratorium Bergera za pomoc i rady. Platforma MultiBac i jej rozwój były i są hojnie wspierane przez agencje finansujące, w tym Szwajcarską Narodową Fundację Nauki (SNSF), Agence National de Recherche (ANR) i Centre National de Recherche Scientifique (CNRS) oraz Komisję Europejską (KE) w ramach programów ramowych (6PR) i 7. Wsparcie dla dostępu międzynarodowego zapewniają projekty KE 7PR P-CUBE (<a href="http://www.p-cube.eu" target="_blank">www.p-cube.eu</a>) i BioStruct-X (<a href="http://www.biostruct-x.eu" target="_blank">www.biostruct-x.eu</a>). Francuskie Ministerstwo Nauki jest szczególnie cenione za wspieranie platformy MultiBac w EMBL poprzez projekt Investissement d'Avenir FRISBI.

1. Rekombinacja tandemowa (TR) do tworzenia wielogenowych konstruktów ekspresji 
<ol>
 <li>Planowanie strategii współwyrażania. Podejście do projektowania wprowadzania interesujących Cię genów do dawców i akceptantów. Potencjalne fizjologiczne podmoduły Twojego kompleksu powinny być zgrupowane według konkretnych Akceptorów i Dawców. Użyj modułu mnożenia składającego się z par endonukleazy samonaprowadzającej (HE) - BstXI, aby połączyć kasety ekspresyjne na poszczególnych plazmidach donorowych i akceptorowych. 7,8 Stwórz wszystkie istotne konstrukty in silico i dokładnie zweryfikuj strategię przed przystąpieniem do prac eksperymentalnych. Na przykład, geny będące przedmiotem zainteresowania powinny być sprawdzane, aby nie zawierały HE lub innych miejsc restrykcyjnych, a obecność prawidłowych otwartych ramek odczytu (ORF) powinna zostać zweryfikowana. Rozważ zamówienie syntetycznych genów zoptymalizowanych pod kątem wykorzystania kodonów w komórkach owadów i struktury drugorzędowej mRNA, aby poprawić poziom produkcji białek, a także usunąć wszelkie istniejące miejsca HE z genów będących przedmiotem zainteresowania. Rozważ umieszczenie znaczników oczyszczania w oparciu o dane z literatury na temat elastycznych lub odsłoniętych N- lub C-końców wybranych białek. Rozważ zastosowanie strategii polibiałkowych, które mają na celu wytworzenie kilku podjednostek białkowych w twoim kompleksie, jeśli względne ilości poszczególnych białek muszą być kontrolowane ze względu na problemy ze stechiometrią w kompleksie. 4 Przygotowanie szczegółowego dokumentu "Jak to zrobić" (zalecana jest elektroniczna książka laboratoryjna) zawierającego wszystkie przewidywane etapy eksperymentalne projektu prowadzące do kompletnego konstruktu wielogenowego. Twórz elektroniczne pliki plazmidów ze stopionymi plazmidami Cre-LoxP, na przykład za pomocą oprogramowania Cre-ACEMBLER, które można pobrać ze strony domowej grupy Berger (<a href="http://www.embl.fr/multibac/%20multiexpression_technologies/cre-acembler" target="_blank">www.embl.fr/multibac/ multiexpression_technologies/cre-acembler</a>).</li>
 <li>Wstaw interesujące Cię geny do wybranych dawców i akceptorów za pomocą enzymów restrykcyjnych i ligazy lub, alternatywnie, za pomocą metod niezależnych od ligacji, zgodnie z opublikowanymi protokołami. 5,6,14 Jeśli masz dostęp do stanowiska pracy do obsługi cieczy i planujesz generowanie dużej liczby konstrukcji (na przykład dla podejść kombinatorycznych), rozważ użycie skryptów robotycznych opracowanych i wdrożonych przez grupę Berger (rysunek 2). 14,15 Jeśli stanowisko pracy do pracy z cieczami nie jest dostępne, ręczna obsługa za pomocą płytek do mikromiareczkowania umożliwia wprowadzenie genu w sposób podobny do HT.</li>
 <li>Ograniczenia wynikające z konieczności kontroli stechiometrii wyrażonych podjednostek mogą się zmaterializować. W przypadku niezrównoważonych stechiometrycznie poziomów ekspresji poszczególnych podjednostek kompleksu białkowego, należy rozważyć zastosowanie strategii polibiałkowych w celu połączenia kilku podjednostek kompleksu i określonej proteazy (na przykład proteazy NIa wirusa wytrawiania tytoniu) w pojedynczych dużych ORF oddalonych od siebie o określone miejsca proteolityczne. 4,8 Rozważ jednoczesną ekspresję jednego lub kilku poliprotein z kasetami o pojedynczej ekspresji, jeśli masz bardzo duży kompleks z wieloma podjednostkami i szeroko rozgałęzionymi masami cząsteczkowymi poszczególnych podjednostek. Rozważ jednoczesną ekspresję kilku genów kodujących to samo białko w poliproteinie lub jako kilka identycznych kaset ekspresji, jeśli białko to charakteryzuje się niską wydajnością produkcji. Kategoria 4,13 </li>
 <li>Zweryfikuj wszystkie konstrukcje dawcy i akceptora sklonowane przez mapowanie ograniczeń (opcjonalnie w wysokiej przepływności) i sekwencjonowanie. Przystąp do fuzji kombinacji dawca-akceptor za pomocą rekombinacji Cre-LoxP w celu wygenerowania wybranych konstruktów ekspresji wielogenowej. Walidacja oczyszczonych plazmidów fuzyjnych akceptor-dawca poprzez mapowanie restrykcji, użycie sekwencji elektronicznych utworzonych przez Cre-ACEMBLER lub podobne programy jako odniesienie.</li>
 <li>Oczyszczone i zwalidowane fuzje Dawcy, Akceptory i Dawca-Akceptor przechowuj w temperaturze -20 °C lub -80 °C. Starannie archiwizuj plazmidy i ich sekwencje (Microsoft Excel, Filemaker, inne) do późniejszego wykorzystania.</li>
</ol>
2. Generowanie, amplifikacja i przechowywanie złożonego wielogenowego bakulowirusa
<ol>
 <li>Zintegruj wielogenowe wektory transferowe genomu bakulowirusa MultiBac poprzez przekształcenie w komórki DH10 zawierające genom wirusa i funkcje wymagane do transpozycji Tn7. Należy zauważyć, że genom bakulowirusa Multibac może być wstępnie załadowany określonymi genami będącymi przedmiotem zainteresowania (marker YFP, białka opiekuńcze itp.) we własnym miejscu LoxP (zmodyfikowanym w genomie dystalnie do miejsca przyłączenia Tn7) przez reakcję Cre in vivo poprzedzającą integrację Tn7. 13 Po transpozycji Tn7 komórki ze złożonym bakulowirusem zawierającym interesujące geny są selekcjonowane przez niebiesko-białe badanie przesiewowe (udana transpozycja Tn7 powoduje utratę α-komplementacji β-galaktozydazy; dlatego kolonie z prawidłową transpozycją Tn7 pozostają białe na selektywnych płytkach agarowych zawierających X-gal), a genom jest przygotowywany przez lizę alkaliczną i wytrącanie etanolu/izopropanolu. 5,6</li> TGL
 <li>Transfekcja i początkowa produkcja wirusa. Umieścić 6-dołkową płytkę do hodowli tkankowej w sterylnym kapturze. Z hodowli komórek owadów Sf21 w fazie logarytmicznej wysadzić podwielokrotności komórek w studzienkach i dokonać transfekcji, dodając oczyszczony genom bakulowirusa i odczynnik do transfekcji zmieszany z pożywką hodowlaną, jak opisano. 6 Pobrać początkowego wirusa po 48-60 godzinach, usuwając pożywkę (wirus V0 o niskiej jakości, zwykle 3 ml na studzienkę). Uzupełnij świeżą pożywkę i przetestuj produkcję białka (i, jeśli obecny jest marker YFP, fluorescencję) po dodatkowych 2-3 dniach. 6,7 </li>
 <li>Amplifikacja wirusa, niski schemat MOI. Użyj wirusa V0, aby zainfekować 25-50 ml komórek w fazie logarytmicznej (gęstość komórek <1x106 komórek na ml) w małych (100-250 ml) kolbach Erlenmeyera mieszanych na wytrząsarkach platformy orbitalnej (ryc. 3). Policz komórki i dziel je co 24 godziny, aż komórki przestaną się podwajać (zatrzymanie proliferacji). Postępuj zgodnie ze schematem niskiego MOI (mnogość infekcji, tj. liczba cząstek wirusa na komórkę): Komórki muszą podwoić się (co najmniej) raz (MOI < 1), w przeciwnym razie powtórz eksperyment z dodaną mniejszą objętością V0. Zwykle 3 ml V0 są używane do zakażenia 25 ml komórek owadów Sf21 o gęstości 0,5x106 komórek / ml. Jest to niezbędne, aby zapobiec szkodliwej nadmiernej amplifikacji i autodelecji wirusa, które mogą skutkować utratą interesujących nas heterologicznych genów. Zebrać wirusa V1 (25-50 ml) po 48-60 godzinach, osadzając komórki i usuwając pożywkę zawierającą wirusa. Uzupełnij świeżą pożywką i przetestuj YFP i produkcję białka, usuwając1x10 6 komórek co 12 lub 24 godziny, granulując i walidując produkcję białka i sygnał białka markerowego (YFP). 6, Amplifikować wirusa (do V2) dalej, jeśli dąży się do większych objętości ekspresji poprzez zakażenie do 400 ml komórek w 2 litrowych kolbach wytrząsarskich wirusem V1 przestrzegającym powyższego schematu niskiego MOI (komórki muszą podwoić się co najmniej raz po zakażeniu V1). Rygorystycznie testuj produkcję białek i sygnał białka markerowego podczas amplifikacji, aby uniknąć akumulacji wadliwych wirusów, które nie zawierają już interesujących Cię genów. 5-7 Użyj osadów komórkowych gromadzących się na każdym etapie amplifikacji już w celu ustalenia protokołów oczyszczania dla eksprymowanego kompleksu białkowego będącego przedmiotem zainteresowania.</li>
 <li>Przechowywanie wirusa produkcyjnego BIIC. Zdecydowanie zalecamy przechowywanie wirusa V2 jako wirusa produkcyjnego przy użyciu metody BIIC (Baculovirus-i nfected insect cells), aby zapobiec modyfikacjom (np. utracie interesującego genu) rekombinowanego wirusa i zachować wysokie poziomy ekspresji. 16 Komórki zakażone osadkami obserwuje się 24 godziny po zatrzymaniu proliferacji - na tym etapie komórki zawierają kompletne cząsteczki wirusa tuż przed ich uwolnieniem (przez pączkowanie) do pożywki. Usunąć pożywkę i zamrozić porcje osadu komórkowego w ciekłym azocie i przechowywać przez czas nieokreślony. 7,16</li>
</ol>
3. Produkcja i przetwórstwo białek
<ol>
 <li>Infekowanie dużych kultur i monitorowanie YFP. Użyć podwielokrotności V1, V2 lub zamrożonych BIIC do infekowania większych kultur komórkowych w seriach produkcyjnych (zwykle 400 ml w kolbach o pojemności 2 l). Przestrzegaj schematu niskiego MOI (dostosuj objętość wirusa używaną do infekcji tak, aby zakażona hodowla podwoiła się co najmniej raz). W razie potrzeby powiększyć objętości zainfekowanych kultur, mnożąc liczbę kolb. Jeśli obecne jest białko markerowe YFP, należy wycofać w określonych odstępach czasu6 komórek, osadów i komórek lizujących oraz monitorować ewolucję sygnału YFP, aż do osiągnięcia plateau wskazującego na maksymalną produkcję białka rekombinowanego. Poziomy YFP można mierzyć w standardowym 96-dołkowym czytniku płytek zdolnym do rejestrowania sygnałów fluorescencyjnych (np. Tecan SPECTRAFluor). Na tym etapie zbierz komórki. Przechowuj granulki komórkowe w temperaturze -20 °C (krótkoterminowo) lub -80 °C (długoterminowo).</li>
 <li>Liza i frakcjonowanie komórek. Lizuj komórki ulubioną metodą z wyboru, dostosowaną do wymagań Twojego białka (zamrażanie-rozmrażanie, sonikacja, French Press, inne). 5-7 Frakcjonuj cytozol i jądra i przetestuj obecność interesujących Cię białek. Opracuj protokoły oczyszczania w oparciu o wyniki, aby uprościć oczyszczanie białek. Rozważ zastosowanie procedur namaczania w celu ekstrakcji białka z frakcji jądrowej w warunkach wysokiego KCl, jeśli białka znajdują się w jądrze. 7,18</li>
 <li>Oczyszczanie białek (mikroskala, duża skala). Należy pamiętać, że często małe objętości (10 lub 25 ml) hodowli komórkowej są wystarczające do uzyskania granulek komórkowych do oczyszczania znacznych ilości interesujących Cię białek ze względu na zazwyczaj wysoki lub bardzo wysoki poziom produkcji białek heterologicznych w systemach komórkowych bakulowirusa / owadów (często 10-100 mg białka na kulturę L i więcej). W połączeniu z mikrooczyszczaniem (płytki wielodołkowe, metody mikrokońcówek, system GE Healthcare ÄKTAmicro, inne) możliwe jest uzyskanie danych biochemicznych i aktywnych, a często także wystarczającej ilości pożądanych białek i kompleksów do wysokoprzepustowej krystalizacji w skali nanolitrów (HTX). Rozważ użycie oczyszczania powinowactwa do metali (Clonetech Takara TALON, żywice chelatatorowe metali Qiagen NiNTA) i znacznika oligo-histydyny (6-10 reszt) na odsłoniętych podjednostkach kompleksu białkowego, aby ułatwić oczyszczanie, w połączeniu z chromatografią wymiany jonowej i wykluczania wielkości w małych objętościach, na przykład przy użyciu ÄKTAmicro lub podobnej maszyny do oczyszczania o małej objętości (Rysunek 4). Inne etapy oczyszczania powinowactwa i etapy wymiany jonowej (IEX) oprócz oczyszczania powinowactwa za pomocą znaczników oligohistydyny lub innych znaczników (do wyboru GST, MBP, CBP, inne) mogą i powinny być brane pod uwagę, zgodnie z właściwościami biochemicznymi interesujących białek i indywidualnymi preferencjami. Rozważ oznaczenie więcej niż jednej podjednostki znacznikami powinowactwa, aby zwiększyć wydajność oczyszczania. Skoncentruj oczyszczone kompleksy białkowe i ustal protokoły przechowywania, takie jak zamrażanie z glicerolem lub bez. Opracuj kryteria kontroli jakości, które mogą być stosowane standardowo (testy aktywności, testy biochemiczne i biofizyczne) w celu oceny zmienności oczyszczonych białek między partiami.</li>
</ol>

<ol><li>Nie, Y., Viola, C., Bieniossek, C., Trowitzsch, S., Vijay-Achandran, L. S., Chaillet, M., Garzoni, F., Berger, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Getting+a+Grip+on+Complexes%5BTitle%5D)+AND+%22Curr.+Genomics%22%5BJournal%5D)">Getting a Grip on Complexes.</a> Curr. Genomics. 10 (8), 558-572 (2009).</li>
<li>Robinson, C. V., Sali, A., Baumeister, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+molecular+sociology+of+the+cell%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">The molecular sociology of the cell.</a> Nature. 450 (7172), 973-982 (2007).</li>
<li>Kost, T. A., Condreay, J. P., Jarvis, D. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Baculovirus+as+versatile+vectors+for+protein+expression+in+insect+and+mammalian+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Baculovirus as versatile vectors for protein expression in insect and mammalian cells.</a> Nat. Biotechnol. 23 (5), 567-575 (2005).</li>
<li>Bieniossek, C., Imasaki, T., Takagi, Y., Berger, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MultiBac%3A+expanding+the+research+toolbox+for+multiprotein+complexes%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+Biochem.+Sci%22%5BJournal%5D)">MultiBac: expanding the research toolbox for multiprotein complexes.</a> Trends Biochem. Sci. 37 (2), 49-57 (2012).</li>
<li>Fitzgerald, D. J., Berger, P., Schaffitzel, C., Yamada, K., Richmond, T. J., Berger, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protein+complex+expression+by+using+multigene+baculoviral+vectors%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Methods%22%5BJournal%5D)">Protein complex expression by using multigene baculoviral vectors.</a> Nat. Methods. 3 (12), 1021-1032 (2006).</li>
<li>Bieniossek, C., Richmond, T. J., Berger, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MultiBac%3A+multigene+baculovirus-based+eukaryotic+protein+complex+production%5BTitle%5D)+AND+%22Curr.+Protoc.+Protein+Sci%22%5BJournal%5D)">MultiBac: multigene baculovirus-based eukaryotic protein complex production.</a> Curr. Protoc. Protein Sci. Chapter 5, Unit 5.20(2008).</li>
<li>Trowitzsch, S., Bieniossek, C., Nie, Y., Garzoni, F., Berger, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((New+baculovirus+expression+tools+for+recombinant+protein+complex+production%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Struct.+Biol%22%5BJournal%5D)">New baculovirus expression tools for recombinant protein complex production.</a> J. Struct. Biol. 172 (1), 45-54 (2010).</li>
<li>Vijayachandran, L. S., Viola, C., Garzoni, F., Trowitzsch, S., Bieniossek, C., Chaillet, M., Schaffitzel, C., Busso, D., Romier, C., Poterszman, A., Richmond, T. J., Berger, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Robots%2C+pipelines%2C+polyproteins%3A+enabling+multiprotein+expression+in+prokaryotic+and+eukaryotic+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Struct.+Biol%22%5BJournal%5D)">Robots, pipelines, polyproteins: enabling multiprotein expression in prokaryotic and eukaryotic cells.</a> J. Struct. Biol. 175 (2), 198-208 (2011).</li>
<li>Thomas, M. C., Chiang, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+general+transcription+machinery+and+general+cofactors%5BTitle%5D)+AND+%22Crit.+Rev.+Biochem.+Mol.+Biol%22%5BJournal%5D)">The general transcription machinery and general cofactors.</a> Crit. Rev. Biochem. Mol. Biol. 41 (3), 105-178 (2006).</li>
<li>Klinge, S., Voigts-Hoffmann, F., Leibundgut, M., Ban, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Atomic+structures+of+the+eukaryotic+ribosome%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+Biochem.+Sci%22%5BJournal%5D)">Atomic structures of the eukaryotic ribosome.</a> Trends Biochem. Sci. 37 (5), 189-198 (2012).</li>
<li>Melnikov, S., Ben-Shem, A., Garreau de Loubresse, N., Jenner, L., Yusupova, G., Yusupov, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((One+core%2C+two+shells%3A+bacterial+and+eukaryotic+ribosomes%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Struct.+Mol.+Biol%22%5BJournal%5D)">One core, two shells: bacterial and eukaryotic ribosomes.</a> Nat. Struct. Mol. Biol. 19 (6), 560-567 (2012).</li>
<li>Cramer, P., Bushnell, D. A., Fu, J., Gnatt, A. L., Maier-Davis, B., Thompson, N. E., Burgess, R. R., Edwards, A. M., David, P. R., Kornberg, R. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Architecture+of+RNA+polymerase+II+and+implications+for+the+transcription+mechanism%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Architecture of RNA polymerase II and implications for the transcription mechanism.</a> Science. 288 (5466), 640-649 (2000).</li>
<li>Berger, I., Fitzgerald, D. J., Richmond, T. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Baculovirus+expression+system+for+heterologous+multiprotein+complexes%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Baculovirus expression system for heterologous multiprotein complexes.</a> Nat. Biotechnol. 22 (12), 1583-1587 (2004).</li>
<li>Bieniossek, C., Nie, Y., Frey, D., Olieric, N., Schaffitzel, C., Collinson, I., Romier, C., Berger, P., Richmond, T. J., Steinmetz, M. O., Berger, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Automated+unrestricted+multigene+recombineering+for+multiprotein+complex+production%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Methods%22%5BJournal%5D)">Automated unrestricted multigene recombineering for multiprotein complex production.</a> Nat. Methods. 6 (6), 447-450 (2009).</li>
<li>Nie, Y., Bieniossek, C., Frey, D., Olieric, N., Schaffitzel, C., Steinmetz, M. O., Berger, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((ACEMBLing+multigene+expression+constructs+by+recombineering%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Protocols%22%5BJournal%5D)">ACEMBLing multigene expression constructs by recombineering.</a> Nat. Protocols. , (2009).</li>
<li>Wasilko, D. J., Lee, S. E., Stutzman-Engwall, K. J., Reitz, B. A., Emmons, T. L., Mathis, K. J., Bienkowski, M. J., Tomasselli, A. G., Fischer, <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((H.D.+titerless+infected-cells+preservation+and+scale-up+%28TIPS%29+method+for+large-scale+production+of+NO-sensitive+human+soluble+guanylate+cyclase+%28sGC%29+from+insect+cells+infected+with+recombinant+baculovirus%5BTitle%5D)+AND+%22Protein+Expr.+Purif%22%5BJournal%5D)">H.D. titerless infected-cells preservation and scale-up (TIPS) method for large-scale production of NO-sensitive human soluble guanylate cyclase (sGC) from insect cells infected with recombinant baculovirus.</a> Protein Expr. Purif. 65 (2), 122-132 (2009).</li>
<li>Chao, W. C., Kulkarni, K., Zhang, Z., Kong, E. H., Barford, <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structure+of+the+mitotic+checkpoint+complex%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Structure of the mitotic checkpoint complex.</a> Nature. 484 (7393), 208-213 (2012).</li>
<li>Yamada, K., Frouws, T. D., Angst, B., Fitzgerald, D. J., DeLuca, C., Schimmele, K., Sargent, D. F., Richmond, T. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structure+and+mechanism+of+the+chromatin+remodelling+factor+ISW1a%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Structure and mechanism of the chromatin remodelling factor ISW1a.</a> Nature. 472 (7344), 448-453 (2011).</li>
</ol>

IB jest wynalazcą patentów i zgłoszeń patentowych szczegółowo opisujących części opisanej tutaj technologii.

Zrzuty wideo na rysunkach 2 i 3 ilustrują cały proces, od wspomaganego przez robota generowania z cDNA wielogenowych konstruktów ekspresyjnych, aż po infekcję kultur komórek owadów w celu produkcji białka. Opracowano nowe odczynniki (plazmidy i wirusy) oraz solidne protokoły, aby umożliwić proces oparty na standardowych procedurach operacyjnych. Cały rurociąg został wdrożony jako technologia platformowa w EMBL w Grenoble. Z platformy MultiBac korzysta wielu naukowców ze środowisk akademi...

Aktywność biologiczna jest kontrolowana przez zespoły białek i innych biomolekuł, które działają wspólnie, katalizując funkcje komórkowe. Godnymi uwagi przykładami są maszyneria, która transkrybuje dziedziczną informację zawartą w DNA na informacyjny RNA. U ludzi ponad 100 białek łączy się w zdefiniowanym i regulowanym procesie transkrypcji genów, tworząc duże kompleksy wielobiałkowe z 10 i więcej podjednostkami, w tym polimerazą RNA II i ogólnymi czynnikami transkrypcyjnymi, takimi jak TFIID, TFIIH i inne. 9 Innymi przykładami są rybosom, składający się z wielu białek i cząsteczek RNA, który katalizuje syntezę białek, lub kompleks porów jądrowych, który jest odpowiedzialny za przenoszenie biomolekuł przez otoczkę jądrową u eukariontów. Szczegółowa analiza architektoniczna i biochemiczna zasadniczo wszystkich wieloskładnikowych maszyn w komórce jest niezbędna do zrozumienia ich funkcji. Na przykład wyjaśnienie struktury rybosomów prokariotycznych i eukariotycznych stanowiło przełomowe wydarzenia dające bezprecedensowy wgląd w to, w jaki sposób te makromolekularne maszyny wykonują wyznaczone im funkcje w komórce. 10,11
Rybosomy można uzyskać w wystarczającej jakości i ilości do szczegółowych badań poprzez oczyszczanie endogennego materiału z hodowanych komórek, ze względu na fakt, że do 30% masy komórkowej składa się z rybosomów. Polimeraza RNA II jest już mniej obfita o rzędy wielkości, a wiele tysięcy litrów kultur drożdży musiało zostać przetworzonych, aby uzyskać szczegółowy obraz atomowy tego niezbędnego kompleksu kluczowego dla transkrypcji. 12 Przytłaczająca większość innych niezbędnych kompleksów jest jednak obecna w znacznie mniejszych ilościach w komórkach natywnych, a zatem nie może być odpowiednio oczyszczona z rodzimego materiału źródłowego. Udostępnienie takich kompleksów do szczegółowej analizy strukturalnej i funkcjonalnej wymaga produkcji heterologicznej przy użyciu technik rekombinowanych.
Produkcja białek rekombinowanych miała duży wpływ na badania w dziedzinie nauk przyrodniczych. Wiele białek wyprodukowano w sposób rekombinowany, a ich strukturę i funkcję przeanalizowano w wysokiej rozdzielczości. Programy genomiki strukturalnej wykorzystały wyjaśnienie genomów wielu organizmów do zajęcia się repertuarem produktów genowych całych organizmów w trybie wysokoprzepustowym (HT). W ten sposób określono tysiące struktur białkowych. Do tej pory najpowszechniej stosowanym systemem do produkcji rekombinowanych białek była E. coli, a na przestrzeni lat opracowano i udoskonalono wiele systemów ekspresji do produkcji heterologicznej w tym gospodarzu. Plazmidy kryjące w sobie mnóstwo funkcji umożliwiających produkcję białek u E. coli wypełniają całe katalogi komercyjnych dostawców.
Jednakże, E. coli ma pewne ograniczenia, które sprawiają, że nie nadaje się do produkcji wielu białek eukariotycznych, a w szczególności kompleksów białkowych z wieloma podjednostkami. Dlatego produkcja białka w gospodarzach eukariotycznych staje się w ostatnich latach coraz częściej wybieraną metodą. Szczególnie dobrze nadającym się systemem do produkcji białek eukariotycznych jest system wektorów ekspresyjnych bakulowirusa (BEVS), który opiera się na rekombinowanym bakulowirusie przenoszącym heterologiczne geny w celu infekowania kultur komórek owadów hodowanych w laboratorium. System MultiBac jest niedawno opracowanym BEVS, który jest specjalnie dostosowany do produkcji eukariotycznych kompleksów białkowych z wieloma podjednostkami (ryc. 1). MultiBac został po raz pierwszy wprowadzony na rynek w 2004 roku. 13 Od momentu wprowadzenia na rynek, MultiBac jest stale udoskonalany i usprawniany w celu uproszczenia obsługi, poprawy jakości docelowego białka i ogólnego udostępnienia systemu użytkownikom niebędącym specjalistami poprzez opracowanie skutecznych standardowych procedur operacyjnych (SOP). 4 MultiBac został wdrożony w wielu laboratoriach na całym świecie, w środowisku akademickim i przemyśle. Na EMBL w Grenoble Komisja Europejska wdrożyła ponadnarodowe programy dostępu, aby zapewnić szkolenia eksperckie na platformie MultiBac dla naukowców, którzy chcieliby wykorzystać ten system produkcji do rozwoju swoich badań. Struktura i funkcja wielu kompleksów białkowych, które do tej pory były niedostępne, została wyjaśniona na podstawie próbek wytworzonych za pomocą MultiBac. 4 Poniżej podsumowano podstawowe etapy produkcji MultiBac w protokołach obowiązujących w zakładzie MultiBac w EMBL Grenoble.

<table><tbody><tr><td>Bluo-Gal</td><td>Invitrogen</td><td>15519-028 (1 g)</td><td></td></tr><tr><td>Tetracyklina</td><td>Euromedex</td><td>UT2965-B (25 g)</td><td>1,000X przy 10 mg/ml</td></tr><tr><td>Kanamycine</td><td>Euromedex</td><td>EU0420 (25 g)</td><td>1,000X przy 50 mg/ml</td></tr><tr><td>Gentamycine</td><td>SIGMA</td><td>G3632 (5 g)</td><td>1,000X przy 10 mg/ml</td></tr><tr><td>IPTG</td><td>Euromedex</td><td>EU0008-B (5 g)</td><td>1,000X przy 1M</td></tr><tr><td>Cre-rekombinaza</td><td>New England BioLabs</td><td>M0298</td><td></td></tr><tr><td>Odczynnik do transfekcji X-Treme GENE HP</td><td>Roche</td><td>06 366 236 001</td><td></td></tr><tr><td>Hyclone SFM4 Insect</td><td>Thermo Scientific</td><td>SH 30913.02</td><td></td></tr><tr><td>Płytka 6-dołkowa Falcon</td><td>Dominique Dutscher</td><td>353046</td><td></td></tr><tr><td>Pipeta 2 ml Falcon</td><td>Dominique Dutscher</td><td>357507</td><td></td></tr><tr><td>5 ml pipeta Falcon</td><td>Dominique Dutscher</td><td>357543</td><td></td></tr><tr><td>Pipeta 10 ml Falcon</td><td>Dominique Dutscher</td><td>357551</td><td></td></tr><tr><td>Pipeta 25 ml Falcon</td><td>Dominique Dutscher</td><td>357535</td><td></td></tr><tr><td>Rurka 50 ml Falcon</td><td>Dominique Dutscher</td><td>357550</td><td></td></tr><tr><td>Tubka 50 ml Falcon</td><td>Dominique Dutscher</td><td>352070</td><td></td></tr><tr><td>Tubka 15 ml Falcon</td><td>Dominique Dutscher</td><td></td><td></td>352096</tr><tr><td>1,8 ml krioprobówka Nunc</td><td>Dominique Dutscher</td><td>55005</td><td></td></tr><tr><td>Kolby do wytrząsania 100 ml Pyrex</td><td>Dominique Dutscher</td><td>211917</td><td></td></tr><tr><td>Kolby do wytrząsania 250 ml Pyrex</td><td>Dominique Dutscher</td><td>211918</td><td></td></tr><tr><td>Kolby do wytrząsania 500 ml Pyrex</td><td>Dominique Dutscher</td><td>211919</td><td></td></tr><tr><td>2 L Termosy Pyrex</td><td>Dominique Dutscher</td><td></td><td></td>211921</tr><tr><td>Wytrząsarka orbitalna Certomat + plateau</td><td>Sartorius</td><td>4445110, 4445233</td><td></td></tr><tr><td>Zbiornik ciekłego azotu dewar 35 L</td><td>Fisher Scientific</td><td>M76801</td><td></td></tr><tr><td>Szafa bezpieczeństwa biologicznego Szybszy</td> mikroskop optyczny <td>Sodipro</td><td>FASV20000606</td><td></td></tr><tr><td></td><td>Zeiss</td><td>451207</td><td></td></tr><tr><td>Sf21 Komórki</td><td></td><td></td><td></td></tr> <tr><td>owadówHi5 Komórki przeciw owadom</td><td>Invitrogen</td><td>B855-02</td><td></td></tr><tr><td>Tecan freedom EVO z uruchomieniem Evoware plus</td><td>TECAN</td><td></td><td></td></tr><tr><td>10 &mu; l końcówki przewodzące (czarne),</td> <td>TECAN</td><td>10 612 516</td><td></td></tr><tr><td>200 i mu; l końcówki przewodzące (czarne)</td><td>TECAN</td><td>10 612 510</td><td></td></tr><tr><td>jednorazowa rynna na odczynniki, 100 ml</td><td>TECAN</td><td>10 613 049</td><td></td></tr><tr><td>twin.tec PCR płytka 96, z osłoną</td><td>Eppendorf</td><td>0030 128.648</td><td></td></tr><tr><td>96 dołkowa V dno, niesterylna</td><td>płytka głębinowa BD falcon</td><td>353263</td><td></td></tr><tr><td>96 kolor naturalny, PP)</td><td>Mikropłytka Fisher</td><td>M3752M</td><td></td></tr><tr><td>PS, 96 studnia z płaskim dnem</td><td>Greiner</td><td>655101</td><td></td></tr><tr><td>96 płyta głębinowa</td><td>Thermo scientific</td><td>AB-0932</td><td></td></tr><tr><td>bloki 24-dołkowe RB</td><td>Qiagen</td><td>19583</td><td></td></tr><tr><td>Enzym restrykcyjny DpnI</td><td>NEB</td><td>R0176L</td><td>20 U/uL</td></tr><tr><td>NEBuffer 4 10X</td><td>NEB</td><td>B7004S</td><td></td></tr><tr><td>2X phusion mastermix HF</td><td>Finnzyme</td><td>ref F-531L</td><td></td></tr><tr><td>2X phusion mastermix GC</td><td>Finnzyme</td><td>ref F-532L</td><td></td></tr><tr><td>DGLB 1.5X</td><td>domowej roboty</td><td></td><td>7,5% glicerol, 0,031% błękit bromofenolowy, 0,031% xylen cyjanol FF</td></tr><tr><td>Drabinka o wysokiej masie DNA do e-żelu</td><td>Life Technologies</td><td>10496-016</td><td></td></tr><tr><td>Drabinka o niskiej masie DNA do e-żelu</td><td>Life Technologies</td><td>10068-013</td><td></td></tr><tr><td>E-żel 48 1% agaroza GP</td><td>Life Technologies</td><td>G8008-01</td><td></td></tr><tr><td>Zestaw plazmidów Nucleo Spin-robot-96</td><td>Macherey Nagel</td><td>740 708.24</td><td></td></tr><tr><td>Zestaw do czyszczenia PCR, Ekstrakt z robota Nucleospin-96</td><td>Macherey Nagel</td><td>740 707.2</td><td></td></tr><tr><td>Gotaq green master mix</td><td>Promega</td><td>M7113</td><td></td></tr><tr><td>T4 polimeraza DNA, z kwalifikacją LIC</td><td>Novagen</td><td>70099-3</td><td></td></tr><tr><td>DTT 100 mM</td><td>domowej roboty</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Mocznik 2 M</td><td>domowej roboty</td><td></td><td></td></tr><tr><td>EDTA 500 mM pH 8,0</td><td>Domowy</td><td></td><td></td></tr><tr><td>bulion LB (Miller) 500 g</td><td>Athena ES</td><td>103</td><td></td></tr></tbody></table>

platforma do produkcji kompleksu białkowego multibac w embl

The MultiBac Protein Complex Production Platform at the EMBL

Badania proteomiczne ujawniły imponującą złożoność proteomów eukariotycznych w niespotykanych dotąd szczegółach. Obecnie powszechnie przyjmuje się, że białka w komórkach w większości nie istnieją jako izolowane jednostki, ale wywierają swoją aktywność biologiczną w połączeniu z wieloma innymi białkami, u ludzi dziesięcioma lub więcej, tworząc linie montażowe w komórce dla większości, jeśli nie wszystkich funkcji życiowych. 1,2 Wiedza na temat funkcji i architektury tych wielobiałkowych zespołów wymaga ich dostarczenia w najwyższej jakości i wystarczającej ilości do szczegółowej analizy. Niedostatek wielu kompleksów białkowych w komórkach, w szczególności u eukariontów, uniemożliwia ich ekstrakcję ze źródeł natywnych i wymaga produkcji rekombinowanej. System wektorów ekspresyjnych bakulowirusa (BEVS) okazał się szczególnie przydatny do produkcji białek eukariotycznych, których aktywność często opiera się na przetwarzaniu potranslacyjnym, którego inne powszechnie stosowane systemy ekspresji często nie są w stanie obsłużyć. 3 BEVS wykorzystują rekombinowanego bakulowirusa, do którego wprowadzono interesujący nas gen w celu zainfekowania kultur komórek owadów, które z kolei wytwarzają wybrane białko. MultiBac to BEVS, który został specjalnie dostosowany do produkcji eukariotycznych kompleksów białkowych, które zawierają wiele podjednostek. 4 Istotnym warunkiem wstępnym wydajnej produkcji białek i ich kompleksów są solidne protokoły dla wszystkich etapów eksperymentu z ekspresją, które w idealnym przypadku mogą być wdrożone jako standardowe procedury operacyjne (SOP) i stosowane ze stosunkowo łatwością również przez użytkowników niebędących specjalistami. Platforma MultiBac w Europejskim Laboratorium Biologii Molekularnej (EMBL) wykorzystuje standardowe procedury operacyjne (SOP) na wszystkich etapach eksperymentu z ekspresją złożoną wielobiałkową, począwszy od wprowadzenia genów do zmodyfikowanego genomu bakulowirusa zoptymalizowanego pod kątem heterologicznych właściwości produkcji białek, a skończywszy na analizie na małą skalę wytworzonych próbek białek. 5-8 Platforma została zainstalowana w trybie otwartego dostępu w EMBL Grenoble i pomogła wielu naukowcom ze środowisk akademickich i przemysłowych w przyspieszeniu projektów badawczych dotyczących kompleksów białkowych.

Silna koekspresja białek heterologicznych osiągnięta za pomocą systemu MultiBac została przedstawiona na Rysunku 1d (próbki pobrano 48 h po zainfekowaniu hodowli komórkowej w zawiesinie). Prążki nadeksponowanego białka są wyraźnie widoczne w ekstrakcie z całych komórek (SNP) oraz w oczyszczonym lizacie (SN). Jakość i ilość otrzymanego materiału białkowego są często wystarczające, aby umożliwić wyznaczenie struktury kompleksów białkowych, takich jak kompleks punktu kontrolnego mitozy MCC przedstawiony na ...

Kompleksy białkowe katalizują kluczowe funkcje komórkowe. Szczegółowa charakterystyka funkcjonalna i strukturalna wielu istotnych kompleksów wymaga produkcji rekombinowanej. MultiBac to system komórkowy bakulowirusa/owadów specjalnie przystosowany do ekspresji białek eukariotycznych i ich kompleksów. MultiBac został wdrożony jako platforma o otwartym dostępie, a standardowe procedury operacyjne zostały opracowane w celu maksymalizacji jego użyteczności.

Platforma do produkcji kompleksu białkowego MultiBac w EMBL

Proteomics  research revealed the impressive complexity of eukaryotic proteomes in  unprecedented detail. It is now a commonly accepted notion that ...

Ogólnym celem niniejszej procedury jest wytwarzanie kompleksów białkowych z wykorzystaniem systemu komórek owadziego baculowirusa. Jest to realizowane poprzez najpierw wygenerowanie konstruktu wielogenowego kodującego wybrany kompleks białkowy. Drugim krokiem jest stworzenie kompozytowego baculowirusa zawierającego konstrukt wielogenowy poprzez transformację komórek bakteryjnych i przesiewanie w celu wyłonienia poprawnych klonów.Następnie należy wyizolować genom wirusa baula i wykorzystać go do zakażenia komórek owadów w małej skali w płytce sześciodołkowej po przeprowadzeniu testów w kierunku produkcji białka. Wybrany kompleks białkowy jest wyrażany w większej skali, a następnie oczyszczany. Ostatecznie oczyszczony kompleks białkowy służy do poznania jego struktury i funkcji, a potencjalnie także do opracowywania nowych leków.Główne zalety tej techniki w porównaniu z istniejącymi systemami echowirusowymi są dwukrotne. Kompleksy MultiPro mogą być produkowane z niespotykaną wydajnością. Ponadto wytworzony materiał charakteryzuje się znacznie wyższą jakością, ponieważ modyfikujemy echowirusa w celu optymalizacji produkcji białek.Zastosowania tej techniki wykraczają daleko poza podstawowe pytania biologiczne. Nasza platforma wielotorbowa była z powodzeniem wykorzystywana do produkcji białek, które stanowią obiecujących nowych kandydatów na szczepionki przeciwko różnym chorobom, a także do przyspieszania badań nad nowotworami poprzez wytwarzanie kluczowych kompleksów białkowych odpowiedzialnych za wzrost guza. Zazwyczaj osoby rozpoczynające pracę z tą metodą mogą napotkać pewne trudności związane z przebiegiem procesów oraz koniecznością zachowania sterylności.Włożyliśmy wiele wysiłku w opracowanie standardowych procedur operacyjnych, aby zastosowanie systemu multi-bank było jak najłatwiejsze dla użytkowników niebędących specjalistami. Wizualna prezentacja tej metody ma kluczowe znaczenie, ponieważ kroki robotyczne są znacznie łatwiejsze do zrozumienia, gdy proces jest pokazany w ruchu. Jest to wiedza, której nie da się uzyskać jedynie z opisanych protokołów, bez względu na stopień ich szczegółowości.Przed rozpoczęciem tej procedury ważne jest dokładne zaplanowanie strategii koekspresji. Zaleca się, aby eksperyment został najpierw przeprowadzony w symulacji in silico.Geny muszą zostać rozdzielone pomiędzy plazmidy akceptorowe i donorowe. Najskuteczniejszym rozwiązaniem jest grupowanie podjednostek, które mogą tworzyć fizjologiczne podmoduły. Ponieważ duże kompleksy składają się z wielu podjednostek białkowych, wiele genów musi być eksprimowanych jednocześnie.System MultiBac znacznie upraszcza klonowanie genów dzięki zastosowaniu zautomatyzowanych procedur umożliwiających umieszczanie genów w niewielkich cząsteczkach prekursorowych DNA, które zawierają krótką sekwencję DNA zwaną lox P, rozpoznawaną przez enzym rekombinazę Cre. Prekursory te są następnie łączone w reakcji jednokrokowej poprzez dodanie rekombinazy, która kondensuje wszystkie elementy posiadające miejsce lox P w jeden duży plazmid DNA. Tak przygotowana konstrukcja wielogenowa jest następnie wprowadzana do genomu baculowirusa MultiBac.W przypadku konieczności wygenerowania dużej liczby konstruktów zaleca się stosowanie skryptów robotycznych oraz stacji roboczej do obsługi cieczy. Stacja ta jest wyposażona w pompę próżniową do mini-preparatyki i oczyszczania produktów PCR, EEL do automatycznego ładowania próbek PCR, termocykler do etapów PCR i inkubacji, wytrząsarkę do resuspensji komórek oraz bloki chłodzące.W przypadku enzymów geny docelowe są wprowadzane do wybranych donorów i akceptorów za pomocą enzymów restrykcyjnych i ligazy lub alternatywnie przy użyciu metod niezależnych od ligacji; wszystkie konstrukty donorów i akceptorów są walidowane poprzez mapowanie restrykcyjne i sekwencjonowanie. Następnie przeprowadzane są kombinacje donor-akceptor za pomocą rekombinacji CRE LAX P w celu wygenerowania wybranych wielogenowych konstruktów ekspresyjnych. Złożone konstrukty wielogenowe są walidowane za pomocą analitycznych reakcji PCR z wykorzystaniem specjalnie zaprojektowanych zestawów starterów.Tutaj przedstawiono migawki z procesu TR wspomaganego przez robota. Obejmują one przygotowanie reakcji PCR w płytkach wielodołkowych, dostarczenie matrycowego DNA i starterów, amplifikację PCR DNA oraz przygotowanie konstruktów wielogenowych hodowanych w kulturze bakteryjnej poprzez lizę alkaliczną w płytkach wielodołkowych. Aby rozpocząć tę procedurę, należy zintegrować wielogenowe wektory transferowe z wirusowym genomem multi bula poprzez transformację do komórek DH 10, zawierających genom wirusowy oraz funkcjonalności wymagane do transpozycji TN seven.Po transposycji Tn7 komórki z kompozytowym wirusem baula zawierającym interesujące geny są selekcjonowane za pomocą przesiewania niebiesko-białego; udana transposycja Tn7 skutkuje utratą komplementacji alfa beta-galaktozydazy. W związku z tym kolonie z prawidłową transposycją Tn7 pozostają białe na selektywnych płytkach APL zawierających X-gal. Należy przygotować kultury bakteryjne z białych kolonii i wyizolować plazmidy metodą lizy alkalicznej oraz wytrącania etanolem i izopropanolem.Następnie przeprowadź transfekcję komórek owadów oczyszczonym genomem wirusa bao; pracując w sterylnej komorze z laminarnym przepływem powietrza, zaszczep aliquoty komórek owadów SF 21 w fazie logarytmicznej na sześciodołkowej płytce do hodowli tkankowej. Do każdego dołka dodaj oczyszczony genom wirusa bao oraz odczynnik do transfekcji zmieszany z pożywką hodowlaną. Inkubuj transfektowane komórki w temperaturze 27 °C bez ruchu przez 48 do 60 godzin.Po 48 do 60 godzin zebrać początkowy wirus lub V zero, usuwając pożywkę, uzupełnić ją świeżą pożywką i ponownie umieścić płytkę w inkubatorze. Po dwóch do trzech dniach przetestować produkcję białka, a w przypadku obecności markera YFP, sprawdzić fluorescencję w celu potwierdzenia amplifikacji wirusa. Wykorzystać V zero (początkowy wirus) do zainfekowania 25 do 50 ml komórek w fazie logarytmicznej w małych kolbach Erlenmeyera, inkubowanych w wytrząsaczu orbitalnym.Wstrząsaj, policz komórki i przesiewaj je co 24 godziny, aż przestaną się podwajać. Stosuj schemat niskiej wielokrotności zakażenia (MOI); komórki muszą podwoić swoją liczbę przynajmniej raz, w przeciwnym razie powtórz eksperyment, dodając mniejszą objętość V zero. Obraz po lewej stronie przedstawia niezinfekowane komórki owadzie po zakażeniu wirusem multi back baula.Zainfekowane komórki owadzie przestały się namnażać i zwiększyły swoje rozmiary, co zilustrowano na obrazku po prawej stronie. Po 48 do 60 godzinach należy zebrać wirusa V1 poprzez wirowanie i osadzanie komórek. Następnie należy usunąć i przechowywać pożywkę zawierającą wirusa.Resuspenduj komórki w świeżej pożywce i przenieś je z powrotem do kolby Erlenmeyera. Co 12 lub 24 godzin pobieraj 1×10⁶ komórek poprzez wirowanie i sprawdzaj produkcję białka oraz sygnał białka markerowego, jeśli pożądane są większe objętości ekspresji. Dalszą amplifikację wirusa przeprowadź, zakażając wirusem V1 do 400 ml zawiesiny komórkowej w dwulitrowych kolbach wytrząsowych.Stosując schemat z niskim MOI, stanowczo zalecamy przechowywanie wirusa V1 jako wirusa produkcyjnego z wykorzystaniem metody komórek owadziej zakażonych wirusem (VIC), aby zapobiec modyfikacjom wirusa rekombinowanego i zachować wysokie poziomy ekspresji. Po zaobserwowaniu zatrzymania proliferacji w 24. godzinie należy odwirować zakażone komórki. Na tym etapie komórki zawierają kompletne cząstki wirusowe tuż przed ich uwolnieniem do pożywki.Usunąć medium, resuspender osad komórkowy w roztworze do mrożenia i zamrozić BIIC w probówkach kriogenicznych do późniejszych serii produkcji białka. Do zakażania większych kultur komórkowych używać V one, V two lub mrożonych alikwotów BIC. Zazwyczaj 400 milliliters w kolbach o pojemności dwóch litrów są zgodne z protokołem niskiego MOI.Należy dostosować objętość wirusa używanego do infekcji w taki sposób, aby zainfekowana kultura podwoiła swoją liczbę co najmniej raz. W przypadku obecności białka markerowego YFP, w określonych odstępach czasu należy pobrać 1×10⁶ komórek, poddać je sonikacji i wirowaniu, a następnie przenieść na płytkę 96-dołkową. Poziomy YFP należy zmierzyć w standardowym czytniku płytek 96-dołkowych zdolnym do rejestrowania sygnałów fluorescencyjnych. Należy monitorować ewolucję sygnału YFP aż do osiągnięcia plateau, co wskazuje na maksymalną produkcję białka rekombinowanego. Na tym etapie należy zebrać komórki, a osady komórkowe przechowywać w temperaturze -20 °C krótkoterminowo lub -80 °C długoterminowo. Komórki powinny zostać poddane lizie metodą dostosowaną do wymagań białka, a następnie wydzielić cytozol i jądra.Ufrakcjonowane białka jądrowe znajdują się zazwyczaj w osadzie jądrowym, podczas gdy białka cytozolowe pozostają w cytozolu. Frakcjonowanie znacznie upraszcza proces oczyszczania białek.Ponieważ wiele zanieczyszczeń można usunąć w jednym etapie wirowania, kompleksy białkowe można wygodnie oczyszczać z początkowych hodowli komórkowych w małej skali, wykorzystując zminiaturyzowane metody oczyszczania, takie jak oczyszczanie w płytkach wielodołkowych lub w mikrokońcówkach. W połączeniu z systemami chromatograficznymi do małych objętości, takimi jak ACTA micro, kolejnym krokiem będzie miniaturyzacja i integracja całego układu eksperymentalnego w niewielkim urządzeniu nablatowym zintegrowanym ze stacją roboczą do klonowania.Przedstawiono tutaj opracowywanego obecnie robota do procesów szarżowych w mikroskali, który zostanie wykorzystany w tym celu. Silna koekspresja białek heterologicznych jest osiągana dzięki zastosowaniu systemu multi-back, jak pokazano tutaj. Przeeksponowane prążki białkowe są wyraźnie widoczne w ekstrakcie z całych komórek (WCE) oraz w oczyszczonym lizacie.Jakość i ilość otrzymanego materiału białkowego są zazwyczaj wystarczające. Umożliwia to ustrukturyzowane wyznaczenie kompleksów białkowych, takich jak przedstawiony na tym schemacie kompleks kontrolny mitycznego (MCC). Często wydajność tych analitycznych procesów oczyszczania jest wystarczająca do analizy struktury i funkcji oczyszczonego kompleksu za pomocą różnych metod, w tym mikroskopii elektronowej.Opracowane przez nas standardowe procedury operacyjne pozwalają użytkownikom niebędącym specjalistami na łatwe zastosowanie naszej metody, a nasza technologia może być wykorzystywana w wielu laboratoriach zainteresowanych dużymi kompleksami białkowymi, podobnie jak ma to obecnie miejsce w przypadku małych białek w Nikola. Po obejrzeniu tego filmu powinni Państwo mieć dobrą wiedzę na temat tego, jak używać multi bag w celu produkcji interesujących Państwa kompleksów białkowych w niespotykanej ilości i jakości, aby zrealizować ambitne cele badawcze. Praca z naszymi systemami nie wymaga specjalnych warunków bezpieczeństwa.Należy jednak pamiętać, że w przypadku niedbałości wirus może doprowadzić do zakażenia, mimo że nie będzie się replikować w komórkach ludzkich. Dlatego podczas wykonywania tej procedury niezbędne jest zachowanie szczególnej ostrożności w zakresie warunków sterylności. Nasza metoda zyskała już dużą popularność i jest stosowana w ponad 600 laboratoriach na całym świecie.Zastosuj naszą technikę. Wierzymy, że w przyszłości nasza metoda stanie się integralną częścią wielkoskalowych wysiłków w zakresie genomiki strukturalnej, dotyczących ludzkiej strefy złożonej. Może to pomóc w ujawnieniu podstaw chorób, a w dłuższej perspektywie doprowadzić do opracowania nowych i lepszych leków oraz terapii.

the-multibac-protein-complex-production-platform-at-the-embl

Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

Platforma Produkcji Kompleksów Białkowych MultiBac w EMBL

Opisano wysokoprzepustową, zautomatyzowaną platformę rozwoju linii komórkowych do produkcji białkowych leków terapeutycznych. Wdrożenie sortera komórek BD FACS Aria, obrazownika CloneSelect Imager oraz systemu do obsługi cieczy TECAN Freedom EVO wykazało znaczące zwiększenie wydajności przetwarzania w procesie rozwoju linii komórkowych, przy jednoczesnej poprawie jakości linii komórkowych i wysokiej powtarzalności.

Wysokoprzepustowa zautomatyzowana platforma do opracowywania linii komórkowych produkcyjnych dla białkowych produktów terapeutycznych

W erze genomiki post-humanistycznej dostępność białek rekombinowanych w natywnych konformacjach jest kluczowa dla badań i rozwoju w obszarze strukturalnym, funkcjonalnym oraz terapeutycznym. W niniejszej pracy opisujemy system ekspresji białek w skali testowej i przemysłowej z wykorzystaniem ludzkich komórek embrionalnej nerki 293T, który może być stosowany do produkcji różnorodnych białek rekombinowanych.

Wygodna i uniwersalna platforma ekspresyjna do produkcji białek wydzielanych z komórek ludzkich

Oczyszczanie powinowactwa oznaczonych białek w połączeniu ze spektrometrią mas (APMS) to potężna metoda systematycznego mapowania sieci interakcji białek i badania mechanistycznych podstaw procesów biologicznych. W tym miejscu opisujemy zoptymalizowaną procedurę APMS opartą na powinowactwie do peptydów sekwencyjnych (SPA) opracowaną dla bakterii Escherichia coli, która może być stosowana do izolowania i charakteryzowania stabilnych kompleksów wielobiałkowych do niemal jednorodności, nawet...

Identyfikacja kompleksów białkowych w Escherichia coli za pomocą sekwencyjnego oczyszczania powinowactwa peptydów w połączeniu z tandemową spektrometrią mas

Projektowanie leków w oparciu o strukturę odgrywa istotną rolę w opracowywaniu nowych preparatów terapeutycznych. Równoległe dążenie do uzyskania wielu celów znacznie zwiększa szanse na sukces w odkrywaniu związków wiodących. Poniższy artykuł przedstawia, w jaki sposób Seattle Structural Genomics Center for Infectious Disease wykorzystuje podejście wielocelowe w procesie wyznaczania struktury na podstawie genu dla podjednostki PB2 wirusa grypy typu A.

Podejście z zastosowaniem równoległego przetwarzania wielu celów w wyznaczaniu struktury na podstawie sekwencji genu podjednostki PB2 polimerazy wirusa grypy

Współekspresja białek jest potężną alternatywą dla rekonstytucji in vitro kompleksów białkowych i jest pomocna w przeprowadzaniu testów biochemicznych i genetycznych in vivo. W tym artykule informujemy o wykorzystaniu koekspresji białek w Escherichia coli do uzyskania kompleksów białkowych i dostrojenia częstotliwości mutacji komórek.

Wieloaspektowe korzyści płynące z koekspresji białek w Escherichia coli

To badanie opisuje metody koekspresji wielu genów z pojedynczego plazmidu w Escherichia coli za pośrednictwem T7 przy użyciu systemu plazmidowego pMGX.

Indukowalny wielogenowy system ekspresji za pośrednictwem polimerazy RNA T7, pMGX

Przedstawiono metodę stabilizacji i separacji natywnych kompleksów białkowych z niemodyfikowanego lizatu tkankowego za pomocą aminowo-reaktywnego białka sieciującego sprzężonego z nowatorskim dwuwymiarowym systemem elektroforezy w żelu poliakrylamidowym (PAGE).

Multimer-PAGE: Metoda wychwytywania i rozdzielania kompleksów białkowych w próbkach biologicznych

Ten manuskrypt opisuje protokół oczyszczania powinowactwa do uzupełnienia bimolekularnego (BiCAP). Ta nowatorska metoda ułatwia specyficzną izolację i dalszą charakterystykę proteomiczną dowolnych dwóch oddziałujących białek, wykluczając jednocześnie nieskompleksowane pojedyncze białka, a także kompleksy utworzone z konkurującymi partnerami wiążącymi.

Analizowanie wielobiałkowych kompleksów sygnalizacyjnych za pomocą oczyszczania powinowactwa z komplementacją bimolekularną (BiCAP)

Ten protokół szczegółowo opisuje kroki, koszty i sprzęt niezbędny do generowania ekstraktów komórkowych na bazie E. coli i przeprowadzania reakcji syntezy białek in vitro w ciągu 4 dni lub krócej. Aby wykorzystać elastyczny charakter tej platformy do szerokich zastosowań, omawiamy warunki reakcji, które można dostosować i zoptymalizować.

Bezkomórkowa synteza białek na bazie Escherichia coli: Protokoły dla solidnej, elastycznej i dostępnej technologii platformy

System wektorów ekspresyjnych bakulowirusa (BEVS) to solidna platforma do badania ekspresji i produkcji białkowych metylotransferaz argininowych (PRMT) do wykorzystania w badaniach biochemicznych, biofizycznych i strukturalnych. Miligramowe ilości materiału mogą być produkowane dla większości PRMT i innych białek będących przedmiotem zainteresowania, wymagających eukariotycznej platformy ekspresyjnej.

Produkcja rekombinowanych białek PRMT przy użyciu systemu wektorów ekspresyjnych bakulowirusa

Ten protokół szczegółowo opisuje procedury rekombinacyjnego wytwarzania ludzkiego holoenzymu miozyny-7a za pomocą systemu MultiBac Baculovirus oraz badania jego ruchliwości za pomocą dostosowanego testu ślizgowego in vitro.

Oczyszczanie oparte na systemie MultiBac i biofizyczna charakterystyka ludzkiej miozyny-7a

Poznaj produkcję kompleksów białkowych za pomocą systemu MultiBac w komórkach owadzich. Ta metoda umożliwia ekspresję i oczyszczanie białek eukariotycznych do badań strukturalnych oraz odkrywania leków.

Platforma do produkcji kompleksu białkowego MultiBac w EMBL

Przeglądaj więcej filmów