Kwantyfikacja właściwości mechanicznych glikokaliksu śródbłonka za pomocą mikroskopii sił atomowych

Ogólnym celem poniższego eksperymentu jest zmierzenie właściwości mechanicznych glikokaliksu śródbłonka za pomocą mikroskopu sił atomowych lub FM. Osiąga się to poprzez pierwszą hodowlę, monowarstwę komórek śródbłonka pod fizjologicznym przepływem w bioreaktorze w celu zbudowania warstwy glikokaliksu w drugim etapie. Koraliki o wielkości mikronów są przymocowane do wsporników FM i używane jako sonda do pomiaru siły oporu korpusu komórki i glikokaliksu podczas wgłębienia. Następnie krzywe wgłębień są dopasowywane do modelu dwuwarstwowego w celu określenia modułu glikokaliksu i uzyskuje się wyniki grubości, które pokazują, że glikokaliks śródbłonka ma moduł 0,7 kilo paskali i grubość 380 nanometrów na podstawie analizy dwuwarstwowej.

Cześć, nazywam się Rick Wa.Jestem kierownikiem Katedry Inżynierii Biomedycznej na Uniwersytecie w Rochester. W ostatnich latach toczy się wiele dyskusji na temat możliwej roli glikokaliksu śródbłonka w zapaleniu, w szczególności na temat tego, czy może on działać jako bariera ochronna zapobiegająca niepożądanej adhezji komórek podczas stanu zapalnego. Jednym z kluczy do rozwiązania pytań, które otaczają tę kwestię, jest możliwość pomiaru właściwości fizycznych, a mianowicie grubości i sztywności tej warstwy, zarówno w normalnych warunkach, jak i podczas odpowiedzi zapalnej.

Nazywam się Graham Marsh. Jestem doktorantem na Wydziale Inżynierii Biomedycznej Uniwersytetu w Rochester. Dużym problemem w scharakteryzowaniu glikokaliksu śródbłonka jest to, że jest on niewiarygodnie miękki.

Podejście, które wymyśliliśmy, polega na przymocowaniu dużego koralika do końcówki wspornika A i A FM, tak aby zmierzone siły były rozwiązywalne za pomocą A FM.To rozpocznij tę procedurę, zbuduj komorę przepływową, taką jak ta pokazana tutaj, zdolną do wzrostu komórek pod wpływem naprężenia ścinającego 1,0 Pascala. Przygotuj komorę przepływową do eksperymentu, najpierw czyszcząc szkiełka podstawowe w roztworze piranii przez 15 minut. Płukamy je trzykrotnie wodą destylowaną i suszymy w temperaturze 70 stopni Celsjusza przez 30 minut.

Następnie pokryj szkiełka amino propylotrixi, cy lane lub apte przez osadzanie z fazy gazowej. Dodać jeden mililitr apte do kolby, która jest przymocowana do komory próżniowej z próbką. Następnie nakręć kolbę i utrzymuj podciśnienie 0,7 bara przez godzinę.

W tym czasie trzykrotnie odśwież odkurzacz. Następnie wytnij nową uszczelkę komory przepływowej z arkusza silikonu o grubości 0,4 milimetra za pomocą narzędzia tnącego Silhouette SD. Kanał ma 6,4 milimetra szerokości i 19 milimetrów długości, a średnica zewnętrzna jest przycinana do 35 milimetrów, aby zmieścił się w naczyniu do hodowli azylu.

Korzystając z tych wymiarów, oblicz natężenie przepływu niezbędne do wygenerowania czystego naprężenia jednego paskali za pomocą równania pokazanego tutaj. Q oznacza natężenie przepływu. Tau to czysty stres.

Mu to lepkość pożywki. H to wysokość kanału, a W to szerokość komory przepływowej. Kolejnym krokiem jest wyrównanie górnej części komory przepływowej z uszczelką w naczyniu do hodowli komórkowych i zabezpieczenie jej pierścieniem magnetycznym.

Podłącz porty przepływu w naczyniu do hodowli komórkowej do trzech zaworów falowych z przewodami do 30-mililitrowych strzykawek. Następnie wysterylizuj cały zespół, przepłukując go alkoholem izopropylowym przez pięć minut. Następnie usuń alkohol i pozostaw go do wyschnięcia na powietrzu w chusteczce.

Kaptur hodowlany Rozgrzej 4% płodową surowicę cielęcą w podłożu McCoy's do 37 stopni Celsjusza. Po pozostawieniu do wyschnięcia na pięć do 10 minut, wypłucz pozostały alkohol za pomocą 30 mililitrów wstępnie rozgrzanej surowicy cielęcej płodu. Następnie napełnij strzykawki 20 mililitrami pożywki wzrostowej veek MCDB 1 31.

Następnie należy zakryć strzykawki, aby zapobiec zanieczyszczeniu. Podczas wyjmowania systemu ze sterylnego kaptura należy założyć nasadkę zbiornika wychwytującego za pomocą igły, która sięga do płynu, aby wciągnąć medium z powrotem do zbiornika znajdującego się przed nim. Na koniec przymocuj sterylne filtry 0,2 mikrona do wlotów powietrza na nasadkach przy następnym pobraniu ludzkiej żyły pępowinowej.

Komórki śródbłonka wyhodowane do zbiegu w kolbie T 25. Ponownie zawiesić granulowane komórki w ilości 100 000 komórek na mililitr w pożywce i wciągnąć roztwór do strzykawki. Następnie wstrzyknąć zawiesinę do komory przepływowej przez zawór trójdrogowy.

Pozwól komórkom osiąść i przylegać do szklanego podłoża przez dwie godziny. Przed rozpoczęciem przepływu przenieś bioreaktor i komórki do inkubatora, w którym komórki mogą się osiąść i przylegać przez dwie godziny. Rurka łącząca zbiorniki z pompą perystaltyczną przechodzi przez tylną część inkubatora Gdy komórki przylgną, ustaw pompę perystaltyczną na żądane natężenie przepływu.

Media przemieszczają się między zbiornikami, tworząc wysokość podnoszenia ciśnienia i przepływ przez bioreaktor, który wytwarza naprężenie ścinające ścianę o wartości jednego paskala. Pozwól komórkom inkubować się z ciągłym przepływem w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez jeden do pięciu dni, aż komora zacznie się zlewać. Aby rozpocząć przygotowanie wspornika, wyczyść końcówkę i wspornik FM w kwasie azotowym przez pięć minut, a następnie spłucz wodą destylowaną.

Po wyschnięciu funkcjonalizować wspornik za pomocą apdi w komorze osadzania parowego, jak pokazano wcześniej dla szkiełek szklanych. Następnie przygotuj roztwór pięciu miligramów na mililitr wagowo NHS Sulf O lc, biotyny w buforowanym roztworze soli Hanka. Zanurz wsporniki w roztworze na 15 minut.

Ta reakcja sprzęga CY i końcowy hydroksyltlenek i przedstawia cząsteczki biotyny na powierzchni wsporników. Dzień wcześniej zacznij przygotowywać roztwór pożywki wolnej od biotyny, łącząc 20 mililitrów pożywki hodowlanej vexcel zawierającej 20% surowicy z 200 mikrolitrami paciorkowców pokrytych streptem ENC i inkubuj przez 12 godzin podczas obracania. W dniu eksperymentu.

Pociągnij kulki magnetyczne do dna probówki za pomocą magnesu na dwie minuty i przenieś supernatant zawierający pożywkę wolną od biotyny do nowej probówki. Wysterylizuj pożywkę, przepuszczając ją przez filtr 0,22 mikrometra i włóż do nowej probówki. Następnym krokiem jest wyjęcie komory przepływowej z naczynia do hodowli komórkowych, a następnie trzykrotne umycie komórek dwoma mililitrami pożywki wolnej od biotyny o temperaturze 37 stopni Celsjusza.

Następnie dodaj jeden mikrogram o średnicy 2,4 mikrometra, pozbawione koralików pokrytych Adenem. Dodaj stężenie 10 mikrogramów na mililitr do naczynia do hodowli komórkowych i delikatnie wymieszaj. Następnie skalibruj tib A FM, przymocowując go do listwy paskowej i wciskając w zwykłą szklaną powierzchnię.

Aby to osiągnąć, wyląduj końcówką na szklanej powierzchni obok stopki, cofnij końcówkę, a następnie umieść wierzchołek wspornika nad koralikiem i dociśnij przez kilka sekund. Na koniec użyj skalibrowanego wspornika, aby wciąć próbki. Kulki o średnicy 2,4 mikrometra zapewniają większą powierzchnię styku z powierzchnią komórki, dzięki czemu właściwości mechaniczne miękkiej warstwy glikokaliksu można łatwiej wykryć.

Aby osiągnąć tę pozycję, wspornik nad komórką w pobliżu jądra komórkowego, użyj miękkiego podejścia końcówki do komórki, aby ustawić wysokość wspornika około trzech mikrometrów nad powierzchnią komórki. Następnie wciąć powierzchnię 20 razy z szybkością jednego mikrometra na sekundę do maksymalnej siły siedmiu. Nanoniutony pozwalają na upływ sześciu sekund między kolejnymi kontaktami.

Oblicz grubość warstwy glikokaliksu za pomocą równań związanych z teorią herców. Siła wcięcia F jest opisana tym równaniem, gdzie delta jest głębokością wcięcia. R to promień kuli, a estar to połączony moduł materiałów poddanych naprężeniu.

Aby rozdzielić połączony moduł sprężystości estar na składniki komórkowe i glikokaliksowe, należy potraktować warstwę glikokaliksu jako jednolitą, cienką miękką warstwę na powierzchni ciała komórki i użyć dwuwarstwowego modelu Clifforda, a C.In tym równaniu PQ i N są stałe wyznaczone empirycznie na podstawie pasowań polimerowych. M jest stałą z modelu polimerowego, a Z jest związana z grubością cienkiej warstwy lub warstwy glikokaliksu za pomocą równania pokazanego tutaj. Siła mierzona przez A FM mierzona w nanoniutonach zaczyna rosnąć po kontakcie z powierzchnią i początkowo jest zdominowana przez składnik warstwy glikokaliksu.

Po ściśnięciu warstwy glikokaliksu ciało komórki staje się głównym składnikiem deformacji. Niebieska dwuwarstwowa linia dopasowania została obliczona przez dopasowanie czterech wolnych parametrów, aby dopasować ją do danych wcięcia pokazanych na czerwono z użytego równania, można określić moduł komórki, glikokaliks, moduł warstwy i grubość warstwy glikokaliksu. Właściwości z 25 komórek zostały skompilowane w pokazany tutaj histogram.

Średni moduł warstwy glikokaliksu określono na 0,7 plus minus 0,5 kipa cals, a grubość warstwy glikokaliksu określono na 380 plus minus 50 nanometrów. Takie podejście daje nam narzędzie, którego potrzebowaliśmy, aby odpowiedzieć na fundamentalne pytania dotyczące roli glikokaliksu w regulacji adhezji komórek podczas stanu zapalnego. Jesteśmy teraz w stanie odpowiedzieć na pytania dotyczące tego, w jaki sposób właściwości glikokaliksu zmieniają się podczas stanu zapalnego.

W jaki sposób te zmiany są realizowane. Podejście to można rozszerzyć na wiele sposobów. Na przykład, można go użyć do przetestowania nowych, bardziej wyrafinowanych teoretycznych opisów właściwości glikokaliksu.

Lub na bardziej praktycznym poziomie, można to wykorzystać do testowania powłok powierzchniowych inspirowanych biologią, zaprojektowanych w celu ochrony wszczepialnych urządzeń przed odpowiedzią immunologiczną gospodarza. Bardzo dziękujemy za zainteresowanie naszą pracą.