Name: Kwantyfikacja właściwości mechanicznych glikokaliksu śródbłonka za pomocą mikroskopii sił atomowych (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-02-21T13:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 24 s
Description: Poznaj metodę pomiaru właściwości mechanicznych glikokaliksu śródbłonka za pomocą mikroskopii sił atomowych AFM. Technika ta umożliwia bezpośrednie określenie modułu Younga i grubości tej warstwy.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Autorzy chcieliby podziękować Elenie Lomakine, Richardowi Bausermanowi, Margaret Youngman, Shayowi Vakninowi, Jessice Snyder, Chrisowi Striemerowi, Nakulowi Natarajowi, Hung Li Chungowi, Tejasowi Khire'owi i Ericowi Lamowi za pomoc w tym projekcie. Ten projekt został sfinansowany przez NIH #PO1 HL 018208.

1. Metody
1.1 Komora przepływowa dla komórek
Komora przepływowa, przedstawiona na Rysunku 1, została skonstruowana w taki sposób, aby komórki mogły być hodowane przy naprężeniu ścinającym 1,0 Pa (10 dyn/cm2), a następnie przeniesione bezpośrednio do AFM Asylum MFP3D (Santa Barbara, CA).
<ol>
	<li>Komorę przepływową przygotowano do eksperymentu, najpierw czyszcząc szkiełka przedmiotowe w roztworze pirania (3:1 H2SO4:H2O2) przez 15 min, a następnie płucząc je wodą destylowaną. Następnie wysuszono je w piecu i pokryto aminopropylotrietoksysilanem (APTES) w komorze do osadzania próżniowego.</li>
	<li>Uszczelkę silikonową wycięto za pomocą plotera Silhouette SD. Pozwoliło to na precyzyjną kontrolę wymiarów komory przepływowej w celu regulacji natężenia przepływu i naprężenia ścinającego podczas wzrostu komórek. Typowo z arkusza silikonu o grubości 0.4 mm wycinano kanał o szerokości 6,4 mm i długości 19 mm. Natężenie przepływu niezbędne do wygenerowania naprężenia ścinającego wynoszącego 1,0 Pa (10 dyn/cm2) oblicza się, zakładając przepływ laminarny w kanale prostokątnym, korzystając z równania:</li>
</ol>
<img alt="Równanie dynamiki płynów, Q=(1/6)(τ/μ)h²w, ilustrujące naprężenie ścinające i przepływ, formuła." fo:content-width="0.737in" fo:src="/files/ftp_upload/50163/50163eq1highres.jpg" src="/files/ftp_upload/50163/50163eq1.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Równanie 1"> 
gdzie Q to natężenie przepływu, τ to naprężenie ścinające, μ to lepkość medium, przyjęta tutaj jako 1.0 mPa (0.01 dyn*sec/cm2), h to wysokość, a w to szerokość komory przepływowej.
<ol start="3">
	<li>Górną część komory przepływowej wyrównano z uszczelką w naczyniu do hodowli komórkowej i zabezpieczono pierścieniem magnetycznym. Zespół wypełniono alkoholem izopropylowym (IPA) w celu sterylizacji.</li>
	<li>Zmontowano cały system przepływowy. Porty przepływowe w naczyniu do hodowli komórkowej podłączono do zaworów trójdrożnych. Zawory podłączono do otwartych strzykawek o pojemności 30 ml. Przez system przepłukano IPA, a następnie przemyto go 30 ml pożywki McCoy's z dodatkiem 4% płodowej surowicy cielęcej (FCS). Następnie system wypełniono 20 ml pożywki do wzrostu komórek firmy Vec Technologies. Na górnych częściach strzykawek umieszczono osłonki. Nakrętka strzykawki zbiornika odbiorczego posiadała igłę umożliwiającą przesunięcie pożywki z powrotem do zbiornika podającego. Do wlotów powietrza w osłonkach przymocowano sterylne filtry 0,2 μm, aby zapobiec kontaminacji systemu. Komora przepływowa była następnie gotowa do wysiewu komórek.</li>
</ol>
1.2 Hodowla komórkowa
<ol>
	<li>Ludzkie komórki śródbłonka żyły pępkowej (HUVEC) oraz pożywka wzrostowa zostały zakupione od Vec Technologies (Rensselaer, NY) i hodowane do osiągnięcia konfluencji w kolbie T25.</li>
	<li>Z kolby usunięto pożywkę wzrostową, a monowarstwę komórek odczepiono za pomocą 2 ml 2,5% trypsyny. Po zawieszeniu komórek proces trypsynizacji przerwano poprzez dodanie do kolby 10 ml pożywki do hodowli komórkowej.</li>
	<li>Zawiesinę komórkową odwirowano przez 5 min i usunięto naddestylat. Komórki resuspenderowano w 1 ml pożywki do hodowli komórkowej (zawierającej serum) w celu wstrzyknięcia do komory przepływowej.</li>
	<li>Zawiesinę komórkową (0,5 ml, ~50 000 komórek) nabrano do strzykawki i wstrzyknięto do komory przepływowej poprzez zawór trójdrożny.</li>
	<li>Pozwolono komórkom opaść i przywrzeć do szklanego podłoża przez 2 hr przed rozpoczęciem przepływu. Komórki hodowano w warunkach przepływu w inkubatorze w temperaturze 37 °C od 1 do 5 dni, aż do osiągnięcia konfluencji.</li>
</ol>
1.3 Przygotowanie wspornika i indentacja komórki
<ol>
	<li>Wygładzone igły AFM (NanoWorld, Szwajcaria) oczyszczono w kwasie azotowym przez 5 min, a następnie funkcjonalizowano aminopropylotrietoksysilanem (APTES) w komorze do osadzania z fazy gazowej.</li>
	<li>Przygotowano roztwór NHS-sulfo-LC-biotyny w zbuforowanym roztworze soli Hanksa (HBSS) o stężeniu 5 mg/ml. Igły zanurzono w roztworze na 15 min w celu sprzężenia silanu z wykorzystaniem chemii N-hydroksysukcynimidu (NHS).</li>
	<li>Medium wolne od biotyny przygotowano poprzez inkubację 20 ml pożywki do hodowli komórkowej Vec Technologies (zawierającej surowicę) z 200 μl kulek streptawidynowych przez 12 h. Kulki usunięto z pożywki za pomocą magnesu, a następnie pożywkę przefiltrowano przez sterylny filtr 0,22 μm.</li>
	<li>Komorę przepływową wyjęto z naczynia do hodowli komórkowej, a komórki przemyto w temperaturze 37 °C medium wolnym od biotyny.</li>
	<li>Przygotowano roztwór zapasowy składający się z 1 μl kulek o średnicy 2,4 μm pokrytych streptawidyną w 1 ml medium wolnego od biotyny, a następnie 100 μl tego roztworu dodano do naczynia z hodowlą komórkową.</li>
	<li>Kulki streptawidynowe pobierano za pomocą igły poprzez opuszczenie wierzchołka na powierzchnię szkła obok kulki, wycofanie go, ustawienie szczytu igły nad kulką, a następnie dociśnięcie igły do kulki i odczekanie kilku sekund.</li>
	<li>Czułość igły zmierzono poprzez wciskanie w obszar czystego szkła, wykorzystując nachylenie krzywej do ustawienia ugięcia wierzchołka jako funkcji napięcia.</li>
	<li>Stałą sprężystości igły obliczono następnie na podstawie kalibracji termicznej w oprogramowaniu MFP3D.</li>
	<li>Skalibrowaną igłę wykorzystano do wciskania w próbki, jak pokazano na Rysunku 2. Kulki o średnicy 2,4 μm zapewniają większą powierzchnię kontaktu z powierzchnią komórki, co pozwala na wykrycie właściwości mechanicznych miękkiej warstwy glikokaliksu. Igłę ustawiono nad komórką w pobliżu jądra komórkowego, a następnie zastosowano miękkie podejście wierzchołka do komórki, aby ustawić wysokość igły na około 3 μm powyżej powierzchni komórki. Oprogramowanie ustawiono na 20 powtórzeń wciskania z prędkością 1 μm/sec do maksymalnej siły 7 nN. Między kolejnymi kontaktami upływało około 6 s. Możliwe jest zastosowanie różnych prędkości wciskania w celu zbadania właściwości glikokaliksu zależnych od czasu, choć w tych wstępnych eksperymentach zastosowano tylko jedną prędkość wciskania (1 μm/sec).</li>
</ol>
2. Teoria wgniecania
Wciskanie sfery o promieniu R w elastyczną półprzestrzeń można opisać za pomocą teorii Hertza, w której siła wciskania, F, jest określona równaniem:
<img alt="równanie równowagi statycznej; F=4/3E*R^(1/2)δ^(3/2); wzór z mechaniki; zastosowanie edukacyjne" fo:content-width="1.157in" fo:src="/files/ftp_upload/50163/50163eq2highres.jpg" src="/files/ftp_upload/50163/50163eq2.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Równanie 2"> 
Gdzie δ to głębokość wcięcia, a E* to zredukowany moduł materiału badanego (Rysunek 3). W przypadku nieskończenie sztywnego wgłębienia wnikającego w jednorodną elastyczną półprzestrzeń, E* jest określone przez równanie:
<img alt="Wzór na moduł sprężystości, E*=E/(1-ν²), schemat, obliczanie właściwości materiału." fo:content-width="0.757in" fo:src="/files/ftp_upload/50163/50163eq3highres.jpg" src="/files/ftp_upload/50163/50163eq3.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Równanie 3"> 
gdzie E to moduł sprężystości, a ν to współczynnik Poissona materiału. Niedawne prace nad filmami polimerowymi zainspirowały opracowanie modelu dwuwarstwowego do wyznaczania modułu i grubości cienkich warstw 1. Stosujemy ten model w biologii komórki, traktując glikokaliks jako jednorodną cienką miękką warstwę na powierzchni ciała komórki. Przy użyciu tego modelu zredukowany moduł układu przyjmuje postać:
<img alt="Równanie potencjału elektrochemicznego; E*=EGC+(Ecell-EGC)(Pzn/(1+Pzn+Qz)); opis formuły." fo:content-width="2.85in" fo:src="/files/ftp_upload/50163/50163eq4highres.jpg" src="/files/ftp_upload/50163/50163eq4.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Równanie 4"> 
Gdzie EGC to moduł glikokaliksu, Ecell to moduł ciała komórki, P, Q i n to stałe wyznaczone empirycznie z dopasowań polimerowych, a z jest określone przez równanie:
<img alt="Równanie dla z w elektrolizie chemicznej, zawierające symbole EGC, Ecell." fo:content-width="1.257in" fo:src="/files/ftp_upload/50163/50163eq5highres.jpg" src="/files/ftp_upload/50163/50163eq5.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Równanie 5"> 
Gdzie t jest grubością warstwy glikokaliksu. Schemat tych parametrów przedstawiono na Rysunku 3. Wykazano, że model ten jest dokładną metodą wyznaczania modułu i grubości cienkiej warstwy na sztywniejszym podłożu 1. Równanie to można wykorzystać do dopasowania krzywych uzyskanych z wklucia w komórki w celu wyznaczenia modułu i grubości śródbłonkowego glikokaliksu, jak pokazano na Rysunku 4.

<ol><li>Clifford, C., Seah, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nanoindentation+measurement+of+young%27s+modulus+for+compliant+layers+on+stiffer+substrates+including+the+effect+of+poisson%27s+ratios%5BTitle%5D)+AND+%22Nanotechnology%22%5BJournal%5D)">Nanoindentation measurement of young's modulus for compliant layers on stiffer substrates including the effect of poisson's ratios.</a> Nanotechnology. , (2009).</li>
<li>Gouverneur, M., Spaan, J. A. E., Pannekoek, H., Fontijn, R. D., Vink, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fluid+shear+stress+stimulates+incorporation+of+hyaluronan+into+endothelial+cell+glycocalyx%5BTitle%5D)+AND+%22Am.+J.+Physiol.+Heart.+Circ.+Physiol%22%5BJournal%5D)">Fluid shear stress stimulates incorporation of hyaluronan into endothelial cell glycocalyx.</a> Am. J. Physiol. Heart. Circ. Physiol. 290 (1), 458-452 (2006).</li>
<li>Hocde, S. A., Hyrien, O., Waugh, R. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell+adhesion+molecule+distribution+relative+to+neutrophil+surface+topography+assessed+by+tirfm%5BTitle%5D)+AND+%22Biophysical+Journal%22%5BJournal%5D)">Cell adhesion molecule distribution relative to neutrophil surface topography assessed by tirfm.</a> Biophysical Journal. 97 (1), 379-387 (2009).</li>
<li>Lipowski, H. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+endothelial+glycocalyx+as+a+barrier+to+leukocyte+adhesion+and+its+mediation+by+extracellular+proteases%5BTitle%5D)+AND+%22Annals+of+biomedical+engineering%22%5BJournal%5D)">The endothelial glycocalyx as a barrier to leukocyte adhesion and its mediation by extracellular proteases.</a> Annals of biomedical engineering. 40 (4), 840-848 (2012).</li>
<li>Lu, L., Oswald, S. J., Ngu, H., Yin, F. C. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanical+properties+of+actin+stress+fibers+in+living+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Biophysical+Journal%22%5BJournal%5D)">Mechanical properties of actin stress fibers in living cells.</a> Biophysical Journal. 95 (12), 6060-6071 (2008).</li>
<li>Pries, A. R., Secomb, T. W., Gaehtgens, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+endothelial+surface+layer%5BTitle%5D)+AND+%22Pflugers+Archiv.+European+Journal+of+Physiology%22%5BJournal%5D)">The endothelial surface layer.</a> Pflugers Archiv. European Journal of Physiology. 440 (5), 653-666 (2000).</li>
<li>Spillmann, C. M., Lomakina, E., Waugh, R. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neutrophil+adhesive+contact+dependence+on+impingement+force%5BTitle%5D)+AND+%22Biophysical+Journal%22%5BJournal%5D)">Neutrophil adhesive contact dependence on impingement force.</a> Biophysical Journal. 87 (6), 4237-4245 (2004).</li>
<li>vanden Berg, B. M., Vink, H., Spaan, J. A. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+endothelial+glycocalyx+protects+against+myocardial+edema%5BTitle%5D)+AND+%22Circulation+Research%22%5BJournal%5D)">The endothelial glycocalyx protects against myocardial edema.</a> Circulation Research. 92 (6), 592-594 (2003).</li>
<li>Williams, T. E., Nagarajan, S., Selvaraj, P., Zhu, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantifying+the+impact+of+membrane+microtopology+on+effective+two-dimensional+affinity%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biol.+Chem%22%5BJournal%5D)">Quantifying the impact of membrane microtopology on effective two-dimensional affinity.</a> J. Biol. Chem. 276 (16), 13283-138 (2001).</li>
<li>Vink, H., Duling, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+Distinct+Luminal+Domains+for+Macromolecules%2C+Erythrocytes%2C+and+Leukocytes+Within+Mammalian+Capillaries%5BTitle%5D)+AND+%22Circulation+Research%22%5BJournal%5D)">Identification of Distinct Luminal Domains for Macromolecules, Erythrocytes, and Leukocytes Within Mammalian Capillaries.</a> Circulation Research. 79, 581-589 (1996).</li>
</ol>

Nie stwierdzono konfliktu interesów.

Wykorzystaliśmy wartości obliczone na podstawie modelu dwuwarstwowego i teorii Hertza do modelowania oddziaływania leukocytów krążących we krwi ze ścianą śródbłonka. Obliczyliśmy, że mikrokosmek na leukocycie o średnicy 50 nm pod obciążeniem 10 pN wgniótłby około 150 nm w glikokaliks, czyli tylko ułamek całkowitej grubości. Wskazuje to, że glikokaliks, o właściwościach zmierzonych w tym eksperymencie, jest istotną barierą dla interakcji komórka-komórka i może być dużą przeszkodą steryczną, którą komórki muszą pokonać pod...

<table><tbody><tr><td>McCoy's Medium</td><td>Gibco</td><td>16600-082</td><td></td></tr><tr><td>Płodowa surowica cielęca</td><td>Hyclon</td><td>SH30070</td><td></td></tr><tr><td>Pożywka do wzrostu komórek śródbłonka Vec</td><td>Technologies</td><td>MCDB-131</td><td></td></tr><tr><td>Połączone ludzkie komórki śródbłonka żyły pępowinowej</td><td>Vec Technologies</td><td>PHUVEC/T-25</td><td></td></tr><tr><td>Kwas siarkowy</td><td>JT Baker</td><td>9681-02</td><td></td></tr><tr><td>Nadtlenek wodoru</td><td>VWR</td><td>BDH3742-1</td><td></td></tr><tr><td>(3-aminopropylo)trietoksysilan</td><td>Aldrich</td><td>440140-100ML</td><td></td></tr><tr><td>Alkohol izopropylowy</td><td>VWR</td><td>BDH8999-4</td><td></td></tr><tr><td>Trypsyna</td><td>Cellgro</td><td>25-054-C1</td><td></td></tr><tr><td>Buforowany roztwór soli Hanka</td><td>Gibco</td><td>14175-095</td><td></td></tr><tr><td>sulfo-NHS-LC-Biotyna</td><td>Thermo Scientific</td><td>21335</td><td></td></tr><tr><td>Koraliki Streptavadin</td><td>Dynabeads</td><td>112.06D</td><td></td></tr><tr><td>MFP-3D AFM</td><td>Azyl Research</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Wsporniki bez końcówek</td><td>Nanoworld</td><td>ARROW-TL1-50</td><td></td></tr><tr><td>Sylwetka SD</td><td>Quickutz</td><td>Silhouette-SD</td><td></td></tr><tr><td>Guma silikonowa</td><td>Stockwell Elastomerics</td><td>SE50-RS</td><td></td></tr><tr><td>30 ml Strzykawki</td><td>Benton Dickinson</td><td>309650</td><td></td></tr><tr><td>18 igieł Benton</td><td>Dickinson</td><td>305196</td><td></td></tr><tr><td>Zestawy przedłużające</td><td>Hospira</td><td>4429-48</td><td></td></tr><tr><td>Zawory 4-drogowe</td><td>Teleflex</td><td>W21372</td><td></td></tr><tr><td>Męskie/żeńskie nasadki portowe</td><td>Smith&#8217; s Medyczna</td> pompa perystaltyczna <td>MX491B</td><td></td></tr><tr><td></td><td>Watson-Marlow</td><td>401U/D</td><td></td></tr><tr><td>Rurka perystaltyczna</td><td>Watson-Marlow</td><td>903.0016.016</td><td></td></tr><tr><td>sterylne filtry</td><td>Pall Life Science</td><td>4652</td><td></td></tr></tbody></table>

kwantyfikacja właściwości mechanicznych glikokaliksu śródbłonka za pomocą mikroskopii sił atomowych

Quantifying the Mechanical Properties of the Endothelial Glycocalyx with Atomic Force Microscopy

Nasze zrozumienie interakcji leukocytów ze ścianą naczynia podczas wychwytywania leukocytów jest ograniczone przez niepełne zrozumienie właściwości mechanicznych warstwy powierzchniowej śródbłonka. Wiadomo, że cząsteczki adhezyjne na leukocytach są rozmieszczone nierównomiernie względem topografii powierzchni 3, że topografia ogranicza tworzenie się wiązań adhezyjnych z innymi powierzchniami 9 oraz że fizjologiczne siły kontaktowe (≈ 5,0 − 10,0 pN na mikrokosmki) mogą ściskać mikrokosmki do zaledwie jednej trzeciej ich długości spoczynkowej, zwiększając dostępność cząsteczek do przeciwległej powierzchni 3, 7. Uważamy, że śródbłonek jest strukturą dwuwarstwową, stosunkowo sztywnym korpusem komórkowym oraz glikokaliksem, miękką ochronną powłoką cukrową na powierzchni światła 6. Wykazano, że glikokaliks może działać jako bariera zmniejszająca przyleganie leukocytów do powierzchni śródbłonka 4. W tym raporcie zaczynamy zajmować się odkształcalnością powierzchni śródbłonka, aby zrozumieć, w jaki sposób sztywność mechaniczna śródbłonka może wpływać na tworzenie wiązań. Komórki śródbłonka wyhodowane w hodowli statycznej nie wykazują ekspresji silnego glikokaliksu, ale komórki wyhodowane w fizjologicznych warunkach przepływu zaczynają zbliżać się do glikokaliksu obserwowanego in vivo 2. Moduł korpusu komórki śródbłonka został zmierzony za pomocą mikroskopii sił atomowych (AFM) i wynosi około 5 do 20 kPa 5. Grubość i strukturę glikokaliksu badano za pomocą mikroskopii elektronowej 8, a moduł glikokaliksu przybliżono metodami pośrednimi, ale według naszej wiedzy nie opublikowano doniesień o bezpośrednim pomiarze modułu glikokaliksu w żywych komórkach. W tym badaniu przedstawiamy eksperymenty z wgłębieniami wykonane za pomocą nowatorskiej sondy AFM na komórkach, które były hodowane w warunkach maksymalizujących ekspresję ich glikokaliksu w celu dokonania bezpośrednich pomiarów modułu i grubości glikokaliksu śródbłonka.

W typowym eksperymencie uzyskano 20 krzywych siła-odległość z określonego obszaru komórki, zazwyczaj w regionie okojądrowym, w pobliżu jądra, ale nie na nim (w odległości ~2 μm). Krzywe zostały wyrównane w celu uwzględnienia ewentualnego dryfu próbki podczas pomiaru, a następnie uśrednione w celu usunięcia szumów wspornika, co przedstawiono na Rysunku 4. Krzywe przeanalizowano i dopasowano do modelu dwuwarstwowego, opracowanego w celu wyznaczenia modułu i grubości cienkich filmów polimerowych 1</sup...

Mechaniczne cechy glikokaliksu śródbłonka zostały zmierzone za pomocą wgłębień za pomocą kulek o rozmiarach mikronowych na wspornikach AFM. Komórki śródbłonka hodowano w niestandardowej komorze w fizjologicznych warunkach przepływu w celu wywołania ekspresji glikokaliksu. Dane analizowano przy użyciu modelu cienkowarstwowego w celu określenia grubości i modułu glikokaliksu.

Kwantyfikacja właściwości mechanicznych glikokaliksu śródbłonka za pomocą mikroskopii sił atomowych

Our  understanding of the interaction of leukocytes and the vessel wall during  leukocyte capture is limited by an incomplete understanding of the ...

Ogólnym celem poniższego eksperymentu jest zmierzenie właściwości mechanicznych glikokaliksu śródbłonka za pomocą mikroskopu sił atomowych lub FM. Osiąga się to poprzez pierwszą hodowlę, monowarstwę komórek śródbłonka pod fizjologicznym przepływem w bioreaktorze w celu zbudowania warstwy glikokaliksu w drugim etapie. Koraliki o wielkości mikronów są przymocowane do wsporników FM i używane jako sonda do pomiaru siły oporu korpusu komórki i glikokaliksu podczas wgłębienia. Następnie krzywe wgłębień są dopasowywane do modelu dwuwarstwowego w celu określenia modułu glikokaliksu i uzyskuje się wyniki grubości, które pokazują, że glikokaliks śródbłonka ma moduł 0,7 kilo paskali i grubość 380 nanometrów na podstawie analizy dwuwarstwowej.Cześć, nazywam się Rick Wa.Jestem kierownikiem Katedry Inżynierii Biomedycznej na Uniwersytecie w Rochester. W ostatnich latach toczy się wiele dyskusji na temat możliwej roli glikokaliksu śródbłonka w zapaleniu, w szczególności na temat tego, czy może on działać jako bariera ochronna zapobiegająca niepożądanej adhezji komórek podczas stanu zapalnego. Jednym z kluczy do rozwiązania pytań, które otaczają tę kwestię, jest możliwość pomiaru właściwości fizycznych, a mianowicie grubości i sztywności tej warstwy, zarówno w normalnych warunkach, jak i podczas odpowiedzi zapalnej.Nazywam się Graham Marsh. Jestem doktorantem na Wydziale Inżynierii Biomedycznej Uniwersytetu w Rochester. Dużym problemem w scharakteryzowaniu glikokaliksu śródbłonka jest to, że jest on niewiarygodnie miękki.Podejście, które wymyśliliśmy, polega na przymocowaniu dużego koralika do końcówki wspornika A i A FM, tak aby zmierzone siły były rozwiązywalne za pomocą A FM.To rozpocznij tę procedurę, zbuduj komorę przepływową, taką jak ta pokazana tutaj, zdolną do wzrostu komórek pod wpływem naprężenia ścinającego 1,0 Pascala. Przygotuj komorę przepływową do eksperymentu, najpierw czyszcząc szkiełka podstawowe w roztworze piranii przez 15 minut. Płukamy je trzykrotnie wodą destylowaną i suszymy w temperaturze 70 stopni Celsjusza przez 30 minut.Następnie pokryj szkiełka amino propylotrixi, cy lane lub apte przez osadzanie z fazy gazowej. Dodać jeden mililitr apte do kolby, która jest przymocowana do komory próżniowej z próbką. Następnie nakręć kolbę i utrzymuj podciśnienie 0,7 bara przez godzinę.W tym czasie trzykrotnie odśwież odkurzacz. Następnie wytnij nową uszczelkę komory przepływowej z arkusza silikonu o grubości 0,4 milimetra za pomocą narzędzia tnącego Silhouette SD. Kanał ma 6,4 milimetra szerokości i 19 milimetrów długości, a średnica zewnętrzna jest przycinana do 35 milimetrów, aby zmieścił się w naczyniu do hodowli azylu.Korzystając z tych wymiarów, oblicz natężenie przepływu niezbędne do wygenerowania czystego naprężenia jednego paskali za pomocą równania pokazanego tutaj. Q oznacza natężenie przepływu. Tau to czysty stres.Mu to lepkość pożywki. H to wysokość kanału, a W to szerokość komory przepływowej. Kolejnym krokiem jest wyrównanie górnej części komory przepływowej z uszczelką w naczyniu do hodowli komórkowych i zabezpieczenie jej pierścieniem magnetycznym.Podłącz porty przepływu w naczyniu do hodowli komórkowej do trzech zaworów falowych z przewodami do 30-mililitrowych strzykawek. Następnie wysterylizuj cały zespół, przepłukując go alkoholem izopropylowym przez pięć minut. Następnie usuń alkohol i pozostaw go do wyschnięcia na powietrzu w chusteczce.Kaptur hodowlany Rozgrzej 4% płodową surowicę cielęcą w podłożu McCoy's do 37 stopni Celsjusza. Po pozostawieniu do wyschnięcia na pięć do 10 minut, wypłucz pozostały alkohol za pomocą 30 mililitrów wstępnie rozgrzanej surowicy cielęcej płodu. Następnie napełnij strzykawki 20 mililitrami pożywki wzrostowej veek MCDB 1 31.Następnie należy zakryć strzykawki, aby zapobiec zanieczyszczeniu. Podczas wyjmowania systemu ze sterylnego kaptura należy założyć nasadkę zbiornika wychwytującego za pomocą igły, która sięga do płynu, aby wciągnąć medium z powrotem do zbiornika znajdującego się przed nim. Na koniec przymocuj sterylne filtry 0,2 mikrona do wlotów powietrza na nasadkach przy następnym pobraniu ludzkiej żyły pępowinowej.Komórki śródbłonka wyhodowane do zbiegu w kolbie T 25. Ponownie zawiesić granulowane komórki w ilości 100 000 komórek na mililitr w pożywce i wciągnąć roztwór do strzykawki. Następnie wstrzyknąć zawiesinę do komory przepływowej przez zawór trójdrogowy.Pozwól komórkom osiąść i przylegać do szklanego podłoża przez dwie godziny. Przed rozpoczęciem przepływu przenieś bioreaktor i komórki do inkubatora, w którym komórki mogą się osiąść i przylegać przez dwie godziny. Rurka łącząca zbiorniki z pompą perystaltyczną przechodzi przez tylną część inkubatora Gdy komórki przylgną, ustaw pompę perystaltyczną na żądane natężenie przepływu.Media przemieszczają się między zbiornikami, tworząc wysokość podnoszenia ciśnienia i przepływ przez bioreaktor, który wytwarza naprężenie ścinające ścianę o wartości jednego paskala. Pozwól komórkom inkubować się z ciągłym przepływem w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez jeden do pięciu dni, aż komora zacznie się zlewać. Aby rozpocząć przygotowanie wspornika, wyczyść końcówkę i wspornik FM w kwasie azotowym przez pięć minut, a następnie spłucz wodą destylowaną.Po wyschnięciu funkcjonalizować wspornik za pomocą apdi w komorze osadzania parowego, jak pokazano wcześniej dla szkiełek szklanych. Następnie przygotuj roztwór pięciu miligramów na mililitr wagowo NHS Sulf O lc, biotyny w buforowanym roztworze soli Hanka. Zanurz wsporniki w roztworze na 15 minut.Ta reakcja sprzęga CY i końcowy hydroksyltlenek i przedstawia cząsteczki biotyny na powierzchni wsporników. Dzień wcześniej zacznij przygotowywać roztwór pożywki wolnej od biotyny, łącząc 20 mililitrów pożywki hodowlanej vexcel zawierającej 20% surowicy z 200 mikrolitrami paciorkowców pokrytych streptem ENC i inkubuj przez 12 godzin podczas obracania. W dniu eksperymentu.Pociągnij kulki magnetyczne do dna probówki za pomocą magnesu na dwie minuty i przenieś supernatant zawierający pożywkę wolną od biotyny do nowej probówki. Wysterylizuj pożywkę, przepuszczając ją przez filtr 0,22 mikrometra i włóż do nowej probówki. Następnym krokiem jest wyjęcie komory przepływowej z naczynia do hodowli komórkowych, a następnie trzykrotne umycie komórek dwoma mililitrami pożywki wolnej od biotyny o temperaturze 37 stopni Celsjusza.Następnie dodaj jeden mikrogram o średnicy 2,4 mikrometra, pozbawione koralików pokrytych Adenem. Dodaj stężenie 10 mikrogramów na mililitr do naczynia do hodowli komórkowych i delikatnie wymieszaj. Następnie skalibruj tib A FM, przymocowując go do listwy paskowej i wciskając w zwykłą szklaną powierzchnię.Aby to osiągnąć, wyląduj końcówką na szklanej powierzchni obok stopki, cofnij końcówkę, a następnie umieść wierzchołek wspornika nad koralikiem i dociśnij przez kilka sekund. Na koniec użyj skalibrowanego wspornika, aby wciąć próbki. Kulki o średnicy 2,4 mikrometra zapewniają większą powierzchnię styku z powierzchnią komórki, dzięki czemu właściwości mechaniczne miękkiej warstwy glikokaliksu można łatwiej wykryć.Aby osiągnąć tę pozycję, wspornik nad komórką w pobliżu jądra komórkowego, użyj miękkiego podejścia końcówki do komórki, aby ustawić wysokość wspornika około trzech mikrometrów nad powierzchnią komórki. Następnie wciąć powierzchnię 20 razy z szybkością jednego mikrometra na sekundę do maksymalnej siły siedmiu. Nanoniutony pozwalają na upływ sześciu sekund między kolejnymi kontaktami.Oblicz grubość warstwy glikokaliksu za pomocą równań związanych z teorią herców. Siła wcięcia F jest opisana tym równaniem, gdzie delta jest głębokością wcięcia. R to promień kuli, a estar to połączony moduł materiałów poddanych naprężeniu.Aby rozdzielić połączony moduł sprężystości estar na składniki komórkowe i glikokaliksowe, należy potraktować warstwę glikokaliksu jako jednolitą, cienką miękką warstwę na powierzchni ciała komórki i użyć dwuwarstwowego modelu Clifforda, a C.In tym równaniu PQ i N są stałe wyznaczone empirycznie na podstawie pasowań polimerowych. M jest stałą z modelu polimerowego, a Z jest związana z grubością cienkiej warstwy lub warstwy glikokaliksu za pomocą równania pokazanego tutaj. Siła mierzona przez A FM mierzona w nanoniutonach zaczyna rosnąć po kontakcie z powierzchnią i początkowo jest zdominowana przez składnik warstwy glikokaliksu.Po ściśnięciu warstwy glikokaliksu ciało komórki staje się głównym składnikiem deformacji. Niebieska dwuwarstwowa linia dopasowania została obliczona przez dopasowanie czterech wolnych parametrów, aby dopasować ją do danych wcięcia pokazanych na czerwono z użytego równania, można określić moduł komórki, glikokaliks, moduł warstwy i grubość warstwy glikokaliksu. Właściwości z 25 komórek zostały skompilowane w pokazany tutaj histogram.Średni moduł warstwy glikokaliksu określono na 0,7 plus minus 0,5 kipa cals, a grubość warstwy glikokaliksu określono na 380 plus minus 50 nanometrów. Takie podejście daje nam narzędzie, którego potrzebowaliśmy, aby odpowiedzieć na fundamentalne pytania dotyczące roli glikokaliksu w regulacji adhezji komórek podczas stanu zapalnego. Jesteśmy teraz w stanie odpowiedzieć na pytania dotyczące tego, w jaki sposób właściwości glikokaliksu zmieniają się podczas stanu zapalnego.W jaki sposób te zmiany są realizowane. Podejście to można rozszerzyć na wiele sposobów. Na przykład, można go użyć do przetestowania nowych, bardziej wyrafinowanych teoretycznych opisów właściwości glikokaliksu.Lub na bardziej praktycznym poziomie, można to wykorzystać do testowania powłok powierzchniowych inspirowanych biologią, zaprojektowanych w celu ochrony wszczepialnych urządzeń przed odpowiedzią immunologiczną gospodarza. Bardzo dziękujemy za zainteresowanie naszą pracą.

quantifying-mechanical-properties-endothelial-glycocalyx-with-atomic

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Bioinżynieria

Określanie właściwości mechanicznych warstwy glikokalyksowej śródbłonka za pomocą mikroskopii sił atomowych

Sztywność macierzy zewnątrzkomórkowej silnie wpływa na wiele zachowań komórek adherentnych. Sztywność macierzy zmienia się przestrzennie w obrębie tkanki i ulega modyfikacjom w różnych stanach chorobowych. W niniejszej pracy opracowujemy metody charakteryzacji zmienności przestrzennej sztywności w normalnej i zwłókniałej tkance płuc myszy z wykorzystaniem mikroindentacji za pomocą mikroskopii sił atomowych.

Mikromechaniczna charakterystyka tkanki płucnej z wykorzystaniem skaningowej mikroskopii siłowej

Ten film prezentuje ilościową mikroskopię poklatkową do oceny zależnej od sztywności macierzy zewnątrzkomórkowej rozprzestrzeniania się Listeria monocytogenes przez komórki śródbłonka. Bardziej miękki hydrożel ułatwia szybsze rozprzestrzenianie się bakterii przez komórki śródbłonka w porównaniu ze sztywniejszymi odpowiednikami, co podkreśla wpływ sztywności matrycy na rozprzestrzenianie się bakterii.

Ilościowa mikroskopia poklatkowa do oceny rozsiewu bakterii zależnego od sztywności macierzy zewnątrzkomórkowej

Glikokaliks śródbłonka/warstwa powierzchniowa śródbłonka jest idealnie badana za pomocą mikroskopii przyżyciowej.  Mikroskopia przyżyciowa jest technicznie trudna w przypadku poruszającego się narządu, takiego jak płuca.   Pokazujemy, w jaki sposób można wykorzystać jednoczesną mikroskopię jasnego pola i mikroskopię fluorescencyjną do oszacowania grubości warstwy powierzchniowej śródbłonka w swobodnie poruszającym się płucu myszy in vivo.

In vivo (in vivo) Pomiar warstwy powierzchniowej śródbłonka płucnego myszy

Ten artykuł demonstruje protokół charakteryzujący właściwości mechaniczne żywych komórek za pomocą mikrowgłębienia za pomocą mikroskopu sił atomowych (AFM).

Pomiar właściwości mechanicznych żywych komórek za pomocą mikroskopii sił atomowych

Opisujemy metodę in vitro, która pozwala na ilościowe określenie rzeczywistej liczby komórek adhezyjnych w monowarstwie komórek śródbłonka.

Kwantyfikacja adhezji komórek śródbłonka in vitro

Przedstawiamy szczegółowe protokoły izolacji aort od myszy i pomiaru ich modułu sprężystości za pomocą mikroskopii sił atomowych.

Pomiar sztywności mysich aort ex vivo za pomocą mikroskopii sił atomowych

Przedstawiamy protokół funkcjonalizacji wsporników mikroskopu sił atomowych (AFM) z pojedynczym limfocytem T i cząstką kulki do badań immunologicznych. Przedstawiono procedury badania wiązania jednoparowych komórek T z komórkami dendrytycznymi przez AFM oraz monitorowania odpowiedzi komórkowej makrofagów w czasie rzeczywistym na pojedynczą cząstkę stałą za pomocą AFM z obrazowaniem fluorescencyjnym.

Funkcjonalizacja wsporników mikroskopu sił atomowych z pojedynczymi limfocytami T lub pojedynczą cząstką do immunologicznej spektroskopii sił pojedynczych komórek

Tutaj prezentujemy protokół oparty na mechanice, który ma na celu zakłócenie połączenia szczelinowego 43 i zmierzenie późniejszego wpływu, jaki ma to na biomechanikę śródbłonka poprzez obserwację trakcji i naprężeń międzykomórkowych.

Zaburzanie biomechaniki śródbłonka poprzez zakłócenie strukturalne Connexin 43

Litografia w bliskim UV i mikroskopia siły trakcyjnej są połączone w celu pomiaru sił komórkowych na mikrowzorzystych hydrożelach. Ukierunkowane uwalnianie pojedynczych komórek pod wpływem światła umożliwia dużą liczbę pomiarów na tej samej próbce.

Kontrola adhezji komórek za pomocą technik modelowania hydrożelu do zastosowań w mikroskopii sił trakcyjnych

Ilościowe określenie powierzchni styku i siły wywieranej przez końcówkę sondy mikroskopu sił atomowych (AFM) na powierzchnię próbki umożliwia określenie właściwości mechanicznych w nanoskali. Omówiono najlepsze praktyki w zakresie wdrażania nanotwardości opartej na wspornikach AFM w powietrzu lub płynie na miękkich i twardych próbkach w celu pomiaru modułu sprężystości lub innych właściwości nanomechanicznych.

Mikroskopia sił atomowych Nanotwardość oparta na wspornikach: pomiary właściwości mechanicznych w nanoskali w powietrzu i płynie

Ten protokół wizualizuje, jak przygotować kriosekcje mysiej tkanki płucnej, przeprowadzić eksperymenty z mapą siły pod mikroskopią sił atomowych i przeanalizować dane w celu określenia modułu Younga natywnej mysiej błony podstawnej płuc.

Wyodrębnianie modułu Younga natywnych mysich błon podstawnych płuc z map sił pochodnych mikroskopii sił atomowych

Poznaj metodę pomiaru właściwości mechanicznych glikokaliksu śródbłonka za pomocą mikroskopii sił atomowych AFM. Technika ta umożliwia bezpośrednie określenie modułu Younga i grubości tej warstwy.

Kwantyfikacja właściwości mechanicznych glikokaliksu śródbłonka za pomocą mikroskopii sił atomowych

Przeglądaj więcej filmów