Name: Zastosowanie chemostatów w biologii systemów mikrobiologicznych (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-10-14T20:45:00.000+00:00
Duration: 13 min 19 s
Description: Odkryj zastosowanie chemostatów w biologii systemów mikrobiologicznych przy użyciu modelowania matematycznego. Ta metoda umożliwia precyzyjną kontrolę wzrostu komórek i badanie regulacji fizjologii mikroorganizmów.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Ta praca była wspierana przez fundusze startowe z Uniwersytetu Nowojorskiego. Dziękujemy Maitreyi Dunham i Mattowi Brauerowi, którzy jako pierwsi opracowali metodę wykorzystania bioreaktorów Sixfors jako chemostatów.

Zasada ciągłego hodowania za pomocą chemostatu może być realizowana w różnych implementacjach. We wszystkich chemostatach niezbędne jest posiadanie: 1) metod utrzymania sterylności wszystkich składników, 2) dobrze wymieszanej kultury, 3) odpowiedniego napowietrzenia naczynia hodowlanego oraz 4) niezawodnego sposobu dodawania pożywki i usuwania kultur. W tym miejscu opisujemy zastosowanie bioreaktora Sixfors (Infors Inc) jako chemostatu przy użyciu metod, które można łatwo dostosować do alternatywnych konfiguracji.
1. Montaż statków Chemostat
<ol>
	<li>Włącz Sixfors za pomocą wyłącznika głównego.</li>
	<li>Dokładnie wypłucz naczynie chemostatu, zespół mieszadła i dołączoną rurkę wodą dejonizowaną (DI). Sprawdź wszystkie rurki i o-ringi i wymień wszystkie zużyte elementy.</li>
	<li>Upewnij się, że podstawa nośna wału napędowego jest skierowana do góry w szklanym naczyniu i że górna część wału napędowego jest zatrzaśnięta w obudowie mieszadła. Umieść zespół mieszadła w szklanym naczyniu, upewniając się, że spód wału napędowego jest osadzony we wsporniku wału napędowego. Użyj clamp, aby przymocować zespół mieszadła do szklanego naczynia.</li>
	<li>Napełnij naczynie około 300 ml wody DI.</li>
	<li>Zdejmij nakrętki z sondy tlenu rozpuszczonego (dO2 ) i sprawdź poziom elektrolitu, odkręcając dolną obudowę i upewniając się, że dolna obudowa jest wypełniona do połowy roztworem elektrolitu. Przykręć dolną obudowę i włóż do portu na naczyniu chemostatu. Dokręć do oporu palcami.</li>
	<li>Weź sondę pH i wyjmij ją z bufora do przechowywania (3 M KCl). Zdejmij nasadkę sondy pH i podłącz ją do fermentora 1. Korzystając z ekranu sterowania Sixfors, przejdź do menu parametrów fermentora i wybierz "kalibruj pH". Umieść sondę pH w standardowym buforze pH 7 i zapisz odczyt jako wysoki odczyt. Powtórz z buforem pH 4 i zapisz odczyt jako niski odczyt. Odłącz sondę pH od fermentora, umyj ją wodą demineralizowaną i włóż sondę do portu w naczyniu chemostatu. Dokręć do oporu palcami.</li>
	<li>Umieść naczynie z chemostatem w stojaku. Na naczyniu zanotuj na którym fermentorze (1-6) sonda pH została podłączona i skalibrowana. Umieść nasadkę sondy pH na sondzie pH. Za pomocą folii szczelnie przykryj górną część sondy dO2.</li>
	<li>Zawiń folię na końcach rurki przymocowanej do naczynia chemostatu.</li>
	<li>Powtórz kroki 1.2-1.8 dla wszystkich statków.</li>
	<li>Wysterylizuj naczynia, sterylizując je w autoklawie przez 15 minut w cyklu płynnym.</li>
</ol>
2. Przygotowanie nośnika
<ol>
	<li>Ustal graniczny zakres stężeń składnika odżywczego, hodując kultury okresowe o różnych stężeniach składników odżywczych. Składnik odżywczy jest ograniczony w zakresie, w którym końcowa gęstość komórek jest funkcją liniową początkowego stężenia składnika odżywczego (ryc. 4). Dobrze dobrać stężenie składników odżywczych w zakresie granicznym. Przykłady standardowego składu pożywki do badań z Saccharomyces cerevisiae są dostępne w 7-11.</li>
	<li>Autoklaw należy opróżnić pusty gąsior, który jest zaślepiony gumową zatyczką zawierającą wlot powietrza i wylot mediów, po uprzednim upewnieniu się, że koniec rurki z mediami jest pokryty folią.</li>
	<li>W osobnym naczyniu przygotować 10 L podłoża</li>.
	<li>Podłącz kubek filtrujący o pojemności 500 ml do butelki z pożywką o pojemności 100 ml. Wyjmij bawełniany filtr za pomocą kleszczyków wysterylizowanych w etanolu i natychmiast podłącz do portu filtracji w gąsieniczku.</li>
	<li>Przymocuj gąsień do źródła podciśnienia i przefiltruj sterylizację mediów, dodając je do kubka filtra.</li>
	<li>Po zakończeniu filtracji mediów zamknij port filtracji metalowym zaciskiem.</li>
</ol>
3. Kalibracja sond dO2 i konfiguracja Chemostatu
<ol>
	<li>Po autoklawowaniu naczyń chemostatu i pozostawieniu ich do ostygnięcia, umieścić naczynie w odpowiednim płaszczu grzewczym. Podłącz sondę temperatury, sondę pH i sondę dO2. Pozostaw naczynie przy włączonym zasilaniu przez co najmniej 6 godzin, aby umożliwić polaryzację sond dO2.</li>
	<li>Umieść koniec każdej rurki odpływowej w osobnym pojemniku zbiorczym. Podłącz dopływ powietrza przez autoklawowany filtr i włącz przepływ powietrza. Woda w każdym naczyniu powinna wypływać z rur odpływowych, co świadczy o tym, że wszystkie uszczelki są prawidłowo uformowane.</li>
	<li>Dostosuj wysokość rurki odpływowej zgodnie z żądaną objętością roboczą (np. 300 ml). Używamy linijki, która jest oznaczona rozmieszczeniem rurek skalibrowanych do różnych objętości roboczych.</li>
	<li>Podłączyć gąsiorek z pożywką do naczynia chemostatu. Używaj etanolu, aby końce rurek były jak najbardziej sterylne. Przewlecz rurkę pompy przez pompę i otwórz zacisk. Ręcznie nacisnąć pompę, aż pożywka zacznie spływać do naczynia chemostatu. Odłącz rurkę od pompy, media powinny swobodnie przepływać do naczynia chemostatu. Gdy media dotrą do rury odpływowej, ponownie podłącz rurkę do pompy i clamp.</li>
	<li>Uruchom program podstawowy z wirnikiem ustawionym na 400 obr./min i temperaturą ustawioną na 30 °C.</li>
	<li>W celu kalibracji sond dO2 należy wyłączyć dopływ powietrza i przełączyć się na azot gazowy. Odczekaj co najmniej godzinę i zapisz wartość pomiaru jako "niski odczyt". Przełącz się z powrotem na dopływ powietrza (tj. zawierający stężenie tlenu w otoczeniu), odczekaj co najmniej jedną dodatkową godzinę i zapisz pomiar jako "wysoki odczyt".</li>
	<li>Rozpocznij rejestrację danych za pomocą oprogramowania Iris.</li>
</ol>
4. Szczepienie
<ol>
	<li>Użyj 70% etanolu do sterylizacji górnej części naczynia hodowlanego.</li>
	<li>Zdjąć z górnej części naczynia i odpipetować 1 ml kultury na noc do naczynia z chemostatem. Dokręć.</li>
	<li>Wskaż czas inokulacji w Iris.</li>
	<li>Odczekaj około 24 godzin, aż posiewy osiągną wczesną fazę stacjonarną. Wraz ze wzrostem kultury rozpuszczony tlen i pH będą się zmniejszać. W przypadku mediów ograniczających stężenie glukozy tlen rozpuszczony powróci do ~100% w fazie stacjonarnej. W przypadku innych ograniczeń składników odżywczych rozpuszczony tlen pozostanie <100% w fazie stacjonarnej.</li>
</ol>
5. Uruchamianie pomp i osiąganie stanu ustalonego
<ol>
	<li>Szybkość rozcieńczania oblicza się, dzieląc natężenie przepływu (ilość pożywki wpływającej do naczynia na godzinę) przez objętość kultury. Na przykład, przy użyciu objętości 300 ml stopień rozcieńczenia 0,1 oznacza, że co godzinę do kultury dodaje się 30 ml pożywki. Ponieważ system znajduje się pod dodatnim ciśnieniem, ta sama objętość jest usuwana z naczynia, zapewniając, że kultura jest stale rozcieńczana. Można zastosować szereg szybkości rozcieńczania (D), które nie przekraczają maksymalnej szybkości wzrostu (μmax) komórek, powyżej której komórki zostaną wypłukane z chemostatu.</li>
	<li>Wybierz ustawienia pompy, które określają liczbę sekund, przez którą pompa jest włączona i wyłączona, aby ustalić żądane natężenie przepływu. Pompa dostarcza media z szybkością ~0,11 ml/sek.</li>
	<li>Zdefiniuj program za pomocą interfejsu Sixfors, który określa czas pracy pompy, temperaturę i prędkość obrotową wirnika. Uruchom program.</li>
	<li>Opróżnij pojemniki zbiorcze z płynu i zapisz czas.</li>
	<li>Po upływie co najmniej dwóch godzin użyj cylindra z podziałką, aby zmierzyć, ile pożywki zostało usunięte z naczynia. Będzie to równe objętości, która została dodana do naczynia z chemostatem. Obliczyć szybkość rozcieńczania (D = Vścieki/V kultura/czas). Dostosuj ustawienia pompy, jeśli obliczona szybkość rozcieńczania nie odpowiada żądanej szybkości rozcieńczania.</li>
	<li>W stanie stacjonarnym gęstość komórek w chemostacie nie zmienia się w czasie. Można to zmierzyć bez zakłócania hodowli poprzez pobieranie próbek odpływu. Operacyjnie definiujemy osiągnięcie stanu ustalonego jako identyczne pomiary gęstości komórek, które są oddzielone podwojeniem co najmniej jednej populacji. Osiągnięcie stanu stacjonarnego zajmie około ośmiu pokoleń kultur po rozpoczęciu rozcieńczania kultur. W stanie stacjonarnym komórki rosną wykładniczo (tj. stałe tempo wzrostu w czasie) w warunkach ograniczonej ilości składników odżywczych. Czas podwojenia populacji (czas generacji) wynosi ln(2)/D.</li>
	<li>Kontynuuj okresowe pomiary objętości ścieków przez cały czas trwania eksperymentu, aby zapewnić utrzymanie stałej szybkości rozcieńczenia.</li>
</ol>
6. Zastosowanie 1: Badanie komórek rosnących w różnym tempie w warunkach stanu ustalonego
<ol>
	<li>W stanie stacjonarnym w chemostacie szybkość wzrostu populacji komórek jest równa szybkości rozcieńczenia. Poprzez systematyczną zmianę szybkości rozcieńczania możliwe jest hodowanie komórek w różnym tempie. Umożliwia to systematyczne badanie parametrów fizjologicznych, które zmieniają się wraz z tempem wzrostu, w tym objętości komórki, etapu cyklu komórkowego i odporności na stres. Ponadto w komórkach rosnących w różnym tempie można badać profile w stanie stacjonarnym globalnych poziomów mRNA, białek i metabolitów. Istnieją dwa sposoby pozyskiwania próbek:</li>
	<li>Małe próbki można uzyskać pasywnie, umieszczając koniec rurki odpływowej w probówce o pojemności 1,5 ml lub 15 ml. Próbkę o objętości 1-5 ml można uzyskać w ciągu kilku minut (w zależności od natężenia przepływu). Na podstawie tych próbek można zmierzyć wiele parametrów fizjologicznych.</li>
	<li>Analiza ekspresji genów lub metabolitów wymaga większych próbek, które należy uzyskać tak szybko, jak to możliwe. Umieść koniec rurki odpływowej w stożkowej rurce o pojemności 15 ml. Odkręć mocującą metalowy koniec rurki odprowadzającej ścieki i delikatnie dociśnij. Próbka o objętości ~10 ml szybko wypełni probówkę. Należy pamiętać, że objętość w naczyniu chemostatu uległa zmianie. W przypadku pobierania wielu kolejnych próbek może być konieczne zmniejszenie przepływu w celu utrzymania stałej szybkości rozcieńczania.</li>
</ol>
7. Aplikacja 2: Precyzyjny pomiar różnic w tempie wzrostu między genotypami w kontrolowanych środowiskach przy użyciu testów konkurencji opartych na cytometrii przepływowej
<ol>
	<li>Chemostaty można wykorzystać do dokładnego ilościowego określenia wpływu stężenia składników odżywczych na różnice w tempie wzrostu (tj. dopasowaniu) między różnymi tłami genetycznymi. Poprzez wspólną hodowlę szczepów znakowanych różnymi białkami fluorescencyjnymi określa się tempo zmian względnej liczebności podczas wykładniczego wzrostu. Przeprowadzenie tego testu przy różnych wskaźnikach rozcieńczenia (D) pozwala na badanie wpływu stężenia składników odżywczych (s) na różnice w dopasowaniu.</li>
	<li>Ustalić kultury w stanie stacjonarnym obu szczepów w oddzielnych naczyniach chemostatu o identycznych szybkościach rozcieńczenia i objętości 300 ml.</li>
	<li>Biernie pobrać 1 ml próbki z każdego naczynia. Odwirować komórki, ponownie zawiesić w roztworze soli fizjologicznej buforowanej fosforanami (PBS) i umieścić w temperaturze 4 °C. Próbki te zawierają jednorodne próbki komórek, które są kontrolne do późniejszej analizy za pomocą cytometrii przepływowej.</li>
	<li>Umieść rurkę odpływową z jednego naczynia w autoklawizowanym cylindrze miarowym. Odkręć mocującą metalowy koniec rurki odpływowej i delikatnie dociśnij, aby usunąć komórki z chemostatu. Gdy objętość osiągnie 150 ml, przywróć metalowy koniec rurki odpływowej do pierwotnego położenia (300 ml). Powtórzyć z drugim naczyniem, używając innego cylindra z podziałką.</li>
	<li>Użyj 70% etanolu, aby utrzymać sterylność, jednocześnie odkręcając z górnej części naczynia chemostatu. Umieścić lejek w otworze i wlać 150 ml z drugiej kultury do naczynia chemostatu. Dokręć. Powtórz z drugim naczyniem, używając drugiego lejka. Każde naczynie chemostatu zawiera teraz mieszaninę tych dwóch szczepów.</li>
	<li>Pobrać 1 ml próbki z każdego naczynia, stosując bierne pobieranie próbek co 2-6 godzin. Odwirować komórki, ponownie zawiesić w PBS i przechowywać w temperaturze 4 °C. Kontynuować pobieranie próbek przez 2-3 dni, dokładnie odnotowując czas pobrania każdej próbki.</li>
	<li>Pod koniec eksperymentu sonikować i rozcieńczać próbki do ~2 x 106 komórek/ml. Za pomocą cytometrii przepływowej zmierz proporcję dwóch szczepów w każdej próbce. Ponieważ oba szczepy rosną wykładniczo, względna różnica w tempie wzrostu jest określana przez regresję liniową ln(szczep1/szczep2) w czasie (mierzonym w pokoleniach). Nachylenie regresji to proporcjonalna różnica w tempie wzrostu (tj. przewadze dopasowania) jednego szczepu w stosunku do drugiego.</li>
	<li>Ponieważ kultura mieszana może potrzebować trochę czasu, aby osiągnąć nowy stan ustalony, wczesne punkty czasowe mogą słabo pasować do regresji. Ten problem najlepiej rozwiązać, pozwalając na upływ 2-3 pokoleń przed rozpoczęciem próbkowania lub usunięciem wczesnych punktów, które są wyraźnymi wartościami odstającymi. I odwrotnie, gdy jeden szczep prześcignął drugi, dane nie są już przydatne i te punkty powinny zostać wykluczone.</li>
</ol>
8. Zastosowanie 3: Ewolucja eksperymentalna
<ol>
	<li>Eksperymentalna ewolucja przeprowadzona na chemostatach selekcjonuje mutanty, które mają zwiększoną sprawność w środowisku ubogim w składniki odżywcze. Selekcja odbywa się na ogół przez setki pokoleń.</li>
	<li>Ustalić kulturę chemostatu w stanie ustalonym przy użyciu szczepu o znanym genotypie (i najlepiej znanej sekwencji genomu) i określonym ograniczeniu składników odżywczych.</li>
	<li>Aby utrzymać "zapis kopalny" populacji adaptującej, należy biernie pobierać próbki chemostatu co 2-3 dni i przechowywać próbkę w 15% glicerolu w temperaturze -80 °C.</li>
	<li>Monitoruj zbiornik pożywki i w razie potrzeby uzupełnij ją świeżymi nośnikami.</li>
	<li>Utrzymuj wykładniczo rosnącą kulturę przez kilkaset pokoleń.</li>
	<li>Po zakończeniu płytki selekcyjnej próbka komórek na stałych płytkach agarowych. Po tym, jak komórki wyrosną w kolonie, wybierz bezstronną próbkę kolonii za pomocą wykałaczek i zaszczep klony w indywidualnych dołkach 96-dołkowej płytki zawierającej 100 μl pożywki. Pozostawić próbki klonów do wzrostu przez noc, dodać 100 μl 30% glicerolu i przechowywać w temperaturze -80 °C.</li>
	<li>Scharakteryzować klony poprzez sekwencjonowanie całego genomu i przeprowadzenie testów fenotypowych, w tym ocenę przydatności, przy użyciu powszechnego fluorescencyjnie znakowanego szczepu referencyjnego, jak opisano w aplikacji 2.</li>
</ol>

<ol><li>Ingraham, J. L., Maaloe, O., Neidhardt, F. C. Growth of the Bacterial Cell. , Sinauer Associates, Inc. (1983).</li>
<li><a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=%22Cell+Growth%3A+Control+of+Cell+Size%22">Cell Growth: Control of Cell Size</a>. Hall, M. N., Raff, M. C., Thomas, G. , CSHL Press. (2004).</li>
<li>Monod, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((La+technique+de+culture+continue%2C+theorie+et+applications%5BTitle%5D)+AND+%22Ann.+Inst.+Pasteur%22%5BJournal%5D)">La technique de culture continue, theorie et applications.</a> Ann. Inst. Pasteur. 79, 390-410 (1950).</li>
<li>Novick, A., Szilard, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Description+of+the+chemostat%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Description of the chemostat.</a> Science. 112, 715-716 (1950).</li>
<li>Kjeldgaard, N. O., Maaloe, O., Schaechter, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+transition+between+different+physiological+states+during+balanced+growth+of+Salmonella+typhimurium%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Gen.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">The transition between different physiological states during balanced growth of Salmonella typhimurium.</a> J. Gen. Microbiol. 19, 607-616 (1958).</li>
<li>Maaloe, O., Kjeldgaard, N. O. Control of macromolecular synthesis. , W.A. Benjamin. (1966).</li>
<li>Saldanha, A. J., Brauer, M. J., Botstein, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nutritional+Homeostasis+in+Batch+and+Steady-State%5BTitle%5D)+AND+%22Culture+of+Yeast.+Mol.+Biol.+Cell%22%5BJournal%5D)">Nutritional Homeostasis in Batch and Steady-State.</a> Culture of Yeast. Mol. Biol. Cell. 15, 4089-4104 (2004).</li>
<li>Boer, V. M., Crutchfield, C. A., Bradley, P. H., Botstein, D., Rabinowitz, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Growth-limiting+intracellular+metabolites+in+yeast+growing+under+diverse+nutrient+limitations%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Biol.+Cell%22%5BJournal%5D)">Growth-limiting intracellular metabolites in yeast growing under diverse nutrient limitations.</a> Mol. Biol. Cell. 21, 198-211 (2010).</li>
<li>Boer, V. M., de Winde, J. H., Pronk, J. T., Piper, M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+genome-wide+transcriptional+responses+of+Saccharomyces+cerevisiae+grown+on+glucose+in+aerobic+chemostat+cultures+limited+for+carbon%2C+nitrogen%2C+phosphorus%2C+or+sulfur%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biol.+Chem%22%5BJournal%5D)">The genome-wide transcriptional responses of Saccharomyces cerevisiae grown on glucose in aerobic chemostat cultures limited for carbon, nitrogen, phosphorus, or sulfur.</a> J. Biol. Chem. 278, 3265-3274 (2003).</li>
<li>Brauer, M. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Coordination+of+growth+rate%2C+cell+cycle%2C+stress+response%2C+and+metabolic+activity+in+yeast%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Biol.+Cell%22%5BJournal%5D)">Coordination of growth rate, cell cycle, stress response, and metabolic activity in yeast.</a> Mol. Biol. Cell. 19, 352-367 (2008).</li>
<li>Gresham, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Adaptation+to+diverse+nitrogen-limited+environments+by+deletion+or+extrachromosomal+element+formation+of+the+GAP1+locus%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Adaptation to diverse nitrogen-limited environments by deletion or extrachromosomal element formation of the GAP1 locus.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 107, 18551-18556 (2010).</li>
<li>Regenberg, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Growth-rate+regulated+genes+have+profound+impact+on+interpretation+of+transcriptome+profiling+in+Saccharomyces+cerevisiae%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Biol%22%5BJournal%5D)">Growth-rate regulated genes have profound impact on interpretation of transcriptome profiling in Saccharomyces cerevisiae.</a> Genome Biol. 7, R107(2006).</li>
<li>Castrillo, J. I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Growth+control+of+the+eukaryote+cell%3A+a+systems+biology+study+in+yeast%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biol%22%5BJournal%5D)">Growth control of the eukaryote cell: a systems biology study in yeast.</a> J. Biol. 6, 4(2007).</li>
<li>Cipollina, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Revisiting+the+role+of+yeast+Sfp1+in+ribosome+biogenesis+and+cell+size+control%3A+a+chemostat+study%5BTitle%5D)+AND+%22Microbiology%22%5BJournal%5D)">Revisiting the role of yeast Sfp1 in ribosome biogenesis and cell size control: a chemostat study.</a> Microbiology. 154, 337-346 (2008).</li>
<li>Gresham, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((System-level+analysis+of+genes+and+functions+affecting+survival+during+nutrient+starvation+in+Saccharomyces+cerevisiae%5BTitle%5D)+AND+%22Genetics%22%5BJournal%5D)">System-level analysis of genes and functions affecting survival during nutrient starvation in Saccharomyces cerevisiae.</a> Genetics. 187, 299-317 (2011).</li>
<li>Levy, S. F., Ziv, N., Siegal, M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bet+hedging+in+yeast+by+heterogeneous%2C+age-correlated+expression+of+a+stress+protectant%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Biol%22%5BJournal%5D)">Bet hedging in yeast by heterogeneous, age-correlated expression of a stress protectant.</a> PLoS Biol. 10, e1001325(2012).</li>
<li>Kao, K. C., Sherlock, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+characterization+of+clonal+interference+during+adaptive+evolution+in+asexual+populations+of+Saccharomyces+cerevisiae%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Genet%22%5BJournal%5D)">Molecular characterization of clonal interference during adaptive evolution in asexual populations of Saccharomyces cerevisiae.</a> Nat. Genet. 40, 1499-1504 (2008).</li>
<li>Gresham, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+repertoire+and+dynamics+of+evolutionary+adaptations+to+controlled+nutrient-limited+environments+in+yeast%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Genet%22%5BJournal%5D)">The repertoire and dynamics of evolutionary adaptations to controlled nutrient-limited environments in yeast.</a> PLoS Genet. 4, e1000303(2008).</li>
<li>Wenger, J. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hunger+Artists%3A+Yeast+Adapted+to+Carbon+Limitation+Show+Trade-Offs+under+Carbon+Sufficiency%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Genet%22%5BJournal%5D)">Hunger Artists: Yeast Adapted to Carbon Limitation Show Trade-Offs under Carbon Sufficiency.</a> PLoS Genet. 7, e1002202(2011).</li>
<li>Dunham, M. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characteristic+genome+rearrangements+in+experimental+evolution+of+Saccharomyces+cerevisiae%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Characteristic genome rearrangements in experimental evolution of Saccharomyces cerevisiae.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 99, 16144-16149 (2002).</li>
<li>Ronen, M., Botstein, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transcriptional+response+of+steady-state+yeast+cultures+to+transient+perturbations+in+carbon+source%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Transcriptional response of steady-state yeast cultures to transient perturbations in carbon source.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 103, 389-394 (2006).</li>
<li>Kresnowati, M. T. A. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((When+transcriptome+meets+metabolome%3A+fast+cellular+responses+of+yeast+to+sudden+relief+of+glucose+limitation%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Sys.+Biol%22%5BJournal%5D)">When transcriptome meets metabolome: fast cellular responses of yeast to sudden relief of glucose limitation.</a> Mol. Sys. Biol. 2, 49(2006).</li>
<li>Tu, B. P., Kudlicki, A., Rowicka, M., McKnight, S. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Logic+of+the+yeast+metabolic+cycle%3A+temporal+compartmentalization+of+cellular+processes%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Logic of the yeast metabolic cycle: temporal compartmentalization of cellular processes.</a> Science. 310, 1152-1158 (2005).</li>
<li>Tzur, A., Kafri, R., LeBleu, V. S., Lahav, G., Kirschner, M. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell+Growth+and+Size+Homeostasis+in+Proliferating+Animal+Cells%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Cell Growth and Size Homeostasis in Proliferating Animal Cells.</a> Science. 325, 167-171 (2009).</li>
<li>Conlon, I., Raff, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Size+control+in+animal+development%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Size control in animal development.</a> Cell. 96, 235-244 (1999).</li>
<li>Conlon, I. J., Dunn, G. A., Mudge, A. W., Raff, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Extracellular+control+of+cell+size%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Extracellular control of cell size.</a> Nat. Cell Biol. 3, 918-921 (2001).</li>
<li>Fussmann, G. F., Ellner, S. P., Shertzer, K. W., Hairston, N. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Crossing+the+hopf+bifurcation+in+a+live+predator-prey+system%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Crossing the hopf bifurcation in a live predator-prey system.</a> Science. 290, 1358-1360 (2000).</li>
<li>Cohen, E. P., Eagle, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+simplified+chemostat+for+the+growth+of+mammalian+cells%3A+characteristics+of+cell+growth+in+continuous+culture%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Exp.+Med%22%5BJournal%5D)">A simplified chemostat for the growth of mammalian cells: characteristics of cell growth in continuous culture.</a> J. Exp. Med. 113, 467-474 (1961).</li>
</ol>

Autorzy oświadczają, że nie mają konkurencyjnych interesów finansowych.

Chemostaty umożliwiają hodowlę drobnoustrojów w warunkach kontrolowanego wzrostu w stanie ustalonym. Komórki rosną w sposób ciągły ze stałą szybkością, co skutkuje niezmiennym środowiskiem zewnętrznym. Jest to przeciwieństwo metod hodowli okresowej, w których środowisko zewnętrzne stale się zmienia, a tempo wzrostu komórek jest determinowane przez złożoną interakcję środowiska i genotypu. Tak więc główną zaletą hodowli drobnoustrojów w chemostatach w porównaniu z hodowlami wsadowymi jest możliwość eksperymentalnego kontr...

Wzrost komórek jest regulowany przez złożone sieci oddziałujących na siebie czynników genetycznych i środowiskowych1,2. Wieloczynnikowa regulacja wzrostu komórek wymaga podejścia systemowego do jego badania. Jednak rygorystyczne badania nad regulowanym wzrostem komórek są kwestionowane przez trudności w eksperymentalnym kontrolowaniu tempa wzrostu komórek. Co więcej, nawet w najprostszych eksperymentach warunki zewnątrzkomórkowe są często dynamiczne i złożone, ponieważ komórki nieustannie zmieniają swoje środowisko w miarę namnażania się. Rozwiązaniem tych problemów jest chemostat: metoda hodowli komórek, która umożliwia eksperymentalną kontrolę tempa wzrostu komórek w określonych, niezmiennych i kontrolowanych środowiskach.
Metoda ciągłego hodowania za pomocą chemostatu została niezależnie opisana przez Monod3 oraz Novick & Szilard4 w 1950 roku. Zgodnie z pierwotną koncepcją, komórki są hodowane w ustalonej objętości pożywki, która jest stale rozcieńczana przez dodawanie nowych pożywek i jednoczesne usuwanie starych pożywek i komórek (ryc. 1). Sprzężone zwykłe równania różniczkowe (ryc. 2) opisują szybkość zmian gęstości komórek (x) i stężenie składnika odżywczego (s) ograniczającego wzrost w naczyniu chemostatu. Co ważne, ten układ równań przewiduje pojedynczy (niezerowy) stabilny stan ustalony (rysunek 3) z niezwykłą implikacją, że w stanie ustalonym właściwa szybkość wzrostu komórek (tj. wykładnicza stała szybkości wzrostu) jest równa szybkości, z jaką kultura jest rozcieńczana (D). Poprzez różnicowanie szybkości rozcieńczania możliwe jest ustalenie populacji komórek w stanie ustalonym przy różnych szybkościach wzrostu i w różnych warunkach ograniczenia składników odżywczych.
Eksperymentalna kontrola tempa wzrostu za pomocą chemostatów była kluczowa dla rozwoju zrozumienia, jak fizjologia komórki zmienia się wraz z tempem wzrostu5,6. Jednak ta dawna podstawa metod mikrobiologicznych stawała się coraz bardziej niejasna podczas eksplozji badań biologii molekularnej pod koniec XX wieku. Obecnie ponowne zainteresowanie kontrolą wzrostu zarówno drobnoustrojów, jak i organizmów wielokomórkowych oraz pojawienie się metod analizy na poziomie systemu w skali genomu ponownie zmotywowały do stosowania chemostatów. W tym miejscu opisujemy trzy zastosowania, które wykorzystują precyzyjną kontrolę tempa wzrostu komórek i środowiska zewnętrznego, które są wyjątkowo możliwe przy użyciu chemostatów. Po pierwsze, opisujemy zastosowanie chemostatów do zbadania, w jaki sposób obfitość tysięcy biomolekuł - takich jak transkrypty i metabolity - jest koordynowana z tempem wzrostu. Po drugie, opisujemy, w jaki sposób chemostaty mogą być wykorzystywane do uzyskania precyzyjnych szacunków różnic w tempie wzrostu między różnymi genotypami w środowiskach o ograniczonej zawartości składników odżywczych za pomocą eksperymentów konkurencyjnych. Po trzecie, opisujemy, w jaki sposób chemostaty mogą być wykorzystywane do badania ewolucji adaptacyjnej komórek rosnących w środowiskach stale ubogich w składniki odżywcze. Przykłady te ilustrują sposób, w jaki chemostaty umożliwiają badania na poziomie systemowym regulacji wzrostu komórek, interakcji genów ze środowiskiem i ewolucji adaptacyjnej.

<table><tbody><tr><td>Infors-HT Sixfors Chemostat</td><td>Odpowiednie Zasoby Techniczne, Inc.</td><td></td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>Szklana butelka 9,5 l</td><td>Fisher Scientific</td><td>02-887-1</td><td>Do naczynia na media i</td></tr><tr><td>węża Pinchcock</td><td>Fisher Scientific</td><td>05-867</td><td>Do naczynia na media i</td></tr><tr><td>korka do węża, rozmiar 12, zielony neopren</td><td>Cole-Palmer</td><td>EW-62991-42</td><td>do naczynia na media i</td></tr><tr><td>prostego złącza</td><td>węża Cole-Palmer</td><td>EW-30703-02</td><td>do naczynia na media i węża</td></tr><tr><td>ogólnego Opaski celowe 4 w</td><td>Fisher Scientific NC9557052</td><td></td><td>do naczynia na media i rurki wężowej</td></tr><tr>, małe <td>części</td><td>z gumy silikonowej</td><td>B000FMWTDE</td><td>do naczynia na media i rurki wężowej</td></tr><tr><td>, silikon, 3/8 cala OD</td><td>Fisher Scientific</td><td>02-587-1Q</td><td>do naczynia medialnego i rurki wężowej</td></tr><tr><td>, silikon, 7/32 w OD</td><td>Fisher Scientific</td><td>02-587-1E</td><td>do naczynia na media i węża</td></tr><tr><td>Rurka, Stal nierdzewna, 3/16 cala średnicy zewnętrznej</td><td>McMaster-Carr</td><td>6100K164</td><td>Do zbiornika na media i</td></tr><tr><td>wężyka, Stal nierdzewna, 3/8 cala średnicy zewnętrznej</td><td>McMaster-Carr</td><td>6100K161</td><td>Do złączy zbiornika na media i</td></tr><tr><td>haka</td> wężowego <td>Fisher Scientific</td><td>14-66-18Q</td><td>Do naczynia na media i</td></tr><tr><td>zacisku zapadkowego</td><td>węża Cole-Palmer</td><td>EW-06403-11</td><td>Do zbiornika na media i węża</td></tr><tr><td>Luer, żeński</td><td>Cole-Palmer</td><td>EW-45512-34</td><td>do naczynia na media i węża</td></tr><tr><td>Luer, męski</td><td>Cole-Palmer</td><td>EW-45513-04</td><td>do naczynia na media i</td></tr><tr><td>węża Millipore Aervent MTGR05010 62 mm Filtr, 0,2 &mu; m</td><td>Fisher Scientific</td><td>MTGR05010</td><td>do zbiornika na media i węża</td></tr><tr><td>Filtry PTFE Acrodisc CR 13 mm, 0,2 &mu; </td><td>m Fisher Scientific NC9131037</td><td></td><td>do naczynia na media i węża Rurka</td></tr><tr><td>przepływowa z bezpośrednim odczytem do powietrza</td><td>Cole-Palmer</td><td>EW-32047-77</td><td>Do konfiguracji azotu</td></tr><tr><td>Rurka przepływowa z bezpośrednim odczytem do azotu</td><td>Cole-Palmer</td><td>EW-32048-63</td><td>Do konfiguracji azotu</td></tr><tr><td>Dozownik gazu Multitube Frames</td><td>Cole-Palmer</td><td>EW-03218-50</td><td>Do konfiguracji</td></tr> <tr><td>azotuReduktor, dwustopniowy analityczny</td><td>gaz powietrzny</td><td>Y12-N145D580</td><td>do konfiguracji węża azotowego</td></tr><tr><td>, stal nierdzewna Airgas</td><td></td><td>Y99-26450</td><td>do konfiguracji węża azotowego</td></tr><tr><td>Męski adapter</td><td>Airgas</td><td>WES544</td><td>do konfiguracji azotu</td></tr><tr><td>Rurki Norprene</td><td>US Plastics</td><td>57280</td><td>do konfiguracji azotu</td></tr><tr><td>Podstawa statywu</td><td>Cole-Palmer</td><td>EW-03218-58</td><td>Do konfiguracji azotu Wkłady</td></tr><tr><td>zaworowe</td><td>Cole-Palmer</td><td>EW-03217-92</td><td>Do konfiguracji azotu</td></tr><tr><td>gazowego Carboy 10 L</td><td>Fisher Scientific</td><td>02-963-2A</td><td>do przygotowania mediów</td></tr><tr><td>Sterylne filtry próżniowe do butelek Steritop, 1 000 ml, membrana PES; do szyjki o rozmiarze 45 mm</td><td>Fisher Scientific</td><td>SCGP-T10-RE</td> Do przygotowania mediów <td></td></tr><tr><td>Butelka z mediami 100 ml, rozmiar szyjki 45 mm</td><td>Fisher Scientific</td><td>FB-800-100</td><td>do przygotowania podłoża</td></tr><tr><td>chlorek wapnia i middot; 2H2O</td><td>Fisher Scientific</td><td>C79-500</td><td>Odczynniki do mediów</td></tr><tr><td>chlorek sodu</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP358-1</td><td>Odczynniki</td></tr><tr><td>do mediów siarczan magnezu i middot; 7H2O</td><td>Sigma Aldrich</td><td>230391</td><td>Media Odczynniki</td></tr><tr><td>fosforan potasu jednozasadowy</td><td>Fisher Scientific</td><td>AC424205000</td><td>Media Odczynniki</td></tr><tr><td>Siarczan amonu</td><td>Fisher Scientific</td><td>AC423400010</td><td>Media Odczynniki</td></tr><tr><td>chlorek potasu</td><td>Sigma Aldrich</td><td>P9541</td><td>Odczynniki</td></tr><tr><td>Kwas borowy</td><td>Sigma Aldrich</td><td>B6768</td><td>Odczynniki do podłoży</td></tr><tr><td>siarczan miedzi i middot; 5H2O</td><td>Sigma Aldrich</td><td>209198</td><td>Media Odczynniki</td></tr><tr><td>jodek potasu</td><td>Sigma Aldrich</td><td>60400</td><td>Odczynniki</td></tr><tr><td>chlorek żelaza i middot; 6H2O</td><td>Fisher Scientific</td><td>I88-100</td><td>Odczynniki do mediów</td></tr><tr><td>siarczan manganu i middot; H2O</td><td>Sigma Aldrich</td><td>230391</td><td>Media Odczynniki</td></tr><tr><td>molibdenian sodu i middot; 2H2O</td><td>Sigma Aldrich</td><td>M7634</td><td>Media Odczynniki</td></tr><tr><td>siarczan i middot; 7H2O</td><td>Fisher Scientific</td><td>Z68-500</td><td>Odczynniki</td></tr><tr><td>do mediów biotyna</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP232-1</td><td>Odczynniki do mediów</td></tr><tr><td>pantotenian wapnia</td><td>Fisher Scientific</td><td>AC24330-1000</td><td>Odczynniki</td></tr><tr><td>do mediów Kwas foliowy</td><td>Sigma Aldrich</td><td>F7876</td><td>Odczynniki</td></tr><tr><td>do mediów inozytol (inaczej mio-inozytol)</td><td>Fisher Scientific</td><td>AC12226-1000</td><td>Odczynniki do pożywek</td></tr><tr><td>niacyna (znana również jako kwas nikotynowy)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>N4126</td><td>Odczynniki do pożywek</td></tr><tr><td>Kwas p-aminobenzoesowy</td><td>Fisher Scientific</td><td>AC14621-2500</td><td>Odczynniki do pożywek</td></tr><tr><td>pirydoksyna HCl</td><td>Sigma Aldrich</td><td>P9755</td><td>Odczynniki do pożywek</td></tr><tr><td>ryboflawina</td><td>Sigma Aldrich</td><td>R4500-25G</td><td>Odczynniki do podłoży</td></tr><tr><td>tiamina HCl</td><td>Odczynniki do</td><td>pożywek</td>Fisher Scientific <td>BP892-100</td></tr><tr><td>Leucine</td><td>Sigma Aldrich</td><td>L8000-100G</td><td>Odczynniki do pożywek</td></tr><tr><td>Uracil</td><td>Sigma Aldrich</td><td>U0750</td><td>Odczynniki do pożywek</td></tr><tr><td>Odczynniki</td> do <td>pożywek</td> <td>Fisher Scientific</td><td>DF0155-08-5</td></tr></tbody></table>

zastosowanie chemostatów w biologii systemów mikrobiologicznych

The Use of Chemostats in Microbial Systems Biology

Komórki regulują tempo wzrostu w odpowiedzi na sygnały ze świata zewnętrznego. W miarę wzrostu komórki należy koordynować różne procesy komórkowe, w tym syntezę makromolekularną, metabolizm i ostatecznie zaangażowanie w cykl podziału komórki. Chemostat, metoda eksperymentalnego kontrolowania tempa wzrostu komórek, zapewnia potężny środek do systematycznego badania, w jaki sposób tempo wzrostu wpływa na procesy komórkowe - w tym ekspresję genów i metabolizm - oraz sieci regulacyjne, które kontrolują tempo wzrostu komórek. Chemostatyki, które są utrzymywane przez setki pokoleń, mogą być wykorzystywane do badania ewolucji adaptacyjnej drobnoustrojów w warunkach środowiskowych ograniczających wzrost komórek. Opisujemy zasadę działania kultur chemostatów, demonstrujemy ich działanie i podajemy przykłady ich różnych zastosowań. Po okresie nieużywania po ich wprowadzeniu w połowie XX wieku, konwergencja metodologii skali genomu z ponownym zainteresowaniem regulacją wzrostu komórek i molekularnymi podstawami ewolucji adaptacyjnej stymuluje renesans stosowania chemostatów w badaniach biologicznych.

Główną zaletą chemostatów jest możliwość eksperymentalnego kontrolowania szybkości wzrostu komórek poprzez zmianę stopnia rozcieńczenia. W przypadku drożdży pączkujących, Saccharomyces cerevisiae, morfologia komórki dostarcza informacji o jej fazie w cyklu podziału komórkowego. Populacje o wyższych szybkościach wzrostu zawierają większy odsetek komórek aktywnie dzielących się, co określono poprzez pomiar frakcji komórek niepączkujących (Rycina 5A). Analizy globalnej ekspresji mRNA w kulturach chemostatow...

Tempo wzrostu komórek jest procesem regulowanym i głównym wyznacznikiem fizjologii komórki. Ciągła hodowla przy użyciu chemostatów umożliwia zewnętrzną kontrolę tempa wzrostu komórek poprzez ograniczenie składników odżywczych, co ułatwia badanie sieci molekularnych, które kontrolują wzrost komórek i jak te sieci ewoluują w celu optymalizacji wzrostu komórek.

Zastosowanie chemostatów w biologii systemów mikrobiologicznych

Cells regulate their rate of growth in response to signals from the external world. As the cell grows, diverse cellular processes must be coordinated ...

Ogólnymi celami poniższej prezentacji są opis zasady działania chemostatu, zademonstrowanie jego funkcjonowania oraz przedstawienie przykładów zastosowań z wykorzystaniem chemostatów. Cel ten zostaje osiągnięty poprzez najpierw złożenie naczynia chemostatu i jego zaszczepienie, a następnie ciągłe dodawanie nowej pożywki przy jednoczesnym usuwaniu starej pożywki i komórek ze stałą prędkością. Modelowanie matematyczne opisuje zmianę gęstości komórek oraz zmianę stężenia składnika odżywczego ograniczającego wzrost w każdym chemostacie.Zastosowanie tych równań pozwala na przewidzenie pojedynczego, niezerowego, stabilnego stanu stacjonarnego, w którym stężenia komórek i składników odżywczych są stałe, a swoista szybkość wzrostu komórek jest równa szybkości ich usuwania. Połączenie precyzyjnej kontroli wzrostu komórek i środowiska w chemostatach z innymi technologiami umożliwia uzyskanie wyników pozwalających na badania regulacji wzrostu komórek, zmian genetycznych i ewolucji adaptacyjnej na poziomie systemowym. Główną zaletą tej metody hodowli komórek w porównaniu z innymi technikami jest to, że szybkość wzrostu jest kontrolowana, a zewnętrzne środowisko komórek pozostaje stałe.Ta metoda może pomóc w odpowiedzi na kluczowe pytania z zakresu biologii komórki i ewolucji, takie jak molekularne podstawy regulacji wzrostu komórek oraz ewolucji adaptacyjnej w określonych środowiskach. Wizualna prezentacja tej metody jest kluczowa, ponieważ przygotowanie i utrzymanie kultur w hemostacie jest trudne ze względu na dużą liczbę etapów i zaangażowanych komponentów. Rozpocznij tę procedurę od włączenia systemu six four za pomocą głównego przełącznika.Następnie dokładnie wypłucz naczynie hemostatyczne, zespół mieszający oraz podłączone przewody wodą dejonizowaną. Sprawdź wszystkie przewody i pierścienie O-ring, a następnie wymień wszelkie zużyte elementy. Po zmontowaniu zespołu mieszającego i wału napędowego napełnij naczynie 300 milliliters wody DI.Sprawdzić poziom elektrolitu w sondzie do pomiaru tlenu rozpuszczonego, upewniając się, że dolna obudowa jest wypełniona w połowie roztworem elektrolitu. Następnie skalibrować sondę pH. Po kalibracji odłączyć sondę od fermentora.Opłukać wodą dejonizowaną (DI) i włożyć do portu w naczyniu hemostatycznym. Przykręcić, aż do oporu (dokręcić palcami). Po podłączeniu sond umieścić naczynie hemostatyczne w statywie, pamiętając o zaznaczeniu na naczyniu, z którym fermentorem kalibrowano sondę pH. Na koniec przygotować sondy i rurki do autoklawowania, zakładając nasadkę na sondę pH oraz owijając sondę tlenu rozpuszczonego i wszystkie wolne końce rurek folią do autoklawowania.Pusta kolba zamknięta gumowym korkiem zawierającym wlot powietrza i wylot pożywki. Należy upewnić się, że koniec rurki do pożywki jest owinięty folią. Do butelki na pożywkę o pojemności 100 mililitrów przymocować kubek filtracyjny o pojemności 500 mililitrów.Za pomocą pęsety, wysterylizowanej w etanolu, wyjmij filtr bawełniany z filtra i niezwłocznie przymocuj go do portu filtracyjnego w wózku do pożywek. Podłącz wózek do pożywek do źródła próżni i filtra. Sterylizuj 10 litrów świeżo przygotowanej pożywki, wlewając ją do naczynia filtrującego.Po zakończeniu filtracji pożywki, zamknij port filtracyjny za pomocą metalnego zacisku. Po autoklawowaniu naczyń hemostatycznych i ich ostudzeniu, umieść naczynie w odpowiadającym mu płaszczu grzewczym. Podłącz sondę temperatury, sondę pH oraz sondę tlenu rozpuszczonego.Pozostaw naczynie przy włączonym zasilaniu przez co najmniej sześć godzin, aby umożliwić spolaryzowanie elektrod sond tlenu rozpuszczonego. Następnie podłącz zbiornik z pożywką do naczynia hemostatycznego. Użyj etanolu, aby utrzymać końce rurek w jak najbardziej sterylnych warunkach.Następnie przełóż dren pompy przez pompę i otwórz zacisk. Potem umieść koniec każdej rurki odpływowej w osobny pojemnik zbiorczy. Podłącz zasilanie powietrzem przez filtr autoklawowalny i włącz przepływ powietrza.Woda w każdym mięśniu powinna wypłynąć przez rurki odpływowe, co wskazuje na prawidłowe uszczelnienie wszystkich połączeń. Dostosuj wysokość rurki odpływowej do pożądanej objętości roboczej wynoszącej 300 mililitrów. Ręcznie naciskaj pompę, aż medium zacznie wpływać do naczynia z hemostatem.Następnie zwolnij dren z pompy. Gdy pożywka dotrze do rurki odpływowej, ponownie podłącz dren do pompy i zaklemuj go po uprzednim odpowietrzeniu układu z pożywką. Uruchom program podstawowy, ustawiając prędkość obrotową wirnika na 400 RPM oraz temperaturę na 30 °C.Następnie skalibruj sondy tlenu rozpuszczonego, wyłączając dopływ powietrza i przełączając na gaz azotowy. Odczekaj co najmniej jedną godzinę i zapisz zmierzoną wartość jako odczyt niski. Przywróć dopływ powietrza o tlenowej koncentracji otoczenia i odczekaj co najmniej kolejną godzinę.Zapisz ten pomiar jako wysoką wartość odczytu. W tym momencie, przed inokulacją, rozpocznij rejestrację danych za pomocą oprogramowania iris. Zdezynfekuj górną część naczynia hodowlanego 70% etanolem.Następnie otwórz port naczynia za pomocą śrubokręta i pipetuj 1 mL kultury nocnej do naczynia, po czym przykręć śrubę. Gdy kultury osiągną wczesną fazę stacjonarną, uruchom pompy i ustaw żądany przepływ. Poprzez określenie liczby sekund pracy i przerwy pompy, reguluje się szybkość przepływu oraz objętość kultury.Wyznacz stopień rozcieńczenia. Korzystając z interfejsu six fours, zdefiniuj program określający czas pracy pompy, temperaturę oraz prędkość obrotową mieszadła. Następnie uruchom program po upływie co najmniej dwóch godzin.Zanotuj czas i użyj cylindra miarowego, aby zmierzyć ilość medium usuniętego z naczynia. Ilość usunięta będzie równa objętości dodanej do naczynia chemostatu i może zostać wykorzystana do obliczenia szybkości rozcieńczenia oraz pomiaru gęstości komórek w odpływie. Stan stacjonarny wzrostu zostaje osiągnięty, gdy gęstość komórek nie zmienia się w czasie.Po osiągnięciu stanu stacjonarnego należy pobrać niewielkie próbki z rurki odpływowej w ciągu kilku minut, pozwalając cieczy na pasywny przepływ do probówki zbiorczej. Analizy ekspresji genów i metabolitów wymagają większych próbek. Można je szybko pobrać, luzując śrubę, chwytając za metalny koniec rurki odpływowej i powoli opuszczając rurkę.Przy usuwaniu dużej objętości należy zmniejszyć szybkość przepływu, aby utrzymać tę samą szybkość rozcieńczania. Najpierw należy przygotować kultury w stanie stacjonarnym dwóch szczepów drożdży o identycznych szybkościach rozcieńczania i objętościach. Pobierz pasywnie jeden mililitr z każdego naczynia, aby posłużyły one jako kontrole w późniejszej analizie cytometrycznej. Wirować komórki przez jedną minutę przy 6 000 RPM, resuspender je w jednym mililitrze PBS i przechowywać probówkę w temperaturze czterech stopni Celsius.Następnie, kolejno umieszczaj rurkę odpływową z każdego naczynia w menzurce autoklawowalnej. Poluzuj śrubę mocującą rurkę odpływową i delikatnie naciśnij ją, aby wypchnąć 150 ml komórek z chemostatu, a następnie przywróć metalowy koniec rurki odpływowej do pierwotnej pozycji. Po zakończeniu, po wysterylizowaniu obszaru, otwórz port naczynia na górze naczynia chemostatu.W otwór należy włożyć sterylny lejek i dodać 150 mililitrów drugiej kultury. Następnie należy zamknąć port i powtórzyć czynność z drugim naczyniem. Każde naczynie zawiera teraz mieszaninę obu szczepów w stosunku 50:50; można pobierać próbki co dwie do sześciu godzin przez dwa do trzech dni.Próbki należy przechowywać w PBS, a proporcje szczepów w każdej próbce analizować za pomocą cytometrii przepływowej. Po ustanowieniu hodowli w chemostacie w stanie stacjonarnym z wykorzystaniem szczepu o znanym genotypie i określonym ograniczeniem składników odżywczych, należy utrzymywać niezakłóconą hodowlę przez kilkaset pokoleń, uzupełniając zbiornik z pożywką świeżą pożywką w razie potrzeby. Należy prowadzić zapis ewolucyjny adaptującej się populacji poprzez pasywne pobieranie próbek z odpływu co dwa do trzech dni.Po zakończeniu selekcji próbkę należy przechowywać w 15% glicerolu w temperaturze -80 °C, a następnie wysiać próbkę komórek na stałe płytki agarowe. Po tym, jak komórki wyrosną w kolonie, należy pobrać reprezentatywną próbkę kolonii za pomocą wykałaczek i zaszczepić klony do poszczególnych studni płytki 96-dołkowej zawierającej 100 µL pożywki. Próbki klonalne należy inkubować przez noc.Następnie do każdej studni należy dodać 100 µL 30% glicerolu i przechowywać w temperaturze -80 °C do czasu przeprowadzenia analizy genomicznej. Główną zaletą chemostatów jest możliwość kontrolowania tempa wzrostu komórek. Procent komórek drożdży w fazie pączkowania, przedstawiony tutaj na osi Y, stanowi dobrą reprezentację tempa ich wzrostu.Jak widać tutaj. Procent ten wzrasta w sposób niemal liniowy wraz ze zwiększeniem szybkości rozcieńczania. Wyższe szybkości rozcieńczania skutkują szybszymi tempami wzrostu, co może prowadzić do systematycznych wzrostów ekspresji genów, reprezentowanych tutaj przez zwiększenie poziomu mRNA UTR dwa.Jednakże wraz ze zwiększeniem tempa wzrostu mogą wystąpić również systematyczne spadki ekspresji genów, jak ma to miejsce w przypadku ASM one. Względną dostosowanie różnych genotypów można określić poprzez przeprowadzenie testów konkurencji w hemostatach z użyciem komórek znakowanych fluorescencyjnie; analiza cytometrii przepływowej przedstawiona tutaj to reprezentatywny wynik, w którym mutant był zestawiony w konkurencji ze szczepem typu dzikiego znakowanym fluorescencyjnie. W tym przykładzie szczep mutant wykazuje 40% przewagę tempa wzrostu na pokolenie.Analiza sekwencji całego genomu może zostać wykorzystana do zidentyfikowania mutacji nabytych w komórkach o zwiększonej sprawności biologicznej po długotrwałej selekcji w chemostatach. Na przykład analiza niezależnych eksperymentów ewolucji adaptacyjnej w warunkach ograniczonej dostępności azotu pozwoliła zidentyfikować różne warianty liczby kopii alleli w locus gap1, który koduje ogólną permeazę aminokwasów. Po zastosowaniu tej procedury można wykorzystać inne metody, takie jak spektrometria mas, cytometria przepływowa i sekwencjonowanie nowej generacji, aby odpowiedzieć na podobne pytania dotyczące regulacji wzrostu komórek i ewolucji adaptacyjnej na poziomie systemowym.Opracowanie tej techniki utorowało drogę badaczom z wielu dziedzin, od mikrobiologii po biologię komórki, do badania wpływu zmienności tempa wzrostu komórek na fizjologię komórkową i procesy molekularne. Po obejrzeniu tego filmu powinni Państwo mieć jasne wyobrażenie o tym, jak przygotować i prowadzić hodowle w chemostacie, a także o różnych sposobach pobierania próbek wymaganych dla odmiennych zastosowań.

the-use-of-chemostats-in-microbial-systems-biology

Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

Zastosowanie chemostatów w biologii systemowej mikroorganizmów

Opracowaliśmy i sprawdziliśmy zestaw miniaturowych chemostatów o niewielkich rozmiarach, zbudowanych z łatwo dostępnych części za niskie koszty. Wyniki ewolucji fizjologicznej i eksperymentalnej były podobne do chemostatów o większej objętości. Macierz ministat zapewnia kompaktową, niedrogą i dostępną platformę do tradycyjnych eksperymentów z chemostatem, genomiki funkcjonalnej i badań przesiewowych substancji chemicznych.

Projektowanie i wykorzystanie multipleksowanych macierzy chemostatów

Opisujemy tani, konfigurowalny morbidostat, który umożliwia charakterystykę oporności na antybiotyki poprzez dynamiczne dostosowywanie stężenia leku. Urządzenie można zintegrować z multipleksowaną platformą mikroprzepływową. Podejście to można rozszerzyć na potrzeby laboratoryjnych badań nad opornością na antybiotyki.

Opracowanie i zastosowanie niedrogiego, zautomatyzowanego morbidostu do adaptacyjnej ewolucji bakterii pod wpływem doboru antybiotyków

Tutaj prezentujemy protokół umożliwiający uzyskanie adaptacyjnej ewolucji laboratoryjnej mikroorganizmów w warunkach wykorzystujących hodowlę chemostatu. Omówiono również analizę genomiczną wyewoluowanego szczepu.

Procedura adaptacyjnej laboratoryjnej ewolucji mikroorganizmów przy użyciu chemostatu

Zaprojektowaliśmy aparat do ciągłej hodowli do użytku z systemami optogenetycznymi do oświetlania kultur mikrobów i regularnego obrazowania komórek w ściekach za pomocą mikroskopu odwróconego. Hodowla, pobieranie próbek, obrazowanie i analiza obrazu są w pełni zautomatyzowane, dzięki czemu dynamiczne reakcje na oświetlenie mogą być mierzone przez kilka dni.

Projekt i wdrożenie zautomatyzowanego systemu oświetlenia, hodowli i pobierania próbek do zastosowań optogenetycznych drobnoustrojów

Tutaj opisujemy protokół ekstrakcji metabolitów ze Staphylococcus aureus i ich późniejszej analizy za pomocą chromatografii cieczowej i spektrometrii mas.

Podejście oparte na tandemowej chromatografii cieczowej i spektrometrii mas do analizy metabolitów Staphylococcus aureus

Przedstawiono szczegółowy protokół jednoczesnego działania 48 równoległych kultur komórkowych w różnych warunkach w systemie mikrobioreaktora. Opisano proces hodowli komórek, zbiór i późniejszą analizę miana przeciwciał.

Zastosowanie wysokowydajnego zautomatyzowanego systemu mikrobioreaktorów do produkcji modelowej IgG1 w komórkach CHO

Framework eVOLVER umożliwia wysokoprzepustową ciągłą hodowlę mikroorganizmów z wysoką rozdzielczością i dynamiczną kontrolą parametrów eksperymentalnych. Protokół ten pokazuje, jak zastosować system do przeprowadzenia złożonego eksperymentu fitness, prowadząc użytkowników przez programowanie automatycznej kontroli nad wieloma indywidualnymi kulturami, mierzenie, gromadzenie i interakcję z danymi eksperymentalnymi w czasie rzeczywistym.

Projektowanie zautomatyzowanych, wysokowydajnych, ciągłych eksperymentów wzrostu komórek przy użyciu eVOLVER

Przedstawiono protokół do generowania dynamicznych krajobrazów chemicznych przez fotolizę w układach mikroprzepływowych i milifluidowych. Metodologia ta jest odpowiednia do badania różnych procesów biologicznych, w tym zachowania ruchliwego, pobierania składników odżywczych lub adaptacji mikroorganizmów do substancji chemicznych, zarówno na poziomie pojedynczej komórki, jak i populacji.

Generowanie kontrolowanych, dynamicznych krajobrazów chemicznych w celu badania zachowania mikroorganizmów

Prezentowany jest tutaj protokół testu chemotaksji in situ, niedawno opracowanego urządzenia mikroprzepływowego, które umożliwia badanie zachowania mikroorganizmów bezpośrednio w środowisku.

Test chemotaksji in situ w celu zbadania zachowania mikroorganizmów w ekosystemach wodnych

Optogenetyczna kontrola metabolizmu mikrobiologicznego oferuje elastyczną dynamiczną kontrolę nad procesami fermentacji. Niniejszy protokół pokazuje, jak skonfigurować fermentację regulowaną niebieskim światłem do produkcji chemicznej i białkowej w różnych skalach objętościowych.

Fermentacja kontrolowana światłem do produkcji mikrobiologicznej, chemicznej i białkowej

Przedstawiamy protokół urządzenia do ciągłej kultury mikrofluidalnej (MCCD), które umożliwia uprawę populacji bakteryjnych w stałych warunkach niskiego pożywienia (aż do setek nanomolarnych stężeń) lub czasowych fluktuacji składników odżywczych w skali minut.

Urządzenie mikrofluidyczne do ciągłej hodowli przeznaczone do badania Escherichia coli w warunkach niskich i wahających się stężeń składników odżywczych

Odkryj zastosowanie chemostatów w biologii systemów mikrobiologicznych przy użyciu modelowania matematycznego. Ta metoda umożliwia precyzyjną kontrolę wzrostu komórek i badanie regulacji fizjologii mikroorganizmów.

Zastosowanie chemostatów w biologii systemów mikrobiologicznych

Przeglądaj więcej filmów