Name: Analizy transportu retinolu w czasie rzeczywistym przez receptor błonowy białka wiążącego retinol w osoczu (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-01-28T13:00:00.000+00:00
Duration: 14 min 32 s
Description: Poznaj metodę produkcji wysokiej jakości białka wiążącego retinol z bakterii i jego oczyszczania HPLC do badań receptora STRA6 w czasie rzeczywistym. Technika umożliwia monitorowanie transportu witaminy A.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Wspierane przez R01EY018144 grantowe National Institutes of Health.

1. Produkcja, ponowne składanie i oczyszczanie Holo-RBP metodą HPLC
<ol>
	<li>Przekształć komórki BL-21 z wektorem pET3a zawierającym cDNA dla ludzkiego RBP z 6-krotnym znacznikiem He na N-końcu. Hodować przekształcone komórki BL-21 w wytrząsarce w temperaturze 37 °C w 40 ml pożywki LB z karbenicyliną, aż do osiągnięcia średnicy zewnętrznej przy 600 nm 0,5. Indukuj ekspresję białka RBP, dodając IPTG do 1mM. Hoduj bakterie w temperaturze 37 °C przez kolejne 5 godzin.</li>
	<li>RBP wytwarzany w E. coli jest głównie obecny w nierozpuszczalnych ciałach inkluzyjnych. Aby wzbogacić ciała inkluzyjne, osadzaj komórki w granulkach o masie 10 000 x g przez 20 minut. Następnie sonikować komórki na lodzie w 5 ml PBS z inhibitorami proteazy, a następnie 2 cykle zamrażania i rozmrażania. Osadzać inkluzje w roztworach 20 000 x g przez 30 minut w temperaturze 4 °C. Usunąć supernatant i trzymać osad na lodzie.</li>
	<li>Rozpuścić osad z inkluzją przez sonikację w 10 ml 7,5 M chlorowodorku guanidyny. Dodać połowę objętości (5 ml) 25 mM buforu Tris, pH 9,0 i naziemnej telewizji cyfrowej (DTT) do końcowego stężenia 10 mM. Energicznie wymieszaj roztwór w mieszalniku wirowym przez noc w temperaturze pokojowej, aby całkowicie zredukować i zdenaturować białka.</li>
	<li>Odwirować roztwór białkowy w celu usunięcia nierozpuszczalnego materiału o stężeniu 18 000 x g przez 20 minut w temperaturze 4 °C. Po odwirowaniu przenieś supernatant do nowej probówki i umieść probówkę na lodzie.</li>
	<li>Przygotować cztery objętości (60 ml) buforu do ponownego składania (25 mM Tris, pH 9,0, 0,3 mM cystyny, 3,0 mM cysteiny, 1 mM EDTA). Odgazowuje bufor do ponownego składania. Przygotuj również 600 μl 10 mM retinolu w etanolu w przyćmionym czerwonym świetle. Trzymaj go w ciemności na lodzie. Zarówno bufor do ponownego składania, jak i roztwór retinolu muszą być świeżo przygotowane.</li>
	<li>Schłodzić zarówno roztwór białkowy, jak i bufor do ponownego fałdowania na lodzie przez co najmniej 30 minut. Wyższa temperatura prawdopodobnie obniży jakość ponownie złożonego RBP. Dodać kroplami 1 ml buforu do ponownego składania i 10 μl roztworu retinolu, podczas gdy roztwór białkowy energicznie miesza się w zlewce na lodzie. Powtarzaj ten krok, aż zostanie dodany cały bufor do ponownego składania i retinol. Mieszaj reakcję na lodzie w ciemności przez 5 godzin.</li>
	<li>Odwirować reakcję ponownego fałdowania przy 24 000 x g przez 30 minut w temperaturze 4 °C. Konieczne jest usunięcie kruszyw zaraz po reakcji ponownego fałdowania.</li>
	<li>Roztwór sklarowanego osadu należy zagęścić za pomocą koncentratora Amicon Ultra 15 (MWCO 10 K) do objętości około 10 ml. Nie należy koncentrować ponownie złożonego roztworu powyżej tego poziomu. Zbyt duża koncentracja doprowadzi do agregacji białek i obniży ostateczną wydajność i jakość prawidłowo sfałdowanych RBP. Rozcieńczyć zagęszczoną próbkę zimnym PBS do objętości 100 ml. Celem tego etapu jest usunięcie składników w reakcji ponownego fałdowania, które zakłócają oczyszczanie niklu.</li>
	<li>Wirować roztwór jeszcze raz w temperaturze 24 000 x g przez 20 minut w temperaturze 4 °C. Ważne jest, aby usunąć wszelkie osady. Przenieść sklarowany osad do dwóch probówek o pojemności 50 ml, z których każda zawiera 1 ml zawiesiny Ni-NTA, która została przemyta PBS. Obracać probówki w temperaturze 4 °C przez jedną godzinę. Inkubacja rozcieńczonego roztworu przez 1 godzinę może spowodować wytrącanie się nieprawidłowo sfałdowanych białek, które należy usunąć.</li>
	<li>Wirować probówki o masie 500 x g przez 3 minuty. Ostrożnie usunąć supernatant. Wszystko, co unosi się na wodzie, powinno zostać usunięte. Dodać zimny PBS do 30 ml na każdą probówkę. Ponownie odwirować i usunąć supernatant. Powtarzaj ten proces, aż nie zobaczysz nic poza koralikami w tubie.</li>
	<li>Przenieś żywicę Ni-NTA do pustej kolumny. Przepłucz żywicę z 20 objętościami kolumny zawierającą 10 mM imidazolu, 500 mM NaCl w PBS. Eluować His-RBP w 5 objętościach kolumn po 100 mM imidazolu w PBS. Nie przechowuj tego roztworu przez dłuższy czas, a zamrożenie zmniejsza ostateczną wydajność i jakość. Aby uzyskać najlepszy wynik, należy natychmiast oczyścić RBP za pomocą HPLC.</li>
	<li>Dializować His-RBP oczyszczony z żywicy Ni-NTA w stosunku do 25 mM Tris, pH 8,4 i 120 mM NaCl. Koncentrator może być również używany do wymiany. Klarowne próbki do HPLC należy pobrać przez odwirowanie przy 16 000 x g przez 10 minut w temperaturze 4 °C bezpośrednio przed każdym cyklem.</li>
	<li>Oczyść holo-RBP na HPLC za pomocą kolumny jonowymiennej AX-300 za pomocą gradientu krokowego NaCl (220 mM 12 min, 360 mM 15 min i 1,000 mM 15 min) przy użyciu 25 mM Tris, pH 8,4 jako faza ruchoma przy 1 ml / min. Wraz ze wzrostem stężenia NaCl holo-His-RBP jest uwalniany, podczas gdy apo-RBP i nieprawidłowo sfałdowany RBP pozostają związane z kolumną (ryc. 1). Jeśli ponowne fałdowanie RBP nie zostanie wykonane optymalnie, nieprawidłowo złożony RBP (np. źle złożony RBP-I na rysunku 1) może zdominować cały preparat</li>.
	<li>Odzyskać prawidłowo złożony holo-RBP z frakcji pikowych przy 360 mM NaCl. Uważnie monitoruj profil elucji prawidłowo złożonego i źle złożonego His-RBP. Przy 1,000 mM NaCl większość nieprawidłowo sfałdowanych His-RBP powinna zostać uwolniona.</li>
	<li>Frakcje zawierające holo-RBP są łączone, zagęszczane i dializowane z PBS przez noc w temperaturze 4 °C. Sprawdź końcową wydajność i jakość (330 nm/280 nm) za pomocą spektrofotometru. Prawidłowo złożony produkt powinien mieć stosunek 330 nm/280 nm nieco większy niż 1 (rysunek 1).</li>
	<li>Aby wytworzyć apo-RBP, dodać równą objętość heptanu do oczyszczonego holo-RBP i delikatnie wymieszać, obracając przez noc w temperaturze 4 °C. Wirować przy 16 000 g przez 10 minut w temperaturze 4 °C i ostrożnie przenieść dolną fazę wodną do nowej probówki (unikając osadu na granicy faz). Powtórz proces trzy razy z 3-godzinną inkubacją dla każdego. Sprawdź absorpcję na spektrofotometrze Nanodrop, aby upewnić się, że pik 330 nm zmniejszył się do poziomu tła.</li>
</ol>
2. Monitorowanie w czasie rzeczywistym uwalniania i ładowania retinolu katalizowanego przez STRA6
<ol>
	<li>Zablokuj czarną 96-dołkową płytkę Microfluor-2 (Thermo Scientific) 200 μl kazeiny blokującej (Pierce) przez noc w temperaturze 4 °C, aby zapobiec niespecyficznemu przywieraniu holo-RBP do plastiku. Kazeina blokująca daje najlepszy efekt blokowania ze wszystkich testowanych przez nas rozwiązań blokujących.</li>
	<li>Błony świeżo przygotowane z komórek wykazujących ekspresję STRA6 lub komórek kontrolnych są myte za pomocą PBS i przepuszczane przez strzykawkę Hamiltona (Gastight #1710) 6 razy w celu wytworzenia jednolitej zawiesiny w PBS. Zazwyczaj używamy błon pochodzących z 1/100 do 1/20 komórek wyhodowanych na szalce o średnicy 100 mm na reakcję.</li>
	<li>Umyć powleczone studzienki płytki Microfluor-2 jednorazowo 200 μl PBS. Schłodzić płytkę na lodzie przed dodaniem zawiesiny membranowej (50 μl na studzienkę).</li>
	<li>Monitorowanie fluorescencji retinolu w czasie rzeczywistym jest mierzone za pomocą optyki fluorescencyjnej POLARstar Omega (BMG Labtech) z filtrem wzbudzenia 320ex i filtrem emisyjnym 460-10. Program jest ustawiony na tryb odczytu punktu końcowego. Tryb płyty może być również używany do pomiaru przebiegu czasu, jeśli przedziały czasowe nie są zmieniane. Sygnał z każdego punktu czasowego jest średnią z 10 pomiarów (uśrednianie orbitalne o średnicy 2 mm), a wzmocnienie jest ustawione na 1,800. Płytka jest wytrząsana przez 10 sekund przy 500 obr./min przy użyciu podwójnego wytrząsania orbitalnego przed każdym pomiarem.</li>
	<li>Aby rozpocząć test uwalniania retinolu, studzienki są odczytywane raz w trybie odczytu punktu końcowego przed dodaniem holo-RBP (zwykle 1 μM stężenia końcowego) po 0 minutach. Po dodaniu holo-RBP reakcja jest monitorowana w sposób ciągły co 5-10 minut przez 1-3 godziny. Aby rozpocząć test obciążenia retinolem, retinol all-trans (zwykle końcowe stężenie 1 μM) dodaje się do studzienek w przyćmionym czerwonym świetle. Płytkę odczytuje się raz przed dodaniem apo-RBP po 0 min. Po dodaniu apo-RBP reakcja jest monitorowana w sposób ciągły co 5-10 minut przez 1-3 godziny.</li>
	<li>Po wykonaniu wszystkich pomiarów pobierz surowe dane (przykład pokazany na rysunku 2) z oprogramowania Omega Data Analysis (BMG Labtech) do programu Microsoft Excel w celu analizy danych. Każdy punkt czasowy generuje plik, który zawiera odczyty wszystkich warunków eksperymentalnych. Na przykład, jeśli istnieje 20 punktów czasowych, skonsoliduj 20 plików w jeden plik programu Excel w celu analizy danych.</li>
	<li>Do analizy danych sygnały fluorescencyjne przed dodaniem retinolu lub holo-RBP po 0 minutach są traktowane jako sygnały tła i odejmowane od końcowych sygnałów fluorescencyjnych we wszystkich punktach czasowych. Chociaż sygnały tła są niskie w porównaniu z fluorescencją retinolu w holo-RBP, odjęcie tła eliminuje niespecyficzny wpływ rozpraszania światła przez błony i umożliwia skupienie się na fluorescencji retinolu holo-RBP lub retinolu dodanego po 0 min.</li>
</ol>
3. Monitorowanie w czasie rzeczywistym katalizowanego przez STRA6 transportu retinolu z Holo-RBP do CRBP-I
<ol>
	<li>Retinol-EGFP to nowa para transferu rezonansu fluorescencyjnego (FRET), która została niedawno ustalona 41. Katalizowany przez STRA6 transport retinolu z holo-RBP do EGFP-CRBP-I jest monitorowany w czasie rzeczywistym poprzez pomiar fret retinolu-EGFP. Białko fuzyjne EGFP-CRBP-I ze znacznikiem 6XHis (EGFP-CRBP-I) jest wytwarzane w komórkach ssaków i przed eksperymentem jest oczyszczane na żywicy Ni-NTA. EGFP-CRBP-I może być przechowywany w PBS z inhibitorami proteazy przez krótki okres czasu w temperaturze 4 °C. Alternatywnie białko fuzyjne zamraża się w temperaturze -80 °C w małych podwielokrotnościach.</li>
	<li>Przed reakcjami należy przygotować zablokowaną płytkę Microfluor-2 i membrany, jak opisano powyżej. Powleczone studzienki płytki Microfluor-2 przemyć raz 200 μl PBS przed dodaniem zawiesiny membranowej (50 μl na studzienkę).</li>
	<li>Retinol-EGFP FRET w czasie rzeczywistym jest mierzony za pomocą POLARstar Omega z filtrem wzbudzenia 320ex oraz filtrów emisyjnych 460-10 i 510-10 przy użyciu jednoczesnej optyki fluorescencji emisyjnej podwójnej. Program jest ustawiony na tryb odczytu punktu końcowego. Tryb płyty może być również używany do pomiaru przebiegu czasu, jeśli przedziały czasowe nie są zmieniane. Sygnał z każdego punktu czasowego jest średnią z 10 pomiarów (uśrednianie orbitalne o średnicy 2 mm), a wzmocnienie jest ustawione na 1 800 na kanał. Płytka jest wytrząsana przez 10 sekund przy 500 obr./min przy użyciu podwójnego wytrząsania orbitalnego przed każdym pomiarem.</li>
	<li>Aby rozpocząć reakcje, do studzienek dodaje się EGFP-CRBP-I (zwykle 1 μM stężenie końcowe). Tabliczka jest odczytywana raz w trybie odczytu punktu końcowego przed dodaniem holo-RBP po 0 min. Po dodaniu holo-RBP reakcja jest monitorowana w sposób ciągły poprzez pomiar co 5-10 minut przez 1-2 godziny.</li>
	<li>Po wykonaniu wszystkich pomiarów pobierz surowe dane (przykład pokazany na rysunku 3) z oprogramowania Omega Data Analysis do programu Microsoft Excel w celu analizy danych, jak opisano powyżej.</li>
	<li>Retinol-EGFP FRET oblicza się na podstawie dynamicznej zmiany stosunku pików emisji akceptor/donor47. Równanie41 do obliczenia tego stosunku to [(510 t-510b)/(460t-460 b)], gdzie 510t, 510b, 460t i 460b reprezentują emisje przy 510 nm po rozpoczęciu reakcji (t = punkt czasowy), przy 510 nm przed dodaniem retinolu lub holo-RBP (b = tło), przy 460 nm po rozpoczęciu reakcji (t = punkt czasowy), i przy 460 nm przed dodaniem odpowiednio retinolu lub holo-RBP (b = tło).</li>
</ol>

Nie stwierdzono konfliktu interesów.

Dzielimy się tutaj zoptymalizowanym protokołem produkcji RBP, ponieważ procedury produkcji i oczyszczania RBP mają kluczowe znaczenie dla generowania prawidłowo złożonych RBP. Biorąc pod uwagę możliwość nieprawidłowego sfałdowania gatunków RBP i obecność śladowych ilości białek bakteryjnych nawet w oczyszczonych przez HPLC RBP wytwarzanych przez bakterie, pomocne jest użycie natywnego RBP z surowicy w celu potwierdzenia wniosku związanego z RBP. RBP z moczem, który jest dostępny w handlu, jest złożoną mieszaniną wielu ga...

Witamina A to organiczna cząsteczka, która jest niezbędna do przetrwania człowieka i prawidłowego funkcjonowania prawie wszystkich ludzkich organów. Pochodne witaminy A (retinoidy) uczestniczą w różnych zdarzeniach biochemicznych i komórkowych, w tym w wykrywaniu światła dla widzenia 1,2 oraz regulacji ekspresji genów i translacji białek podczas rozwoju embrionalnego i w tkankach dorosłych 3-6. Chociaż retinol ma zdolność dyfuzji ogólnoustrojowej, ewolucja wymyśliła białko wiążące retinol w osoczu, specyficzne białko nośnikowe do transportu witaminy A we krwi, aby osiągnąć wysoką wydajność i specyficzność oraz uniknąć toksyczności związanej z losową dyfuzją 7-10. Receptor o wysokim powinowactwie, który wiąże się z RBP i pobiera witaminę A, został wysunięty w latach siedemdziesiątych XX wieku 11-13. Pomimo zgromadzonych w ciągu trzech dekad dowodów na istnienie receptora RBP 14-31, hipoteza receptora była dyskutowana przez wiele lat ze względu na istnienie nieprawidłowej definicji holo-RBP. Prawidłowa definicja holo-RBP jest taka, że jest to kompleks o wysokim powinowactwie 1:1 między retinolem a RBP. Wielokrotna ekstrakcja holo-RBP za pomocą rozpuszczalnika organicznego jest niezbędna do wytworzenia apo-RBP. Definicja ta jest używana przez prawie wszystkie laboratoria badające RBP 7,9,32-35 lub receptor RBP 14-31,36-42. Nieprawidłowa definicja holo-RBP, która została użyta do obalenia istnienia receptora RBP, to ostra mieszanina wolnego retinolu z apo-RBP. Ponieważ funkcją receptora RBP w wychwytywaniu witaminy A z holo-RBP jest uwalnianie retinolu z holo-RBP, receptor RBP nie odgrywałby żadnej roli w wychwytywaniu retinolu, gdyby retinol był wolny na początku (jak sugeruje błędna definicja holo-RBP).
Niedawna identyfikacja receptora RBP jako wielobłonowego białka domenie o nazwie STRA636 i jego funkcji w wychwytywaniu witaminy A z holo-RBP 36-43 zdecydowanie sprzeciwia się hipotezie, że RBP nie potrzebuje receptora do dostarczania witaminy A. Szczegółowe analizy wykazały, że STRA6 ma 9 domen transbłonowych, z N-końcem zlokalizowanym zewnątrzkomórkowo i C-końcem zlokalizowanym wewnątrzkomórkowo 40. Pomiędzy transbłonowymi 6 i 7 znajduje się niezbędna domena wiążąca RBP 39. STRA6 jest sprzężony zarówno z LRAT, jak i CRBP-I w wychwytywaniu witaminy A z holo-RBP, ale ani LRAT, ani CRBP-I nie są absolutnie wymagane do zwiększonej aktywności STRA6 41. Zdolność STRA6 do katalizowania uwalniania retinolu z holo-RBP jest kluczem do jego aktywności wychwytu witaminy A 41. Opierając się na STRA6 w celu uwolnienia retinolu, dostarczanie witaminy A przez RBP może transportować witaminę A do komórek docelowych w tkankach obwodowych z wysoką specyficznością i wydajnością.
Krytyczne znaczenie definicji i przygotowania holo-RBP ilustruje nie tylko historyczna debata na temat istnienia receptora RBP, ale także trzy powiązane ostatnio prace oparte na definicjach holo-RBP różniących się od oryginalnej i poprawnej definicji 44-46. W pierwszym artykule wykorzystano definicję holo-RBP, która została użyta do odrzucenia istnienia receptora RBP w celu zbadania receptora RBP 44. W drugim i trzecim artykule przedstawiono trzecią definicję holo-RBP, która jeszcze mniej prawdopodobna, aby retinol był badany, tworząc właściwy kompleks z RBP 45,46. W badaniach tych otrzymano 3H-retinol/RBP poprzez zmieszanie holo-RBP (nawet nie apo-RBP) z 3H-retinolem. Ponieważ ten test nie miał utworzonego 3H-retinolu / RBP i nie usunął nadmiaru wolnego 3H-retinolu 45,46, nie jest to test na wychwyt 3H-retinolu z 3H-retinolu / RBP, ale jest testem dyfuzji wolnego 3H-retinolu. Wcześniej wykazano, że STRA6 nie zwiększa wychwytu komórkowego wolnego retinolu przez LRAT 38 lub CRBP-I 41. Praktycznie cały retinol jest związany z RBP we krwi i nie ma wykrywalnego wolnego retinolu. Główną funkcją receptora RBP jest katalizowanie uwalniania retinolu z holo-RBP podczas wychwytu retinolu z holo-RBP 41. Jeśli retinol jest sztucznie uwalniany lub jest w wolnej postaci na początku od 45,46, receptor RBP nie jest potrzebny. Radykalnie odmienne wyniki uzyskane z testu wolnej dyfuzji retinolu w porównaniu z testami opartymi na prawidłowo przygotowanym holo-RBP ilustrują, że prawidłowe przygotowanie RBP ma kluczowe znaczenie dla jego testów funkcjonalnych.
RBP można oczyścić z ludzkiej surowicy 41, ale procedura jest skomplikowana, a wydajność niska. Alternatywnym podejściem jest produkcja RBP w E. coli. Ponieważ E. coli nie ma zdolności do prawidłowego fałdowania białek wydzielanych przez ssaki z więcej niż jedną parą wiązań dwusiarczkowych, takich jak RBP, konieczne jest ponowne złożenie RBP i oczyszczenie prawidłowo pofałdowanego białka. Nieprawidłowo sfałdowane białka nie tylko zachowują się inaczej niż skorygowane pofałdowane RBP w różnych testach, ale także powodują agregację białek podczas przechowywania. Z tego samego powodu apo-RBP jest produkowany wyłącznie z wysokiej jakości holo-RBP. Opisujemy tutaj zoptymalizowany protokół produkcji wysokiej jakości RBP w 100% naładowanego retinolem poprzez ekspresję bakterii, ponowne fałdowanie i oczyszczanie HPLC. Oczyszczanie HPLC nie tylko usuwa nieprawidłowo pofałdowane RBP, ale także znaczne zanieczyszczenie bakteryjne, które może powodować poważne artefakty, jeśli RBP jest używany w testach transdukcji sygnału. Opisujemy również dwie czułe techniki monitorowania w czasie rzeczywistym w celu zbadania transportu retinolu przez STRA6. Obie techniki opierają się na wysokiej jakości RBP. Ze względu na ograniczoną przestrzeń, klasyczne techniki oznaczania wychwytu witaminy A na bazie radioaktywnych retinoidów i HPLC nie są tutaj opisane.

<table><tbody><tr><td>chlorowodorek guanidyny</td><td>EMD</td><td>5010</td><td></td></tr><tr><td>cystyna</td><td>Sigma</td><td>C8755</td><td></td></tr><tr><td>cysteina</td><td>Sigma</td><td>C7352</td><td></td></tr><tr><td>EDTA</td><td>Fisher</td><td>BP118-500</td><td></td></tr><tr><td>Tris</td><td>Fisher</td><td>7786-1</td><td></td></tr><tr><td>DTT</td><td>EMD</td><td>3860</td><td></td></tr><tr><td>retinol</td><td>Sigma</td><td>R7632</td><td></td></tr><tr><td>karbenicylina</td><td>Fisher</td><td>BP2648-5</td><td></td></tr><tr><td>IPTG</td><td>EMD</td><td>5810</td><td></td></tr><tr><td>PBS</td><td>EMD</td><td>6508</td><td></td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Fisher</td><td>BP358-10</td><td></td></tr><tr><td>Ni-NTA</td><td>Qiagen</td><td>1018244</td><td></td></tr><tr><td>imidazol</td><td>EMD</td><td>5720</td><td></td></tr><tr><td>heptan</td><td>EMD</td><td>HX0295-1</td><td></td></tr><tr><td>Bloker Kazeina</td><td>Pierce</td><td>37528</td><td></td></tr><tr><td>Koncentrator Amicon Ultra 15 (MWCO 10 K)</td><td>Płytka Millipore</td><td>UFC901024</td><td></td></tr><tr><td>Microfluor-2 </td><td>Fisher</td><td>14-245-177</td><td></td></tr><tr><td>Strzykawka Hamilton Gazoszczelna #1710</td><td>Fisher</td><td>14-824-655</td><td></td></tr></tbody></table>

analizy transportu retinolu w czasie rzeczywistym przez receptor błonowy białka wiążącego retinol w osoczu

Real-time Analyses of Retinol Transport by the Membrane Receptor of Plasma Retinol Binding Protein

Witamina A jest niezbędna dla widzenia i wzrostu/różnicowania prawie wszystkich ludzkich organów. Białko wiążące retinol w osoczu (RBP) jest podstawowym i swoistym nośnikiem witaminy A we krwi. W tym miejscu opisujemy zoptymalizowaną technikę produkcji i oczyszczania holo-RBP oraz dwie techniki monitorowania w czasie rzeczywistym w celu zbadania transportu witaminy A przez receptor RBP o wysokim powinowactwie STRA6. Pierwsza technika umożliwia wyprodukowanie dużej ilości wysokiej jakości holo-RBP (w 100% naładowanego retinolem) do testów transportu witaminy A. Wysokiej jakości RBP jest niezbędna do testów funkcjonalnych, ponieważ nieprawidłowo sfałdowany RBP łatwo uwalnia witaminę A, a zanieczyszczenie bakteryjne w preparacie RBP może powodować artefakty. Techniki monitorowania w czasie rzeczywistym, takie jak elektrofizjologia, wniosły istotny wkład w badania nad transportem błonowym. Transport retinolu za pośrednictwem receptora RBP do niedawna nie był analizowany w czasie rzeczywistym. Drugą opisaną tutaj techniką jest analiza w czasie rzeczywistym uwalniania lub ładowania retinolu katalizowanego przez STRA6. Trzecią techniką jest analiza w czasie rzeczywistym katalizowanego przez STRA6 transportu retinolu z holo-RBP do komórkowego białka wiążącego retinol I (CRBP-I). Techniki te zapewniają wysoką czułość i rozdzielczość w ujawnianiu mechanizmu wychwytu witaminy A przez receptor RBP.

Przedstawiamy tutaj reprezentatywne wyniki produkcji i oczyszczania holo-RBP za pomocą HPLC (Rycina 1), analizę w czasie rzeczywistym uwalniania retinolu z holo-RBP katalizowanego przez STRA6 oraz ładowania retinolu do apo-RBP (Rycina 2) oraz analizę w czasie rzeczywistym transportu retinolu z holo-RBP do EGFP-CRBP-I katalizowanego przez STRA6 (Rycina 3).
Bez refoldingu białko RBP produkowane w bakteriach jest niemal całkowicie błędnie sfałdow...

Tutaj opisujemy zoptymalizowaną technikę produkcji wysokiej jakości kompleksu witaminy A/RBP oraz dwie techniki monitorowania w czasie rzeczywistym do badania transportu witaminy A przez STRA6, receptor RBP.

Analizy transportu retinolu w czasie rzeczywistym przez receptor błonowy białka wiążącego retinol w osoczu

Vitamin A is essential for vision and the growth/differentiation of almost all human organs.  Plasma retinol binding protein (RBP) is the principle and ...

Protokół ten pokazuje produkcję wysokiej jakości białka wiążącego retinol w osoczu, które służy do badania aktywności receptora białka wiążącego retinol w czasie rzeczywistym. Osiąga się to poprzez uprzednią ekspresję i oczyszczenie dużej ilości białka wiążącego retinol z bakterii. Oczyszczone białko wiążące retinol jest całkowicie denaturowane i powoli ponownie fałdowane w obecności swojego liganda retinolu.Następnie prawidłowo złożone białko wiążące retinol jest oczyszczane za pomocą HPLC w celu usunięcia nieprawidłowo pofałdowanych zanieczyszczeń białkowych i bakteryjnych. Po uzyskaniu wysokiej jakości białka wiążącego retinol można je wykorzystać do badania aktywności jego receptora błonowego w katalizowaniu uwalniania retinolu, ładowania retinolu lub transportu retinolu do komórkowego białka wiążącego retinol. W czasie rzeczywistym.Dzisiaj zademonstruję nasz ulepszony protokół reformowania i oczyszczania bakterii wytwarzających białka wiążące siatkówkę. Technika ta może wytwarzać wysokiej jakości białko wiążące siatkówkę, które jest niezbędne do testów funkcjonalnych. Zademonstruję nowo opracowane techniki badania receptora dla białka wiążącego siatkówkę.Główną przewagą tych t

real-time-analyses-retinol-transport-membrane-receptor-plasma-retinol

Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

Analizy w czasie rzeczywistym transportu retinolu przez receptor błonowy białka wiążącego retinol w osoczu

Celem niniejszego badania było sprawdzenie odtwarzalności modelu BBB in vitro z udziałem syngenicznej kohodowli komórek śródbłonka i astrocytów na szczurach. Monowarstwa komórek śródbłonka charakteryzowała się wysoką przepuszczalnością TEER i niską przepuszczalnością LY. Oceniano ekspresję specyficznych białek TJ, funkcjonalne odpowiedzi na stan zapalny oraz funkcjonalność transporterów i receptorów.

Tworzenie modelu in vitro bariery krew-mózg szczura (BBB): skupienie się na nieprzepuszczalności bariery krew-mózg i transporcie za pośrednictwem receptorów

Status metaboliczny ludzkich komórek nabłonka barwnikowego siatkówki (H-RPE) odzwierciedla ich zdrowie i funkcję. Przedstawiono zoptymalizowany protokół badania strumienia metabolicznego H-RPE w czasie rzeczywistym za pomocą respirometrii o wysokiej rozdzielczości.

Analiza bioenergetyki w czasie rzeczywistym w pierwotnych komórkach nabłonka barwnikowego ludzkiej siatkówki przy użyciu respirometrii o wysokiej rozdzielczości

Tutaj opisana jest metoda wysokosprawnej chromatografii cieczowej fazy normalnej, mająca na celu wykrywanie i ilościowe określanie krytycznych retinoidów zaangażowanych w ułatwianie funkcji wzrokowych zarówno w tkance ocznej, jak i ogólnoustrojowej, w kontekście ogólnoustrojowego dostarczania witaminy A do wytwarzania niezbędnego światłoczułego chromoforu rodopsyny 11-cis-retinal.

Analiza ilościowa metabolitów witaminy A w diecie metabolitów witaminy A w mysich tkankach ocznych i nieocznych przy użyciu wysokosprawnej chromatografii cieczowej

Tutaj opisujemy dwie ilościowe metody badania oddziaływań białko-ligand receptorów błonowych witaminy A i opsyny fotoreceptorów z ich odpowiednimi fizjologicznymi ligandami.

Metodologia badania oddziaływań receptorów błonowych witaminy A i białka opsyny z ich ligandami w wytwarzaniu białka retinylidenu

Regulowana endocytoza kontroluje poziomy ekspresji na powierzchni komórki dla większości białek błonowych. W niniejszym opracowaniu wykorzystujemy redukowalne, nieprzenikające przez błonę odczynniki do biotinylacji, aby zmierzyć tempo endocytozy transportera dopaminy (DAT), który jest politopeowym białkiem błonowym. Metoda ta umożliwia prostą procedurę pomiaru tempa endocytozy większości białek błony plazmatycznej.

Pomiar szybkości endocytozy białek błony plazmatycznej za pomocą odwracalnego znakowania biotyną

Niniejszy protokół opisuje szybką technikę ilościowego oznaczania translokacji GLUT4 z cytoplazmy do błony plazmatycznej komórek za pomocą cytometrii przepływowej.

Ilościowy pomiar translokacji GLUT4 do błony komórkowej przy użyciu cytometrii przepływowej

Opisano metodę in vitro przygotowywania funkcjonalnych kompleksów białkowych receptora glikokortykoidowego (GR)•hsp90 z oczyszczonych białek oraz lizatów komórkowych. Metoda wykorzystuje immunoadsorpcję rekombinowanego GR, po której następuje usuwanie soli (salt-stripping) i rekonstytucja kompleksu białkowego. Omówiono znaczenie kofaktorów i warunków buforowych, a także potencjalne zastosowania tej metody.

Biochemiczna rekonstrukcja kompleksów białkowych receptor steroidowy•Hsp90 oraz reaktywacja wiązania ligandu

Multiple-Target Tracing to autorski algorytm opracowany do śledzenia pojedynczo znakowanych cząsteczek w błonie plazmatycznej żywych komórek. Efektywne wykrywanie, szacowanie i śledzenie cząsteczek w czasie przy wysokiej gęstości znakowania zapewnia przyjazne dla użytkownika, kompleksowe narzędzie do badania dynamiki błon w skali nanometrycznej.

Mapowanie dyfuzji molekularnej w błonie plazmatycznej za pomocą Multiple-Target Tracing (MTT)

Prezentujemy zjawisko FRET pomiędzy sprzężonym polimerem polidiacetylenem (PDA) a fluorophorem przyczepionym do powierzchni liposomów PDA w celu detekcji biomolekuł. Liposomy PDA zawierały na swojej powierzchni cząsteczki receptorowe dla biomolekuł, które służyły jako sondy. Oddziaływania ligand-receptor prowadzą do zmian w efektywności FRET pomiędzy fluorophorem a PDA, co stanowi podstawę mechanizmu detekcji.

Monitorowanie w czasie rzeczywistym oddziaływań ligand-receptor z wykorzystaniem transferu energii rezonansowej fluorescencji

Termoforeza w mikroskali (MST) może być szeroko stosowana do określania powinowactwa do wiązania bez oczyszczania docelowego białka z lizatów komórkowych. Protokół obejmuje nadekspresję białka połączonego z GFP, lizę komórek w warunkach niedenaturujących oraz wykrywanie sygnału MST w obecności różnych stężeń liganda.

Metoda oznaczania powinowactwa do wiązań bez oczyszczania białek za pomocą termoforezy w mikroskali

Poznaj metodę produkcji wysokiej jakości białka wiążącego retinol z bakterii i jego oczyszczania HPLC do badań receptora STRA6 w czasie rzeczywistym. Technika umożliwia monitorowanie transportu witaminy A.

Analizy transportu retinolu w czasie rzeczywistym przez receptor błonowy białka wiążącego retinol w osoczu

Przeglądaj więcej filmów