Name: Generowanie stabilnych linii komórek ludzkich z ekspresją shRNA lub cDNA indukowaną tetracykliną (Tet-on) (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-03-05T13:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 51 s
Description: Poznaj metodę generowania stabilnych linii komórkowych z indukowalną ekspresją genów. Technika Tet-on umożliwia kontrolowane nadekspresję cDNA lub knockdown shRNA w komórkach ludzkich.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Dziękujemy wszystkim członkom naszego laboratorium za pomocne dyskusje. Dziękujemy Joannie Lisztwan i Christinie Gewinner za krytyczną lekturę rękopisu. Prace te były wspierane przez grant BBSRC BB/I021248/1 oraz grant Wellcome Trust 090090/Z/09/Z.A.H. jest stypendystą Wellcome Trust Research Career Development w UCL Cancer Institute.

1. Klonowanie pcDNA6_TetR_IRES_blast
<ol>
	<li>Jak pokazano na rysunku 3, przeprowadzić częściowe trawienie plazmidu pcDNA6 / TR (V1025-20, Invitrogen) z enzymami restrykcyjnymi XbaI i NcoI w celu usunięcia genu TetR i promotora genu oporności na blasticydynę (BlastR). Wyizoluj fragment wektora o rozmiarze 4,6 kb.</li>
	<li>Aby usunąć sekwencję poliadenylacji z genu TetR, wprowadź metodą PCR miejsce XhoI natychmiast po kodonie Stop cDNA TetR, zachowując miejsce XbaI na końcu 5' cDNA. Powstały fragment należy sklonować do pMigR117 za pomocą enzymów restrykcyjnych XbaI i XhoI w celu wytworzenia plazmidu pMigR1_TetR.</li>
	<li>Strawij wektor pMigR1_TetR enzymami restrykcyjnymi XbaI i NcoI, aby uwolnić fragment TetR_IRES. Wyizoluj fragment wkładki o rozmiarze 1,25 kb.</li>
	<li>Zliżuj 4,6 kb pcDNA6/TR i 1,25 kb TetR_IRES fragmentów. Przekształć produkt ligacji w kompetentną E. coli i zidentyfikuj pożądany konstrukt pcDNA6_TetR_IRES_blast przy użyciu standardowych technik biologii molekularnej.</li>
</ol>
2. Generacja linii komórkowych stabilnie wyrażających TetR
<ol>
	<li>W pierwszym dniu wysiewaj 1x106 komórek na 10-centymetrową płytkę do hodowli tkankowej przy użyciu standardowego podłoża wzrostowego (np. DMEM uzupełnionego 10% FCS). Wysiewaj dwie płytki, jedną do transfekcji z pcDNA6_TetR_IRES_blast, a drugą jako kontrolę ujemną do selekcji blasticydyny. Upewnij się, że używasz najniższego możliwego pasażu i zalecanego podłoża wzrostowego.</li>
	<li>W dniu 2 należy wykonać transfekcję na jednej płytce z 2 μg pcDNA6_TetR_IRES_blast przy użyciu Fugene 6 (E2691, Promega) zgodnie z instrukcjami producenta. Nie należy transfekować drugiej płytki.</li>
	<li>W dniu 3 dodaj standardową pożywkę zawierającą 5 μg/ml blasticydyny do obu płytek. Należy pamiętać, że optymalne stężenie selekcyjne może się różnić dla danej linii komórkowej i może być konieczne wcześniejsze określenie.</li>
	<li>W 4 dniu podziel komórki na 1/5, 1/25, 1/50 i 1/100 za pomocą 10-centymetrowych płytek i standardowej pożywki zawierającej 5 mg/ml blasticydyny. Upewnij się, że prawidłowo oznaczyłeś płytki zawierające komórki nietransfekowane lub transfekowane. Przygotować dwie płytki na każdym etapie rozcieńczania.</li>
	<li>Sprawdzaj komórki codziennie, upewniając się, że wszystkie komórki na nietransfekowanych płytkach obumarły w ciągu pierwszego tygodnia. Zmieniaj wybrane media co 2-3 dni.</li>
	<li>Po 1-2 tygodniach powinny zacząć pojawiać się kolonie oporne na blasticydynę. Wybierz płytki zawierające od 5 do 50 kolonii, aby mieć pewność, że można zbierać pojedyncze kolonie.</li>
	<li>Gdy kolonie osiągną średnicę około 5 mm (lub większą), wyizoluj co najmniej 12 niezależnych klonów za pomocą cylindrów klonujących, aby wybrać pojedyncze kolonie. Przenieść każdy klon do oddzielnego dołka na 24-dołkowej płytce do hodowli tkankowej. W przypadku zlewania się podziel komórki z każdej studzienki na jedną studzienkę 6-dołkowej płytki do hodowli tkankowej.</li>
	<li>Kontynuuj hodowlę klonów w pożywkach selekcyjnych. Po zlewaniu się podziel komórki z każdej studzienki na dwie pojedyncze studzienki 6-dołkowej płytki do hodowli tkankowej.</li>
	<li>Dla każdego klonu, który ma być badany, należy zamrozić jedną studzienkę zlewających się komórek i zebrać komórki w drugiej studzience w celu przeprowadzenia kolejnych testów za pomocą immunoblottingu.</li>
	<li>Wykryj TetR za pomocą Western blot przy użyciu mysiego przeciwciała monoklonalnego anty-TET02 (MoBiTec GmbH). Pamiętaj, aby jako kontrolę ujemną włączyć lizat rodzicielskiej linii komórkowej.</li>
	<li>Wybierz 3 klony o najwyższej ekspresji TetR i rozwiń każdą kulturę klonalną. Zamroź zapasy każdego obiecującego klonu tak szybko, jak to możliwe. Na koniec zbadaj interesujące nas parametry molekularne i biologiczne komórki, porównując rodzicielskie linie komórkowe z klonami wykazującymi ekspresję TetR. Wybierz "najlepszy" klon o najwyższej ekspresji TetR, który nie wykazuje żadnych zmian w interesujących nas parametrach molekularnych i biologicznych komórki.</li>
</ol>
3. Pilotażowe testowanie wektorów pTER i pT-Rex DEST30 wyrażających odpowiednio shRNA lub cDNA
<ol>
	<li>Wygeneruj plazmid pTER z wstawieniami shRNA, jak opisano12. Skonstruować wektor pT-Rex DEST30 (12301-016, Invitrogen) zawierający interesujące go cDNA przy użyciu technologii Gateway (Invitrogen). W przypadku ekspresji cDNA, dodanie znacznika do cDNA ułatwi później wykrycie białka eksprymowanego egzogennie.</li>
	<li>Przejściowo transfekować rodzicielską docelową linię komórkową plazmidami pTER lub pT-Rex DEST30 (wyrażającymi interesujące nas shRNA lub cDNA) przy użyciu wybranego odczynnika do transfekcji. Do testowania plazmidów ekspresyjnych shRNA należy zapewnić wysoką wydajność transfekcji.</li>
	<li>Zbierz transfekowane komórki i poddaj je immunoblottingowi przy użyciu odpowiednich przeciwciał, spodziewając się wykrycia wyczerpania lub nadekspresji interesującego Cię genu.</li>
</ol>
4. Generowanie stabilnych linii komórkowych z ekspresją shRNA lub cDNA indukowaną tetracykliną (Tet-on) za pomocą wektorów pTER lub pT-Rex DEST30
<ol>
	<li>W dniu 1 wysiewaj 1x106 komórek "najlepszego" klonu z ekspresją TetR na 10-centymetrową płytkę, używając standardowej pożywki wzrostowej uzupełnionej certyfikowaną surowicą wolną od tetracyklin (na przykład FBS z Invitrogen; 16000-014). Zasiać jedną płytkę do transfekcji pTER (lub pT-Rex DEST30) i jedną szalkę jako kontrolę ujemną do podwójnej selekcji. Upewnij się, że korzystasz z najniższego możliwego przejścia.</li>
	<li>W dniu 2 należy wykonać transfekcję na jednej płytce z 2 μg pTER (lub pT-Rex DEST30) przy użyciu Fugene 6. Nie należy transfekować drugiej płytki.</li>
	<li>W dniu 3 dodaj standardową pożywkę wzrostową zawierającą 5 μg/ml blasticydyny i 500 μg/ml zeocyny (lub 1 mg/ml G418).</li>
	<li>W 4 dniu podziel komórki na 1/5, 1/25, 1/50 i 1/100 za pomocą 10-centymetrowych płytek i standardowej pożywki zawierającej 5 μg/ml blasticydyny i 500 μg/ml zeocyny (lub 1 mg/ml G418). Przygotować dwie płytki na każdym etapie rozcieńczania.</li>
	<li>Sprawdzaj komórki codziennie, upewniając się, że w ciągu pierwszego tygodnia wszystkie komórki na nietransfekowanych płytkach obumarły. Zmieniaj standardową pożywkę zawierającą blasticydynę i zeocynę (lub G418) co 3-4 dni.</li>
	<li>Po 2-3 tygodniach powinny zacząć pojawiać się kolonie podwójnie oporne blasticydyna/zeocyna (lub blasticydyna/G418). Wybierz płytki zawierające od 5 do 50 kolonii, aby wybrać pojedyncze kolonie.</li>
	<li>Gdy kolonie osiągną średnicę około 5 mm (lub większą), użyj cylindrów klonujących, aby wybrać pojedyncze kolonie. Odizoluj co najmniej 24 pojedyncze klony. Przenieść każdy klon do oddzielnego dołka na 24-dołkowej płytce do hodowli tkankowej.</li>
	<li>Klony hodowlane w pożywce zawierającej podtrzymujące stężenia blasticydyny (5 μg/ml) i zeocyny (250 μg/ml) [lub G418 (0,5 mg/ml)]. W przypadku zlewania się podziel komórki z każdej studzienki na jedną studzienkę 6-dołkowej płytki do hodowli tkankowej.</li>
	<li>Dla każdego klonu, który ma być badany, należy podzielić jedną zlewającą się studzienkę z płytki 6-dołkowej na trzy pojedyncze studzienki z płytki 6-dołkowej. Po zlewaniu się zamroź komórki z jednej studzienki. Użyj pozostałych dwóch studzienek do zbadania ekspresji indukowanej tetracykliną. Dodać tetracyklinę w stężeniu 1 μg/ml do jednego dołka, pozostawiając drugi studzienkę wolną od tetracykliny.</li>
	<li>Po 24 do 96 godzinach inkubacji z tetracykliną należy pobrać komórki i przeprowadzić proces immunoblottingu przy użyciu odpowiednich przeciwciał. Krótsze czasy inkubacji tetracyklin są zalecane podczas badań przesiewowych pod kątem indukcji ekspresji cDNA, podczas gdy dłuższe leczenie tetracykliną będzie konieczne w celu określenia zubożenia endogennych białek za pośrednictwem shRNA.</li>
	<li>Wybierz co najmniej dwa klony z żądanym zubożeniem/nadekspresją i rozwiń każdą kulturę. Zamroź zapasy każdego obiecującego klonu tak szybko, jak to możliwe. Podczas hodowli klonów Tet-on do eksperymentów zawsze upewnij się, że używasz pożywki uzupełnionej surowicą wolną od tetracyklin i odpowiednimi antybiotykami selekcyjnymi w stężeniach podtrzymujących.</li>
</ol>

<ol><li>Postle, K., Nguyen, T. T., Bertrand, K. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nucleotide+sequence+of+the+repressor+gene+of+the+TN10+tetracycline+resistance+determinant%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">Nucleotide sequence of the repressor gene of the TN10 tetracycline resistance determinant.</a> Nucleic Acids Res. 12, 4849-4863 (1984).</li>
<li>Gossen, M., Bujard, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tight+control+of+gene+expression+in+mammalian+cells+by+tetracycline-responsive+promoters%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Tight control of gene expression in mammalian cells by tetracycline-responsive promoters.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 89, 5547-5551 (1992).</li>
<li>Gossen, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transcriptional+activation+by+tetracyclines+in+mammalian+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Transcriptional activation by tetracyclines in mammalian cells.</a> Science. 268, 1766-1769 (1995).</li>
<li>Elbashir, S. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Duplexes+of+21-nucleotide+RNAs+mediate+RNA+interference+in+cultured+mammalian+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Duplexes of 21-nucleotide RNAs mediate RNA interference in cultured mammalian cells.</a> Nature. 411, 494-498 (2001).</li>
<li>Brummelkamp, T. R., Bernards, R., Agami, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+system+for+stable+expression+of+short+interfering+RNAs+in+mammalian+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">A system for stable expression of short interfering RNAs in mammalian cells.</a> Science. 296, 550-553 (2002).</li>
<li>McManus, M. T., Petersen, C. P., Haines, B. B., Chen, J., Sharp, P. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gene+silencing+using+micro-RNA+designed+hairpins%5BTitle%5D)+AND+%22RNA%22%5BJournal%5D)">Gene silencing using micro-RNA designed hairpins.</a> RNA. 8, 842-850 (2002).</li>
<li>Miyagishi, M., Taira, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((U6+promoter-driven+siRNAs+with+four+uridine+3%27+overhangs+efficiently+suppress+targeted+gene+expression+in+mammalian+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">U6 promoter-driven siRNAs with four uridine 3' overhangs efficiently suppress targeted gene expression in mammalian cells.</a> Nat. Biotechnol. 20, 497-500 (2002).</li>
<li>Paddison, P. J., Caudy, A. A., Bernstein, E., Hannon, G. J., Conklin, D. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Short+hairpin+RNAs+%28shRNAs%29+induce+sequence-specific+silencing+in+mammalian+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Genes+Dev%22%5BJournal%5D)">Short hairpin RNAs (shRNAs) induce sequence-specific silencing in mammalian cells.</a> Genes Dev. 16, 948-958 (2002).</li>
<li>Paul, C. P., Good, P. D., Winer, I., Engelke, D. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effective+expression+of+small+interfering+RNA+in+human+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Effective expression of small interfering RNA in human cells.</a> Nat. Biotechnol. 20, 505-508 (2002).</li>
<li>Sui, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+DNA+vector-based+RNAi+technology+to+suppress+gene+expression+in+mammalian+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">A DNA vector-based RNAi technology to suppress gene expression in mammalian cells.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 99, 5515-5520 (2002).</li>
<li>Yu, J. Y., DeRuiter, S. L., Turner, D. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((RNA+interference+by+expression+of+short-interfering+RNAs+and+hairpin+RNAs+in+mammalian+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">RNA interference by expression of short-interfering RNAs and hairpin RNAs in mammalian cells.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 99, 6047-6052 (2002).</li>
<li>van de Wetering, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Specific+inhibition+of+gene+expression+using+a+stably+integrated%2C+inducible+small-interfering-RNA+vector%5BTitle%5D)+AND+%22EMBO+Rep%22%5BJournal%5D)">Specific inhibition of gene expression using a stably integrated, inducible small-interfering-RNA vector.</a> EMBO Rep. 4, 609-615 (2003).</li>
<li>Hergovich, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+MST1+and+hMOB1+tumor+suppressors+control+human+centrosome+duplication+by+regulating+NDR+kinase+phosphorylation%5BTitle%5D)+AND+%22Curr.+Biol%22%5BJournal%5D)">The MST1 and hMOB1 tumor suppressors control human centrosome duplication by regulating NDR kinase phosphorylation.</a> Curr. Biol. 19, 1692-1702 (2009).</li>
<li>Hergovich, A., Lamla, S., Nigg, E. A., Hemmings, B. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Centrosome-associated+NDR+kinase+regulates+centrosome+duplication%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Cell%22%5BJournal%5D)">Centrosome-associated NDR kinase regulates centrosome duplication.</a> Mol. Cell. 25, 625-634 (2007).</li>
<li>Kohler, R. S., Schmitz, D., Cornils, H., Hemmings, B. A., Hergovich, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differential+NDR%2FLATS+interactions+with+the+human+MOB+family+reveal+a+negative+role+for+human+MOB2+in+the+regulation+of+human+NDR+kinases%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Differential NDR/LATS interactions with the human MOB family reveal a negative role for human MOB2 in the regulation of human NDR kinases.</a> Mol. Cell Biol. 30, 4507-4520 (2010).</li>
<li>Vichalkovski, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((NDR+kinase+is+activated+by+RASSF1A%2FMST1+in+response+to+Fas+receptor+stimulation+and+promotes+apoptosis%5BTitle%5D)+AND+%22Curr.+Biol%22%5BJournal%5D)">NDR kinase is activated by RASSF1A/MST1 in response to Fas receptor stimulation and promotes apoptosis.</a> Curr. Biol. 18, 1889-1895 (2008).</li>
<li>Pear, W. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Efficient+and+rapid+induction+of+a+chronic+myelogenous+leukemia-like+myeloproliferative+disease+in+mice+receiving+P210+bcr%2Fabl-transduced+bone+marrow%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Efficient and rapid induction of a chronic myelogenous leukemia-like myeloproliferative disease in mice receiving P210 bcr/abl-transduced bone marrow.</a> Blood. 92, 3780-3792 (1998).</li>
</ol>

Nie stwierdzono konfliktu interesów.

Uważamy, że systemy Tet-on znacznie ułatwiają analizę funkcji genów, szczególnie w systemach komórkowych, które są trudne do manipulowania i/lub gdy manipulowany gen jest niezbędny do przeżycia komórki. Co więcej, zdolność do kontrolowania ekspresji genów przez wysoce specyficzne systemy Tet-on daje możliwość badania funkcji genów na różnych etapach (na przykład podczas progresji cyklu komórkowego lub dobrze zdefiniowanych procesów różnicowania). Przedstawiona tutaj metoda umożliwi naukowcom wygenerowanie pożądanych stab...

<table><tbody><tr><td>Płodowa surowica bydlęca (FBS)</td><td>Invitrogen</td><td>16000-044</td><td>Testowane Tet-free</td></tr><tr><td>Blasticidin</td><td>Invivogen</td><td>ant-bl-1</td><td> </td></tr><tr><td>Zeocin</td><td>Invivogen</td><td>ant-zn-5</td><td> </td></tr><tr><td>G418</td><td>PAA laboratories</td><td>P31-011</td><td>100 mg / ml w pożywce</td></tr><tr><td>anty-TET02</td><td>MoBiTec GmbH</td><td>TET02</td><td>Stosować w 1/1000 do 1/2000 dla WB</td></tr><tr><td>pcDNA6/ TR</td><td>Invitrogen</td><td>V1025-20</td><td> </td></tr><tr><td>pT-Rex DEST30</td><td>Invitrogen</td><td>12301-016</td><td> </td></tr><tr><td>Tetracyklina</td><td>Sigma</td><td>87128</td><td>2 mg/ml w etanolu</td></tr><tr><td>Doksycyklina</td><td>Sigma</td><td>D9891</td><td>2 mg/ml w wodzie</td></tr><tr><td>Butle klonujące</td><td>Bellco Glass Inc.</td><td>2090-00808</td><td>wielokrotnego użytku</td></tr></tbody></table>

generowanie stabilnych linii komórek ludzkich z ekspresją shrna lub cdna indukowaną tetracykliną (tet-on)

Generation of Stable Human Cell Lines with Tetracycline-inducible (Tet-on) shRNA or cDNA Expression

Głównym podejściem w dziedzinie biologii komórek ssaków jest manipulowanie ekspresją interesujących genów w wybranych liniach komórkowych, w celu ujawnienia jednej lub kilku funkcji genu za pomocą przejściowej/stabilnej nadekspresji lub knockdownu interesującego genu. Niestety, w przypadku różnych badań biologicznych komórek podejście to jest nieodpowiednie, gdy manipulacje ekspresją genów skutkują defektami wzrostu/proliferacji komórek lub niepożądanym różnicowaniem komórek. W związku z tym naukowcy dostosowali białko represorowe tetracykliny (TetR), pobrane z operonuoporności na tetracyklinę E. coli 1, do wytworzenia bardzo wydajnych i ścisłych systemów regulacyjnych do ekspresji cDNA w komórkach ssaków2,3. Krótko mówiąc, TetR został zmodyfikowany tak, aby (1) blokować inicjację transkrypcji poprzez wiązanie się z operatorem Tet (TO) w regionie promotora po dodaniu tetracykliny (określanej jako system Tet-off) lub (2) wiązać się z TO przy braku tetracykliny (określanej jako system Tet-on) (Figura 1). Biorąc pod uwagę niedogodność polegającą na tym, że system Tet-off wymaga ciągłej obecności tetracykliny (której okres półtrwania wynosi około 24 godziny w pożywce do hodowli komórek tkankowych), system Tet-on został bardziej zoptymalizowany, co zaowocowało opracowaniem bardzo ścisłych i wydajnych systemów wektorowych do ekspresji cDNA, jak zastosowano tutaj.
Krótko po ustaleniu interferencji RNA (RNAi) dla knockdownu genów w komórkach ssaków4, opisano wektory wyrażające krótkie RNA (shRNA), które działają bardzo podobnie do siRNA5-11. Jednak te podejścia do knockdownu, w których pośredniczy shRNA, mają takie same ograniczenia, jak konwencjonalne strategie nokautu, ponieważ stabilne wyczerpanie nie jest wykonalne, gdy cele genowe są niezbędne do przetrwania komórki. Aby przezwyciężyć to ograniczenie, van de Wetering i wsp. 12 zmodyfikowało wektor ekspresji shRNA pSUPER5 poprzez wstawienie TO do regionu promotora, co umożliwiło im wygenerowanie stabilnych linii komórkowych z indukowanym tetracykliną zubożeniem docelowych genów będących przedmiotem zainteresowania.
Tutaj opisujemy metodę efektywnego generowania stabilnych ludzkich linii komórkowych Tet-on, które niezawodnie napędzają albo indukowaną nadekspresję, albo zubożenie interesującego nas genu. Za pomocą tej metody udało nam się wygenerować linie komórkowe Tet-on, które znacznie ułatwiły analizę kaskady MST/hMOB/NDR w centrosomie13,14 i sygnalizacji apoptozy15,16. W tym raporcie opisujemy wybrane przez nas wektory, a także opisujemy dwa kolejne etapy manipulacji, które są niezbędne do wydajnego generowania ludzkich linii komórkowych Tet-on (ryc. 2). Ponadto, oprócz nakreślenia protokołu generowania ludzkich linii komórkowych Tet-on, omówimy krytyczne aspekty dotyczące procedur technicznych i charakterystyki komórek Tet-on.

Przykład wstępnej charakterystyki linii komórkowych RPE-1 stabilnie eksponujących TetR przedstawiono na Rysunku 4. Należy zauważyć, że wszystkie klony RPE-1 wykazują zróżnicowany poziom ekspresji TetR (porównać ścieżki 2 i 5), podczas gdy linia komórek macierzystych (pełniąca rolę kontroli negatywnej) nie wykazuje ekspresji egzogennego białka TetR (Rysunek 4, ścieżka 1). Taka zmienność ekspresji TetR pomiędzy klonami komórek RPE-1 Tet-on jest spodziewana, ponieważ ekspresja plazmidów kod...

Szybki i prosty sposób na wygenerowanie ludzkich linii komórkowych z indukowalną i odwracalną nadekspresją cDNA lub nokautem za pośrednictwem shRNA interesującego genu. Metoda ta umożliwia naukowcom wiarygodne i wysoce powtarzalne manipulowanie liniami komórkowymi, które są trudne do zmiany za pomocą przejściowych metod transfekcji lub konwencjonalnych strategii knockdown/knockout.

Generowanie stabilnych linii komórek ludzkich z ekspresją shRNA lub cDNA indukowaną tetracykliną (Tet-on)

A major approach in  the field of mammalian cell biology is the manipulation of the expression of  genes of interest in selected cell lines, with the aim ...

Ogólnym celem tej procedury jest wytworzenie stabilnych ludzkich linii komórkowych z indukowalną tetracykliną ekspresją S-H-R-N-A lub CDNA. Najpierw należy przeprowadzić transfekcję komórek docelowych plazmidem ekspresyjnym tatar, a następnie wyselekcjonować komórki oporne na blastercydynę. Następnie należy wyizolować poszczególne kolonie i przesiewać je w celu znalezienia komórek stabilnie ekspresujących białko represora Tet.Następnie należy przeprowadzić transfekcję najlepszego klonu wykazującego ekspresję teta plazmidami zaprojektowanymi do modulowania ekspresji genu docelowego pod kontrolą elementu odpowiedzi Tet. Po poddaniu transfekowanych komórek podwójnej selekcji należy wyizolować pojedyncze kolonie i wyłonić pożądane klony Teton za pomocą analizy western blotting. Ostatecznie otrzymane klony Teton mogą zostać wykorzystane do zbadania wpływu konkretnych celów na wybrane parametry biologiczne.Procedurę zaprezentuje postdok w laboratorium, Marty Gomez Martinez. Należy wygenerować wektor, który steruje ekspresją represora Tet oraz genu oporności na Blain z tego samego promotora CMV. W dwóch 10 centymetrowych płytkach do hodowli tkanek należy wysiać w centrum sześć komórek w standardowej pożywce wzrostowej: jedną płytkę do transfekcji plazmidem ekspresyjnym tatar, a drugą jako kontrolę negatywną dla selekcji Blain. Następnego dnia należy przeprowadzić transfekcję jednej płytki dwiema mikrogramami plazmidu ekspresyjnego TTA przy użyciu FU gene six.Postępując zgodnie z instrukcjami producenta, inkubować kulturę przez noc obok obu płytek. Po 24 godzinach dodać standardową pożywkę wzrostową zawierającą optymalne stężenie blastycyny dla używanej linii komórkowej, zebrać komórki, a następnie oznakować płytki 10 cm do rozcieńczeń seryjnych i przystąpić do wysiewania powtórzeń rozcieńczeń seryjnych przy użyciu standardowej pożywki wzrostowej zawierającej 5 µg/mL blastycyny; należy upewnić się, że płytki zawierające komórki niepodane pod selekcję lub komórki transfektowane zostały odpowiednio oznakowane. Monitorować komórki, zwracając szczególną uwagę na to, czy wszystkie komórki na płytkach niepodanych pod selekcję obumarły w ciągu pierwszego tygodnia.Wymieniaj podłoże selekcyjne co dwa do trzech dni po upływie jednego do dwóch tygodni, gdy pojawią się kolonie oporne na blaster soin. Wybierz płytki zawierające od pięciu do 50 kolonii, aby zapewnić możliwość wyselekcjonowania pojedynczych kolonii w momencie, gdy osiągną one średnicę około pięciu milimetrów. Wyizoluj co najmniej 12 niezależnych klonów, używając cylindrów do klonowania do pobierania pojedynczych kolonii.Przenieś każdy klon do oddzielnej studzienki płytki 24-dołkowej i hoduj komórki do osiągnięcia konfluencji. Zbierz i przenieś komórki z każdej kolonii do oddzielnych studzienek 6-dołkowej płytki do hodowli tkankowej. Kontynuuj hodowlę klonów w pożywce selekcyjnej, gdy kultury osiągną pełną konfluencję.Podziel komórki z każdej studni na dwie pojedyncze studnie w sześciostudniowej płytce do hodowli tkanek. Dla każdego klonu przeznaczonego do testów zamroź jedną studnię z konfluencyjnymi komórkami. Zbierz komórki z drugiej studni w celu oceny ekspresji białka tatar.Przeprowadź analizę western blot klonów, wykorzystując lizat rodzimej linii komórkowej jako kontrolę negatywną w celu wykrycia białka tatar. Użyj mysiego przeciwciała monoklonalnego anty Tet zero dwa. Następnie przystąp do namnażania trzech klonów o najwyższej ekspresji testar.Jak najszybciej zamroź zapasy każdego obiecującego klonu. Obecnie komórki klonalne są gotowe do analizy wybranych parametrów molekularnych i komórkowych. Porównując linie komórkowe rodzicielskie z klonami wykazującymi ekspresję tatar, wybierz najlepszy klon z najwyższą ekspresją tatar, który nie wykazuje żadnych zmian w analizowanych parametrach molekularnych i biologii komórki.Przygotuj plazmidy PTER z interesującymi wstawkami hRNA. Skonstruuj również wektor PT REX desk 30 zawierający interesujące cDNA z wykorzystaniem technologii Gateway. Przeprowadź przejściową transfekcję macierzystej linii komórkowej docelowej plazmidami PTER lub P T-Rex S 30.Należy użyć wybranych odczynników do transfekcji. Następnie należy zebrać transfektowane komórki i ocenić ekspresję genu docelowego za pomocą immunoblottingu. W pierwszym dniu należy zasiać dwie płytki najlepszego klonu wykazującego ekspresję tetracykliny, używając standardowego podłoża wzrostowego uzupełnionego o certyfikowane serum wolne od tetracykliny, i inkubować kulturę przez noc.Następnego dnia przeprowadź transfekcję tylko jednej płytki przy użyciu 2 µg plazmidu ekspresyjnego A-S-H-R-N-A lub CDNA, stosując FU gene six. W trzecim dniu dodaj standardową pożywkę wzrostową zawierającą albo 5 µg/ml blastycyny i 500 µg/ml eozyny, albo blastycynę i G 418. Następnie w czwartym dniu dokonaj przesiewu komórek w celu przygotowania dubletów płytek z rozcieńczeniami, używając standardowej pożywki wzrostowej do podwójnej selekcji.Codziennie sprawdzaj komórki pod kątem odpowiedzi na śmierć komórkową indukowaną leczeniem antybiotykiem i wymieniaj medium co trzy do czterech dni. Po dwóch do trzech tygodniach, gdy w medium zein lub G418 zaczną pojawiać się kolonie podwójnie oporne.Wybierz płytki zawierające od pięciu do 50 kolonii, aby wyizolować pojedyncze kultury kolonii, aż osiągną one średnicę około pięciu milimetrów lub więcej. Za pomocą cylindrów do klonowania pobierz i przenieś pojedyncze kolonie do oddzielnych studni 24-dołkowej płytki do hodowli tkankowej. Klony hoduj w medium zawierającym stężenia podtrzymujące: pięć µg/mL blasteryzoiny i 50 µg/mL.Eozynofile lub blasty w G418. Po osiągnięciu konfluencji przenieść komórki z każdego dołka do jednego dołka w 6-dołkowej płytce do hodowli tkankowych. Po osiągnięciu konfluencji przenieść komórki do trzech dołków płytki 6-dołkowej, aby hodować je do 100% konfluencji.Zamroź komórki z jednej studzienki w celu przetestowania ekspresji indukowalnej; do jednej studzienki dodaj 1 µg/mL tetracykliny, pozostawiając drugą studzienkę z komórkami jako kontrolę. Inkubuj przez 24 do 96 godzin bez tetracykliny, stosując krótszy czas w celu badania indukcji ekspresji CD NA, a dłuższy czas w celu oznaczenia wyczerpania białek endogennych za pośrednictwem S-H-R-N-A. Następnie zbierz komórki i poddaj je analizie immuno-blottingu z użyciem odpowiednich przeciwciał.Wybrać co najmniej dwa klony z pożądanym poziomem deplekcji lub nadekspresji i powiększyć każdą z kultur. Należy pamiętać o jak najszybszym zamrożeniu zapasów każdego obiecującego klonu. Ta wstępna charakterystyka ludzkiej linii nabłonkowych komórek siatkówki pod kątem stabilnej ekspresji tatar wykazuje, że wszystkie klony RPE one wykazują zróżnicowany poziom ekspresji tatar.Zgodnie z oczekiwaniami, macierzysta linia komórkowa RPE one nie wykazuje ekspresji egzogennego białka tatar. Zróżnicowanie ekspresji Tet R wśród klonów komórek RPE one Teton odzwierciedla miejsca integracji plazmidu. Niniejszy eksperyment charakteryzuje stabilne klony komórek RPE one Teton, które wykazują ekspresję RNA skierowanego przeciwko kinazie MST three; trzy klony komórkowe wybrano do dalszej analizy.Po obejrzeniu tego filmu będą Państwo mieli dobrą wiedzę na temat tego, jak generować stabilne linie ludzkich komórek z niekontrolowaną ekspresją badanego RNA lub cDNA.

generation-stable-human-cell-lines-with-tetracycline-inducible-tet-on

Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

Generowanie stabilnych linii komórek ludzkich z tetracyklinowo-indukcyjną (Tet-on) ekspresją shRNA lub cDNA

Zmierzono wkład czynnika przebudowy chromatyny ACF w indukowaną przez E4orf4 śmierć komórek. Protokół obejmuje selekcję klonów komórkowych, w których traktowanie doksycykliną indukuje warunkowy knockdown podjednostek ACF: Acf1 i SNF2h, oraz zastosowanie testu z DAPI do pomiaru indukowanej przez E4orf4 śmierci komórek w indukowalnych liniach komórkowych.

Przygotowanie linii komórkowych do warunkowego wyciszenia ekspresji genu i pomiar efektów wyciszenia w odniesieniu do indukowanej przez E4orf4 śmierci komórek

Ten film demonstruje system ekspresji genów tetracykliny lub Tet-On w modelu mysim. W obecności doksycykliny, pochodnej tetracykliny, system Tet-On składający się z białka transaktywatora kontrolowanego przez odwróconą tetracyklinę ulega aktywacji i ulega ekspresji interesującego genu.

Indukowalna regulacyjna ekspresja genów oparta na systemie Tet-On in vivo: indukowany tetracykliną system ekspresji genów do aktywacji transkrypcji genu docelowego w modelu mysim

Ten film opisuje metodę regulacji ekspresji genów w hodowanych komórkach poprzez transfekcję plazmidem zawierającym interesujący nas gen i plazmid regulatorowy. Ekspresja tego plazmidu może być kontrolowana przez tetracyklinę lub jej syntetyczne analogi, co czyni ten system użytecznym modelem do badania regulowanej ekspresji genów.

Indukowalny system regulowany Tet-Off: metoda in vitro do modulacji ekspresji genów w hodowanych komórkach przy użyciu systemu Tetracyklina-Off

Tutaj używamy transdukcji retrowirusowej i transfekcji konkategomerycznej, aby stworzyć linię komórkową, która może wyrażać składniki wektora lentiwirusowego (LV) przy braku tetracykliny. Ten LV koduje GFP i jest pseudotypowany glikoproteiną SVGmu, która jest specyficzna dla receptora na komórkach dendrytycznych.

Linia komórkowa regulowana tetracykliną wytwarza wektory lentiwirusowe o wysokim mianie, które są specyficznie ukierunkowane na komórki dendrytyczne

Tutaj opisujemy nowatorską metodę generowania specyficznych dla antygenu receptorów limfocytów T (TCR) poprzez parowanie TCRα lub TCRβ istniejącego TCR, posiadającego swoistość antygenową będącą przedmiotem zainteresowania, z komplementarnym półłańcuchem repertuaru obwodowych receptorów limfocytów T. Generowane de novo TCR zachowują swoistość antygenową z różnym powinowactwem.

Generowanie receptorów ludzkich limfocytów T specyficznych dla antygenu de novo poprzez transdukcję retrowirusową centralnego hemiłańcucha

Badanie kanałów jonowych za pomocą heterologicznie wyrażającego systemu stało się podstawową techniką w badaniach biomedycznych. W tym manuskrypcie przedstawiamy efektywną czasowo metodę osiągania ściśle kontrolowanej ekspresji kanału jonowego poprzez przeprowadzanie transfekcji przejściowej pod kontrolą indukowalnego promotora.

Kontrolowana ekspresja kanału jonowego poprzez indukowalną transfekcję przejściową

Ten protokół służy jako schemat do tworzenia funkcjonalnego systemu Tet-ON w liniach komórek nowotworowych i jego późniejszego wykorzystania, w szczególności do badania roli białek pochodzących z komórek nowotworowych w rekrutacji monocytów/makrofagów do mikrośrodowiska guza.

Warunkowe obniżenie ekspresji genów w liniach komórek nowotworowych w celu zbadania rekrutacji monocytów/makrofagów do mikrośrodowiska guza

Tutaj prezentujemy protokół rozwoju dominująco-ujemnego systemu indukcyjnego, w którym każde białko może być warunkowo dezaktywowane przez odwracalną nadekspresję jego dominująco-ujemnej wersji zmutowanej.

Indukowalne i odwracalne hamowanie białka dominująco-ujemnego (DN)

Tutaj prezentujemy narzędzie, które może być użyte do badania potranskrypcyjnej modulacji transkryptu w pierwotnych komórkach nabłonka pęcherzyków płucnych za pomocą indukowalnego systemu ekspresji sprzężonego z techniką elektroporacji pipetowej.

Wydajny system ekspresji plazmidu sterowany transkrypcją do badania stabilności transkryptów mRNA w pierwotnych komórkach nabłonka pęcherzyków płucnych

W tym protokole prezentujemy eksperymentalny projekt wykorzystujący system warunkowego knockdown i dostosowany test tworzenia kuli w celu zbadania wpływu klastryny na macierzystość GCSC pochodzących od pacjenta. Protokół można łatwo dostosować do badania zarówno in vitro, jak i in vivo funkcji genów związanych z macierzystą naturą w różnych typach CSC.

Połączony test warunkowego knockdownu i dostosowanego tworzenia kuli w celu zbadania genu związanego z łodygą komórek macierzystych raka żołądka pochodzących od pacjenta

Poznaj metodę generowania stabilnych linii komórkowych z indukowalną ekspresją genów. Technika Tet-on umożliwia kontrolowane nadekspresję cDNA lub knockdown shRNA w komórkach ludzkich.

Generowanie stabilnych linii komórek ludzkich z ekspresją shRNA lub cDNA indukowaną tetracykliną (Tet-on)

Przeglądaj więcej filmów