Ocena mechaniki układu oddechowego u myszy przy użyciu techniki wymuszonej oscylacji
15 maja 2013
Niniejszy protokół zawiera szczegółowy opis krok po kroku procedur wymaganych do wykonania pomiarów mechaniki układu oddechowego, jak również oceny reakcji dróg oddechowych na wdychaną metacholinę u myszy przy użyciu techniki wymuszonej oscylacji (flexiVent; SCIREQ Inc, Montreal, Qc, Kanada).
Ogólnym celem tej procedury jest zademonstrowanie pomiarów wymuszonej oscylacji mechaniki oddechowej u myszy przy użyciu zdarzenia flex, komercyjnego wentylatora tłokowego sterowanego komputerowo. Zostanie to osiągnięte poprzez ocenę reakcji dróg oddechowych na wziewną metylocholinę. Pierwszym krokiem jest przygotowanie wymaganych odczynników, sprzętu i tematu.
Następnie pacjent jest podłączany do respiratora w celu wykonania pomiarów wentylacji mechanicznej i mechaniki oddechowej. Za pomocą predefiniowanego skryptu wykonuje się zbiór wysoce kontrolowanych zautomatyzowanych pomiarów na początku badania i po prowokacji metylocholiną. Analiza wyników może wykazać nadreaktywność dróg oddechowych, o czym świadczy większa maksymalna odpowiedź oporności i elastyny u myszy narażonych na działanie chloru w porównaniu z osobami kontrolnymi.
Główną przewagą tej techniki nad istniejącymi metodami jest to, że zapewnia ona dokładne narzędzie, za pomocą którego można mierzyć czynność płuc w sposób kompleksowy, szczegółowy i translacyjny. Osiąga się to poprzez analizę sygnałów ciśnienia i objętości uzyskanych w reakcji na predefiniowane oscylacyjne przebiegi przepływu powietrza stosowane przy ujściu dróg oddechowych badanego. Ponadto wiele czynników wpływających na odpowiedź fizjologiczną można kontrolować i standaryzować.
Korzystając z tej metody, włącz system Flex event FX i uruchom oprogramowanie. Niniejszy protokół ma zastosowanie do jednej z dwóch generacji zdarzeń flex obsługiwanych przez flexi. Załóż oprogramowanie Seven podczas pierwszej sesji eksperymentalnej lub w dowolnym momencie przed nią Otwórz moduł definicji i planowania badania, aby wstępnie zdefiniować strukturę badania.
Kliknij przycisk Utwórz nowe badanie i postępuj zgodnie z instrukcjami kreatora, aby utworzyć badanie. Nakreśl protokół i zdefiniuj grupy eksperymentalne i osoby, które mają być badane. Zainicjuj sesję eksperymentowania, otwierając moduł sesji eksperymentowania i postępując zgodnie z sekwencją startową.
Do nauki i wyboru szablonu. Przypisz obiekt do miejsca pomiaru i potwierdź jego wagę. Kontynuuj kalibrację systemu, postępując zgodnie z instrukcjami opisanymi w oprogramowaniu operacyjnym.
Pojawi się monit o podłączenie kaniuli, która ma być użyta do rurki Y w celu kalibracji. Kontynuuj kalibrację kaniuli, postępując zgodnie z instrukcjami kreatora kalibracji i sprawdź, czy uzyskane wartości kalibracji mieszczą się w określonym zakresie. W razie potrzeby powtórz proces kalibracji, jeśli nie jest gotowy, anuluj monity, aby rozpocząć wentylację i rejestrację danych.
Można je zainicjować w późniejszym terminie. Znieczulić pacjenta za pomocą odpowiednich dawek środków znieczulających. Sprawdź, czy pacjent osiągnął chirurgiczny poziom znieczulenia.
Pacjent nie powinien reagować na uszczypnięcie palca u nogi, a jego oddech powinien być regularny i nie powinien być ciężki. Ułóż zwierzę na wznak ze źródłem ciepła, aby utrzymać odpowiednią temperaturę ciała. Wystarczająca jest żarówka o mocy 60 W umieszczona 45 centymetrów od myszy.
Następnie oczyść obszar gardła alkoholem, aby odsłonić tchawicę. Wykonaj nacięcie i delikatnie oddziel gruczoł podszczękowy i pokrywającą go warstwę mięśniową. Delikatnie podnieś tchawicę za pomocą mikrokleszczy.
Następnie przełóż szew pod nim. Przeciąć między dwoma pierścieniami chrząstki znajdującymi się najbliżej krtani. Powoduje to małe nacięcie w tchawicy bez jej cięcia.
Włóż skalibrowaną kaniulę do nacięcia i delikatnie przeprowadź ją przez pięć pierścieni tchawicy. W tym przykładzie działa metalowa kaniula o grubości 1,2 centymetra o rozmiarze 18 cm. Bardzo ważne jest, aby zabezpieczyć kaniulę za pomocą szwu.
Nasadka powinna tworzyć hermetyczne uszczelnienie wokół kaniuli. Przyłóż kaniulowane zwierzę do respiratora. Wentylację mechaniczną można uruchomić, wybierając predefiniowany lub dostosowany profil wentylacji w oknie dokowanym wentylacji.
Teraz podłącz zwierzę do respiratora za pomocą rurki Y. Ostrożnie przymocuj zwierzę do respiratora i upewnij się, że kaniula tchawicy znajduje się na tym samym poziomie co respirator. Pozwala to uniknąć możliwego skręcenia kaniuli, okluzji lub tchawicy w oprogramowaniu.
Wykonaj głębokie zaburzenie pompowania, klikając dwukrotnie nazwę perturbacji, aby zweryfikować wprowadzenie i zamocowanie kaniuli. O ile nie ma wycieku, system utrzyma ciśnienie 30 centymetrów wody w ciągu trzech sekund bez nadmiernego przemieszczenia objętościowego. Zarejestrowane ślady objętości i ciśnienia powinny być gładkie, bez śladów przesunięcia lub deformacji.
W przeciwnym razie w tym miejscu może dojść do kaniuli, niedrożności lub przemieszczenia. W razie potrzeby można podłączyć przetworniki parametrów życiowych do monitorowania tętna i temperatury ciała. Rejestrację danych tych sygnałów można zainicjować w dowolnym momencie, ręcznie lub automatycznie za pomocą skryptu.
Pomiary lub polecenia aktywacji nebulizatora, znaczniki zdarzeń i tak dalej mogą być zautomatyzowane za pomocą predefiniowanych lub dostosowanych skryptów w celu uzyskania wysoce kontrolowanego i powtarzalnego procesu eksperymentalnego. Sześć rodzin zaburzeń powodujących powstanie szeregu parametrów można wykorzystać do opisania badanej mechaniki układu oddechowego na początku badania i po danym wyzwaniu. Kiedy jesteś gotowy do rozpoczęcia wykonywania pomiarów, ważne jest, aby najpierw uruchomić głębokie zaburzenie inflacji, aby zrekrutować zamknięte obszary płuc i ustandaryzować historię objętości płuc.
Następnie zweryfikuj brak spontanicznych wysiłków wdechowych, przeprowadzając pomiar testowy. Obserwuj ślady sygnału ciśnienia w wybranym widoku zestawu danych. Ze stopniowymi krzywymi PV.
Płaskowyże ciśnienia powinny być dobrze zdefiniowane, bez odchyleń w dół. Huśtawka ciśnienia w dół wskazywałaby na wysiłek wdechowy zwierzęcia. Teraz zainicjuj skrypt do oceny reakcji dróg oddechowych na wdychaną metylocholinę, klikając dwukrotnie na jego tytuł.
W tym przykładzie skrypt tworzy sekwencję pomiarów linii bazowej w trzech egzemplarzach. Następnie pojawia się monit o załadowanie nebulizatora solą fizjologiczną. Lub w tym przykładzie roztwór metylocholiny ładuje około 100 mikrolitrów roztworu do nebulizatora.
Nebulizacja rozpocznie się automatycznie, gdy tylko informacje zostaną wprowadzone do oprogramowania. Krótko po zakończeniu nebulizacji rozpoczyna się sekwencja pomiarów w krótkich odstępach czasu, trwająca około trzech minut. Następnie monit do wykonania.
Przewidziane jest kolejne wyzwanie, a sekwencja pomiarów może być powtarzana między wyzwaniami. Osuszenie wnętrza uchwytu nebulizatora za pomocą wacika może pomóc w zapobieganiu gromadzeniu się kropelek lub kondensatu w przewodzie wdechowym. W miarę zbierania danych oprogramowanie oblicza parametry związane z perturbacją i zapewnia współczynnik determinacji na podstawie dopasowania danych do modelu.
Później dostęp do eksperymentu można uzyskać za pośrednictwem modułu przeglądu i raportowania oprogramowania w celu wyeksportowania lub dalszej analizy danych. Pod koniec eksperymentu zatrzymaj wentylację i odłącz badanego. Po odłączeniu szybko poddać zwierzę eutanazji za pomocą przedawkowania pentobarbitalu sodu, następnie można wykonać płukanie oskrzeli i pęcherzyków płucnych lub wyizolować płuca w celu dalszej analizy.
Przed przejściem do następnego tematu wypłucz i osusz adapter nebulizatora y rurkę i kaniulę. Przełącz się na następny temat w oprogramowaniu operacyjnym i potwierdź jego wagę. Następnie postępuj zgodnie z sugerowanymi krokami kalibracji przed kontynuowaniem eksperymentu.
Pod koniec dnia opłucz i osusz sprzęt. Pamiętaj, aby przed zamknięciem sesji eksperymentalnej wyczyścić również zawór wydechowy systemu zgodnie z instrukcjami producenta, aby utrzymać wydajność systemu. Poniższe przykłady reprezentują wybór typowych wyników z eksperymentów na myszach naiwnych i narażonych na chlor, równoważne wyniki z naiwnych aj.
Myszy uzyskano na początku badania i po zwężeniu oskrzeli wywołanym metylocholiną przy użyciu jednej z dwóch generacji zdarzeń elastycznych wspieranych przez flexi wear seven. Ponieważ szerokopasmowe pomiary FOT pozwalają na podział odpowiedzi płuc na parametry dróg oddechowych i tkanek miąższowych, zapewniają one średnią do identyfikacji dotkniętych obszarów płuc. Na przykład naiwne myszy AJ wykazywały wzrost odporności wyjściowej, gdy końcowe ciśnienie wydechowe wzrosło z trzech do dziewięciu centymetrów wody.
Zmiana końcowego ciśnienia wydechowego spowodowała zmniejszenie oporu dróg oddechowych zgodne z rozszerzającym oskrzela działaniem większej objętości płuc i większego ciśnienia napompowania oraz wzrostem tłumienia tkanek, parametru ściśle związanego z oporem tkanek, który odzwierciedla lepkosprężystość tkanek i ewentualnie opór małych dróg oddechowych. Wiadomo, że ten ostatni zwiększa się wraz ze wzrostem objętości płuc. Protokół ten jest często stosowany do oceny reakcji dróg oddechowych na wdychaną metylocholinę po ekspozycji na chlor gazowy.
Myszy B.SEA wykazywały nadreaktywność dróg oddechowych w porównaniu z kontrolami wystawionymi na działanie powietrza. W tym przykładzie myszy wystawione na działanie chloru gazowego wykazywały większe maksymalne odpowiedzi przy wszystkich parametrach HOT. Myszy te wykazały również statystycznie istotne przesunięcie krzywej stężenie-odpowiedź w lewo lub nadwrażliwość na wdychaną metylocholinę, czego przykładem jest zmniejszenie stężenia metyllocholiny wymagane do spowodowania podwojenia oporności i elastyny.
Oprócz FOT, system zdarzeń flex może rejestrować inne pomiary, takie jak krzywe objętości ciśnienia. Górna część kończyny deflacyjnej jest dopasowana do równania Salazara Khillla, a powiązane parametry są obliczane przez oprogramowanie. Aby odnieść sukces w tej technice, ważne jest, aby zwrócić uwagę na każdy krok o szczególnym znaczeniu, jakim jest kalibracja systemu, opór kaniuli dotchawiczej, ułożenie zwierzęcia i standaryzacja objętości płuc.
Jeśli te kroki zostaną dokładnie wykonane, metoda ta zapewni dokładną charakterystykę właściwości mechanicznych płuca myszy.
Przegląd
Ten protokół szczegółowo opisuje procedury pomiaru mechaniki układu oddechowego i oceny reaktywności dróg oddechowych na wdychany metacholinę u myszy za pomocą techniki oscylacji wymuszonej (flexiVent). Metoda ta pozwala na dokładne i kontrolowane pomiary czynności płuc.
Kluczowe elementy badania
Obszar nauki
- Fizjologia układu oddechowego
- Modele zwierzęce
- Techniki pomiarowe
Tło
- Technika oscylacji wymuszonej zapewnia nieinwazyjną metodę oceny czynności płuc.
- Metacholina jest używana do oceny nadwrażliwości dróg oddechowych.
- System flexiVent pozwala na precyzyjną kontrolę parametrów wentylacji.
- Standardyzacja reakcji fizjologicznych jest kluczowa dla reprodukowalności.
Cel badania
- Aby wykazać pomiary oscylacji wymuszonej mechaniki układu oddechowego.
- Aby ocenić reaktywność dróg oddechowych w kontrolowanym środowisku eksperymentalnym.
- Aby zapewnić szczegółowy protokół dla badaczy z zakresu fizjologii układu oddechowego.
Zastosowane metody
- Przygotowanie odczynników i sprzętu do eksperymentu.
- Mechaniczna wentylacja podmiotu za pomocą systemu flexiVent.
- Zautomatyzowane pomiary mechaniki układu oddechowego w warunkach wyjściowych i po podaniu metacholiny.
- Analiza danych w celu oceny reaktywności dróg oddechowych i czynności płuc.
Główne wyniki
- Identyfikacja nadwrażliwości dróg oddechowych u traktowanych myszy.
- Dokładne pomiary rezystancji i elastyczności w odpowiedzi na metacholinę.
- Standardyzowane protokoły poprawiają reprodukowalność wyników.
- Wykazanie zalet systemu flexiVent w porównaniu z tradycyjnymi metodami.
Wnioski
- Technika oscylacji wymuszonej jest skuteczna w ocenie mechaniki układu oddechowego.
- Ten protokół zapewnia kompleksowe podejście dla badaczy.
- Przyszłe badania mogą budować na tej metodologii dla dalszych wnikliwości w fizjologię układu oddechowego.
Często zadawane pytania
Executive Industry Relevance
The forced oscillation technique (FOT) provides a translational tool for assessing lung function in preclinical models, enabling mechanistic de-risking of respiratory targets. By delivering quantitative, reproducible measurements of respiratory system mechanics, FOT supports target validation and predictive confidence in early discovery. This approach aids in characterizing disease models and screening compounds for airway hyperresponsiveness, informing go/no-go decisions in respiratory therapeutic development.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of therapeutic hypotheses by quantifying airway resistance and elastance changes in response to methacholine challenge.
- Operational Value: Provides standardized, automated measurements that reduce variability and support reproducible target engagement assessments.
- Predictive Value: Facilitates biological de-risking through precise phenotyping of lung mechanics in disease models, aiding portfolio triage.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Generates quantitative, dose-responsive data on airway function, enabling reliable compound screening for bronchodilatory or bronchoconstrictive effects.
- Operational Value: Supports assay standardization via predefined ventilation profiles and automated perturbation scripts, ensuring consistency across experiments.
- Scalability: The flexiVent system allows high-throughput, repeatable measurements, facilitating platform reuse in respiratory discovery workflows.
Translational & Preclinical Research
- Translational Continuity: Bridges discovery and preclinical validation by providing clinically relevant lung function metrics that mirror human pulmonary assessments.
- Mechanistic De-risking: Partitions lung response into airway and tissue compartments, helping identify affected lung regions and mechanism of action.
- Disease Model Characterization: Enables comparison of naive and oxidative-stress models (e.g., chlorine-exposed mice) to validate pathophysiological relevance.
Pipeline & Workflow Integration
FOT integrates into the discovery continuum from early target validation through lead identification to preclinical efficacy testing, particularly for respiratory indications where lung mechanics are a key biomarker.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing by measuring changes in resistance and elastance following pharmacological or genetic perturbations.
- Screening: Delivers assay readiness through standardized, automated lung function readouts that enable reliable compound evaluation.
- Analytics: Provides quantitative outputs including resistance, elastance, tissue damping, and coefficient of determination, facilitating comparative analysis across conditions.
- Translational Research: Connects to preclinical continuity by offering translational biomarkers of lung function that predict in vivo responses.
- Enterprise Reuse: Functions as a reusable capability across multiple projects studying airway diseases, fibrosis, or toxicant-induced lung injury.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence by reducing mechanistic ambiguity in lung function assessments.
- Operational Value: Enhances reproducibility through system calibration, standardized ventilation, and automated data acquisition.
- Strategic Value: Improves go/no-go decisions by providing objective, quantitative endpoints for airway hyperresponsiveness.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted prioritization of compounds based on lung function profiles, reducing late-stage biological risk.
Implementation Considerations
- Requires expertise in respiratory physiology, anesthesia, and surgical techniques for tracheal cannulation in mice.
- Dependent on instrumentation such as the flexiVent system, nebulizers, and transducers for pressure, volume, and vital sign monitoring.
- Necessitates cross-team standardization of ventilation profiles, challenge protocols, and data analysis pipelines.
- Involves adaptation considerations when applying the technique across different mouse strains, disease models, or exposure paradigms.
- Includes practical limitations such as the need for precise cannula placement, leak-free seals, and controlled anesthetic depth to avoid confounding ventilatory efforts.
