Name: Kondycjonowanie dotykowe i analiza ruchu w strategiach pobierania próbek czułków u pszczół miodnych (Apis mellifera L.) (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-12-12T11:50:00.000+00:00
Duration: 10 min 14 s
Description: Poznaj metodę kondycjonowania dotykowego pszczół miodnych Apis mellifera oraz analizę kinematyczną ruchów czułków przy użyciu techniki 2D motion capture w MATLAB. Protokół umożliwia badanie mechanizmów uczenia się dotykowego.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Dziękujemy Joachimowi Erberowi za wprowadzenie nas w paradygmat uczenia się dotykowego u pszczół miodnych. Prace te były wspierane przez Klaster Doskonałości 277 CITEC, finansowany w ramach Niemieckiej Inicjatywy Doskonałości.

1. Przygotowanie pszczół
<ol>
	<li>Zbieracze nektaru lub pyłku są łapane na polu z karmnika sacharozy lub bezpośrednio z wejścia do ula podczas powrotu z wyprawy na żerowanie. Każda pojedyncza pszczoła jest umieszczana w szklanej fiolce, która jest zamykana piankowym korkiem i natychmiast zabierana do laboratorium w celu dalszej obsługi.</li>
	<li>W laboratorium schwytane pszczoły są krótko schładzane w lodówce w temperaturze 4 °C, aż do momentu, gdy pojawią się pierwsze oznaki bezruchu.</li>
	<li>Każda unieruchomiona pszczoła jest umieszczona w małej metalowej rurce z taśmą klejącą między głową a klatką piersiową oraz nad brzuchem. Należy zadbać o to, aby trąbka i czułki były swobodnie ruchome.</li>
	<li>Pomaluj złożone oczy i oczka utrwalonej pszczoły białą farbą (np. bezrozpuszczalnikową Tipp-Ex), aby zasłonić widzenie.</li>
	<li>Dodaj małą kroplę stopionego wosku za głową pszczoły, aby przymocować ją do taśmy między głową a klatką piersiową, aby zapobiec ruchom głowy podczas nagrań.</li>
	<li>Oznacz każdą pszczołę numerem na taśmie dla lepszej identyfikacji i umieść rurkę ze stałą pszczołą w wilgotnej atmosferze, aby zapobiec odwodnieniu.</li>
	<li>Karm każdą pszczołę przez 5 sekund kropelkami 30% roztworu sacharozy dostarczonymi za pomocą strzykawki i pozwól wszystkim pszczołom dojść do siebie przez 30 minut przed rozpoczęciem protokołu kondycjonowania dotykowego.</li>
</ol>
2. Kondycjonowanie dotykowe
<ol>
	<li>Przed kondycjonowaniem każda pszczoła musi zostać przetestowana pod kątem reakcji na rozszerzenie trąbki (PER) na 30% bodziec sacharozowy zastosowany do czułków. W ten sposób końcówka trąbki musi przekroczyć wirtualną linię między otwartymi żuchwami. Wyrzuć wszystkie pszczoły, które nie reagują PER na bodziec sacharozy.</li>
	<li>Do kondycjonowania dotykowego należy użyć mosiężnej kostki (np. 3 x 5 mm) z gładkim lub wygrawerowanym wzorem, np. poziomymi lub pionowymi rowkami tworzącymi siatkę o długości fali 150 μm, jako bodziec kondycjonowany (CS). W przypadku bodźca bezwarunkowego (US) użyj 30% roztworu sacharozy (cukier domowy, rozcieńczony w wodzie).</li>
	<li>Mosiężna kostka (CS) jest umieszczana w uchwycie na mikromanipulatorze (np. Märzhäuser MM33), aby zapewnić dokładne pozycjonowanie podczas procedury kondycjonowania. Stany Zjednoczone są przedstawiane pszczole za pomocą strzykawki wypełnionej 30% roztworem sacharozy.</li>
	<li>Procedura kondycjonowania składa się z pięciu par bodźca dotykowego (CS) i roztworu sacharozy (US) w odstępie międzypróbnym (ITI) wynoszącym 5 minut. Umieść pojedynczą pszczołę przed mikromanipulatorem z zamontowanym bodźcem dotykowym (CS). Ustaw CS powoli, tak aby powierzchnia bodźca dotykowego była równoległa do głowy pszczoły (Rysunek 1 A i B). Odległość między zwierzęciem a obiektem dotykowym powinna mieścić się w zakresie promienia pracy czułka badanej pszczoły, tj. pszczoła powinna być w stanie zeskanować bodziec dotykowy w wygodnej pozycji obiema czułkami. W przykładzie pokazanym na rysunku 1 odległość wynosiła 3 mm. Pozwól pszczole skanować bodziec dotykowy (CS) przez 5 sekund. Po pierwszych 3 sekundach umieścić kroplę 30% roztworu sacharozy (US) za pomocą strzykawki pod trąbką. Za pomocą końcówki strzykawki delikatnie podnieść trąbkę. Stymulacja sacharozy pod trąbką wywoła bezwarunkowy PER15. Pozwól pszczole polizać nagrodę w postaci sacharozy. Użyj stopera z sygnałem alarmowym, aby utrzymać dokładne odstępy czasu podczas kondycjonowania.</li>
	<li>Warunkowy PER jest używany jako miara sukcesu w uczeniu się pszczoły. Po pierwszych nagrodzonych parach pszczoły zaczynają reagować na prezentację CS poprzez wydłużenie trąbki, co wskazuje, że spodziewają się nadchodzącej nagrody. W pełni rozciągnięta trąba obserwowana w dowolnym momencie w ciągu 3-sekundowego okna czasowego prezentacji bodźca dotykowego i przed prezentacją sacharozy jest oceniana jako odpowiedź pozytywna. Żadna odpowiedź nie jest uznawana za negatywną. Występowanie PER musi być odnotowane przez eksperymentatora. Odsetek pszczół wykazujących PER podczas prezentacji CS jest wykreślany dla każdej próby.</li>
</ol>
3. Nagrania kinematyczne
<ol>
	<li>Ruchy czułka pojedynczej pszczoły zaprzęgniętej są rejestrowane za pomocą cyfrowej kamery wideo z odpowiednim obiektywem makro (np. Basler A602f-2 wyposażony w TechSpec VZM 200, działający z prędkością 50 kl./s za pomocą połączenia przewodu przeciwpożarowego). Kamera jest umieszczona nad zwierzęciem w widoku z góry na dół (Rysunek 1 A). Na rysunku 1 rozdzielczość przestrzenna nagrań wynosi 0,02 mm/piksel.</li>
	<li>Skalibruj aparat, rejestrując pojedyncze zdjęcia szachownicy o wymiarach 10 x 10 mm z krawędzią o długości 1 mm z różnych orientacji pod obiektywem aparatu. Kalibrację można wykonać za pomocą zestawu narzędzi do kalibracji aparatu Matlab16.</li>
	<li>Umieść pojedynczą stałą pszczołę pod obiektywem aparatu. Przedstaw zwierzęciu bodziec dotykowy, przymocowany do mikromanipulatora. Postępuj w taki sam sposób, jak opisano dla kondycjonowania dotykowego i rejestruj ruch czułka, gdy pszczoła skanuje obiekt. Ważne jest, aby widoczny był pełny zakres pracy anteny oraz bodziec dotykowy. Wybór badanych wzorców bodźców i liczby prób zależą od projektu eksperymentu.</li>
</ol>
4. Analiza danych
<ol>
	<li>Obliczanie tła obrazu odbywa się w Matlabie. Po pierwsze, dla każdego piksela należy obliczyć medianę wartości skali szarości w czasie. Statyczne obiekty, takie jak nieruchoma głowa pszczoły i bodziec dotykowy, będą stanowić tło obrazu. Poruszające się obiekty, takie jak dwie anteny, nie będą częścią tła.</li>
	<li>Każda klatka nagranego wideo musi być wczytywana sekwencyjnie, a różnica między bieżącą klatką a tłem obrazu musi zostać obliczona. Wynikiem tego odejmowania jest uwydatnienie tych części obrazu, które poruszają się z klatki na klatkę. Idealnie byłoby, gdyby czułki pszczoły były jedynymi obszarami o wartościach niezerowych (rysunek 1C).</li>
	<li>Do dalszego przetwarzania przyjmuje się, że dwa największe obszary z niezerowymi wartościami pikseli to anteny. Dla obu anten należy wygenerować maskę binarną zawierającą dla każdego piksela wartość 1, jeśli piksel należy do anteny i wartość 0 w przeciwnym razie. Ta maska służy jako podstawa do późniejszego lokalizowania końcówek czułków. Aby uzyskać wstępną maskę dla całego obrazu, wartość szarości każdego piksela obrazu różnicowego jest porównywana ze wstępnie zdefiniowanym progiem. Ponieważ później zajmujemy się hałasem, próg ten jest wybierany jako dość niski. Maska wstępna nadal zawiera dwa rodzaje błędów: Po pierwsze, ze względu na szum obrazu małe obszary są nadal częścią maski. Po drugie, obszary należące do anteny niekoniecznie muszą być w pełni połączone. To ostatnie występuje najczęściej, gdy tło ma w przybliżeniu taką samą luminescencję jak antena. W celu wyeliminowania tych artefaktów stosuje się standardowe operacje morfologiczne przetwarzania obrazu, tj. kombinację erozji i dylatacji obrazu, opierając się na standardowych funkcjach Matlaba imerode i imdilate odpowiednio (patrz17 s. 158-205 w celu dalszego wyjaśnienia). Po procesie odszumiania hipotezy dotyczące czułków są nadal zawarte w tej samej masce. W związku z tym, w następnym kroku, maska binarna jest grupowana dla obszarów rozłącznych za pomocą standardowej funkcji Matlaba bwlabel (patrz17 s. 40-48, aby uzyskać więcej informacji na temat algorytmu segmentacji obrazu).</li>
	<li>Zliczana jest liczba pikseli w klastrze i wybierane są dwa największe klastry. Środek ciężkości jest obliczany w celu rozróżnienia lewej i prawej anteny (rysunek 1D).</li>
	<li>Końcówkę anteny dla każdej anteny można zdefiniować jako piksel w klastrze o najwyższej wartości w kierunku proksymalnym do dystalnego (patrz rysunek 1D).</li>
</ol>

<ol><li>Page, R. E., Scheiner, R., Erber, J., Amdam, G. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+development+and+evolution+of+division+of+labor+and+foraging+specialization+in+a+social+insect+%28Apis+mellifera++L.%29%5BTitle%5D)+AND+%22Curr.+Top.+Dev.+Biol%22%5BJournal%5D)">The development and evolution of division of labor and foraging specialization in a social insect (Apis mellifera L.).</a> Curr. Top. Dev. Biol. 74, 253-286 (2006).</li>
<li>Menzel, R., Müller, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Learning+and+memory+in+honeybees%3A+From+behavior+to+neural+substrates%5BTitle%5D)+AND+%22Annu.+Rev.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Learning and memory in honeybees: From behavior to neural substrates.</a> Annu. Rev. Neurosci. 19, 379-404 (1996).</li>
<li>Seeley, T. D. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aSeeley%2C+TD+%22The+wisdom+of+the+hive%22">The wisdom of the hive</a>. , Harvard University Press. Cambridge Mass, London. (1995).</li>
<li>Staudacher, E., Gebhardt, M. J., Dürr, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Antennal+movements+and+mechanoreception%3A+neurobiology+of+active+tactile+sensors%5BTitle%5D)+AND+%22Adv.+Insect+Physiol%22%5BJournal%5D)">Antennal movements and mechanoreception: neurobiology of active tactile sensors.</a> Adv. Insect Physiol. 32, 49-205 (2005).</li>
<li>Martin, H., Lindauer, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sinnesphysiologische+Leistungen+beim+Wabenbau+der+Honigbiene%5BTitle%5D)+AND+%22Z.+Vergl.+Physiol%22%5BJournal%5D)">Sinnesphysiologische Leistungen beim Wabenbau der Honigbiene.</a> Z. Vergl. Physiol. 53, 372-404 (1966).</li>
<li>Kevan, P. G. Texture sensitivity in the life of honeybees. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aKevan%2C+PG+%22Neurobiology+and+behavior+of+honeybees%22">Neurobiology and behavior of honeybees</a>. Menzel, R., Mercer, A. , Springer Verlag. Berlin, Heidelberg, New York. 96-101 (1987).</li>
<li>von Frisch, K. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3avon+Frisch%2C+K+%22Tanzsprache+und+Orientierung+der+Bienen%22">Tanzsprache und Orientierung der Bienen</a>. , Springer Verlag. Berlin, Heidelberg, New York. (1965).</li>
<li>Waser, N. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Flower+constancy%3A+definition%2C+cause%2C+and+ceasurement%5BTitle%5D)+AND+%22Am.+Nat%22%5BJournal%5D)">Flower constancy: definition, cause, and ceasurement.</a> Am. Nat. 127, 593-603 (1986).</li>
<li>Kevan, P. G., Lane, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Flower+petal+microtexture+is+a+tactile+cue+for+bees%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Flower petal microtexture is a tactile cue for bees.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 82, 4750-4752 (1985).</li>
<li>Erber, J., Kierzek, S., Sander, E., Grandy, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tactile+learning+in+the+honeybee%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Comp.+Physiol.+A%22%5BJournal%5D)">Tactile learning in the honeybee.</a> J. Comp. Physiol. A. 183, 737-744 (1998).</li>
<li>Kisch, J., Erber, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Operant+conditioning+of+antennal+movements+in+the+honey+bee%5BTitle%5D)+AND+%22Behav.+Brain.+Res%22%5BJournal%5D)">Operant conditioning of antennal movements in the honey bee.</a> Behav. Brain. Res. 99, 93-102 (1999).</li>
<li>Scheiner, R., Erber, J., Page, R. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tactile+learning+and+the+individual+evaluation+of+the+reward+in+honey+bees+%28Apis+mellifera+L.%29%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Comp.+Physiol.+A%22%5BJournal%5D)">Tactile learning and the individual evaluation of the reward in honey bees (Apis mellifera L.).</a> J. Comp. Physiol. A. 185, 1-10 (1999).</li>
<li>Erber, J., Scheiner, R. Honeybee learning. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aErber%2C+J+%22Encyclopedia+of+Neuroscience%22">Encyclopedia of Neuroscience</a>. Adelman, G., Smith, B. , Elsevier. (2004).</li>
<li>Bitterman, M. E., Menzel, R., Fietz, A., Schäfer, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Classical+conditioning+of+proboscis+extension+in+honeybees+%28Apis+mellifera%29%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Comp.+Psychol%22%5BJournal%5D)">Classical conditioning of proboscis extension in honeybees (Apis mellifera).</a> J. Comp. Psychol. 97, 107-119 (1983).</li>
<li>Dacher, M., Gauthier, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Involvement+of+NO-synthase+and+nicotinic+receptors+in+learning+in+the+honey+bee%5BTitle%5D)+AND+%22Physiol.+Behav%22%5BJournal%5D)">Involvement of NO-synthase and nicotinic receptors in learning in the honey bee.</a> Physiol. Behav. 95, 200-207 (2008).</li>
<li>Camera Calibration Toolbox for Matlab [Internet]. , Available from: 
 <a target="_blank" href=" http://www.vision.caltech.edu/bouguetj/calib_doc"> http://www.vision.caltech.edu/bouguetj/calib_doc</a> (2004).</li>
<li>Haralick, R. M., Shapiro, L. G. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aHaralick%2C+RM+%22Computer+and+Robot+Vision%22">Computer and Robot Vision</a>. I, Addison-Wesley. Reading, Mass. (1992).</li>
<li>Erber, J. Tactile antennal learning in the honey bee. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aErber%2C+J+%22Honeybee+Neurobiology+and+Behavior%22">Honeybee Neurobiology and Behavior</a>. Galizia, C. G., et al. , Springer Verlag. 439-455 (2012).</li>
<li>Pankiw, T., Page, R. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effect+of+pheromones%2C+hormones%2C+and+handling+on+sucrose+response+thresholds+of+honey+bees+%28Apis+mellifera+L.%29%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Comp.+Physiol.+A%22%5BJournal%5D)">Effect of pheromones, hormones, and handling on sucrose response thresholds of honey bees (Apis mellifera L.).</a> J. Comp. Physiol. A. 189, 675-684 (2003).</li>
<li>Harris, J. W., Woodring, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effects+of+stress%2C+age%2C+season+and+source+colony+on+levels+of+octopamine%2C+dopamine+and+serotonine+in+the+honey+bee+%28Apis+mellifera+L.%29+brain%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Insect.+Physiol%22%5BJournal%5D)">Effects of stress, age, season and source colony on levels of octopamine, dopamine and serotonine in the honey bee (Apis mellifera L.) brain.</a> J. Insect. Physiol. 38, 29-35 (1992).</li>
<li>Scheiner, R., Kuritz-Kaiser, A., Menzel, R., Erber, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sensory+responsiveness+and+the+effects+of+equal+subjective+rewards+on+tactile+learning+and+memory+of+honeybees%5BTitle%5D)+AND+%22Learn.+Mem%22%5BJournal%5D)">Sensory responsiveness and the effects of equal subjective rewards on tactile learning and memory of honeybees.</a> Learn. Mem. 12, 626-635 (2005).</li>
<li>Mujagic, S., Sarkander, J., Erber, B., Erber, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sucrose+acceptance+and+different+forms+of+associative+learning+of+the+honey+bee+%28Apis+mellifera+L.%29+in+the+field+and+laboratory%5BTitle%5D)+AND+%22Front.+Behav.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Sucrose acceptance and different forms of associative learning of the honey bee (Apis mellifera L.) in the field and laboratory.</a> Front. Behav. Neurosci. 4, 46(2010).</li>
<li>Scheiner, R., Barnert, M., Erber, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Variation+in+water+and+sucrose+responsiveness+during+the+foraging+season+affects+proboscis+extension+learning+in+honey+bees%5BTitle%5D)+AND+%22Apidologie%22%5BJournal%5D)">Variation in water and sucrose responsiveness during the foraging season affects proboscis extension learning in honey bees.</a> Apidologie. 34, 67-72 (2003).</li>
<li>Mujagic, S., Erber, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sucrose+acceptance%2C+discrimination+and+proboscis+responses+of+honey+bees+%28Apis+mellifera+L.%29+in+the+field+and+the+laboratory%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Comp.+Physiol.+A%22%5BJournal%5D)">Sucrose acceptance, discrimination and proboscis responses of honey bees (Apis mellifera L.) in the field and the laboratory.</a> J. Comp. Physiol. A. 195, 325-339 (2009).</li>
<li>Friedrich, A., Thomas, U., Müller, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Learning+at+different+satiation+levels+reveals+parallel+functions+for+the+cAMP-protein+kinase+A+cascade+in+formation+of+long-term+memory%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Learning at different satiation levels reveals parallel functions for the cAMP-protein kinase A cascade in formation of long-term memory.</a> J. Neurosci. 24, 4460-4468 (2004).</li>
<li>Erber, J., Pribbenow, B., Grandy, K., Kierzek, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tactile+motor+learning+in+the+antennal+system+of+the+honeybee+%28Apis+mellifera+L.%29%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Comp.+Physiol.+A%22%5BJournal%5D)">Tactile motor learning in the antennal system of the honeybee (Apis mellifera L.).</a> J. Comp. Physiol. A. 181, 355-365 (1997).</li>
<li>Lambin, M., Déglise, P., Gauthier, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Antennal+movements+as+indicators+of+odor+detection+by+worker+honeybees%5BTitle%5D)+AND+%22Apidologie%22%5BJournal%5D)">Antennal movements as indicators of odor detection by worker honeybees.</a> Apidologie. 36, 119-126 (2005).</li>
</ol>

Nie stwierdzono konfliktu interesów.

Przygotowanie pszczół: Zbieranie i naprawianie pszczół powinno odbywać się szybko, aby utrzymać niski poziom stresu zwierzęcia. Stres ma wpływ na reakcję PER, a zatem może mieć pośredni wpływ na wyniki uczenia się u pszczół19, 20. Poziom stresu można zmniejszyć, umieszczając szklane fiolki z pszczołami bezpośrednio na lodzie natychmiast po pobraniu, aby szybko je unieruchomić. Należy wziąć pod uwagę, że pszczoły potrzebują więcej czasu na regenerację, im dłuższy jest okres znieczulenia.
<...

<table><tbody><tr><td>Zbieracze pyłku, Apis mellifera L.</td><td></td><td></td><td>Ule prywatne</td></tr><tr><td>Fiolki szklane (22 x 45 mm)</td><td>Carl Roth GmbH Co</td><td>X655.1</td><td></td></tr><tr><td>Rurki mosiężne, 10 x 30 mm</td><td></td><td></td><td>Własna produkcja</td></tr><tr><td>Kostka mosiężna, 3 x 5 mm</td><td></td><td></td><td>Własna produkcja</td></tr><tr><td>Tipp-Ex (bez rozpuszczalników)</td><td>Tipp-Ex GmbH Co KG</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Roztwór sacharozy (30%)</td><td></td><td></td><td>Domowy suger rozcieńczony w wodzie</td></tr><tr><td>Etanol (70%)</td><td>Carl Roth GmbH Co</td><td>9065.3</td><td></td></tr><tr><td>Strzykawka (1 ml) i igła (0,6 x 25)</td><td>Carl Roth GmbH Co</td><td>59.1</td><td></td></tr><tr><td>Stup</td><td>Carl Roth GmbH Co</td><td>L423.1</td><td></td></tr><tr><td>Mikromanipulator</td><td>M&#228; RZH&#228; użytkownik MM33</td><td>00-42-101-0000</td><td></td></tr><tr><td>Cyfrowa kamera wideo</td><td>Basler A602f-2</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Obiektyw makro do kamery</td><td>TechSpec VZM 200</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Matlab R2009b</td><td>The MathWorks</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

kondycjonowanie dotykowe i analiza ruchu w strategiach pobierania próbek czułków u pszczół miodnych (apis mellifera l.)

Tactile Conditioning And Movement Analysis Of Antennal Sampling Strategies In Honey Bees (Apis mellifera L.)

Pszczoły miodne (Apis mellifera L.) są owadami euspołecznymi i dobrze znane ze swojego złożonego podziału pracy i zdolności do asocjacyjnego uczenia się1, 2. Pszczoły robotnice spędzają pierwszą połowę swojego życia w ciemnym ulu, gdzie karmią larwy lub budują regularne sześciokątne plastry na pożywienie (np. pyłek lub nektar) i czerw3. Anteny są niezwykłymi czujnikami multisensorycznymi i odgrywają kluczową rolę w różnych zadaniach dotykowych4, w tym w budowaniu ula5 i rozpoznawaniu wzorców6. W późniejszym życiu każda pszczoła opuszcza ul, aby szukać pożywienia. Następnie pszczoła musi nauczyć się rozróżniać dochodowe źródła pożywienia, zapamiętywać ich położenie i komunikować je swoim kolegom z gniazda7. Pszczoły wykorzystują różne sygnały kwiatowe, takie jak kolory lub zapachy7, 8, ale także wskazówki dotykowe z powierzchni płatków9, aby tworzyć multisensoryczne wspomnienia źródła pożywienia. W warunkach laboratoryjnych pszczoły mogą być szkolone w paradygmacie uczenia się apetytywnego w celu rozróżniania cech dotykowych obiektów, takich jak krawędzie lub rowki za pomocą czułków10, 11, 12, 13. Ten paradygmat uczenia się jest ściśle związany z klasycznym warunkowaniem węchowym odpowiedzi na przedłużenie trąbki (PER) u pszczół zaprzęgniętych14. Zaletą paradygmatu uczenia się dotykowego w laboratorium jest możliwość łączenia eksperymentów behawioralnych dotyczących uczenia się z różnymi pomiarami fizjologicznymi, w tym analizą wzorca ruchu anteny.

W poniższym eksperymencie zbadaliśmy, w jaki sposób uczenie się dotykowe wpływa na zachowanie próbkowania antennego u pszczół miodnych. W tym celu monitorowaliśmy ruch końcówki czułka u pszczół naiwnych i uwarunkowanych przed oraz w trakcie prezentacji bodźca dotykowego.
Najpierw zarejestrowano spontaniczne ruchy czułków w grupie pszczół zbieraczek pyłku (N = 42) przez 1 min. Połowa pszczół (N = 21) została następnie poddana warunkowaniu poprzez pięciokrotne parowanie bodźca dotykowego z nagro...

W tym protokole pokazujemy, jak kondycjonować zaprzęgnięte pszczoły miodne do bodźców dotykowych i wprowadzamy technikę przechwytywania ruchu 2D do analizy kinematyki wzorca próbkowania anteny na małą skalę.

Kondycjonowanie dotykowe i analiza ruchu w strategiach pobierania próbek czułków u pszczół miodnych (Apis mellifera L.)

Honey bees (Apis mellifera L.) are eusocial insects and well known for their complex division of labor and associative learning capability1, 2. The worker ...

Ogólnym celem tej procedury jest pokazanie, w jaki sposób kondycjonować pszczoły miodne na bodźce dotykowe oraz wprowadzenie techniki przechwytywania ruchu 2D do analizy kinematyki w drobnej skali i 10 wzorców próbkowania. Na początku procedura wymaga schwytania swobodnie latających pszczół przed ich ulem. Drugim krokiem jest zaprzęgnięcie pszczół do metalowych rurek i zasłonięcie ich oczu białą farbą.Następnie pszczoły są szkolone do bodźców dotykowych przy użyciu klasycznej procedury warunkowania. Ostatnim krokiem jest zarejestrowanie ruchu anteny kondycjonowanej pszczoły za pomocą cyfrowej kamery wideo. Ostatecznie przechwytywanie ruchu 2D w MATLAB służy do analizy zmian w zachowaniu ruchu anteny u pszczół miodnych po paradygmatach uczenia się dotykowego zarówno asocjacyjnych, jak i nieasocjacyjnych.Metoda ta może być wykorzystana do badania dyskryminacji i percepcji dotykowej u różnych zmiennych gatunków. Może odróżniać zmiany wynikające z nieasocjacyjnego uczenia się dotykowego od zmian zachodzących w wyniku uczenia się asocjacyjnego, takich jak podczas warunkowania. Ogólnie rzecz biorąc, osoby, które są nowicjuszami w tej metodzie, będą miały trudności, ponieważ z pszczołami należy obchodzić się bardzo ostrożnie, a czas procedury kondycjonowania dotykowego ma kluczowe znaczenie.Metoda ta może pomóc odpowiedzieć na kluczowe pytania z zakresu aktywnego wykrywania dotyku. Wykorzystuje naturalne zachowanie odruchowe jako zachowanie sprawozdawcze, co pozwala nam stwierdzić, czy zwierzę potrafi rozróżnić dwa bodźce dotykowe. Aby rozpocząć, zbieraj pszczoły bezpośrednio z wejścia do ula.Umieść każdą pszczołę w szklanej fiolce zamkniętej piankowym korkiem i natychmiast zabierz ją do laboratorium w celu dalszej obróbki w laboratorium. Krótko mówiąc, schłodzić pszczoły w lodówce o temperaturze czterech stopni Celsjusza, aż zaczną wykazywać oznaki bezruchu. Najpierw unieruchom każdą pszczołę na metalowej rurce.Umieść taśmę klejącą wokół głowy i klatki piersiowej oraz na brzuchu. Upewnij się, że probus i czułki są swobodnie ruchome, aby zasłaniać widzenie pszczoły. Pomaluj oczy złożone i selli białą farbą.Umieść małą kroplę stopionego wosku między głowicą a taśmą, aby zapobiec przesuwaniu się głowy. Podczas nagrań. Aby ułatwić identyfikację, oznacz taśmę każdej pszczoły miodnej numerem i umieść rurkę w wilgotnej atmosferze, aby zapobiec odwodnieniu.Na koniec użyj strzykawki wypełnionej 30% roztworem sacharozy, aby nakarmić każdą pszczołę przez pięć sekund i pozwól im dojść do siebie przez 30 minut. Przed rozpoczęciem protokołu kondycjonowania dotykowego, przed kondycjonowaniem, przetestuj każde B pod kątem odpowiedzi na rozszerzenie psis lub PER. Aby to zrobić, zastosuj 30% bodziec sacharozy do czułków, aby uzyskać prawidłową odpowiedź.Czubek psis musi przekroczyć wirtualną linię między otwartymi szczękami. Do badania wykorzystywane są wyłącznie pszczoły z prawidłowym PER. Do warunkowania dotykowego jako bodziec warunkowy lub cs stosuje się metalowe struktury powierzchniowe.Ich powierzchnia może być gładka lub rowkowana, aby uzyskać inną teksturę. Bodziec bezwarunkowy lub US to 30% roztwór sacharozy. Umieść mosiężną kostkę w uchwycie na mikromanipulatorze.Pozwoli to na dokładne ułożenie podczas procedury kondycjonowania. Po zamontowaniu bodźca dotykowego umieść pszczołę przed mikromanipulatorem. Następnie powoli ustaw C tak, aby powierzchnia bodźca dotykowego była równoległa do głowy pszczoły.Pszczoła powinna być w stanie skanować bodziec dotykowy w wygodnej pozycji za pomocą obu anten. Aby rozpocząć procedurę kondycjonowania, pozwól koralikowi skanować bodziec dotykowy przez pięć sekund. Po pierwszych trzech sekundach za pomocą strzykawki umieść kroplę 30% roztworu sacharozy pod trąbką.Za pomocą końcówki strzykawki delikatnie podnieść probus. Ta stymulacja powinna wywołać bezwarunkowy PER. Pozwól pszczole polizać sacharozę.Nagroda na jedną sekundę. Kontynuuj procedurę kondycjonowania, aż pszczoła otrzyma pięć par. Po pierwszych nagrodzonych parach, pszczoły powinny zacząć reagować na prezentację CS poprzez przedłużenie swojego psis wskazującego, że oczekują nadchodzącej nagrody.W pełni rozszerzony psis obserwowany w dowolnym momencie w ciągu pierwszych trzech sekund prezentacji bodźca dotykowego przed prezentacją sacharozy jest oceniany jako odpowiedź pozytywna. Na koniec generowana jest krzywa uczenia się dla grupy pszczół. W tym celu dla każdej próby wykreślany jest odsetek pszczół wykazujących PER podczas prezentacji CS.Po kondycjonowaniu do rejestrowania ruchów anteny używana jest cyfrowa kamera wideo z odpowiednim obiektywem makro. Tutaj używamy kamery basler a 602 F, wyposażonej w obiektyw VZM 200 o specyfikacji technicznej, działający z prędkością 50 klatek na sekundę za pomocą połączenia przewodu przeciwpożarowego, wyreguluj kamerę tak, aby ujarzmiona pszczoła i bodziec dotykowy były widoczne. Następnie skalibruj aparat, robiąc pojedyncze zdjęcia skalibrowanej szachownicy z różnych orientacji.Użyj specjalistycznego oprogramowania z narzędziem do kalibracji aparatu, aby przeanalizować obrazy. Po kalibracji umieść pojedynczy stały B pod obiektywem aparatu i przedstaw bodziec dotykowy. Jak pokazano wcześniej.Nagraj ruch pieczęci, podczas gdy pszczoła skanuje obiekt. Po zebraniu danych MATLAB służy do zdefiniowania tła obrazu, a następnie obliczenia mediany wartości skali szarości w czasie dla każdego piksela. Statyczne obiekty, takie jak nieruchoma głowa pszczoły i bodziec dotykowy, będą stanowić tło obrazu, odejmując tło obrazu od każdej klatki, ruchomych części wideo.Idealnie byłoby, gdyby czułki pszczoły były izolowane jako jedyne obszary o niezerowych wartościach do dalszego przetwarzania. Zakłada się, że dwa największe obszary z niezerowymi wartościami pikseli to anteny. Maska jest tworzona w celu zlokalizowania końcówek anteny i dla całego obrazu, aby zmniejszyć ilość błędów.Kombinacja narzędzi do erozji obrazu i dylatacji jest stosowana, gdy techniki te zmniejszą poziom hałasu. Binarna funkcja maski służy do grupowania rozłącznych obszarów. Środek ciężkości jest obliczany dla dwóch największych z tych gromad w celu rozróżnienia lewej i prawej anteny.Tutaj są one oznaczone kolorem czerwonym i zielonym. Wreszcie, końcówkę anteny dla każdej anteny można zdefiniować jako piksel w klastrze o najwyższej wartości w kierunku proksymalnym do dystalnym, tworzony jest dwuwymiarowy histogram, który pokazuje rozkład przestrzenny pokazanej końcówki. Oto krzywa uczenia się dotykowego kondycjonowania PER w fałszerze pyłku.Odsetek pozytywnych odpowiedzi po pierwszym sparowaniu był znacznie wyższy w porównaniu z zachowaniem spontanicznym, a krzywa uczenia się pokazuje nasycenie po trzeciej nagrodzie. W tym przykładzie ruch końcówki odbytu zarówno w grupie uwarunkowanej, jak i naiwnej był rejestrowany przez jedną minutę w obecności lub braku widzianego bodźca dotykowego. Oto spontaniczne ruchy tunelowe przed prezentacją bodźca.Odbyt pokazuje boczne położenie końcówki tunelu, podczas gdy rzędna pokazuje pozycję dystalną. Skala kolorów wskazuje procent czasu, jaki końcówka aniny spędziła w dowolnym miejscu. Kolor żółty oznacza bardzo częste lokalizacje na czerwono, rzadziej występujące, a czarne lokalizacje są poza zasięgiem.Dane te pokazują, że zarówno grupa, jak i grupa uwarunkowana zmieniły swój antalny wzorzec ruchowy w obecności bodźca dotykowego w porównaniu z ich spontanicznym zachowaniem. Zwróć uwagę, że prostokątny żółty obszar w pobliżu powierzchni bodźca wskazuje, że czubek pięty mrówki spędził dużo czasu na pobieraniu próbek z powierzchni. Pszczoły z grupy kondycjonowanej spędzały znacznie więcej czasu z końcówką czułka w obszarze bodźca niż pszczoły naiwne.Po tej procedurze można znaleźć metody elektrofizjologiczne i farmakologiczne, aby odpowiedzieć na dodatkowe pytania, takie jak: jaka jest neurofizjologiczna podstawa aktywnego zachowania dotykowego u pszczół miodnych po jego rozwoju? Ta technika warunkowania dotykowego utorowała drogę naukowcom zajmującym się aktywnym wykrywaniem dotyku do zbadania różnych aspektów dyskryminacji bodźców dotykowych, ale także uczenia się i pamięci dotykowej w Alpha Pots. Po obejrzeniu tego filmu powinieneś dobrze zrozumieć, jak analizować aktywne wyszukiwanie dotykowe i pobieranie próbek ruchów i owadów.Należy pamiętać, że analiza ruchu może zostać rozszerzona do analizy trójwymiarowej, jeśli co najmniej jedna dodatkowa kamera zostanie dodana synchronicznie z pierwszą.

tactile-conditioning-movement-analysis-antennal-sampling-strategies

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Neuronauka

Analiza dotykowa i ruchowa strategii pobierania próbek czułków u pszczół miodnych (Apis mellifera L.)

Pszczoły można poddać warunkowaniu w paradygmacie apetytywnego uczenia się węchowego (warunkowanie PER). Wykorzystując zapachy jako bodźce, opracowaliśmy metodę, w której rejestrowane jest zachowanie, przy jednoczesnym zastosowaniu obrazowania wapniowego w celu pomiaru aktywności wywołanej zapachem w neuronach ciała grzybowatego in vivo.

In vivo obrazowanie Ca2+ neuronów ciał grzybowych podczas uczenia się zapachów u pszczoły miodnej

Prezentujemy sposób wdrożenia metody farmakologii behawioralnej w paradygmacie apetycyjnego warunkowania węchowego u pszczół miodnych (Apis mellifera) poprzez systemiczne podawanie leków. Metoda ta pozwala w prosty i niezawodny sposób badać mechanizmy leżące u podstaw uczenia się i tworzenia pamięci.

Farmakologia behawioralna w klasycznym warunkowaniu odruchu wyciągania trąbka u pszczoły miodowej (Apis mellifera)

Bodźce węchowe pośredniczą w wielu różnych zachowaniach owadów i często stanowią złożone mieszaniny składające się z dziesiątek lub setek lotnych związków. Wykorzystując chromatografię gazową z wielokanałowym zapisem w płacie antenalnym owada, opisujemy metodę identyfikacji związków biologicznie czynnych.

Identyfikacja lotnych substancji zapachowych przy użyciu chromatografii gazowej z wielokanałowym zapisem (GCMR) w płacie antenalnym owada

Protokół warunkowania Proboscis Extension Response (PER), opracowany dla pszczół miodnych (Apis mellifera), dostarcza ekologicznie istotnych i łatwo mierzalnych środków do badania kilku różnych mechanizmów uczenia się u wielu gatunków owadów.

Protokół odpowiedzi na wydłużenie trąby do badania plastyczności behawioralnej u owadów: zastosowanie do badań podstawowych, biomedycznych i rolniczych

U pszczół miodnych ustalono jednoczesne zewnątrzkomórkowe długoterminowe zapisy z dwóch różnych neuropile mózgowych lub dwóch różnych dróg anatomicznych. Nagrania te pozwalają na badanie czasowych aspektów przetwarzania neuronalnego w różnych obszarach mózgu zarówno na poziomie pojedynczego neuronu, jak i na poziomie zespołu u zachowującego się zwierzęcia.

Jednoczesne długoterminowe zapisy na dwóch etapach przetwarzania neuronalnego u zachowujących się pszczół miodnych

Ten film opisuje Radio-Frequency Identification (RFID) i metody nagrywania wideo wrażliwe na ruch w celu monitorowania zachowań trzmieli.

Identyfikacja radiowa i wideo wrażliwe na ruch skutecznie automatyzują rejestrowanie nienagradzanych zachowań wybranych przez trzmiele

Opisano nowy test behawioralny do badania krótkoterminowych reakcji smakowych swobodnie poruszających się trzmieli (Bombus terrestris) na składniki odżywcze i toksyny w roztworze.

Nowatorski test behawioralny do badania reakcji smakowych osobników, swobodnie poruszających się trzmieli (Bombus terrestris)

Ten manuskrypt opisuje kilka protokołów podawania środków farmakologicznych pszczołom miodnym, w tym proste nieinwazyjne metody dla pszczół swobodnie latających, a także bardziej inwazyjne warianty, które pozwalają na precyzyjne, miejscowe leczenie krępowanych pszczół.

Neurofarmakologiczna manipulacja skrępowanych i swobodnie latających pszczół miodnych, Apis mellifera

Utrata kolonii pszczół miodnych stanowi wyzwanie dla służb zajmujących się zapylaniem upraw. Obecne praktyki ochrony owadów zapylających uzasadniają alternatywne podejście do minimalizacji kontaktu pszczół miodnych ze szkodliwymi pestycydami przy użyciu odstraszających środków chemicznych. W tym miejscu przedstawiamy szczegółowe metody protokołu śledzenia wizualnego w celu odstraszania pszczół.

Protokół śledzenia wideo w celu przesiewania środków chemicznych odstraszających pszczoły miodne

Ten protokół opisuje kroki korzystania z nowatorskiego oprogramowania, SwarmSight, do śledzenia klatka po klatce pozycji anteny owada i trąbki z konwencjonalnych kamer internetowych przy użyciu konwencjonalnych komputerów. Darmowe oprogramowanie typu open source przetwarza klatki około 120 razy szybciej niż ludzie i działa z dokładnością lepszą niż ludzka.

SwarmSight: Śledzenie w czasie rzeczywistym ruchów anteny owadów i odruchu wysuwania trąbki przy użyciu zwykłego preparatu i konwencjonalnego sprzętu

Prezentujemy protokół klasycznego warunkowania mrówek w okiełznaniu, który pozwala badaczom badać wizualne uczenie się i tworzenie pamięci na poziomie analizy niemożliwym dla swobodnie poruszających się osób.

Wizualne warunkowanie klasyczne u mrówek leśnych

Poznaj metodę kondycjonowania dotykowego pszczół miodnych Apis mellifera oraz analizę kinematyczną ruchów czułków przy użyciu techniki 2D motion capture w MATLAB. Protokół umożliwia badanie mechanizmów uczenia się dotykowego.

Kondycjonowanie dotykowe i analiza ruchu w strategiach pobierania próbek czułków u pszczół miodnych (Apis mellifera L.)

Przeglądaj więcej filmów