Kondycjonowanie dotykowe i analiza ruchu w strategiach pobierania próbek czułków u pszczół miodnych (Apis mellifera L.)
12 grudnia 2012
W tym protokole pokazujemy, jak kondycjonować zaprzęgnięte pszczoły miodne do bodźców dotykowych i wprowadzamy technikę przechwytywania ruchu 2D do analizy kinematyki wzorca próbkowania anteny na małą skalę.
Ogólnym celem tej procedury jest pokazanie, w jaki sposób kondycjonować pszczoły miodne na bodźce dotykowe oraz wprowadzenie techniki przechwytywania ruchu 2D do analizy kinematyki w drobnej skali i 10 wzorców próbkowania. Na początku procedura wymaga schwytania swobodnie latających pszczół przed ich ulem. Drugim krokiem jest zaprzęgnięcie pszczół do metalowych rurek i zasłonięcie ich oczu białą farbą.
Następnie pszczoły są szkolone do bodźców dotykowych przy użyciu klasycznej procedury warunkowania. Ostatnim krokiem jest zarejestrowanie ruchu anteny kondycjonowanej pszczoły za pomocą cyfrowej kamery wideo. Ostatecznie przechwytywanie ruchu 2D w MATLAB służy do analizy zmian w zachowaniu ruchu anteny u pszczół miodnych po paradygmatach uczenia się dotykowego zarówno asocjacyjnych, jak i nieasocjacyjnych.
Metoda ta może być wykorzystana do badania dyskryminacji i percepcji dotykowej u różnych zmiennych gatunków. Może odróżniać zmiany wynikające z nieasocjacyjnego uczenia się dotykowego od zmian zachodzących w wyniku uczenia się asocjacyjnego, takich jak podczas warunkowania. Ogólnie rzecz biorąc, osoby, które są nowicjuszami w tej metodzie, będą miały trudności, ponieważ z pszczołami należy obchodzić się bardzo ostrożnie, a czas procedury kondycjonowania dotykowego ma kluczowe znaczenie.
Metoda ta może pomóc odpowiedzieć na kluczowe pytania z zakresu aktywnego wykrywania dotyku. Wykorzystuje naturalne zachowanie odruchowe jako zachowanie sprawozdawcze, co pozwala nam stwierdzić, czy zwierzę potrafi rozróżnić dwa bodźce dotykowe. Aby rozpocząć, zbieraj pszczoły bezpośrednio z wejścia do ula.
Umieść każdą pszczołę w szklanej fiolce zamkniętej piankowym korkiem i natychmiast zabierz ją do laboratorium w celu dalszej obróbki w laboratorium. Krótko mówiąc, schłodzić pszczoły w lodówce o temperaturze czterech stopni Celsjusza, aż zaczną wykazywać oznaki bezruchu. Najpierw unieruchom każdą pszczołę na metalowej rurce.
Umieść taśmę klejącą wokół głowy i klatki piersiowej oraz na brzuchu. Upewnij się, że probus i czułki są swobodnie ruchome, aby zasłaniać widzenie pszczoły. Pomaluj oczy złożone i selli białą farbą.
Umieść małą kroplę stopionego wosku między głowicą a taśmą, aby zapobiec przesuwaniu się głowy. Podczas nagrań. Aby ułatwić identyfikację, oznacz taśmę każdej pszczoły miodnej numerem i umieść rurkę w wilgotnej atmosferze, aby zapobiec odwodnieniu.
Na koniec użyj strzykawki wypełnionej 30% roztworem sacharozy, aby nakarmić każdą pszczołę przez pięć sekund i pozwól im dojść do siebie przez 30 minut. Przed rozpoczęciem protokołu kondycjonowania dotykowego, przed kondycjonowaniem, przetestuj każde B pod kątem odpowiedzi na rozszerzenie psis lub PER. Aby to zrobić, zastosuj 30% bodziec sacharozy do czułków, aby uzyskać prawidłową odpowiedź.
Czubek psis musi przekroczyć wirtualną linię między otwartymi szczękami. Do badania wykorzystywane są wyłącznie pszczoły z prawidłowym PER. Do warunkowania dotykowego jako bodziec warunkowy lub cs stosuje się metalowe struktury powierzchniowe.
Ich powierzchnia może być gładka lub rowkowana, aby uzyskać inną teksturę. Bodziec bezwarunkowy lub US to 30% roztwór sacharozy. Umieść mosiężną kostkę w uchwycie na mikromanipulatorze.
Pozwoli to na dokładne ułożenie podczas procedury kondycjonowania. Po zamontowaniu bodźca dotykowego umieść pszczołę przed mikromanipulatorem. Następnie powoli ustaw C tak, aby powierzchnia bodźca dotykowego była równoległa do głowy pszczoły.
Pszczoła powinna być w stanie skanować bodziec dotykowy w wygodnej pozycji za pomocą obu anten. Aby rozpocząć procedurę kondycjonowania, pozwól koralikowi skanować bodziec dotykowy przez pięć sekund. Po pierwszych trzech sekundach za pomocą strzykawki umieść kroplę 30% roztworu sacharozy pod trąbką.
Za pomocą końcówki strzykawki delikatnie podnieść probus. Ta stymulacja powinna wywołać bezwarunkowy PER. Pozwól pszczole polizać sacharozę.
Nagroda na jedną sekundę. Kontynuuj procedurę kondycjonowania, aż pszczoła otrzyma pięć par. Po pierwszych nagrodzonych parach, pszczoły powinny zacząć reagować na prezentację CS poprzez przedłużenie swojego psis wskazującego, że oczekują nadchodzącej nagrody.
W pełni rozszerzony psis obserwowany w dowolnym momencie w ciągu pierwszych trzech sekund prezentacji bodźca dotykowego przed prezentacją sacharozy jest oceniany jako odpowiedź pozytywna. Na koniec generowana jest krzywa uczenia się dla grupy pszczół. W tym celu dla każdej próby wykreślany jest odsetek pszczół wykazujących PER podczas prezentacji CS.
Po kondycjonowaniu do rejestrowania ruchów anteny używana jest cyfrowa kamera wideo z odpowiednim obiektywem makro. Tutaj używamy kamery basler a 602 F, wyposażonej w obiektyw VZM 200 o specyfikacji technicznej, działający z prędkością 50 klatek na sekundę za pomocą połączenia przewodu przeciwpożarowego, wyreguluj kamerę tak, aby ujarzmiona pszczoła i bodziec dotykowy były widoczne. Następnie skalibruj aparat, robiąc pojedyncze zdjęcia skalibrowanej szachownicy z różnych orientacji.
Użyj specjalistycznego oprogramowania z narzędziem do kalibracji aparatu, aby przeanalizować obrazy. Po kalibracji umieść pojedynczy stały B pod obiektywem aparatu i przedstaw bodziec dotykowy. Jak pokazano wcześniej.
Nagraj ruch pieczęci, podczas gdy pszczoła skanuje obiekt. Po zebraniu danych MATLAB służy do zdefiniowania tła obrazu, a następnie obliczenia mediany wartości skali szarości w czasie dla każdego piksela. Statyczne obiekty, takie jak nieruchoma głowa pszczoły i bodziec dotykowy, będą stanowić tło obrazu, odejmując tło obrazu od każdej klatki, ruchomych części wideo.
Idealnie byłoby, gdyby czułki pszczoły były izolowane jako jedyne obszary o niezerowych wartościach do dalszego przetwarzania. Zakłada się, że dwa największe obszary z niezerowymi wartościami pikseli to anteny. Maska jest tworzona w celu zlokalizowania końcówek anteny i dla całego obrazu, aby zmniejszyć ilość błędów.
Kombinacja narzędzi do erozji obrazu i dylatacji jest stosowana, gdy techniki te zmniejszą poziom hałasu. Binarna funkcja maski służy do grupowania rozłącznych obszarów. Środek ciężkości jest obliczany dla dwóch największych z tych gromad w celu rozróżnienia lewej i prawej anteny.
Tutaj są one oznaczone kolorem czerwonym i zielonym. Wreszcie, końcówkę anteny dla każdej anteny można zdefiniować jako piksel w klastrze o najwyższej wartości w kierunku proksymalnym do dystalnym, tworzony jest dwuwymiarowy histogram, który pokazuje rozkład przestrzenny pokazanej końcówki. Oto krzywa uczenia się dotykowego kondycjonowania PER w fałszerze pyłku.
Odsetek pozytywnych odpowiedzi po pierwszym sparowaniu był znacznie wyższy w porównaniu z zachowaniem spontanicznym, a krzywa uczenia się pokazuje nasycenie po trzeciej nagrodzie. W tym przykładzie ruch końcówki odbytu zarówno w grupie uwarunkowanej, jak i naiwnej był rejestrowany przez jedną minutę w obecności lub braku widzianego bodźca dotykowego. Oto spontaniczne ruchy tunelowe przed prezentacją bodźca.
Odbyt pokazuje boczne położenie końcówki tunelu, podczas gdy rzędna pokazuje pozycję dystalną. Skala kolorów wskazuje procent czasu, jaki końcówka aniny spędziła w dowolnym miejscu. Kolor żółty oznacza bardzo częste lokalizacje na czerwono, rzadziej występujące, a czarne lokalizacje są poza zasięgiem.
Dane te pokazują, że zarówno grupa, jak i grupa uwarunkowana zmieniły swój antalny wzorzec ruchowy w obecności bodźca dotykowego w porównaniu z ich spontanicznym zachowaniem. Zwróć uwagę, że prostokątny żółty obszar w pobliżu powierzchni bodźca wskazuje, że czubek pięty mrówki spędził dużo czasu na pobieraniu próbek z powierzchni. Pszczoły z grupy kondycjonowanej spędzały znacznie więcej czasu z końcówką czułka w obszarze bodźca niż pszczoły naiwne.
Po tej procedurze można znaleźć metody elektrofizjologiczne i farmakologiczne, aby odpowiedzieć na dodatkowe pytania, takie jak: jaka jest neurofizjologiczna podstawa aktywnego zachowania dotykowego u pszczół miodnych po jego rozwoju? Ta technika warunkowania dotykowego utorowała drogę naukowcom zajmującym się aktywnym wykrywaniem dotyku do zbadania różnych aspektów dyskryminacji bodźców dotykowych, ale także uczenia się i pamięci dotykowej w Alpha Pots. Po obejrzeniu tego filmu powinieneś dobrze zrozumieć, jak analizować aktywne wyszukiwanie dotykowe i pobieranie próbek ruchów i owadów.
Należy pamiętać, że analiza ruchu może zostać rozszerzona do analizy trójwymiarowej, jeśli co najmniej jedna dodatkowa kamera zostanie dodana synchronicznie z pierwszą.
Wyświetl pełny transkrypt i uzyskaj dostęp do tysięcy filmów naukowych
Przegląd
Niniejszy protokół demonstruje sposób warunkowania unieruchomionych pszczół miodnych na bodźce dotykowe oraz wprowadza technikę dwuwymiarowego przechwytywania ruchu (motion capture) do analizy kinetyki drobnoskalowych wzorców próbkowania antenalnego.
Kluczowe elementy badania
Dziedzina nauki
- Neurobiologia
- Biologia behawioralna
- Fizjologia zwierząt
Wstęp
- Pszczoły miodne wykazują złożone zachowania w odpowiedzi na bodźce dotykowe.
- Zrozumienie ich przetwarzania sensorycznego może dostarczyć wiedzy na temat mechanizmów neuronalnych.
- Technologia przechwytywania ruchu pozwala na precyzyjną analizę wzorców poruszania się.
- Warunkowanie klasyczne można zastosować do badania procesów uczenia się u pszczół.
Cel badania
- Warunkowanie pszczół miodnych w celu wywołania reakcji na bodźce dotykowe.
- Analiza wzorców ruchu czułków za pomocą systemu motion capture.
- Badanie uczenia się asocjacyjnego i nieasocjacyjnego u pszczół.
Zastosowane metody
- Odłowić swobodnie latające pszczoły przed ich ulem.
- Umieścić pszczoły w metalowych rurkach i zasłonić im oczy.
- Przeszkolić pszczoły, stosując techniki warunkowania klasycznego.
- Nagrać ruchy czułków za pomocą cyfrowej kamery wideo i przeanalizować je w programie MATLAB.
Główne wyniki
- Pomyślnie przeprowadzono warunkowanie pszczół w odpowiedzi na bodźce dotykowe.
- Dwuwymiarowa analiza ruchu (2D motion capture) pozwoliła na skuteczną analizę ruchów czułków.
- Po warunkowaniu zaobserwowano zmiany w zachowaniu ruchowym.
- Badanie dostarczyło nowych informacji na temat paradygmatów uczenia się.
Wnioski
- Protokół ten zapewnia niezawodną metodę badania uczenia się dotykowego u pszczół miodnych.
- Technologia motion capture jest cennym narzędziem w analizie behawioralnej.
- Wyniki przyczyniają się do zrozumienia przetwarzania sensorycznego u owadów.
Najczęściej zadawane pytania
Znaczenie dla przemysłu
Metoda ta umożliwia mechanistyczne zmniejszenie ryzyka w modelach przetwarzania sensorycznego poprzez ilościowe określenie zachowań związanych z aktywnym dotykiem w genetycznie modyfikowalnym systemie bezkręgowców. Wspiera ona walidację celów w odkryciach neurobiologicznych poprzez powiązanie wzorców ruchu czułków z wynikami uczenia się asocjacyjnego. Podejście to zapewnia pewność prognostyczną przy przesiewowych badaniach związków neuromodulacyjnych, które wpływają na dyskryminację dotykową i formowanie pamięci.
Strategiczne zastosowania w badaniach i rozwoju biofarmaceutycznym
Wczesna faza odkrywania i walidacja celu
- Wartość naukowa: Umożliwia badanie dotykowych szlaków sensorycznych oraz ich modulacji poprzez paradygmaty uczenia się.
- Wartość operacyjna: Zapewnia mierzalny odczyt behawioralny (PER) powiązany z wysokorozdzielczą analizą ruchu w celu oceny interakcji z celem.
- Wartość prognostyczna: Pozwala odróżnić efekty uczenia się asocjacyjnego od nieasocjacyjnego, co redukuje liczbę wyników fałszywie dodatnich w badaniach mechanistycznych.
Przesiewanie i opracowywanie testów
- Gotowość testu: Znormalizowany protokół kondycjonowania pozwala na uzyskanie powtarzalnych krzywych uczenia się w różnych kohortach pszczół.
- Wyniki ilościowe: Dwuwymiarowy system rejestracji ruchu (motion capture) generuje mapy rozkładu przestrzennego próbkowania końców anten w celu obiektywnego porównania.
- Skalowalność: Platforma umożliwia równoległe testowanie wielu bodźców dotykowych (np. powierzchni rowkowanych w porównaniu z gładkimi).
Badania translacyjne i przedkliniczne
- Znaczenie w kontekście chorób: Modeluje procesy integracji wielozmysłowej istotne dla badań nad zaburzeniami neurorozwojowymi.
- Ciągłość translacyjna: Łączy obwodowy sygnał sensoryczny (próbkowanie antenalne) z centralną odpowiedzią behawioralną (PER) w celu analizy szlaków sygnałowych.
- Postęp z uwzględnieniem ryzyka: Umożliwia wczesną weryfikację bezpieczeństwa i skuteczności związków celujących w przetwarzanie sensoryczne lub formowanie pamięci.
Integracja potoku i przepływu pracy
Metoda ta wpisuje się w wczesne etapy procesów badawczych, w których mechanizmy przetwarzania sensorycznego są analizowane przed identyfikacją związków wiodących w programach neurofarmakologicznych.
- Biologia odkrywcza: Wspiera testowanie hipotez dotyczących obwodów neuronalnych leżących u podstaw aktywnego dotyku i uczenia się sensorycznego.
- Przesiewanie: Dostarcza gotowych do analizy, powtarzalnych punktów końcowych behawioralnych z ilościowymi metrykami ruchu.
- Analityka: Umożliwia porównanie wzorców próbkowania antenalnego pomiędzy grupami naiwnymi a uwarunkowanymi w celu wykrycia plastyczności indukowanej uczeniem się.
- Badania translacyjne: Łączy obwodowe zachowania sensoryczne z funkcjami ośrodkowego układu nerwowego w celu mechanistycznego ograniczania ryzyka.
- Ponowne wykorzystanie w przedsiębiorstwie: Tworzy platformę wielokrotnego użytku do oceny efektów neuromodulacyjnych w zakresie dyskryminacji sensorycznej i pamięci.
Wpływ operacyjny i przedsiębiorczy
- Wartość naukowa: Mechanistyczna redukcja ryzyka w odniesieniu do celów przetwarzania sensorycznego poprzez mierzalne odczyty behawioralne i kinematyczne.
- Wartość operacyjna: Zestandaryzowany proces zaprzęgania, warunkowania i przechwytywania ruchu zapewnia powtarzalność w różnych laboratoriach.
- Wartość strategiczna: Poprawia podejmowanie decyzji o kontynuacji lub przerwaniu badań (go/no-go) poprzez zmniejszenie niejednoznaczności w walidacji mechanizmów sensorycznych.
- Wpływ na portfolio: Umożliwia priorytetyzację związków na podstawie ich wpływu na zależną od uczenia się adaptację sensoryczną.
Uwagi dotyczące wdrożenia
- Wymaga doświadczenia w obchodzeniu się z owadami, warunkowaniu klasycznym oraz w analizie ruchu na podstawie nagrań wideo.
- Zależne od systemów szybkiego przechwytywania obrazu wideo i potoków przetwarzania obrazu w programie MATLAB.
- Wymaga standaryzacji prezentacji bodźców dotykowych oraz czasu podawania nagrody w postaci sacharozy.
- Kwestie adaptacyjne obejmują specyficzną dla gatunku morfologię czułków oraz progi wrażliwości dotykowej.
- Ograniczenia praktyczne obejmują wrażliwość na stres związany z manipulacją oraz warunki środowiskowe wpływające na motywację pszczół.
