Optogenetyczna aktywacja neuronów somatosensorycznych danio pręgowanego za pomocą ChEF-tdTomato

Ogólnym celem tej procedury jest aktywacja pojedynczych neuronów somatosensorycznych u larw danio pręgowanego. Osiąga się to poprzez przygotowanie optycznego i podłączenie go do niebieskiego lasera A-D-P-S-S. Drugim krokiem jest wstrzyknięcie transgenu do jednego lub dwóch zarodków w stadium komórkowym.

Następnie przesiewa zarodki tłuszczowe wykazujące ekspresję pomidora C-H-E-F-T-D w neuronach somatosensorycznych i montują je w mózgu. Ostatnim krokiem jest dostarczenie krótkiego impulsu niebieskiego światła w celu aktywacji pojedynczego neuronu i zarejestrowania wynikowego zachowania. Główną zaletą tej techniki istniejących metod wykorzystujących opcję drugą korzenia kanału jest to, że podejście to można wykorzystać do wywołania reakcji behawioralnych z pojedynczych neuronów aktywowanych do co najmniej czterech dni po hospitalizacji.

Chociaż metoda ta jest stosowana w celu uzyskania wglądu w funkcję specyficznych neuronów somatosensorycznych u larw danio pręgowanego. Podejście to można również zaadaptować do badania zachowań wywoływanych przez dowolną populację neuronów danio pręgowanego, takich jak neurony wewnętrzne lub neurony ruchowe. To genetyczne podejście może być wykorzystane do aktywacji określonych neuronów in vivo, scharakteryzowania rozwoju funkcjonalnego, oceny wpływu mutacji lub fenomenologicznej blokady określonych białek na zachowanie i mapowania sieci neuronalnych prowadzących do odrębnych reakcji behawioralnych.

Aby rozpocząć tę procedurę, utwórz jednostkę do przechowywania optycznego, topiąc zwężającą się szyjkę szkła. Pipetę do makaronu na belkach i palniku, aby uzyskać kąt 150 stopni. Następnie za pomocą przecinaka do drutu lub żyletki ostrożnie przetnij optyczny na dwie części.

Każdy element powinien mieć jeden odsłonięty koniec i jeden koniec z adapterem FC PC. Następnie zdejmij optyczny do okładziny, zdejmując osłonę z włókna, wzmacniając włókna i powłokę z 5,0 centymetrów od odciętego końca. Następnie włóż światłowodowy do przygotowanej pipety do makaronu.

Upewnij się, że może łatwo wchodzić i wysuwać się z końcówki pipety za pomocą diamentowego noża do szkła lub kleszcza z cienką końcówką. Naciąć włókno szklane i odłamać koniec, aby uzyskać czyste cięcie na końcu włókna. Następnie wsuń optyczny do pipety do makaronu.

Następnie umieść optyczny w pipecie do makaronu za pomocą mikromanipulatora pod mikroskopem, ręcznie POKRYJ od 24 do 48 zarodków HPF za pomocą kleszczy, a następnie znieczul larwy za pomocą 0,02% trica za pomocą fluorescencyjnego mikroskopu preparacyjnego. Zidentyfikuj larwy za pomocą neuronu Rona Bearda lub ekspresji neuronu trójdzielnego Zarodki z rzadką ekspresją w łatwych do zidentyfikowania komórkach są optymalne, ale poszczególne neurony będą przeznaczone do aktywacji za pomocą światłowodowego, więc dopuszczalny jest szeroki zakres gęstości ekspresji. Przenieś larwy do nowego naczynia ze świeżą niebieską wodą z zarodków PTU.

Przechowuj zarodki w temperaturze 28,5 stopnia Celsjusza w ciemności do pożądanego etapu eksperymentalnego. W tej sekcji przygotuj 1,5% niską zawartość maltazy i podwójnie destylowaną wodę i przechowuj w bloku grzewczym o temperaturze 42 stopni Celsjusza, aby zapobiec jej zestaleniu. Za pomocą szklanej pipety do makaronu przenieś jedną z larw przed przesiewaniem do probówki z 1,5% niskotopliwą agarozą z jak najmniejszą ilością niebieskiej wody dla zarodków.

Następnie przenieś larwę w kropli agarozy na małą szalkę Petriego. Pod mikroskopem preparacyjnym umieść lawę grzbietową stroną do góry, gdy aros zastygnie. Użyj cienkiej żyletki, aby odciąć aros z obu stron lawy.

Wypełnij obszar otaczający aros niebieską wodą z zarodka. Następnie wykonaj dwa ukośne nacięcia po obu stronach żółtka, uważając, aby nie naciąć lawy. Następnie odciągnij agrow od pnia i ogona lawy.

Teraz zamontuj szybką kamerę na lunecie sekcyjnej i podłącz kamerę do komputera. Następnie włącz komputer i szybką kamerę. Otwórz oprogramowanie do obrazowania wideo i dostosuj ustawienia aparatu.

Następnie połącz ze sobą optyczny, laser i stymulator. Następnie włącz stymulator i ustaw go na maksymalnie pięć woltów i czas trwania impulsu na pięć milisekund. Następnie włącz laser.

Następnie użyj fluorescencyjnego mikroskopu preparacyjnego, aby umieścić końcówkę optycznego w pobliżu ciała komórki neuronu z ekspresją pomidora C-H-E-F-T-D. Dostarcz impuls niebieskiego światła, aby aktywować neuron czuciowy. Następnie nagraj odpowiedzi za pomocą szybkiej kamery.

Ustaw na 500 lub 1000 klatek na sekundę i powtórz eksperyment z co najmniej jedną minutą między aktywacjami, aby uniknąć przyzwyczajenia, aby uwolnić lawę przed częścią, Arisem za pomocą kleszczy i uważaj, aby nie wniknąć w zwierzę. Następnie przenieś go do świeżej niebieskiej wody z zarodków. Zwierzętom można pozwolić na dalszy rozwój, a procedurę można powtórzyć w starszych stadiach.

Zarodek może być również ponownie zamontowany w celu obrazowania konfokalnego aktywowanej komórki w wysokiej rozdzielczości w celu skorelowania zachowania ze strukturą komórkową. Przedstawiony tutaj diagram lawy danio pręgowanego jest częściowo osadzony w 1,5% low malt Aris, reprezentowanym przez linie kreskowe otaczające jego część rostralną. Neuron trójdzielny i neuron brody Rohan są przedstawione na czerwono Komórki gębowe są obrysowane liniami kreskowymi na ilustracji.

Oto film pokazujący, że aktywacja pojedynczego neuronu brody Rohan wyrażającego pomidora C-H-E-F-T-D w lawie o objętości około 35 HPF wywołuje reakcję behawioralną. Ten film pokazuje aktywację pomidora C-H-E-F-T-D wyrażającego neurony brody Rohan w lawie 60 HPF, a ten film pokazuje aktywację neuronów brody Rohan z ekspresją pomidora C-H-E-F-T-D w lawie z czterema DPF Po opanowaniu. To genetyczne podejście można wykonać w mniej niż godzinę.

Po obejrzeniu tego filmu powinieneś dobrze zrozumieć, jak aktywować poszczególne neurony i larwy ryb Libra w różnych punktach czasowych. Nie zapominaj, że praca z laserami może być bardzo niebezpieczna i podczas wykonywania tej procedury należy zawsze zachować odpowiednie środki ostrożności.