Name: Optogenetyczna aktywacja neuronów somatosensorycznych danio pręgowanego za pomocą ChEF-tdTomato (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-01-31T13:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 25 s
Description: Poznaj metodę optogenetycznej aktywacji pojedynczych neuronów somatosensorycznych u larw Danio rerio za pomocą lasera niebieskiego. Technika umożliwia badanie zachowań wywołanych aktywacją neuronów.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Dziękujemy Fumi Kubo, Todowi Thiele i HerwigBaier (UCSF/Max Planck Institute) za porady dotyczące eksperymentów behawioralnych i instalacji laserowej DPSS; Heesoo Kim i Chiara Cerri z Kursu Neurobiologii MBL za pomoc w eksperymentach ChEF-tdTomato; Petronella Kettunen (Uniwersytet w Göteborgu) za wstępną współpracę w zakresie eksperymentów optogenetycznych; BaljitKhakh, Eric Hudson, Mike Baca i John Milligan (UCLA) w celu uzyskania porad technicznych; oraz Roger Tsien (UCSD) za konstrukcję ChEF-tdTomato. Prace te zostały wsparte nagrodą NRSA (5F31NS064817) dla AMSP oraz grantem z NSF (RIG:0819010) dla AS.

Przygotuj z wyprzedzeniem następujące elementy.
1. Przygotuj optyczny
<ol>
 <li>Utwórz jednostkę do przechowywania optycznego, topiąc stożkową szyjkę szklanej pipety Pasteura nad palnikiem Bunsena, aby uzyskać kąt ~150 °.</li>
 <li>Za pomocą przecinaka do drutu lub żyletki ostrożnie przetnij optyczny na dwie części. Każdy element powinien mieć jeden koniec z adapterem FC / PC i jeden odsłonięty koniec. Przechowuj jedną sztukę jako zapasowy.</li>
 <li>Zdejmij optyczny do okładziny, zdejmując osłonę z włókna i wzmacniając włókna (rysunek 1A) z 5.0 cm odciętego końca.</li>
 <li>Włóż optyczny do przygotowanej pipety Pasteura. Upewnij się, że może łatwo wchodzić i wysuwać się z końcówki pipety.</li>
 <li>Z światłowodowym wystającym z końcówki pipety Pasteura, ostrożnie odetnij i usuń okładzinę z włókna szklanego, ~2 mm od odciętego końca.</li>
 <li>Za pomocą pisaka diamentowego/noża do szkła naciąć włókno szklane i odłamać koniec, aby uzyskać czyste cięcie/powierzchnię na końcu włókna (Rysunek 1B).</li>
 <li>Wsuń optyczny do pipety Pasteura w celu przechowywania. Powtórz krok (1.6), jeśli końcówka światłowodu zostanie wyszczerbiona lub pęknie nierównomiernie.</li>
 <li>Ułóż przewód optyczny w pipecie Pasteura za pomocą mikromanipulatora (Rysunek 1C).</li>
</ol>
Procedury 2-8 opisują metodę wstrzykiwania transgenów do embrionów, ogólnie stosowaną w wielu eksperymentach z danio pręgowanymi. Wariacje na temat tej metody, podobnie jak te opisane w innych filmach JoVE 6, 7, 8, 9, 22 są równie skuteczne.
2. Wyciągnij igły iniekcyjne
<ol>
 <li>Za pomocą ściągacza do igieł wciągnąć rurkę ze szkła borokrzemianowego do dwóch igieł iniekcyjnych ze stopniowo zwężającą się końcówką. Ustawienia ściągacza będą się różnić. (W ściągaczu igłowym Sutter Instruments używamy ustawień: P = 500, Heat = 720, Pull = 50, Velocity = 70 i Time = 150). Każdy ściągacz igieł jest inny, więc zoptymalizuj ustawienia ściągacza empirycznie. Aby uzyskać bardziej stożkowe igły, zwiększ ciepło i/lub naciąg. W przypadku mniejszej liczby igieł stożkowych, zwiększ czas i/lub zmniejsz siłę naciągu.</li>
 <li>Igły należy przechowywać w bezpiecznym pojemniku (tj. na szalce Petriego ze zwiniętą taśmą, stroną samoprzylepną na zewnątrz).</li>
</ol>
3. Nalewać formy wtryskowe
<ol>
 <li>Rozpuść 0,5 g agarozy w 30 ml zarodka/niebieskiej wody, aż agaroza całkowicie się rozpuści.</li>
 <li>Wlej do dolnej połowy szalki Petriego.</li>
 <li>Umieść prostokątną formę z dołkami montażowymi (ryc. 2) w agarozie, uważając, aby ograniczyć tworzenie się pęcherzyków wokół studzienek.</li>
 <li>Pozwól agarozie stężać.</li>
 <li>Usuń pleśń i napełnij szalkę Petriego niebieską/zarodkową wodą.</li>
 <li>Przechowywać w pozycji pionowej, napełnionej czystą wodą, w temperaturze pokojowej do użytku tego samego dnia lub w temperaturze 4 °C do wykorzystania w przyszłości.</li>
</ol>
4. Przygotuj mieszankę plazmidowego DNA do wstrzykiwań
<ol>
 <li>Rozcieńczyć plazmidowy DNA do stężenia 50 ng/μl czerwienią fenolową 1:10 w ddH2O. Na przykład:
 <obramowanie tabeli="1">
 <tbody>
 <tr>
 <td>Pojemność 1,0 ml</td>
 <td>plazmidowe DNA (250 ng/ml)</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Pojemność 0,5 ml</td>
 <td>czerwień fenolowa</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Pojemność 3,5 ml</td>
 <td>ddH2O</td>
 </tr>
 </tbody>
 </table>
 </li>
 <li>Mieszanina DNA może być przechowywana w temperaturze pokojowej w przypadku natychmiastowego użycia lub przechowywana w temperaturze 4 °C przez kilka dni.</li>
</ol>
5. Ustaw pary kryjące
To powinno być zrobione wieczorem przed planowanym zrobieniem zastrzyków.
<ol>
 <li>Napełnij zbiorniki hodowlane wodą systemową i umieść samce i samice ryb razem. Jeśli nie można wykonać iniekcji, gdy tylko w obiekcie włączą się światła, należy oddzielić samce i samice ryb za pomocą przegrody.</li>
</ol>
6. Przygotuj się do zastrzyków (można to zrobić podczas oczekiwania na zarodki)
<ol>
 <li>Włącz wtryskiwacz ciśnieniowy. Upewnij się, że system jest ustawiony na pulsowanie. Zacznij od ustawienia CZAS TRWANIA IMPULSU na 1.</li>
 <li>Włącz zawór AIR i wyreguluj ciśnienie wtryskiwacza na ~20 psi.</li>
 <li>Używając lunety sekcyjnej przy największym powiększeniu, złamij końcówkę igły kleszczami lub pogrzebaczem, aby utworzyć otwór o wielkości ~2 μm (Rysunek 3, Film 1).</li>
 <li>Napełnij igły mieszanką DNA poprzez: 1. Umieszczając igłę, czubkiem do góry, w mieszance DNA i pozwalając igle wypełnić się kapilarnie lub 2. Za pomocą długodystansowej końcówki pipetować 1-2 μl DNA wymieszać bezpośrednio z igłą.</li>
 <li>Umieść wypełnioną igłę w bezpiecznym miejscu, aż będzie gotowa do wstrzyknięcia.</li>
</ol>
7. Zbieraj zarodki
<ol>
 <li>Po włączeniu świateł w obiekcie usuń przegrody (jeśli dotyczy). Zebrać zarodki za pomocą sitka/małego sitka i przenieść je na szalkę Petriego ze świeżą niebieską wodą/zarodkami.</li>
</ol>
8. Wstrzyknij zarodki w stadium 1-2 komórek
<ol>
 <li>Przenieś pobrane zarodki do form iniekcyjnych za pomocą plastikowej pipety.</li>
 <li>Używając mikroskopu preparacyjnego, delikatnie wepchnij zarodki do studzienek za pomocą kleszczy lub pogrzebacza (Ryc. 4, Film 2).</li>
 <li>Umieść załadowaną igłę w mikromanipulatorze i umieść nad zarodkami.</li>
 <li>Skalibruj objętość wstrzyknięcia, regulując CZAS TRWANIA IMPULSU w krokach co 1 krok, aż osiągniesz żądaną objętość (~1 nl). Można to skalibrować za pomocą szkiełka mikrometrycznego, jak opisano w poprzednich filmach JoVE 8, 22, ale w tym eksperymencie precyzja nie jest konieczna, ponieważ szeroki zakres objętości iniekcji spowoduje odpowiednią ekspresję.</li>
 <li>Wstrzyknąć ~1 nl mieszanki DNA bezpośrednio do komórki i powtórzyć dla wszystkich zarodków. DNA można również wstrzyknąć do żółtka, ale jest to zwykle mniej wydajne (ryc. 5, film 3).</li>
 <li>Usuń wstrzyknięte zarodki z pleśni za pomocą delikatnego strumienia niebieskiej/zarodkowej wody.</li>
 <li>Wstrzykiwane zarodki należy przechowywać w temperaturze 28,5 °C w ciemności.</li>
 <li>Okresowo usuwaj niezapłodnione, uszkodzone lub martwe zarodki.</li>
 <li>Traktuj zarodki PTU między 18-24 hpf, aby zapobiec pigmentacji.</li>
</ol>
9. Badanie przesiewowe ekspresji transgenu
<ol>
 <li>Ręcznie dechorionuj 24-48 zarodków hpf za pomocą kleszczy.</li>
 <li>Znieczulić larwy za pomocą 0,02% trikainy.</li>
 <li>Za pomocą fluorescencyjnego mikroskopu preparacyjnego zidentyfikuj larwy z ekspresją RB lub neuronu trójdzielnego i przenieś je do nowego naczynia ze świeżą wodą PTU blue/embryo. Zarodki z rzadką ekspresją w łatwych do zidentyfikowania komórkach są optymalne, ale poszczególne neurony będą celem aktywacji za pomocą światłowodowego, więc dopuszczalny jest szeroki zakres gęstości ekspresji.</li>
 <li>Przechowywać zarodki w temperaturze 28,5 °C w ciemności do pożądanego etapu doświadczalnego.</li>
</ol>
10. Larwy wierzchowca do eksperymentów behawioralnych
<ol>
 <li>Przygotuj 1,5% niskotopliwej agarozy w ddH2O i przechowuj w bloku grzewczym o temperaturze 42 °C, aby zapobiec jej zestaleniu.</li>
 <li>Za pomocą szklanej pipety Pasteura przenieś jedną z wstępnie przesianych larw do probówki z 1,5% agarozą o niskiej temperaturze topnienia z jak najmniejszą ilością wody niebieskiej/zarodkowej.</li>
 <li>Przenieś larwy w kropli agarozy na małą szalkę Petriego.</li>
 <li>Pod mikroskopem preparacyjnym ustaw larwę grzbietowo do góry.</li>
 <li>Gdy agaroza zastygnie, odetnij agarozę cienką żyletką (skalpel #11), pozostawiając klin agaru wokół całej larwy.</li>
 <li>Wykonaj dwa ukośne nacięcia po obu stronach żółtka; uważając, aby nie naciąć larwy.</li>
 <li>Wypełnij obszar otaczający agarozę zarodkiem/niebieską wodą.</li>
 <li>Odciągnij agarozę od tułowia i ogona larwy (ryc. 6).</li>
</ol>
11. Przygotowanie szybkiej kamery i oprogramowania do obrazowania
<ol>
 <li>Zamontuj szybką kamerę na lunecie sekcyjnej.</li>
 <li>Podłącz aparat do komputera.</li>
 <li>Włącz komputer.</li>
 <li>Włącz szybką kamerę.</li>
 <li>Otwórz oprogramowanie do obrazowania (używamy oprogramowania do obrazowania AOS i opiszemy procedury korzystania z niego tutaj, ale inne oprogramowanie do obrazowania jest równie dopuszczalne).</li>
 <li>Dostosuj odpowiednio ustawienia aparatu (np. 1,000 klatek na sekundę (kl./s), 50% bufora spustu lub inne preferowane ustawienia).</li>
 <li>Rozpocznij nagrywanie.</li>
</ol>
12. Aktywuj pojedyncze neurony za pomocą lasera o długości fali 473 nm
<ol>
 <li>Podłącz stymulator, laser i optyczny.</li>
 <li>Włącz stymulator.</li>
 <li>Ustaw stymulator na maksymalnie 5 woltów i czas trwania impulsu 5 ms.</li>
 <li>Włącz laser zgodnie z instrukcjami producenta.</li>
 <li>Użyj mikroskopu preparacyjnego, aby umieścić końcówkę optycznego w pobliżu ciała komórki neuronu z ekspresją ChEF-tdTomato (ryc. 6).</li>
 <li>Dostarcz impuls niebieskiego światła, aby aktywować neuron czuciowy.</li>
 <li>Nagrywaj zachowanie za pomocą szybkiej kamery ustawionej na 500 lub 1,000 klatek na sekundę.</li>
 <li>Powtórz eksperyment zgodnie z potrzebami, odczekując 1 minutę między każdą aktywacją, aby uniknąć przyzwyczajenia. (Rejestrujemy co najmniej trzy odpowiedzi dla każdego neuronu).</li>
 <li>Aby uwolnić larwy, podważ agarozę kleszczami, uważając, aby nie zranić zwierzęcia. Zwierzęciu temu można pozwolić na dalszy rozwój, a procedurę można powtórzyć na starszym etapie, aby scharakteryzować rozwój zachowania. Zarodek można również ponownie zamontować w celu obrazowania konfokalnego aktywowanej komórki w wysokiej rozdzielczości w celu skorelowania zachowania ze strukturą komórkową, jak opisano poniżej.</li>
 <li>Przenieść larwę na płytkę hodowlaną ze świeżą wodą niebieską/zarodkową. Używamy 24-dołkowej płytki do śledzenia poszczególnych larw.</li>
</ol>
13. Neuron(y) obrazowy z mikroskopem konfokalnym
<ol>
 <li>Znieczulić larwy 0,02% tricainą.</li>
 <li>Zamontuj larwy, grzbietem do góry, w 1,2% niskotopliwej agarozie lub w formie grzbietowej.</li>
 <li>Obraz neuronów ChEF-tdTomato za pomocą lasera 543 nm oraz odpowiedniego filtra i obiektywu. Używamy obiektywu 20x.</li>
 <li>Usuń larwy z agarozy i wróć do indywidualnej studzienki z niebieską/zarodkową wodą.</li>
 <li>Przechowywać w temperaturze 28,5 °C w ciemności do dalszej analizy.</li>
</ol>

<ol><li>Arrenberg, A. B., Del Bene, F., Baier, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optical+control+of+zebrafish+behavior+with+halorhodopsin%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Optical control of zebrafish behavior with halorhodopsin.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 106 (42), 17968-17973 (2009).</li>
<li>Burgess, H. A., Johnson, S. L., Granato, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Unidirectional+startle+responses+and+disrupted+left-right+co-ordination+of+motor+behaviors+in+robo3+mutant+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22Genes+Brain+Behav%22%5BJournal%5D)">Unidirectional startle responses and disrupted left-right co-ordination of motor behaviors in robo3 mutant zebrafish.</a> Genes Brain Behav. 8 (5), 500-511 (2009).</li>
<li>Douglass, A. D., Kraves, S., Deisseroth, K., Schier, A. F., Engert, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Escape+behavior+elicited+by+single%2C+channelrhodopsin-2-evoked+spikes+in+zebrafish+somatosensory+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22Curr.+Biol%22%5BJournal%5D)">Escape behavior elicited by single, channelrhodopsin-2-evoked spikes in zebrafish somatosensory neurons.</a> Curr. Biol. 18 (15), 1133-1137 (2008).</li>
<li>Downes, G. B., Granato, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Supraspinal+input+is+dispensable+to+generate+glycine-mediated+locomotive+behaviors+in+the+zebrafish+embryo%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurobiol%22%5BJournal%5D)">Supraspinal input is dispensable to generate glycine-mediated locomotive behaviors in the zebrafish embryo.</a> J. Neurobiol. 66 (5), 437-451 (2006).</li>
<li>Drapeau, P., Saint-Amant, L., Buss, R. R., Chong, M., McDearmid, J. R., Brustein, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+of+the+locomotor+network+in+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22Prog.+Neurobiol%22%5BJournal%5D)">Development of the locomotor network in zebrafish.</a> Prog. Neurobiol. 68 (2), 85-111 (2002).</li>
<li>Eisenhoffer, G. T., Rosenblatt, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Live+Imaging+of+Cell+Extrusion+from+the+Epidermis+of+Developing+Zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis.+Exp%22%5BJournal%5D)">Live Imaging of Cell Extrusion from the Epidermis of Developing Zebrafish.</a> J. Vis. Exp. (52), e2689(2011).</li>
<li>Graeden, E., Sive, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Live+Imaging+of+the+Zebrafish+Embryonic+Brain+by+Confocal+Microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis.+Exp%22%5BJournal%5D)">Live Imaging of the Zebrafish Embryonic Brain by Confocal Microscopy.</a> J. Vis. Exp. (26), e1217(2009).</li>
<li>Kague, E., Weber, C., Fisher, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mosaic+Zebrafish+Transgenesis+for+Evaluating+Enhancer+Sequences%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis.+Exp%22%5BJournal%5D)">Mosaic Zebrafish Transgenesis for Evaluating Enhancer Sequences.</a> J. Vis. Exp. (41), e1722(2010).</li>
<li>Kemp, H. A., Carmany-Rampey, A., Moens, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generating+Chimeric+Zebrafish+Embryos+by+Transplantation%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis.+Exp%22%5BJournal%5D)">Generating Chimeric Zebrafish Embryos by Transplantation.</a> J. Vis. Exp. (29), e1394(2009).</li>
<li>Kohashi, T., Oda, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Initiation+of+Mauthner-+or+non-Mauthner-mediated+fast+escape+evoked+by+different+modes+of+sensory+input%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Initiation of Mauthner- or non-Mauthner-mediated fast escape evoked by different modes of sensory input.</a> J. Neurosci. 28 (42), 10641-10653 (2008).</li>
<li>Lai, S. L., Lee, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genetic+mosaic+with+dual+binary+transcriptional+systems+in+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Genetic mosaic with dual binary transcriptional systems in Drosophila.</a> Nat. Neurosci. 9 (5), 703-709 (2006).</li>
<li>Liao, J. C., Haehnel, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Physiology+of+afferent+neurons+in+larval+zebrafish+provides+a+functional+framework+for+lateral+line+somatotopy%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurophysiol%22%5BJournal%5D)">Physiology of afferent neurons in larval zebrafish provides a functional framework for lateral line somatotopy.</a> J. Neurophysiol. 107 (10), 2615-2623 (2012).</li>
<li>Lin, J. Y., Lin, M. Z., Steinbach, P., Tsien, R. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+of+engineered+channelrhodopsin+variants+with+improved+properties+and+kinetics%5BTitle%5D)+AND+%22Biophys+J%22%5BJournal%5D)">Characterization of engineered channelrhodopsin variants with improved properties and kinetics.</a> Biophys J. 96 (5), 1803-1814 (2009).</li>
<li>Liu, K. S., Fetcho, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Laser+ablations+reveal+functional+relationships+of+segmental+hindbrain+neurons+in+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Laser ablations reveal functional relationships of segmental hindbrain neurons in zebrafish.</a> Neuron. 23 (2), 325-335 (1999).</li>
<li>Liu, Y. C., Bailey, I., Hale, M. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Alternative+startle+motor+patterns+and+behaviors+in+the+larval+zebrafish+%28Danio+rerio%29%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Comp.+Physiol.+A.+Neuroethol.+Sens+Neural.+Behav.+Physiol%22%5BJournal%5D)">Alternative startle motor patterns and behaviors in the larval zebrafish (Danio rerio).</a> J. Comp. Physiol. A. Neuroethol. Sens Neural. Behav. Physiol. 198 (1), 11-24 (2012).</li>
<li>Palanca, A. M., Lee, S. L., Yee, L. E., Joe-Wong, C., Trinh, L. A., Hiroyasu, E., Husain, M., Fraser, S. E., Pellegrini, M., Sagasti, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((New+transgenic+reporters+identify+somatosensory+neuron+subtypes+in+larval+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22Dev.+Neurobiol%22%5BJournal%5D)">New transgenic reporters identify somatosensory neuron subtypes in larval zebrafish.</a> Dev. Neurobiol. , (2012).</li>
<li>Pujol-Martí, J., Zecca, A., Baudoin, J. P., Faucherre, A., Asakawa, K., Kawakami, K., López-Schier, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neuronal+birth+order+identifies+a+dimorphic+sensorineural+map%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Neuronal birth order identifies a dimorphic sensorineural map.</a> J. Neurosci. 32 (9), 2976-2987 (2012).</li>
<li>Saint-Amant, L., Drapeau, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Time+course+of+the+development+of+motor+behaviors+in+the+zebrafish+embryo%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurobiol%22%5BJournal%5D)">Time course of the development of motor behaviors in the zebrafish embryo.</a> J. Neurobiol. 37 (4), 622-632 (1998).</li>
<li>Szobota, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Remote+control+of+neuronal+activity+with+a+light-gated+glutamate+receptor%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Remote control of neuronal activity with a light-gated glutamate receptor.</a> Neuron. 54 (4), 535-545 (2007).</li>
<li>Uemura, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparative+functional+genomics+revealed+conservation+and+diversification+of+three+enhancers+of+the+isl1+gene+for+motor+and+sensory+neuron-specific+expression%5BTitle%5D)+AND+%22Dev.+Biol%22%5BJournal%5D)">Comparative functional genomics revealed conservation and diversification of three enhancers of the isl1 gene for motor and sensory neuron-specific expression.</a> Dev. Biol. 278 (2), 587-606 (2005).</li>
<li>Wyart, C., Del Bene, F., Warp, E., Scott, E. K., Trauner, D., Baier, H., Isacoff, E. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optogenetic+dissection+of+a+behavioural+module+in+the+vertebrate+spinal+cord%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Optogenetic dissection of a behavioural module in the vertebrate spinal cord.</a> Nature. 461 (7262), 407-410 (2009).</li>
<li>Yuan, S., Sun, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microinjection+of+mRNA+and+Morpholino+Antisense+Oligonucleotides+in+Zebrafish+Embryos%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis.+Exp%22%5BJournal%5D)">Microinjection of mRNA and Morpholino Antisense Oligonucleotides in Zebrafish Embryos.</a> J. Vis. Exp. (27), e1113(2009).</li>
</ol>

Autorzy oświadczają, że nie mają konkurencyjnego interesu finansowego.

Opisaliśmy podejście do optogenetycznej aktywacji pojedynczych neuronów RB u żywych danio pręgowanych. Nasza metoda wykorzystuje transgenezę przejściową do ekspresji fluorescencyjnie znakowanego wariantu rodopsyny kanałowej, ChEF-tdTomato13, w określonych neuronach somatosensorycznych. Podejście to można łatwo zaadaptować do stosowania w innych populacjach komórek larwalnych danio pręgowanego.
Stosując to podejście, konsekwentnie wywoływaliśmy reakcje behawioralne od 34-48 larw hpf ...

Rozwój metod optogenetycznych do promowania lub hamowania pobudliwości neuronów za pomocą określonych długości fal światła umożliwił badanie funkcji różnych populacji neuronów w obwodach nerwowych kontrolujących zachowanie 1, 19, 21. Ta technika jest często używana do aktywacji grup neuronów, ale może być również używana do aktywacji pojedynczych neuronów. Larwy danio pręgowanego są szczególnie podatne na te metody, ponieważ są przezroczyste, ich układ nerwowy rozwija się szybko, a tworzenie zwierząt transgenicznych jest szybkie i rutynowe. Jednak aby niezawodnie osiągnąć aktywację pojedynczego neuronu, należy pokonać znaczne przeszkody techniczne.
Aby zoptymalizować procedurę optogenetycznej aktywacji pojedynczych neuronów danio pręgowanego, skupiliśmy się na neuronach somatosensorycznych. Larwy danio pręgowanego wykrywają różne bodźce somatosensoryczne za pomocą dwóch populacji neuronów: neuronów trójdzielnych, które unerwiają głowę, i neuronów Rohona-Bearda (RB), które unerwiają resztę ciała. Każdy neuron trójdzielny i RB projektuje akson obwodowy, który rozgałęzia się szeroko w skórze w celu wykrywania bodźców, oraz akson centralny, który łączy się z dalszymi obwodami neuronalnymi. Zwierzęta reagują na dotyk już po 21 godzinach od zapłodnienia (hpf), co wskazuje, że utworzyły się spójne obwody somatosensoryczne 5, 18. Podczas rozwoju larwalnego co najmniej niektóre neurony trójdzielne i RB synapsują się na komórce Mauthnera, aby aktywować klasyczne reakcje ucieczki, ale coraz więcej dowodów sugeruje, że istnieje wiele klas neuronów somatosensorycznych o różnych wzorcach połączeń, które mogą wywoływać zmiany w zachowaniu ucieczki 2, 4, 10, 12, 14, 15, 16, 17. Naszą motywacją do opracowania tej metody było scharakteryzowanie funkcji behawioralnych różnych klas neuronów somatosensorycznych, ale podejście to można w zasadzie wykorzystać do badania funkcji prawie każdego neuronu lub populacji neuronów u larw danio pręgowanego.
Douglass et al. wcześniej opisano metodę aktywacji neuronów somatosensorycznych eksprymujących rodopsynę kanałową za pomocą niebieskiego światła, wywołując zachowanie ucieczki 3. W swoim podejściu wykorzystali element wzmacniający z genu isl1 do stymulowania ekspresji ChR2-EYFP w neuronach somatosensorycznych. Doniesiono jednak, że ten transgen wykazuje stosunkowo słabą fluorescencję, co wymaga jednoczesnego wstrzyknięcia drugiego reportera, UAS::GFP, aby umożliwić wizualizację komórek eksprymujących ChR2-EYFP. To podejście zostało użyte do wywołania reakcji behawioralnych w zakresie 24-48 hpf, ale nigdy nie mogło wywołać odpowiedzi powyżej 72 hpf. Tak więc, chociaż metoda ta sprawdza się w badaniu obwodów nerwowych w bardzo wczesnych stadiach larwalnych (24-48 hpf), jest niewystarczająca do charakteryzowania obwodów nerwowych i reakcji behawioralnych u starszych larw, gdy widoczne są bardziej zróżnicowane reakcje behawioralne, a obwody neuronalne są bardziej dojrzałe.
Staraliśmy się poprawić czułość tej techniki, aby scharakteryzować funkcję subpopulacji larwalnych neuronów RB. Aby poprawić ekspresję, użyliśmy wzmacniacza swoistego dla somatosensoryki (CREST3) 20 do sterowania ekspresją LexA-VP16 oraz odcinka sekwencji operatorów LexA (4xLexAop) 11 do wzmocnienia ekspresji fluorescencyjnie znakowanego kanału aktywowanego światłem. Ta konfiguracja wzmocniła ekspresję kanału, eliminując potrzebę koekspresji drugiego reportera i pozwalając nam bezpośrednio określić względną obfitość kanału w każdym neuronie. Użycie sekwencji LexA/LexAop miało tę dodatkową zaletę, że pozwoliło nam wprowadzić transgen do linii reporterowych danio pręgowanego, które wykorzystują system Gal4/UAS. Przejściowa ekspresja tego transgenu skutkowała różnymi poziomami ekspresji, ale zwykle była wystarczająco silna, aby uwidocznić zarówno ciało komórki, jak i projekcje aksonalne poszczególnych neuronów w ciągu kilku dni. Aby zoptymalizować wrażliwość na światło, użyliśmy aktywowanego światłem kanału ChEF, wariantu rodopsyny kanałowej składającej się z chimery kanałopsyny-1 (Chop1) i kanałopsyny-2 (Chop2) z miejscem skrzyżowania w pętli helisy E-F 13. Kanał ten jest aktywowany na tej samej długości fali co ChR2, ale wymaga mniejszego natężenia światła do aktywacji, co czyni go bardziej czułym niż inne powszechnie używane kanały, w tym ChR2. Białko ChEF zostało połączone z białkiem czerwonej fluorescencji, tdTomato, co umożliwiło nam badanie przesiewowe ekspresji białka bez aktywacji kanału. Jako źródło światła użyliśmy lasera półprzewodnikowego (DPSS) pompowanego diodą sprzężonego z światłowodowym, aby dostarczyć precyzyjny, silny impuls niebieskiego światła do określonego obszaru larw. Pozwoliło nam to skupić światło laserowe na pojedynczych neuronach, eliminując potrzebę znajdowania rzadkich zwierząt transgenicznych wykazujących ekspresję kanału w pojedynczym neuronie. Korzystając z tego podejścia, byliśmy w stanie aktywować pojedyncze neurony RB, rejestrować reakcje behawioralne za pomocą szybkiej kamery wideo i obrazować aktywowane neurony w wysokiej rozdzielczości za pomocą mikroskopii konfokalnej.

<table><tbody><tr><td colspan="4"><mocny>Materiały</td></tr><tr><td>Szklana pipeta Pasteura</td><td>Fisher</td><td>1367820B</td><td>lub równoważna (średnica 10-15 mm)</td></tr><tr><td>200 &mu; m światłowód</td><td>ThorLabs</td><td>AFS200/220Y-CUSTOM</td><td>Patchcord Patchcord, Długość: 3 m, Koniec A: FC/PC, Koniec B: FC/PC, Kurtka: FT030</td></tr><tr><td>50 &mu; m światłowód</td><td>ThorLabs</td><td>AFS50/125Y-CUSTOM</td><td>Patchcord krosowy, Długość: 3 m, Koniec A: FC/PC, Koniec B: FC/PC, Kurtka: FT030</td></tr><tr><td>Regulowane narzędzie do zdejmowania izolacji</td><td>ThorLabs</td><td>AFS900</td><td>lub narzędzie do usuwania izolacji z trzema otworami (FTS4)</td></tr><tr><td>Diamentowy rysik klinowy</td><td>ThorLabs</td><td>S90W</td><td></td></tr><tr><td>Flaming/Brown Ściągacz do mikropipet</td><td>Sutter Instruments</td><td>P-97</td><td>lub odpowiednik</td></tr><tr><td>Szkło borokrzemianowe rurki z żarnikiem</td><td>Sutter Instruments</td><td>BF-100-78-10</td><td></td></tr><tr><td>Forma wtryskowa</td><td>nie</td><td>dotyczy</td><td>Rysunek 5</td></tr><tr><td>Probówki wirówkowe 1,5 ml</td><td>Dowolna</td><td>Dowolna</td><td></td></tr><tr><td>szalka Petriego (100x15 mm)</td><td>Dowolna</td><td>Dowolna</td><td></td></tr><tr><td>szalka Petriego (60x15 mm)</td><td>Dowolna</td><td>Dowolna</td><td></td></tr><tr><td>Wtryskiwacz ciśnieniowy</td><td>ASI</td><td>MPPI-3</td><td>lub równoważny</td></tr><tr><td>Mikromanipulator i metalowy stojak</td><td>Narashige</td><td>M152</td><td>lub odpowiednik</td></tr><tr><td>Jednorazowe plastikowe pipety</td><td>Fisherbrand</td><td>13-711-7</td><td>lub odpowiednik</td></tr><tr><td>Poker (uchwyt na szpilkę i szpilka na owady)</td><td>Fine Science Tools, Inc.</td><td>26018-17 i 26000-70</td><td>lub równoważne</td></tr><tr><td>Kleszcze</td><td>Fine Science Tools, Inc.</td><td>11255-20</td><td>lub równoważne</td></tr><tr><td>końcówki do pipet z mikroładowarką</td><td>Eppendorf</td><td>9300001007</td><td></td></tr><tr><td>28,5 &deg; C inkubator</td><td>dowolny</td><td></td><td></td></tr><tr><td>42 &deg; C blok grzewczy</td><td>Dowolne</td><td></td><td></td></tr><tr><td>niesterylne ostrza skalpela #11</td><td>Fine Scientific Tools, Inc.</td><td>10011-00</td><td>lub równoważny</td></tr><tr><td>Luneta preparcyjna</td><td>Zeiss</td><td>Stemi</td><td>lub równoważna</td></tr><tr><td>Luneta fluorescencyjna ze standardowym filtrem</td><td>Dowolna</td><td>dowolna</td><td>lub równoważna</td></tr><tr><td>Mikroskop konfokalny </td><td>Zeiss</td><td>LSM 510 lub 710</td><td>lub równoważny z laserami do GFP i RFP oraz obiektywy 10x, 20x i 40x </td></tr><tr><td>Kamera szybkotnąca</td><td>AOS Technologies, Inc.</td><td>X-PRI (130025-10)</td> <td>lub odpowiednik</td></tr><tr><td>przenośny laser 473 nm</td><td>Lasery kryształkowe</td><td>CL-473-050</td><td>lub o większej mocy, z opcją TTL</td></tr><tr><td>Stymulator S48</td><td>Astro-Med, Inc. Grass Instrument podział</td><td>S48K</td><td>lub równoważny</td></tr><tr><td>Tuleja współpracująca FC/PC do FC/PC</td><td>ThorLabs</td><td>ADAFC1</td><td>Może być konieczne do podłączenia optycznego</td></tr><tr><td>Laserowe okulary ochronne</td><td>ThorLabs</td><td>LG10</td><td>lub równoważne</td></tr><tr><td>24 płytki hodowlane</td><td>Genesee</td><td>25-102</td><td>lub odpowiednik</td></tr><tr><td>Pojedyncze szkiełka depresyjne</td><td>Fisher</td><td>S175201</td><td>Lub odpowiednik</td></tr><tr><td colspan="4">Odczynnik</td></tr><tr><td>Instant ocean</td><td>Ekosystemy wodne</td><td>IS50</td><td></td></tr><tr><td>Błękit metylenowy</td><td>Fisher</td><td>S71325</td><td></td></tr><tr><td>Czerwień fenolowa</td><td>Sigma</td><td>P4758</td><td></td></tr><tr><td>Agaroza</td><td>EMD</td><td>2125</td><td>lub równoważna</td></tr><tr><td>Agaroza niskotopliwa</td><td>Sigma</td><td>A9045</td><td>lub równoważna</td></tr><tr><td>PTU</td><td>Sigma</td><td>P7629</td><td></td></tr><tr><td>Trikaina</td><td>Sigma</td><td>A5040</td><td></td></tr><tr><td>niebieska/zarodek woda</td><td></td><td></td><td>10 L ddH2O 0,6 g Instant Ocean 6 kropli błękitu metylenowego</td></tr><tr><td>czerwieni fenolowej </td><td></td><td></td><td>(5 mg/ml w 0,2 M KCl)</td></tr><tr><td>100x PTU</td><td></td><td></td><td>0,150 g PTU 50 ml ddH2O rozpuścić w temperaturze 70 &deg; C, często wstrząsać podwielokrotność i przechowywać w temperaturze -20 &; C</td></tr><tr><td>1x PTU</td><td></td><td></td><td>1 ml 100x PTU 99 ml niebieski/rybna woda</td></tr><tr><td>Roztwór</td><td></td><td></td> podstawowy trikainy <td>400 mg trikainy 97,9 ddH2O</td></tr><tr><td>~2,1 ml 1M Tris, pH 9,0</td><td></td><td></td><td>dostosować pH do ~7,0 przechowywać w temperaturze 4 stopni; C lub -20 &deg; C do długotrwałego przechowywania</td></tr></tbody></table>

optogenetyczna aktywacja neuronów somatosensorycznych danio pręgowanego za pomocą chef-tdtomato

Optogenetic Activation of Zebrafish Somatosensory Neurons using ChEF-tdTomato

Larwy danio pręgowanego pojawiają się jako model do opisywania rozwoju i funkcji prostych obwodów neuronowych. Ze względu na ich zewnętrzne zapłodnienie, szybki rozwój i przezroczystość, danio pręgowany szczególnie dobrze nadaje się do podejść optogenetycznych do badania funkcji obwodów nerwowych. W tym podejściu światłoczułe kanały jonowe ulegają ekspresji w określonych neuronach, umożliwiając eksperymentatorowi ich aktywację lub hamowanie według własnego uznania, a tym samym ocenę ich wkładu w określone zachowania. Zastosowanie tych metod u larw danio pręgowanego jest koncepcyjnie proste, ale wymaga optymalizacji szczegółów technicznych. Tutaj pokazujemy procedurę ekspresji wariantu rodopsyny kanałowej w neuronach somatosensorycznych larw danio pręgowanego, fotoaktywując pojedyncze komórki i rejestrując wynikające z tego zachowania. Wprowadzając kilka modyfikacji do wcześniej ustalonych metod, podejście to może być wykorzystane do wywołania reakcji behawioralnych z pojedynczych neuronów aktywowanych do co najmniej 4 dni po zapłodnieniu (dpf). W szczególności stworzyliśmy transgen za pomocą wzmacniacza neuronów somatosensorycznych, CREST3, aby sterować ekspresją znakowanego wariantu rodopsyny kanałowej, ChEF-tdTomato. Wstrzyknięcie tego transgenu do zarodków w stadium 1-komórkowym powoduje mozaikową ekspresję w neuronach somatosensorycznych, którą można zobrazować za pomocą mikroskopii konfokalnej. Oświetlanie zidentyfikowanych komórek tych zwierząt światłem z lasera DPSS o długości fali 473 nm, prowadzonego przez światłowodowy, wywołuje zachowania, które można zarejestrować za pomocą szybkiej kamery wideo i przeanalizować ilościowo. Technika ta może być zaadaptowana do badania zachowań wywołanych przez aktywację dowolnego neuronu danio pręgowanego. Połączenie tego podejścia z perturbacjami genetycznymi lub farmakologicznymi będzie potężnym sposobem badania powstawania i funkcjonowania obwodów.

<img src="/files/ftp_upload/50184/50184fig1.jpg" alt="Schemat przekroju kabla światłowodowego, skala pęsety, układ mikroskopowy do inspekcji optycznej." data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Rysunek 1"> 
 Rysunek 1. Konfiguracja kabla światłowodowego. (A) Warstwy kabla światłowodowego. (B) Odizolowany kabel światłowodowy w pipecie Pasteura. (C) Kabel światłowodowy w pipecie Pasteura pozycjonowany za pomocą mikromanipulatora.
<p class="jove_content" fo:ke...

Techniki optogenetyczne umożliwiły badanie wpływu określonych neuronów na zachowanie. Opisujemy metodę u larw danio pręgowanego do aktywacji pojedynczych neuronów somatosensorycznych wyrażających wariant rodopsyny kanałowej (ChEF) za pomocą lasera na ciele stałym pompowanym diodą (DPSS) i rejestrowania wywołanych zachowań za pomocą szybkiej kamery wideo.

Optogenetyczna aktywacja neuronów somatosensorycznych danio pręgowanego za pomocą ChEF-tdTomato

Larval  zebrafish are emerging as a model for describing the development and function  of simple neural circuits. Due to their  external fertilization, ...

Ogólnym celem tej procedury jest aktywacja pojedynczych neuronów somatosensorycznych u larw danio pręgowanego. Osiąga się to poprzez przygotowanie optycznego i podłączenie go do niebieskiego lasera A-D-P-S-S. Drugim krokiem jest wstrzyknięcie transgenu do jednego lub dwóch zarodków w stadium komórkowym.Następnie przesiewa zarodki tłuszczowe wykazujące ekspresję pomidora C-H-E-F-T-D w neuronach somatosensorycznych i montują je w mózgu. Ostatnim krokiem jest dostarczenie krótkiego impulsu niebieskiego światła w celu aktywacji pojedynczego neuronu i zarejestrowania wynikowego zachowania. Główną zaletą tej techniki istniejących metod wykorzystujących opcję drugą korzenia kanału jest to, że podejście to można wykorzystać do wywołania reakcji behawioralnych z pojedynczych neuronów aktywowanych do co najmniej czterech dni po hospitalizacji.Chociaż metoda ta jest stosowana w celu uzyskania wglądu w funkcję specyficznych neuronów somatosensorycznych u larw danio pręgowanego. Podejście to można również zaadaptować do badania zachowań wywoływanych przez dowolną populację neuronów danio pręgowanego, takich jak neurony wewnętrzne lub neurony ruchowe. To genetyczne podejście może być wykorzystan

optogenetic-activation-zebrafish-somatosensory-neurons-using-chef

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Neuronauka

Optogenetyczna aktywacja neuronów somatosensorycznych rybki zebry za pomocą ChEF-tdTomato

W tym filmie przedstawiono techniki wielokolorowego konfokalnego obrazowania time-lapse oraz celowanej ablacji komórek. Obrazowanie time-lapse jest wykorzystywane do monitorowania zachowania wielu wybranych typów komórek in vivo. Celowana ablacja komórek ułatwia badanie funkcji obwodów neuronalnych oraz paradygmatów regeneracji neuronów specyficznych dla danej grupy komórek.

Wielokolorowe obrazowanie poklatkowe transgenicznych rybek zebrafish: wizualizacja komórek macierzystych siatkówki aktywowanych przez ukierunkowaną ablację komórek neuronalnych

Rozdzielczość czasowa i przestrzenna manipulacji genetycznych determinuje spektrum zjawisk biologicznych, na które mogą one oddziaływać. W niniejszej pracy wykorzystujemy dyskretną czasowo i przestrzennie elektroporację in vivo, w połączeniu z transgenicznymi liniami danio pręgowanego, aby indukować ekspresję transgenu GFP specyficznie w neuronach rozwijającej się opolśnij węchowej.

Targetowanie neuronów opłaty węchowej z wykorzystaniem połączonej elektroporacji in vivo oraz linii ryb danio-ostroskrzelnych typu enhancer trap opartych na Gal4

Ten film opisuje techniki optogenetyczne poprzez aktywację genetycznie zmodyfikowanych neuronów somatosensorycznych i rejestrowanie wywołanych reakcji behawioralnych za pomocą szybkiej kamery wideo.

Optogenetyka danio pręgowanego: aktywacja genetycznie zmodyfikowanego neuronu somatosensorycznego w celu zbadania reakcji behawioralnych larw

W tym filmie opisujemy test separacji faz, w którym wewnątrzkomórkowe białka zawierające wewnętrznie nieuporządkowane regiony połączone z światłoczułą domeną oligomeryzacji są indukowane przez ekspozycję na niebieskie światło, aby same się asocjować w pozbawione błony płynne kondensaty.

Test separacji faz białkowych: metoda optogenetyczna separacji faz zmutowanego białka wiążącego RNA w rdzeniowych neuronach ruchowych larw danio pręgowanego

Tutaj przedstawiamy proces korzystania z systemu TetON w celu osiągnięcia specyficznej tkankowo ekspresji genów w dorosłej regenerującej się płetwie ogonowej danio pręgowanego.

Wykorzystanie systemu TetON do badania mechanizmów molekularnych regeneracji danio pręgowanego

Tutaj pokazujemy proces tworzenia linii reportera napięcia elektrycznego komórkowego do wizualizacji rozwoju embrionalnego, ruchu i komórek nowotworowych ryb in vivo.

Wizualizacja komórkowej aktywności elektrycznej we wczesnych zarodkach i nowotworach danio pręgowanego

Optogenetyka to potężne narzędzie o szerokim zastosowaniu. Protokół ten pokazuje, w jaki sposób osiągnąć indukowaną światłem ekspresję genów w zarodkach danio pręgowanego przy użyciu reagującego na niebieskie światło systemu TAEL/C120.

Indukowana światłem ekspresja GFP w zarodkach danio pręgowanego przy użyciu optogenetycznego systemu TAEL/C120

Opisujemy protokół indukowania przejścia fazowego białka wiążącego DNA 43 (TDP-43) TAR przez światło w neuronach ruchowych rdzenia, używając danio pręgowanego jako modelu.

Optogenetyczne przejście fazowe TDP-43 w rdzeniowych neuronach ruchowych larw danio pręgowanego

Optogenetyczne manipulowanie szlakami sygnałowymi może być potężną strategią do zbadania, w jaki sposób sygnalizacja jest dekodowana w rozwoju, regeneracji, homeostazie i chorobie. Protokół ten zawiera praktyczne wskazówki dotyczące stosowania aktywatorów sygnalizacyjnych białka węzłowego i morfogennego kości (BMP) opartych na dziedzinie wykrywania światła i tlenu we wczesnym zarodku danio pręgowanego.

Aktywacja sygnalizacji optogenetycznej w zarodkach danio pręgowanego

Tutaj prezentujemy szczegółowy protokół badania aktywności neuronalnej w obszarach mózgu transgenicznego danio pręgowanego, które wyrażają wskaźniki wapnia GCaMP za pomocą mikroskopii konfokalnej.

In vivo (in vivo) Konfokalne obrazowanie fluorescencyjne aktywności neuronalnej wywołanej stymulacją sensoryczną u częściowo unieruchomionych larw danio pręgowanego

Poznaj metodę optogenetycznej aktywacji pojedynczych neuronów somatosensorycznych u larw Danio rerio za pomocą lasera niebieskiego. Technika umożliwia badanie zachowań wywołanych aktywacją neuronów.

Optogenetyczna aktywacja neuronów somatosensorycznych danio pręgowanego za pomocą ChEF-tdTomato

Przeglądaj więcej filmów