Izolacja i różnicowanie komórek naczyniowych zrębu do komórek beżowych/brite

Ogólnym celem tej procedury jest wyizolowanie pierwotnych adipocytów i wywołanie ich różnicowania w hodowli do komórek beżowych lub jasnych. Pierwszym krokiem jest wypreparowanie tkanki tłuszczowej od myszy. Następnie tkanka jest trawiona kolagenazą.

Po wyizolowaniu frakcji naczyniowej zrębu komórki są platerowane. Ostatnim krokiem jest wywołanie różnicowania komórek do komórek beżowych lub jasnych. Ostatecznie stosuje się metody analityczne, aby wykazać zwiększoną ekspresję genów specyficznych dla brązowych adipocytów.

Metoda ta może pomóc odpowiedzieć na kluczowe pytania dotyczące brunatnej tkanki tłuszczowej, czyli tego, jaki mechanizm molekularny reguluje rozwój jasnych komórek lub be. Implikacje tej techniki rozciągają się na leczenie otyłości i innych chorób cywilizacyjnych. Ponieważ manipulacja brunatną tkanką tłuszczową u ludzi może być stosowana jako potencjalna interwencja terapeutyczna, pierwszym krokiem jest przygotowanie pożywki trawiącej.

Następnie po eutanazji usuwa się tkankę tłuszczową. Najpierw wyizoluj brązową tkankę tłuszczową między łopatkami lub nietoperza, przecinając wzdłuż grzbietu zwierzęcia aż do szyi. Dwa płaty brązowej tkanki tłuszczowej znajdują się tuż pod skórą między ramionami.

Następnie ostrożnie usuń cienką warstwę białego tłuszczu pokrywającą nietoperza. Po wyizolowaniu umieść tkankę bezpośrednio w czystym PBS. Pachwinowa biała tkanka tłuszczowa lub wat znajduje się bezpośrednio pod skórą po obu stronach.

Rozciąga się do wewnętrznej strony ud i w dół w kierunku jąder. Usuń chusteczkę i umieść w czystym PBS. Poniższe kroki stosuje się zarówno do próbek nietoperzy, jak i próbek mokrych.

Szybko usuń wszelkie zanieczyszczenia, takie jak włosy, mięśnie szkieletowe i tkanka łączna z odcinków tkanki. Następnie szybko osusz chusteczkę na ręczniku papierowym, aby zapobiec rozcieńczeniu pożywki preparacyjnej PBS i umieść ją na suchej płytce. Dodaj pożywkę do trawienia i zmiel tkankę na małe kawałki.

Następnie przenieś tkankę do 50-mililitrowej probówki zawierającej resztę pożywki trawiącej. Umieść probówkę w inkubatorze o temperaturze 37 stopni Celsjusza ze stałym mieszaniem przez 40 do 50 minut w celu strawienia. Sprawdzaj co 10 do 15 minut, aby upewnić się, że trawienie przebiega prawidłowo i zapobiec nadmiernemu trawieniu.

Po tym, jak tkanka zostanie dobrze strawiona, przerwij trawienie. Dodając pięć mililitrów kompletnej pożywki i dobrze wymieszając, komórki powinny być prawie całkowicie jednorodne. Następnie odwirować próbkę o temperaturze 700 razy G przez 10 minut.

Frakcja naczyniowa zrębu powinna być teraz widoczna jako brązowawy granulek na dnie probówki, odessać oleistą warstwę dojrzałych adipocytów na górze i większość warstwy płynnej. Następnie rozpuść osad w 10 mililitrach, uzupełnij podłoże i dobrze wymieszaj. Po wymieszaniu umieść sitko komórkowe na nowej 50-mililitrowej probówce i przefiltruj zawiesinę komórek.

Przenieść przefiltrowaną zawiesinę komórkową do 15-mililitrowej probówki i odwirować przy 700 razy G przez 10 minut. Następnie odessać pożywkę i ponownie zawiesić osad. W 10 mililitrach kompletnego podłoża odpipetować i dobrze wymieszać, w razie potrzeby rozformować komórki.

Ogólnie rzecz biorąc, pięć myszy da dwie 10-centymetrowe płytki pachwinowej waty i jedną płytkę nietoperza. Jedna lub dwie godziny po poszyciu. Dwukrotnie zassać pożywkę z PBS i dodać świeżą pożywkę.

Ten krok jest ważny, ponieważ może usunąć czerwone krwinki, komórki odpornościowe i inne zanieczyszczenia. Podłoża konserwacyjne i indukcyjne są przygotowywane z wyprzedzeniem. Gdy pierwotne adipocyty osiągną konfluencję od 95 do 97%, zmień zwykłą kompletną pożywkę na pożywkę indukcyjną.

Po 48 godzinach zmienić pożywkę na pożywkę konserwacyjną zawierającą glitazon RO o stężeniu 0,5 mikromolowym. Po upływie dodatkowych 48 godzin należy zmienić na świeżą pożywkę konserwacyjną zawierającą jeden mikromolowy glitazon RO na dodatkowe dwa do trzech dni. Kropelki pojawią się około trzech do czterech dni po indukcji, jak pokazano tutaj, sześć do siedmiu dni po pierwszym dodaniu pożywki indukcyjnej.

Komórki powinny być w pełni zróżnicowane do dojrzałych komórek tłuszczowych i powinny być wypełnione kropelkami oleju. Komórki można teraz pobierać i wykorzystywać do dalszej analizy. Browning pierwotnych adipocytów można ocenić, mierząc mRNA genów specyficznych lub selektywnych dla brązowej tkanki tłuszczowej za pomocą Q-R-T-P-C-R, jak pokazano tutaj.

Glitazon RO, silnie indukowany UCP jedna ekspresja mRNA FORSKOLINA leczenie oznaczone tutaj jako cykliczne A MP. Dalsze zwiększanie ekspresji UCP indukowanej przez glitazon RO jest również możliwe. Cdia. Inny gen selektywny brunatnej tkanki tłuszczowej został również znacznie zwiększony w sposób zależny od dawki. Leczenie glitazonem RO zwiększyło również ekspresję FABP four i markera adipogennego zarówno dla tłuszczu brunatnego, jak i białego.

Ten efekt brązowienia nie był spowodowany po prostu wzmocnieniem adipogenezy jako takiej. Ponieważ indukcja UCP one i ekspresja CDIA była nadal znacząca, nawet jeśli poziomy mRNA zostały znormalizowane do poziomów FABP cztery, ten Western blot potwierdza zwiększony poziom białka UCP jeden. Po obejrzeniu tego filmu powinieneś dobrze zrozumieć, jak wyizolować preadipocyty i jak różnicować te komórki w beżowe lub jasne komórki w hodowli.