Name: Izolacja i różnicowanie komórek naczyniowych zrębu do komórek beżowych/brite (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-03-28T12:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 22 s
Description: Poznaj izolację i różnicowanie komórek naczyniowych zrębu do komórek beżowych/brite z tkanki tłuszczowej myszy. Ta metoda pozwala badać mechanizmy regulujące brązowienie adipocytów i ich znaczenie w terapii otyłości.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Dziękujemy Haruya Ohno, Kosaku Shinoda, Louisowi Sharpowi, Emi Tomoda i Lauren Ruiz za dyskusję, pomoc techniczną i redakcyjną nad rękopisem. Prace te były wspierane przez granty z NIH (DK087853), z Program for Breakthrough Biomedical Research oraz od Asubio Pharm Inc. dla S.K. U.L.A. były wspierane przez stypendia doktoranckie SHARE z Uniwersytetu w Kopenhadze oraz projekt UE 7PR DIABAT (HEALTH-F2-2011-278373) dla Lise Madsen i Karstena Kristiansena. Przyjmujemy również do wiadomości grant centrum DERC (NIH P30 DK063720).

1. Przygotuj pożywkę do trawienia
Zrób 5 ml na 5 myszy na tkankę (około 1 ml/1 g tkanki tłuszczowej).
<ol>
 <li>Ważenie enzymów trawiennych:
 -Collaginase D: 1,5 u/ml (1108874103, 1 g, Roche, 70334223)
 - Dispaza II: 2,4 u/ml (04942078001, 0,980 mg/lyo, Roche, 11466200)
 </li>
 <li>Dodać 25 ml PBS i dobrze wymieszać do rozpuszczenia</li>
 <li>Dodać CaCl2 tuż przed trawieniem tkanki w końcowym stężeniu 10 mM</li>
</ol>
2. Wypreparuj tkankę tłuszczową od myszy
<ol>
 <li>Sekcję należy przeprowadzić ostrożnie i natychmiast po uśmierceniu myszy (w wieku 6-8 tygodni). Pracuj sterylnie z etanolem spryskanym futro myszy przed jego otwarciem. Umieścić tkankę bezpośrednio w czystym PBS, oddzielić BAT międzyłopatkowy i podskórny pachwinowy WAT.</li>
 <li>W przypadku BAT międzyłopatkowego: umieść mysz tyłem do góry, rozciąć wzdłuż grzbietu i aż do szyi. Brązowa tkanka tłuszczowa znajduje się tuż pod skórą między ramionami (międzyłopatkowo). BAT można postrzegać jako dwa płaty w kształcie motyla. Należy ostrożnie usunąć cienką warstwę białego tłuszczu pokrywającą BAT.</li>
 <li>W przypadku podskórnego WAT (pachwinowego WAT): usunąć skórę. Pachwinowy WAT znajduje się bezpośrednio pod skórą po obu stronach, zaczynając prawie z tyłu i biegnąc wzdłuż, wewnątrz ud i w dół w kierunku jądra.</li>
</ol>
3. Cięcie i trawienie tkanki tłuszczowej
<ol>
 <li>Szybko usuń wszelkie zanieczyszczenia, takie jak włosy, mięśnie szkieletowe i tkanka łączna z odcinków tkanki.</li>
 <li>Szybko wysuszyć chusteczkę na papierze, aby nie rozcieńczać podłoża preparacyjnego PBS i umieścić go na suchej płytce.</li>
 <li>Dodaj pożywkę do wytrawiania (dodano CaCl2 przed trawieniem) i zmiel tkankę na małe kawałki. Bardzo dobrze wymieszać, pipetując w górę i w dół za pomocą pipety o pojemności 5 ml. Przenieś zmielone tkanki do probówek o pojemności 50 ml z resztą pożywki wytrawiającej, wymieszaj jeszcze więcej, pipetując w górę i w dół.</li>
 <li>Trawić w temperaturze 37 °C przy stałym mieszaniu przy 150 obr./min przez 40-50 min. Sprawdzaj co 10-15 minut, aby upewnić się, że trawienie przebiega prawidłowo i zapobiec nadmiernemu trawieniu.</li>
</ol>
Uwaga: Prawidłowe trawienie podłoża i czas są ważne. Tkanka musi być dobrze strawiona, ale nadmierne trawienie może uszkodzić komórki.
4. Zawieszenie komory filtra
<ol>
 <li>Zatrzymaj trawienie, dodając 5 ml kompletnej pożywki (DMEM/F12 zawierającej 10% FPS i P/S). Komórki powinny być prawie całkowicie jednorodne. Dobrze wymieszać przez pipetowanie.</li>
 <li>Wirować przy 700 x g przez 10 min.</li>
 <li>SVF może być teraz widziany jako brązowawy granul na dnie tuby. Odessać tłustą, dojrzałą warstwę adipocytów na wierzchu i większość warstwy płynu - zachować osad i rozpuścić go w 10 ml kompletnego podłoża. Dobrze wymieszaj.</li>
 <li>Umieścić sitko (o średnicy 50-70 μm) na nowej probówce o pojemności 50 ml i przefiltrować zawiesinę komórek.</li>
</ol>
5. Komórki płytkowe 
<ol>
 <li>Przenieść zawiesinę komórek do probówki o pojemności 15 ml i odwirować przy 700 x g przez 10 minut.</li>
 <li>Odessać pożywkę i ponownie zawiesić osad w 10 ml kompletnej pożywki. Odpipetować i dobrze wymieszać.</li>
 <li>Oszacuj, ile talerzy jest potrzebnych. Może się to różnić i zależy od wielkości granulki. Ogólna zasada to 2 z 10 cm płytki od 5 myszy w przypadku pachwinowego WAT i jedna 10 cm płytki w przypadku BAT.</li>
 <li>Komórki płytki na naczyniach pokrytych kolagenem (R&D) w kompletnym podłożu</li>
 <li>1-2 godziny po posianiu komórek odessać pożywkę, dwukrotnie przemyć PBS i dodać świeżą pożywkę. Ten krok jest ważny, ponieważ może usunąć czerwone krwinki, komórki odpornościowe i inne zanieczyszczenia.</li>
</ol>
6. Różnicowanie komórek
<ol>
 <li>Wykonaj media konserwacyjne i indukcyjne.</li>
</ol>
Medium konserwacyjne
Kompletny nośnik z dodanymi: 
Insulina, końcowe stężenie 5 μg/ml (5 mg/ml bulionu, ***100 μl kwasu octowego w 10 ml H2O do przygotowania zakwaszonej wody o pH 2,5. Rozpuść insulinę w zakwaszonej wodzie. Przechowywać zapasy w temperaturze -20 °C)
3,3',5-Triiodo-L-tyronina (T3), końcowe stężenie 1 nM (10 μM zapas, ***rozpuść T3 w 1N NaOH i dodaj pożywkę, aby uzyskać 10 μM zapasu. Sigma cat# T-2877)
Przechowywać w temperaturze 4 °C, dobre przez tydzień.
Medium indukcyjne
Podłoże konserwacyjne zawierające następujące związki:
Indomethacin, końcowe stężenie 125 μM (0,125 M zapas etanolu, Sigma cat#I-7378). Indometacyna musi zostać podgrzana do temperatury 60 °C w celu rozpuszczenia.
Deksametazon, stężenie końcowe 2 μg/ml (2 mg/ml skarpeta w etanolu, Sigma cat# D-1756) 3-Izobutylo-1-metyloksantyna (IBMX), stężenie końcowe. 0,5 mM (0,25 mM zapas w DMSO, Sigma cat# I-5879) Rozyglitazon, stężenie końcowe 0,5 μM (10 mM zapas w DMSO, Sigma cat# R-2408)
Uwaga: Za każdym razem przygotuj nową pożywkę indukcyjną.
<ol start="2">
 <li>Hoduj pierwotne adipocyty do 95-97% konfluencji w kompletnym podłożu (zlewającym się, ale niezbyt upakowanym)</li>
 <li>Zamień zwykłą pożywkę kompletną na pożywkę indukcyjną (dzień 0)</li>
 <li>Po 48 godzinach (dzień 2) zmienić pożywkę na pożywkę podtrzymującą z rozyglitazonem (0,5 μM)</li>
 <li>Po dodatkowych 48 godzinach (dzień 4) zmień pożywkę na świeżą pożywkę podtrzymującą z rozyglitazonem (1 μM) przez dodatkowe 2-3 dni. 6-7 dni po dodaniu pożywki indukcyjnej komórki są w pełni zróżnicowane do dojrzałych komórek tłuszczowych i są wypełnione kropelkami oleju. Kropelki pojawią się około 3-4 dni po indukcji.</li>
</ol>
Uwaga: Zmieniaj podłoże co 2-3 dni, aż komórki w pełni się zróżnicują.
Komórki mogą być teraz pobierane, a ekspresja mRNA Ucp1 i innych genów specyficznych dla brązowych adipocytów może być mierzona za pomocą qRT-PCR. Western blot zostanie użyty do wykrywania białek.

<ol><li>Barness, L. A., Opitz, J. M., Gilbert-Barness, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Obesity%3A+genetic%2C+molecular%2C+and+environmental+aspects%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Medical+Genetics.+Part+A%22%5BJournal%5D)">Obesity: genetic, molecular, and environmental aspects.</a> American Journal of Medical Genetics. Part A. 143A, 3016-3034 (2007).</li>
<li>Rothwell, N. J., Stock, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Combined+effects+of+cafeteria+and+tube-feeding+on+energy+balance+in+the+rat%5BTitle%5D)+AND+%22The+Proceedings+of+the+Nutrition+Society%22%5BJournal%5D)">Combined effects of cafeteria and tube-feeding on energy balance in the rat.</a> The Proceedings of the Nutrition Society. 38, 5A(1979).</li>
<li>Cannon, B., Nedergaard, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Brown+adipose+tissue%3A+function+and+physiological+significance%5BTitle%5D)+AND+%22Physiological+Reviews%22%5BJournal%5D)">Brown adipose tissue: function and physiological significance.</a> Physiological Reviews. 84, 277-359 (2004).</li>
<li>Cypess, A. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+and+importance+of+brown+adipose+tissue+in+adult+humans%5BTitle%5D)+AND+%22The+New+England+Journal+of+Medicine%22%5BJournal%5D)">Identification and importance of brown adipose tissue in adult humans.</a> The New England Journal of Medicine. 360, 1509-1517 (2009).</li>
<li>van Marken Lichtenbelt, W. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cold-activated+brown+adipose+tissue+in+healthy+men%5BTitle%5D)+AND+%22The+New+England+Journal+of+Medicine%22%5BJournal%5D)">Cold-activated brown adipose tissue in healthy men.</a> The New England Journal of Medicine. 360, 1500-1508 (2009).</li>
<li>Virtanen, K. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functional+brown+adipose+tissue+in+healthy+adults%5BTitle%5D)+AND+%22The+New+England+Journal+of+Medicine%22%5BJournal%5D)">Functional brown adipose tissue in healthy adults.</a> The New England Journal of Medicine. 360, 1518-1525 (2009).</li>
<li>Zingaretti, M. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+presence+of+UCP1+demonstrates+that+metabolically+active+adipose+tissue+in+the+neck+of+adult+humans+truly+represents+brown+adipose+tissue%5BTitle%5D)+AND+%22FASEB+Journal%3A+Official+Publication+of+the+Federation+of+American+Societies+for+Experimental+Biology%22%5BJournal%5D)">The presence of UCP1 demonstrates that metabolically active adipose tissue in the neck of adult humans truly represents brown adipose tissue.</a> FASEB Journal: Official Publication of the Federation of American Societies for Experimental Biology. 23, 3113-3120 (2009).</li>
<li>Saito, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High+incidence+of+metabolically+active+brown+adipose+tissue+in+healthy+adult+humans%3A+effects+of+cold+exposure+and+adiposity%5BTitle%5D)+AND+%22Diabetes%22%5BJournal%5D)">High incidence of metabolically active brown adipose tissue in healthy adult humans: effects of cold exposure and adiposity.</a> Diabetes. 58, 1526-1531 (2009).</li>
<li>Seale, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((PRDM16+controls+a+brown+fat%2Fskeletal+muscle+switch%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">PRDM16 controls a brown fat/skeletal muscle switch.</a> Nature. 454, 961-967 (2008).</li>
<li>Petrovic, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chronic+peroxisome+proliferator-activated+receptor+gamma+%28PPARgamma%29+activation+of+epididymally+derived+white+adipocyte+cultures+reveals+a+population+of+thermogenically+competent%2C+UCP1-containing+adipocytes+molecularly+distinct+from+classic+brown+adipocytes%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Chronic peroxisome proliferator-activated receptor gamma (PPARgamma) activation of epididymally derived white adipocyte cultures reveals a population of thermogenically competent, UCP1-containing adipocytes molecularly distinct from classic brown adipocytes.</a> The Journal of Biological Chemistry. 285, 7153-7164 (2010).</li>
<li>Coulter, A. A., Bearden, C. M., Liu, X., Koza, R. A., Kozak, L. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dietary+fat+interacts+with+QTLs+controlling+induction+of+Pgc-1+alpha+and+Ucp1+during+conversion+of+white+to+brown+fat%5BTitle%5D)+AND+%22Physiological+Genomics%22%5BJournal%5D)">Dietary fat interacts with QTLs controlling induction of Pgc-1 alpha and Ucp1 during conversion of white to brown fat.</a> Physiological Genomics. 14, 139-147 (2003).</li>
<li>Klingenspor, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cold-induced+recruitment+of+brown+adipose+tissue+thermogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Experimental+Physiology%22%5BJournal%5D)">Cold-induced recruitment of brown adipose tissue thermogenesis.</a> Experimental Physiology. 88, 141-148 (2003).</li>
<li>Cinti, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+adipose+organ%5BTitle%5D)+AND+%22Prostaglandins%2C+leukotrienes%2C+and+essential+fatty+acids%22%5BJournal%5D)">The adipose organ.</a> Prostaglandins, leukotrienes, and essential fatty acids. 73, 9-15 (1016).</li>
<li>Ghorbani, M., Himms-Hagen, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Appearance+of+brown+adipocytes+in+white+adipose+tissue+during+CL+316%2C243-induced+reversal+of+obesity+and+diabetes+in+Zucker+fa%2Ffa+rats%5BTitle%5D)+AND+%22International+Journal+of+Obesity+and+Related+Metabolic+Disorders%3A+Journal+of+the+International+Association+for+the+Study+of+Obesity%22%5BJournal%5D)">Appearance of brown adipocytes in white adipose tissue during CL 316,243-induced reversal of obesity and diabetes in Zucker fa/fa rats.</a> International Journal of Obesity and Related Metabolic Disorders: Journal of the International Association for the Study of Obesity. 21, 465-475 (1997).</li>
<li>Hansen, J. B., Kristiansen, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulatory+circuits+controlling+white+versus+brown+adipocyte+differentiation%5BTitle%5D)+AND+%22The+Biochemical+Journal%22%5BJournal%5D)">Regulatory circuits controlling white versus brown adipocyte differentiation.</a> The Biochemical Journal. 398, 153-168 (2006).</li>
<li>Ohno, H., Shinoda, K., Spiegelman, B. M., Kajimura, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((PPARy+agonists+induce+a+white-to-brown+fat+conversion+through+stabilization+of+PRDM16+protein%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+metabolism%22%5BJournal%5D)">PPARy agonists induce a white-to-brown fat conversion through stabilization of PRDM16 protein.</a> Cell metabolism. 15, 395-404 (2012).</li>
<li>Lee, Y. H., Petkova, A. P., Mottillo, E. P., Granneman, J. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+identification+of+bipotential+adipocyte+progenitors+recruited+by+beta3-adrenoceptor+activation+and+high-fat+feeding%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Metabolism%22%5BJournal%5D)">In vivo identification of bipotential adipocyte progenitors recruited by beta3-adrenoceptor activation and high-fat feeding.</a> Cell Metabolism. 15, 480-491 (2012).</li>
<li>Cinti, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transdifferentiation+properties+of+adipocytes+in+the+adipose+organ%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Physiology.+Endocrinology+and+Metabolism%22%5BJournal%5D)">Transdifferentiation properties of adipocytes in the adipose organ.</a> American Journal of Physiology. Endocrinology and Metabolism. 297, E977-E986 (2009).</li>
<li>Barbatelli, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+emergence+of+cold-induced+brown+adipocytes+in+mouse+white+fat+depots+is+determined+predominantly+by+white+to+brown+adipocyte+transdifferentiation%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Physiology.+Endocrinology+and+Metabolism%22%5BJournal%5D)">The emergence of cold-induced brown adipocytes in mouse white fat depots is determined predominantly by white to brown adipocyte transdifferentiation.</a> American Journal of Physiology. Endocrinology and Metabolism. 298, E1244-E1253 (2010).</li>
<li>Petrovic, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chronic+peroxisome+proliferator-activated+receptor+gamma+%28PPARgamma%29+activation+of+epididymally+derived+white+adipocyte+cultures+reveals+a+population+of+thermogenically+competent%2C+UCP1-containing+adipocytes+molecularly+distinct+from+classic+brown+adipocytes%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Chronic peroxisome proliferator-activated receptor gamma (PPARgamma) activation of epididymally derived white adipocyte cultures reveals a population of thermogenically competent, UCP1-containing adipocytes molecularly distinct from classic brown adipocytes.</a> The Journal of Biological Chemistry. 285, 7153-7164 (2009).</li>
<li>Rong, J. X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Adipose+mitochondrial+biogenesis+is+suppressed+in+db%2Fdb+and+high-fat+diet-fed+mice+and+improved+by+rosiglitazone%5BTitle%5D)+AND+%22Diabetes%22%5BJournal%5D)">Adipose mitochondrial biogenesis is suppressed in db/db and high-fat diet-fed mice and improved by rosiglitazone.</a> Diabetes. 56, 1751-1760 (2007).</li>
<li>Wilson-Fritch, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mitochondrial+remodeling+in+adipose+tissue+associated+with+obesity+and+treatment+with+rosiglitazone%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Clinical+Investigation%22%5BJournal%5D)">Mitochondrial remodeling in adipose tissue associated with obesity and treatment with rosiglitazone.</a> The Journal of Clinical Investigation. 114, 1281-1289 (2004).</li>
<li>Sell, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Peroxisome+proliferator-activated+receptor+gamma+agonism+increases+the+capacity+for+sympathetically+mediated+thermogenesis+in+lean+and+ob%2Fob+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Endocrinology%22%5BJournal%5D)">Peroxisome proliferator-activated receptor gamma agonism increases the capacity for sympathetically mediated thermogenesis in lean and ob/ob mice.</a> Endocrinology. 145, 3925-3934 (2004).</li>
<li>Fukui, Y., Masui, S., Osada, S., Umesono, K., Motojima, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+new+thiazolidinedione%2C+NC-2100%2C+which+is+a+weak+PPAR-gamma+activator%2C+exhibits+potent+antidiabetic+effects+and+induces+uncoupling+protein+1+in+white+adipose+tissue+of+KKAy+obese+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Diabetes%22%5BJournal%5D)">A new thiazolidinedione, NC-2100, which is a weak PPAR-gamma activator, exhibits potent antidiabetic effects and induces uncoupling protein 1 in white adipose tissue of KKAy obese mice.</a> Diabetes. 49, 759-767 (2000).</li>
<li>Vernochet, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((C%2FEBPalpha+and+the+corepressors+CtBP1+and+CtBP2+regulate+repression+of+select+visceral+white+adipose+genes+during+induction+of+the+brown+phenotype+in+white+adipocytes+by+peroxisome+proliferator-activated+receptor+gamma+agonists%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+and+Cellular+Biology%22%5BJournal%5D)">C/EBPalpha and the corepressors CtBP1 and CtBP2 regulate repression of select visceral white adipose genes during induction of the brown phenotype in white adipocytes by peroxisome proliferator-activated receptor gamma agonists.</a> Molecular and Cellular Biology. 29, 4714-4728 (2009).</li>
<li>Tai, T. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Activation+of+the+nuclear+receptor+peroxisome+proliferator-activated+receptor+gamma+promotes+brown+adipocyte+differentiation%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Activation of the nuclear receptor peroxisome proliferator-activated receptor gamma promotes brown adipocyte differentiation.</a> The Journal of Biological Chemistry. 271, 29909-29914 (1996).</li>
<li>Sugii, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((PPARgamma+activation+in+adipocytes+is+sufficient+for+systemic+insulin+sensitization%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">PPARgamma activation in adipocytes is sufficient for systemic insulin sensitization.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 106, 22504-22509 (2009).</li>
</ol>

Autorzy oświadczają, że nie mają konkurencyjnych interesów finansowych.

Tutaj przedstawiamy niezawodny system komórkowy do badania rozwoju komórek beżowo-brite w pierwotnych adipocytach hodowanych u myszy. W porównaniu z kilkoma dostępnymi nieśmiertelnymi liniami komórkowymi, system ten prawdopodobnie będzie miał większe znaczenie dla brązowienia białego tłuszczu in vivo.
Mimo że badanie tych pierwotnych adipocytów oferuje pewne korzyści, istnieją również pewne ograniczenia i obawy, które należy wziąć pod uwagę. Po pierwsze, system ten jest w dużym stopni...

Otyłość dramatycznie wzrasta na całym świecie i jest obecnie uważana za jeden z najpoważniejszych problemów zdrowia publicznego 1. Stan ten jest związany z nierównowagą w poborze energii w stosunku do wydatku i powoduje nadmiar energii zmagazynowanej w postaci lipidów w białej tkance tłuszczowej (WAT). Powiększenie WAT wiąże się ze wzrostem masy i masy ciała, natomiast brunatna tkanka tłuszczowa ma zdolność do rozpraszania nadmiaru energii w celu wytworzenia ciepła. W związku z tym BAT może funkcjonować jako ochrona zarówno przed przeziębieniem, jak i otyłością 2,3 . Osiąga się to poprzez rozprzęgnięcie transportu elektronów w mitochondriach przez rozprzęganie białka 1 (UCP1). Białko to jest uważane za znak rozpoznawczy termogenezy bez dreszczy w BAT3. Kilka badań przeprowadzonych w ostatnich latach wykazało, że dorośli ludzie mają funkcjonalny BAT 4-8, w związku z czym manipulowanie BAT u ludzi może być potencjalną interwencją terapeutyczną w walce z otyłością i chorobami z nią związanymi.
Obecne dowody wskazują, że u gryzoni istnieją dwa rodzaje brązowych adipocytów; "Klasyczny" lub "istniejący" brązowy tłuszcz rozwija się w fazie prenatalnej i tworzy dedykowane brązowe magazyny tłuszczowe w okolicy międzyłopatkowej i innych tkankach obwodowych. Z drugiej strony, "indukowalna" forma brunatnego tłuszczu (tzw. brite lub beżowe komórki) rozwija się w okresie poporodowym i pojawia się przeplatana w białych tkankach tłuszczowych. Te dwa typy brązowych adipocytów są również oddzielone różnym pochodzeniem rozwojowym. Podczas gdy istniejące wcześniej brązowe adipocyty powstają z mioblastycznych prekursorów Myf5, indukowalne komórki brite / beżowe przeplatane WAT powstają z linii innej niż Myf5 9,10 . Ponadto szlaki regulacyjne tego typu komórek prawdopodobnie różnią się od brązowych adipocytów pochodzących z Myf5 11. Rozwój beżowych komórek (tj. "brązowienie" białego tłuszczu) może być aktywowany w odpowiedzi na przewlekłą ekspozycję na zimno i na agonistów receptorów β3-adrenergicznych lub PPARγ agonistów u dorosłychw wieku 12-14 lat. Komórki beżowo-brite mogą być obiecującym celem terapeutycznym do manipulowania ogólnym bilansem energetycznym i mogą potencjalnie stać się częścią leczenia otyłości; Dlatego ważne jest, aby zrozumieć precyzyjne mechanizmy molekularne i szlaki sygnałowe, za pomocą których sygnały środowiskowe kontrolują rozwój beżowych komórek.
Aby zrozumieć molekularną kontrolę brązowienia białego tłuszczu, najlepiej nadają się eksperymenty in vitro, ponieważ różnicowanie preadipocytów odbywa się raczej asynchronicznie i trudno jest wykryć komórki in situ 15. Chociaż badania nad rozwojem adipocytów były do tej pory prowadzone głównie na liniach komórkowych, takich jak 3T3-L1, 3T3-F442A lub HIB1, wydaje się, że te linie komórkowe nie mają sygnatury molekularnej komórek beżowych. Z drugiej strony, pierwotne adipocyty wyizolowane z podskórnego WAT najprawdopodobniej podsumowują proces brązowienia białej tkanki tłuszczowej w sposób autonomiczny dla komórek. W tym miejscu przedstawiamy protokół skutecznej izolacji frakcji zrębowo-naczyniowej z tkanki tłuszczowej oraz indukowania brązowienia białej tkanki tłuszczowej w odpowiedzi na PPARγ agonistów. Wykazano, że rozyglitazon jest szczególnie skutecznym mediatorem brązowienia w tych komórkach. Jak wcześniej sugerowano 16, ten system komórkowy może być używany do służenia niezawodnemu systemowi komórkowemu do badania rozwoju komórek beżowych / brite.

<table><tbody><tr><td colspan="4"><silny>odczynnik</td></tr><tr><td>Collaginase D</td><td>Roche</td><td>11088874103</td><td></td></tr><tr><td>Dispase II</td><td>Roche</td><td>04942078001</td><td></td></tr><tr><td>CaCl2</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>DMEM medium</td><td>Fisher</td><td>10017-CV</td><td>Z 2,5 g/l glukozy i L-glutamina bez pirogronianu sodu </td></tr><tr><td>Insulina</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>T3 (3,3',5-Triiodo-L-tyronina) </td><td>Sigma</td><td>T-2877</td><td></td></tr><tr><td>Indometacyna </td><td>Sigma</td><td>I-7378</td><td></td></tr><tr><td>Deksametazon </td><td>Sigma</td><td>D-1756</td><td></td></tr><tr><td>IBMX </td><td>Sigma</td><td>I-5879</td><td></td></tr><tr><td>Rozyglitazon </td><td>Sigma</td><td>R-2408</td><td></td></tr><tr><td colspan="4">Equipment</td></tr><tr><td>Naczynia pokryte kolagenem</td><td>BD</td><td>354450</td><td>talerze 10 cm</td></tr><tr><td> 70 &mu; m filtr </td><td>BD Falcon</td><td>352350</td><td>Sitko do komórek, 70 &mu; M Nylon 1/SZT.</td></tr></tbody></table>

izolacja i różnicowanie komórek naczyniowych zrębu do komórek beżowych/brite

Isolation and Differentiation of Stromal Vascular Cells to Beige/Brite Cells

Brązowe adipocyty mają zdolność do rozprzęgania łańcucha oddechowego w mitochondriach i rozpraszania energii chemicznej w postaci ciepła. Rozwój brązowych adipocytów UCP1-dodatnich w białych tkankach tłuszczowych (tzw. komórkach beżowych lub brite) jest silnie indukowany przez różne sygnały środowiskowe, takie jak przewlekła ekspozycja na zimno lub agoniści PPARγ, dlatego ten typ komórek ma potencjał jako cel terapeutyczny w leczeniu otyłości. Chociaż większość unieśmiertelnionych linii adipocytów nie może podsumować procesu "brązowienia" białego tłuszczu w hodowli, pierwotne adipocyty wyizolowane z frakcji naczyniowej zrębu w podskórnej białej tkance tłuszczowej (WAT) zapewniają niezawodny system komórkowy do badania molekularnej kontroli rozwoju komórek beżowo-brite. W tym miejscu opisujemy protokół skutecznej izolacji pierwotnych preadipocytów i indukowania różnicowania do komórek beżowo-britych w hodowli. Efekt brązowienia można ocenić na podstawie ekspresji markerów selektywnych dla brązowej tkanki tłuszczowej, takich jak UCP1.

Proces brązowienia pierwotnych adipocytów można ocenić poprzez pomiar ekspresji mRNA Ucp1 oraz innych genów specyficznych lub selektywnych dla tkanki tłuszczowej brunatnej za pomocą qRT-PCR. Na Rysunku 1 przedstawiono dane dotyczące ekspresji genów w pierwotnych adipocytach pochodzących z pachwinowej tkanki tłuszczowej białej (WAT). Komórki indukowano do różnicowania w obecności dwóch różnych dawek roziglitazonu, odpowiednio 50 nM i 500 nM. Podzbiór komórek traktowano forskoliną w stężeniu 10 μM...

Pierwotne białe preadipocyty wyizolowane z białych tkanek tłuszczowych u myszy mogą być różnicowane na komórki beżowe/brite. Przedstawiono niezawodny system modelu komórkowego do badania molekularnej regulacji "brązowienia" białego tłuszczu.

Izolacja i różnicowanie komórek naczyniowych zrębu do komórek beżowych/brite

Brown adipocytes have the ability to uncouple the  respiratory chain in mitochondria and dissipate chemical energy as heat.  Development of UCP1-positive ...

Ogólnym celem tej procedury jest wyizolowanie pierwotnych adipocytów i wywołanie ich różnicowania w hodowli do komórek beżowych lub jasnych. Pierwszym krokiem jest wypreparowanie tkanki tłuszczowej od myszy. Następnie tkanka jest trawiona kolagenazą.Po wyizolowaniu frakcji naczyniowej zrębu komórki są platerowane. Ostatnim krokiem jest wywołanie różnicowania komórek do komórek beżowych lub jasnych. Ostatecznie stosuje się metody analityczne, aby wykazać zwiększoną ekspresję genów specyficznych dla brązowych adipocytów.Metoda ta może pomóc odpowiedzieć na kluczowe pytania dotyczące brunatnej tkanki tłuszczowej, czyli tego, jaki mechanizm molekularny reguluje rozwój jasnych komórek lub be. Implikacje tej techniki rozciągają się na leczenie otyłości i innych chorób cywilizacyjnych. Ponieważ manipulacja brunatną tkanką tłuszczową u ludzi może być stosowana jako potencjalna interwencja terapeutyczna, pierwszym krokiem jest przygotowanie pożywki trawiącej.Następnie po eutanazji usuwa się tkankę tłuszczową. Najpierw wyizoluj brązową tkankę tłuszczową między łopatkami lub nietoperza, przecinając wzdłuż grzbietu zwierzęcia aż do szyi. Dwa płaty brązowej tkanki tłuszczowej znajdują się tuż pod skórą między ramionami.Następnie ostrożnie usuń cienką warstwę białego tłuszczu pokrywającą nietoperza. Po wyizolowaniu umieść tkankę bezpośrednio w czystym PBS. Pachwinowa biała tkanka tłuszczowa lub wat znajduje się bezpośrednio pod skórą po obu stronach.Rozciąga się do wewnętrznej strony ud i w dół w kierunku jąder. Usuń chusteczkę i umieść w czystym PBS. Poniższe kroki stosuje się zarówno do próbek nietoperzy, jak i próbek mokrych.Szybko usuń wszelkie zanieczyszczenia, takie jak włosy, mięśnie szkieletowe i tkanka łączna z odcinków tkanki. Następnie szybko osusz chusteczkę na ręczniku papierowym, aby zapobiec rozcieńczeniu pożywki preparacyjnej PBS i umieść ją na suchej płytce. Dodaj pożywkę do trawienia i zmiel tkankę na małe kawałki.Następnie przenieś tkankę do 50-mililitrowej probówki zawierającej resztę pożywki trawiącej. Umieść probówkę w inkubatorze o temperaturze 37 stopni Celsjusza ze stałym mieszaniem przez 40 do 50 minut w celu strawienia. Sprawdzaj co 10 do 15 minut, aby upewnić się, że trawienie przebiega prawidłowo i zapobiec nadmiernemu trawieniu.Po tym, jak tkanka zostanie dobrze strawiona, przerwij trawienie. Dodając pięć mililitrów kompletnej pożywki i dobrze wymieszając, komórki powinny być prawie całkowicie jednorodne. Następnie odwirować próbkę o temperaturze 700 razy G przez 10 minut.Frakcja naczyniowa zrębu powinna być teraz widoczna jako brązowawy granulek na dnie probówki, odessać oleistą warstwę dojrzałych adipocytów na górze i większość warstwy płynnej. Następnie rozpuść osad w 10 mililitrach, uzupełnij podłoże i dobrze wymieszaj. Po wymieszaniu umieść sitko komórkowe na nowej 50-mililitrowej probówce i przefiltruj zawiesinę komórek.Przenieść przefiltrowaną zawiesinę komórkową do 15-mililitrowej probówki i odwirować przy 700 razy G przez 10 minut. Następnie odessać pożywkę i ponownie zawiesić osad. W 10 mililitrach kompletnego podłoża odpipetować i dobrze wymieszać, w razie potrzeby rozformować komórki.Ogólnie rzecz biorąc, pięć myszy da dwie 10-centymetrowe płytki pachwinowej waty i jedną płytkę nietoperza. Jedna lub dwie godziny po poszyciu. Dwukrotnie zassać pożywkę z PBS i dodać świeżą pożywkę.Ten krok jest ważny, ponieważ może usunąć czerwone krwinki, komórki odpornościowe i inne zanieczyszczenia. Podłoża konserwacyjne i indukcyjne są przygotowywane z wyprzedzeniem. Gdy pierwotne adipocyty osiągną konfluencję od 95 do 97%, zmień zwykłą kompletną pożywkę na pożywkę indukcyjną.Po 48 godzinach zmienić pożywkę na pożywkę konserwacyjną zawierającą glitazon RO o stężeniu 0,5 mikromolowym. Po upływie dodatkowych 48 godzin należy zmienić na świeżą pożywkę konserwacyjną zawierającą jeden mikromolowy glitazon RO na dodatkowe dwa do trzech dni. Kropelki pojawią się około trzech do czterech dni po indukcji, jak pokazano tutaj, sześć do siedmiu dni po pierwszym dodaniu pożywki indukcyjnej.Komórki powinny być w pełni zróżnicowane do dojrzałych komórek tłuszczowych i powinny być wypełnione kropelkami oleju. Komórki można teraz pobierać i wykorzystywać do dalszej analizy. Browning pierwotnych adipocytów można ocenić, mierząc mRNA genów specyficznych lub selektywnych dla brązowej tkanki tłuszczowej za pomocą Q-R-T-P-C-R, jak pokazano tutaj.Glitazon RO, silnie indukowany UCP jedna ekspresja mRNA FORSKOLINA leczenie oznaczone tutaj jako cykliczne A MP. Dalsze zwiększanie ekspresji UCP indukowanej przez glitazon RO jest również możliwe. Cdia. Inny gen selektywny brunatnej tkanki tłuszczowej został również znacznie zwiększony w sposób zależny od dawki. Leczenie glitazonem RO zwiększyło również ekspresję FABP four i markera adipogennego zarówno dla tłuszczu brunatnego, jak i białego.Ten efekt brązowienia nie był spowodowany po prostu wzmocnieniem adipogenezy jako takiej. Ponieważ indukcja UCP one i ekspresja CDIA była nadal znacząca, nawet jeśli poziomy mRNA zostały znormalizowane do poziomów FABP cztery, ten Western blot potwierdza zwiększony poziom białka UCP jeden. Po obejrzeniu tego filmu powinieneś dobrze zrozumieć, jak wyizolować preadipocyty i jak różnicować te komórki w beżowe lub jasne komórki w hodowli.

isolation-differentiation-stromal-vascular-cells-to-beigebrite

Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

Izolacja i różnicowanie komórek naczyniowych ścięgna do komórek beżowych/brązowych

W 2001 roku naukowcy z UCLA opisali izolację populacji dorosłych komórek macierzystych, określanych jako komórki macierzyste pochodzące z tkanki tłuszczowej lub ASC. W tym artykule przedstawiono izolację ASC z lipoaspiratów przy użyciu ręcznego, enzymatycznego protokołu trawienia z użyciem kolagenazy.

Ręczna izolacja komórek macierzystych pochodzących z tkanki tłuszczowej z ludzkich lipoaspiratów

Naczynia krwionośne w ludzkich mięśniach szkieletowych zawierają kilka wieloliniowych populacji prekursorów, które są idealne do zastosowań regeneracyjnych. Ta metoda izolacji pozwala na jednoczesne oczyszczanie trzech multipotencjalnych populacji komórek prekursorowych odpowiednio z trzech warstw strukturalnych naczyń krwionośnych: miogennych komórek śródbłonka z błony wewnętrznej, perycytów z pożywki i komórek przybyszowych z przydanki.

Izolacja multipotencjalnych prekursorów pochodzących z naczyń krwionośnych z ludzkich mięśni szkieletowych

Izolacja komórek zrębu węzłów chłonnych to wieloetapowa procedura obejmująca trawienie enzymatyczne i mechaniczną dezagregację w celu uzyskania fibroblastycznych komórek siatkowatych, limfatycznych i komórek śródbłonka krwi. W opisanej procedurze krótkie trawienie jest połączone z automatyczną dezagregacją mechaniczną w celu zminimalizowania degradacji markerów powierzchniowych żywotnych komórek zrębu węzłów chłonnych.

Izolacja komórek zrębu mysich węzłów chłonnych

Niejednorodność transkrypcyjna w ludzkich komórkach zrębowych pochodzących z tkanki tłuszczowej może być zdefiniowana na poziomie pojedynczej komórki za pomocą markerów powierzchni komórki i genów osteogennych.  Opisujemy protokół wykorzystujący cytometrię przepływową do izolacji subpopulacji komórek o zwiększonym potencjale osteogennym, który może być wykorzystany do poprawy rekonstrukcji szkieletu twarzoczaszki.

Izolacja i wzbogacenie ludzkich komórek zrębowych pochodzących z tkanki tłuszczowej w celu zwiększenia osteogenezy

Ludzka tkanka serca zawiera multipotencjalne okołonaczyniowe populacje komórek prekursorowych, które mogą być odpowiednie do regeneracji mięśnia sercowego. Opisana technika pozwala na jednoczesną izolację i oczyszczenie dwóch multipotencjalnych populacji komórek zrębu związanych z natywnymi naczyniami krwionośnymi, tj. perycytów CD146+CD34- i komórek przybyszowych CD34+CD146-, z ludzkiego mięśnia sercowego.

Izolacja okołonaczyniowych multipotencjalnych populacji komórek prekursorowych z ludzkiej tkanki serca

W tym artykule prezentujemy metody izolowania i różnicowania komórek zrębu szpiku kostnego i hematopoetycznych komórek macierzystych od kości długich myszy. Przedstawiono dwa różne protokoły dające różne populacje komórek odpowiednie do ekspansji i różnicowania w osteoblasty, adipocyty i osteoklasty.

Izolacja, hodowla i różnicowanie komórek zrębu szpiku kostnego i progenitorów osteoklastów od myszy

Odróżnienie białych i beżowych adipocytów od komórek progenitorowych naczyń tkanki tłuszczowej niesie ze sobą potencjał do metabolicznej poprawy otyłości. Opisujemy protokoły izolacji komórek śródbłonka CD34 + CD31 + z ludzkiego tłuszczu oraz późniejszej ekspansji i różnicowania in vitro do białych i beżowych adipocytów. Omówiono kilka dalszych zastosowań.

Izolacja, ekspansja i indukcja adipogenna komórek śródbłonka CD34+CD31+ z ludzkiej tkanki tłuszczowej i podskórnej

Ten protokół opisuje techniczne podejście do izolowania subpopulacji komórek zrębu adipogennych i włóknisto-zapalnych z mysich magazynów białej tkanki tłuszczowej (WAT) w jamie brzusznej poprzez sortowanie komórek aktywowane fluorescencją lub separację kulek immunomagnetycznych.

Izolacja adipogennych i włóknisto-zapalnych subpopulacji komórek zrębu z mysich wewnątrzbrzusznych magazynów tłuszczu

Ten protokół opisuje półautomatyczną izolację frakcji zrębu naczyniowego (SVF) z mysiej tkanki tłuszczowej w celu uzyskania preadipocytów i osiągnięcia różnicowania adipocytów in vitro. Użycie dysocjatora tkankowego do trawienia kolagenazy zmniejsza zmienność eksperymentalną i zwiększa odtwarzalność.

Półautomatyczna izolacja zrębu frakcji naczyniowej z mysiej białej tkanki tłuszczowej za pomocą dysocjatora tkankowego

Tutaj prezentujemy protokoły, które umożliwiają izolację komórek zrębu z mysich kości, szpiku kostnego, grasicy i ludzkiej tkanki grasicy, kompatybilne z monokomórkową multiomiką.

Izolacja komórek zrębu z narządów krwiotwórczych

Przedstawiamy tutaj protokół izolacji, oczyszczania i hodowli pierwotnych komórek marginalnych z myszy stria vascularis oraz do tworzenia in vitro modeli stresu oksydacyjnego i starzenia komórkowego w celu badania zaburzeń ściany bocznej ślimaka.

Izolacja i hodowla pierwotnych komórek brzegowych prążkowania naczyniowego u noworodkowych myszy

Poznaj izolację i różnicowanie komórek naczyniowych zrębu do komórek beżowych/brite z tkanki tłuszczowej myszy. Ta metoda pozwala badać mechanizmy regulujące brązowienie adipocytów i ich znaczenie w terapii otyłości.

Izolacja i różnicowanie komórek naczyniowych zrębu do komórek beżowych/brite

Przeglądaj więcej filmów