Name: Obrazowanie poklatkowe pierwotnych przednowotworowych komórek nabłonka sutka pochodzących z genetycznie zmodyfikowanych mysich modeli raka piersi (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-02-08T12:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 47 s
Description: Poznaj obrazowanie poklatkowe pierwotnych przednowotworowych komórek nabłonka sutka z genetycznie zmodyfikowanych mysich modeli raka piersi. Ta metoda pozwala analizować dynamikę komórkową i zachowania zależne od zmian genetycznych.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Autorzy pragną podziękować Bofanowi Wu i Christianowi Raithel za pomoc techniczną oraz Michaelowi Riegerowi za wprowadzenie do obrazowania żywych komórek. Wspierane przez NCI, NIH RO1CA112176 (P.A.F.), NCI, NIH. R01CA89041-10S1 (P.A.F.), Deutscher Akademischer Austaush Dienst e.V. A/09/72227 Ref. 316 (R.E.N.), Department of Defense W81XWH-11-1-0074 (R.E.N.), WCU (World Class University) program za pośrednictwem Narodowej Fundacji Badawczej Korei finansowany przez Ministerstwo Edukacji, Nauki i Technologii (R31-10069) (P.A.F.), NIH IG20 RR025828-01 (Gryzonie Barrier Facility Equipment) oraz NIH NCI 5P30CA051008 (Mikroskopia i obrazowanie oraz wspólne zasoby zwierząt).

1. Ogólny schemat
<ol>
	<li>Wygeneruj pierwotne kultury przednowotworowych komórek nabłonka sutka z gruczołów sutkowych genetycznie zmodyfikowanych i kontrolnych myszy typu dzikiego.</li>
	<li>Rejestruj obrazy na żywo co 15 minut za pomocą oprogramowania do akwizycji obrazów Volocity (wersja 5.3.1, PerkinElmer, Waltham, MA) przez okres do 5 dni.</li>
	<li>Przeglądaj obrazy poklatkowe bezpośrednio, aby ocenić czas i mechanizm tworzenia kolonii komórek nabłonkowych, występowanie apoptozy i fazowanie zmian morfologicznych.</li>
	<li>Konwertuj Głośność wygenerowana . TIFF łączy się w stosy z plikami .JPG za pomocą oprogramowania MetaMorph Microscopy Automation & Image Analysis Software (Molecular Devices, LLC Sunnyvale, CA) i zmienia nazwy plików obrazów cyfrowych (THE Rename 2.1.6, <a href="http://www.softpedia.com/get/System/File-Management/THE-Rename.shtml" target="_blank">http://www.softpedia.com/get/System/File-Management/THE-Rename.shtml</a>), aby umożliwić kompatybilność z oprogramowaniem Timm's Tracking Tool (TTT, <a href="http://www.helmholtz-muenchen.de/en/isf/hematopoiesis/software-download/index.html" target="_blank">http://www.helmholtz-muenchen.de/en/isf/hematopoiesis/software-download/index.html</a>).</li>
	<li>Za pomocą TTT generuj mapy losu komórek w celu określenia czasu między podziałami komórek (czas życia komórek) i wzorców podziału komórek (symetryczny lub asymetryczny).</li>
	<li>Przeanalizuj dane ilościowe z kroków 3 i 5 powyżej, aby określić, czy istnieją statystycznie istotne różnice między różnymi genetycznie modyfikowanymi modelami myszy i/lub kontrolami typu dzikiego.</li>
</ol>
2. Generacja pierwotnych kultur komórek nabłonka sutka
<ol>
	<li>Przygotuj kompletną pożywkę do izolacji pojedynczych komórek nabłonka sutka zgodnie z instrukcjami producenta (EpiCult-B Mouse Medium Kit, Stemcell Technologies, Vancouver, BC). Połącz 450 ml pożywki Epi-Cult-B, 50 ml suplementu proliferacyjnego Epi-Cult B, 5% płodowej surowicy bydlęcej (FBS), 50 μg/ml penicyliny/streptomycyny (PenStrep) i 10 ng/ml naskórkowego czynnika wzrostu (EGF).</li>
	<li>Przygotuj pożywkę dysocjacyjną, łącząc 1 część 10x mieszaniny kolagenazy / hialuronidazy z 9 częściami kompletnych pożywek z 2.1.</li>
	<li>Poddaj mysz eutanazji i natychmiast przystąp do sekcji zwłok. Połóż mysz na plecach na styropianowej platformie do sekcji zwłok i zabezpiecz wszystkie cztery kończyny tak, aby skóra brzuszna była napięta. Nasącz brzuszną skórę i włosy, w tym te leżące nad kończynami, 70% etanolem. Odsłoń gruczoły sutkowe #2/3 (piersiowe) i #4/5 (pachwinowe), wykonując nacięcie w linii środkowej przez skórę (nie wchodzić do otrzewnej), które jest przedłużone do nacięcia Y przez przyśrodkową skórę każdej kończyny przedniej i odwrócone nacięcie Y przez przyśrodkową skórę każdej tylnej kończyny.</li>
	<li>Za pomocą rozwarstwienia oddziel skórę od leżącej pod nią otrzewnej, odciągnij po obu stronach skóry, aż będzie napięta, i przymocuj ją do styropianowej platformy sekcyjnej za pomocą kołków. Zaczynając od zewnętrznej strony, użyj sekcji z rozsądnym użyciem nożyczek preparacyjnych, aby wyizolować nienaruszone gruczoły sutkowe pachwinowe i/lub piersiowe od leżącej poniżej tkanki łącznej i mięśni. Umieścić nie więcej niż dwa gruczoły sutkowe na sterylnej szalce Petriego o średnicy 10 cm i przenieść do kaptura do hodowli tkankowej.</li>
	<li>W kapturze do hodowli tkankowej zbadaj gruczoły pod kątem węzłów chłonnych sutka, które są identyfikowane jako małe, dobrze opisane guzki o żółtawym kolorze. Usuń węzły chłonne z otaczającego gruczołu za pomocą sterylnego skalpela i kleszczy. Tkankę sutka zmielić na ~1 mm 3 kostki za pomocą dwóch sterylnych skalpeli, po jednym w każdej ręce.</li>
	<li>Umieść zmieloną tkankę sutka w 5 ml pożywki dysocjacyjnej, wymieszaj, delikatnie pipetując w górę i w dół 2-3 razy za pomocą pipety 10 ml i inkubuj przez noc (do ~16 godzin) w inkubatorze o temperaturze 37 °C z 5% CO2 w stożkowej probówce o pojemności 50 ml z poluzowaną nakrętką.</li>
	<li>Następnego ranka przygotuj zimną mieszaninę 1 części zbilansowanego roztworu soli Hanksa (HBSS) zawierającego 2% FBS i 4 części buforowanego roztworu chlorku amonu w celu pobudzenia lizy czerwonych krwinek (HFAmCl), a także zimnego HBSS uzupełnionego 2% FBS (HF). Wstępnie podgrzej trypsynę-EDTA (0,25%), 5 mg / ml Dispase w zmodyfikowanym zrównoważonym roztworze soli Hanka, 1 mg / ml DNazy I i kompletne podłoże.</li>
	<li>Wyjmij stożkową probówkę wirówkową z tkanką sutkową z inkubatora i delikatnie pulsuj wir 2-3 sekundy dwa razy. Odwirować probówkę o stężeniu 450 × g przez 5 minut (temperatura pokojowa lub 4 °C) i odrzucić supernatant.</li>
	<li>Zawiesić osad w co najmniej 10 ml HFAmCl i odwirować przy 450 × g przez 5 minut (temperatura pokojowa lub 4 °C) i odrzucić supernatant.</li>
	<li>Dodać 3 ml trypsyny-EDTA do osadu i wymieszać najpierw pipetą o pojemności 5 ml, a następnie mikropipetorem P1000 do uzyskania żylastości (1-3 min). Dodać 10 ml HF, odwirować przy 450 × g przez 5 minut (temperatura pokojowa lub 4 °C) i odrzucić supernatant.</li>
	<li>Dodać 2 ml 5 mg/ml dypazy i 200 μl 1 mg/ml DNazy I do osadu i mieszać z mikropipetorem P1000 przez 1 min. Próbka powinna być mętna, ale nie żylasta. Jeśli jest żylasty, dodaj 100 μl DNazy I i ponownie wymieszaj.</li>
	<li>Dodać 10 ml zimnego HF, przecedzić przez sitko o wielkości 40 μm i odwirować przy 450 × g przez 5 minut (temperatura pokojowa lub 4 °C) i odrzucić supernatant.</li>
	<li>Ponownie zawieś ostatnią kulkę w Complete Media. Określ ilościowo całkowitą liczbę komórek (za pomocą hemocytometru lub licznika redlic). Dwa gruczoły sutkowe dają około 1 x 106 do 1 x 107 komórek. Umieść pierwotne komórki nabłonkowe w płaskodennej 6-dołkowej płytce o gęstości 1,5 x 105 komórek na dołek.</li>
</ol>
3. Obrazowanie żywych komórek
<ol>
	<li>Natychmiast po posianiu komórek należy bezpiecznie umieścić 6-dołkową płytkę na stoliku mikroskopowym w komorze inkubacyjnej o temperaturze 5% CO2 / wilgotności nasyconej / 37 °C. Wyreguluj kondensator pod kątem oświetlenia Kohler i wyśrodkuj pierścienie fazowe. Do prezentowanych tu eksperymentów wykorzystano system odwróconego mikroskopu konfokalnego Nikon Eclipse TE300/PerkinElmer Spinning Disc w trybie szerokokątnego kontrastu fazowego z soczewką obiektywową 10x.</li>
	<li>Otwórz oprogramowanie do akwizycji obrazów, utwórz i nazwij bibliotekę dla obrazów poklatkowych i zapisz w lokalizacji, w której jest wystarczająco dużo miejsca na duże pliki. W prezentowanych eksperymentach wykorzystano oprogramowanie do akwizycji obrazów Volocity (wersja 5.3.1, PerkinElmer, Waltham, MA).</li>
	<li>Pozwól płytce zrównoważyć się w inkubatorze mikroskopu przez co najmniej 15 minut. Opuść soczewki, aby uniknąć zakłóceń soczewki stage. Pod nagłówkiem "Stage" wybierz "Kalibruj stage". Ponownie uzyskaj płaszczyznę ogniskowej, ustaw Z=zero pod zakładką x, y, z i zaznacz punkty obrazowania, wybierając "Dodaj punkt" pod nagłówkiem "Stolik". Umieść punkty na środku każdej studzienki 6-dołkowej płytki do obrazowania, ponieważ obrazowanie z kontrastem fazowym może być zniekształcone w pobliżu obrzeży studzienek plastikowych. Ułóż punkty w kwadracie w 4 x 4 pola (pola 650 μm x 700 μm), z których każde ma niewielkie nakładanie się (około 5%). Zapisz wybrane punkty w sekcji "Etap".</li>
	<li>W sekcji "Etap" wybierz "Utwórz mapę ostrości" i postępuj zgodnie z instrukcjami, aby ustawić ostrość każdego punktu. Ustaw czas akwizycji obrazu, aby robić 4 zdjęcia na godzinę (co 15 minut). Można to dostosować w zależności od wymagań konkretnego eksperymentu. Zapisz mapę ostrości w sekcji "Etap".</li>
	<li>Kliknij prawym przyciskiem myszy na pasku narzędzi po prawej stronie "Akwizycja obrazu" i zapisz ustawienia obrazowania. Naciśnij przycisk nagrywania, aby rozpocząć obrazowanie. Po 1 godzinie sprawdź ostrość obrazów, aby zobaczyć, czy potrzebna jest regulacja.</li>
	<li>Monitoruj i kontynuuj obrazowanie na żywo przez 5 dni, kończąc się, gdy komórki stają się zlewne.</li>
</ol>
4. Bezpośrednie przeglądanie obrazów poklatkowych w celu oceny czasu i mechanizmu początkowego tworzenia kolonii komórek nabłonkowych, występowania apoptozy i fazowania zmian morfologicznych
<ol>
	<li>Bezpośrednie oglądanie obrazów poklatkowych może odbywać się za pomocą dowolnego kompatybilnego oprogramowania do przeglądania filmów (np. <a href="http://www.real.com/" target="_blank">http://www.real.com/ realplayer</a> lub innego darmowego lub dostępnego na rynku oprogramowania). Zdjęcia można oglądać w formacie . Format TIFF na tym etapie lub po konwersji do plików .JPG (patrz Krok 5).</li>
	<li>Aby określić mechanizm początkowego tworzenia kolonii, zacznij od stosu pojedynczych obrazów reprezentujących jedno miejsce obrazowania na płytce. W początkowych klatkach komórki będą pływające. Postępuj zgodnie z obrazami seryjnymi, aby określić, kiedy pierwsza komórka nabłonka przylega do płytki. Na tym etapie komórki nabłonkowe można zidentyfikować i odróżnić od fibroblastów na podstawie ich bardziej prostopadłościennej morfologii. Śledź tę pojedynczą komórkę nabłonkową za pomocą seryjnych obrazów i śledź jej los przez kolejne 24 godziny. Rejestruj, czy zostaje otoczony dodatkowymi komórkami nabłonkowymi lub ulega podziałowi komórkowemu lub apoptozie. W przypadku otoczenia przez komórki nabłonkowe mechanizm tworzenia kolonii można określić bezpośrednio, sprawdzając, czy otaczające komórki pochodzą z komórek pływających, które następnie agregują się z początkową komórką przylegającą (komórkami), czy też z podziału początkowej komórki przylegającej. Zapisz liczbę kolonii utworzonych w wyniku agregacji komórek w porównaniu z podziałem komórek w ciągu pierwszych 24 godzin.</li>
	<li>Aby określić liczbę początkowo przylegających komórek, które ulegają apoptozie w określonym czasie, postępuj zgodnie z seryjnymi obrazami pod kątem pojawienia się klasycznych cech apoptozy rozwijających się w komórce, która była przylegająca (<a href="http://www.alsa.org/research/about-als-research/cell-death-and-apoptosis.html" target="_blank">http://www.alsa.org/research/about-als-research/cell-death-and-apoptosis.html</a>) oraz liczbę komórek apoptotycznych zidentyfikowanych podczas całego czasu trwania obrazowania lub w określonych zarejestrowanych ramach czasowych.</li>
	<li>Z biegiem czasu komórki nabłonkowe w hodowli zmieniają swoją morfologię z początkowego kształtu prostopadłościennego na bardziej wydłużony wygląd zgodny z EMT. Postępuj zgodnie z obrazami seryjnymi, aby określić dzień/godzinę po poszyciu, kiedy to nastąpi.</li>
</ol>
5. Modyfikacja pliku obrazu
<ol>
	<li>Za pomocą oprogramowania Volocity eksportuj pliki obrazów do stosów TIFF. W tym przypadku oprogramowanie MetaMorph Microscopy Automation & Image Analysis Software (Molecular Devices, LLC Sunnyvale, CA) zostało użyte do otwarcia plików stosu TIFF, a następnie zostały one zapisane w MetaMorph jako pojedyncze obrazy .JPG.</li>
	<li>Zmień nazwy folderów i plików obrazów zgodnie z wymaganiami oprogramowania Timm's Tracking Tool (<a href="http://www.helmholtz-muenchen.de/fileadmin/ISF/PDF/Haematopoese/publications/TTT_Operating_Instructions_July_2009_.pdf" target="_blank">http://www.helmholtz-muenchen.de/fileadmin/ISF/PDF/Haematopoese/publications/TTT_Operating_Instructions_July_2009_.pdf</a>). Użyj darmowego programu, takiego jak THE Rename 2.1.6 (<a href="http://www.softpedia.com/get/System/File-Management/THE-Rename.shtml" target="_blank">http://www.softpedia.com/get/System/File-Management/THE-Rename.shtml</a>), aby zmienić nazwy plików w grupach. Utwórz jeden folder zawierający wszystkie foldery i pliki eksperymentu i nazwij folder (np. EXPERIMENTNAME).</li>
	<li>Utwórz podfolder dla każdego punktu/pozycji, w której kultura została zobrazowana. Nazwij podfoldery: EXPERIMENTNAME_pPOSITIONNUMBER. Numer pozycji powinien składać się z 3 cyfr. Przykład: 072511RN_p001. Umieść wszystkie pliki obrazów z tej indywidualnej pozycji w podfolderze.</li>
	<li>Dodaj punkt czasowy (używając 5 cyfr) i numer kanału (ponieważ jest tylko jeden kanał jasnego pola, użyj "0") na końcu każdej nazwy pliku w tym formacie: 
	EXPERIMENTNAME_pPOSITIONNUMBER_tTIMEPOINT_wCHANNELNUMBER.jpgPrzykład: 072511RN_p001_t00001_w0.jpg</li>
	<li>Wygeneruj plik dziennika dla każdej pozycji, pobierając najpierw darmowy program TTTlogfileconverter ze strony internetowej TTT. Uruchom program TTTlogfileconverter i wybierz folder eksperymentu. Wprowadź interwał obrazu (w sekundach). W przypadku zdjęcia robionego co 15 minut wprowadź 900 sek. Następnie naciśnij zielony przycisk tajnych plików dziennika.</li>
</ol>
6. Generowanie map losu pojedynczych komórek za pomocą TTT
<ol>
	<li>Utwórz folder o nazwie TTTexport i podfolder o nazwie TTTfiles, w którym wszystkie dane śledzenia komórek będą przechowywane zgodnie z instrukcjami oprogramowania TTT (<a href="http://www.helmholtz-muenchen.de/fileadmin/ISF/PDF/Haematopoese/publications/TTT_Operating_Instructions_July_2009_.pdf" target="_blank">http://www.helmholtz-muenchen.de/fileadmin/ISF/PDF/Haematopoese/publications/TTT_Operating_Instructions_July_2009_.pdf</a>).</li>
	<li>Uruchom program TTT, wybierz inicjały użytkownika i kliknij "Kontynuuj".</li>
	<li>Naciśnij przycisk "Set NAS" (Ustaw serwer NAS), wybierz folder "TTTexport" utworzony przez użytkownika i kliknij przycisk OK. W przeglądarce wybierz folder eksperymentu, wybierz folder pozycji, a następnie naciśnij przycisk "Załaduj pozycję".</li>
	<li>Ustaw współczynnik oka na "10x". Załaduj wymaganą liczbę obrazów (wczytywanie wszystkich obrazów jest zalecane po raz pierwszy).</li>
	<li>W oknie edytora komórek wybierz "Nowa kolonia" w menu Plik. W oknie filmu naciśnij przycisk "Śledź komórkę" lub F2, aby rozpocząć śledzenie komórki.</li>
	<li>Zidentyfikuj komórkę w oknie filmu i umieść kursor myszy nad tą komórką. Po kliknięciu F2 powinien pojawić się okrąg z numerem komórki. Użyj "0" na klawiaturze numerycznej, aby śledzić położenie komórki i przejść do następnego obrazu. Przesuń kursor, aby śledzić położenie każdej komórki w każdej klatce. Aby usunąć utwór i powrócić do poprzedniego obrazu, naciśnij "Del" na klawiaturze numerycznej. Aby przechodzić do przodu klatki bez śledzenia komórki, naciśnij "3", a aby przejść do tyłu bez śledzenia, naciśnij "1" na klawiaturze numerycznej.</li>
	<li>Aby zaznaczyć podział komórki, kliknij przycisk "Dzielenie" w oknie filmu. Aby oznaczyć śmierć komórki, kliknij przycisk "Śmierć komórki" w oknie filmu. Po dokonaniu podziału komórki potomne można śledzić na tej samej mapie losu komórek, klikając prawym przyciskiem myszy symbol okręgu wyznaczonej komórki potomnej w oknie Edytora komórek, aby automatycznie uruchomić tryb śledzenia.</li>
	<li>Naciśnij F10, aby zapisać drzewo. Każde drzewo zostanie zapisane w wyznaczonym folderze wyjściowym (TTTExport). Aby rozpocząć nową mapę losu komórki, wybierz "Nowa kolonia" w menu "Plik", a następnie "Otwórz" w oknie edytora komórek.</li>
	<li>Tabelaryzuj dane o okresie istnienia komórki po zebraniu z zakładki "Dane komórki" w oknie Edytora komórek.</li>
</ol>
7. Analizy statystyczne
<ol>
	<li>Użyj testu t-Studenta (w przypadku porównywania dwóch genotypów) lub ANOVA (w przypadku porównywania > dwóch genotypów), aby określić, czy różnice w danych parametrycznych, takich jak liczba początkowych kolonii komórkowych, czas życia komórek lub godziny do pojawienia się EMT między różnymi genotypami, są statystycznie istotne. Częstość apoptozy można porównać jako liczbę/całkowitą liczbę posianych komórek za pomocą testu t Studenta lub ANOVA lub z Manna-Whitneya lub Kruskala-Wallisa, gdy uzyskano ją jako procent komórek przylegających.</li>
	<li>Wykonaj testy mocy, wykorzystując dane z analiz początkowych eksperymentów, aby określić, ile powtórzeń eksperymentalnych należy wykonać, oraz mapy losu komórek wygenerowane z każdej repliki w celu uzyskania odpowiedniej mocy statystycznej przy użyciu dostępnego darmowego oprogramowania (np. <a href="http://statpages.org/" target="_blank">http://statpages.org/</a>). W przedstawionych tutaj eksperymentach hodowle komórkowe pochodzące od trzech myszy na genotyp były wystarczające do określenia, czy istnieją statystycznie istotne różnice w tworzeniu kolonii komórkowych i czasie życia komórek, gdy dokonano określonych modyfikacji genetycznych.</li>
</ol>

<ol><li>Jones, L. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Activation+of+estrogen+signaling+pathways+collaborates+with+loss+of+Brca1+to+promote+development+of+ERalpha-negative+and+ERalpha-positive+mammary+preneoplasia+and+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Oncogene%22%5BJournal%5D)">Activation of estrogen signaling pathways collaborates with loss of Brca1 to promote development of ERalpha-negative and ERalpha-positive mammary preneoplasia and cancer.</a> Oncogene. 27, 794-802 (2008).</li>
<li>Burga, L. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Altered+proliferation+and+differentiation+properties+of+primary+mammary+epithelial+cells+from+BRCA1+mutation+carriers%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Res%22%5BJournal%5D)">Altered proliferation and differentiation properties of primary mammary epithelial cells from BRCA1 mutation carriers.</a> Cancer Res. 69, 1273-1278 (2009).</li>
<li>Li, M., Wagner, K., Furth, P. A. Preparation of primary mammary epithelial cells and transfection by viral and nonviral methods. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aLi%2C+M+%22Methods+in+Mammary+Gland+Biology+and+Breast+Cancer%22">Methods in Mammary Gland Biology and Breast Cancer</a>. Ip, M., Asch, B. , Kluwer Academic, Plenum Press. (2000).</li>
<li>Schroeder, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Imaging+stem-cell-driven+regeneration+in+mammals%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Imaging stem-cell-driven regeneration in mammals.</a> Nature. 453, 345-351 (2008).</li>
<li>Schroeder, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Long-term+single-cell+imaging+of+mammalian+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">Long-term single-cell imaging of mammalian stem cells.</a> Nature Methods. 8, S30-S35 (2011).</li>
<li>Eilken, H. M., Nishikawa, S. -I., Schroeder, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Continuous+single-cell+imaging+of+blood+generation+from+haemogenic+endothelium%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Continuous single-cell imaging of blood generation from haemogenic endothelium.</a> Nature. 457, 896-900 (2009).</li>
<li>Kokkaliaris, K. D., Loeffler, D., Schroeder, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Advances+in+tracking+hematopoiesis+at+the+single-cell+level%5BTitle%5D)+AND+%22Current+opinion+in+hematology%22%5BJournal%5D)">Advances in tracking hematopoiesis at the single-cell level.</a> Current opinion in hematology. , (2012).</li>
<li>Rieger, M. A., Hoppe, P. S., Smejkal, B. M., Eitelhuber, A. C., Schroeder, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hematopoietic+cytokines+can+instruct+lineage+choice%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Hematopoietic cytokines can instruct lineage choice.</a> Science. 325, 217-218 (2009).</li>
<li>Rieger, M. A., Schroeder, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Instruction+of+lineage+choice+by+hematopoietic+cytokines%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Cycle%22%5BJournal%5D)">Instruction of lineage choice by hematopoietic cytokines.</a> Cell Cycle. 8, 4019-4020 (2009).</li>
<li>Heinrich, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generation+of+subtype-specific+neurons+from+postnatal+astroglia+of+the+mouse+cerebral+cortex%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Protoc%22%5BJournal%5D)">Generation of subtype-specific neurons from postnatal astroglia of the mouse cerebral cortex.</a> Nat. Protoc. 6, 214-228 (2011).</li>
</ol>

Autorzy oświadczają, że nie mają konkurencyjnych interesów finansowych.

Kroki krytyczne
Ważne jest, aby upewnić się, że gruczoły sutkowe są pobierane od myszy w tym samym wieku, aby kontrolować związaną z wiekiem zmienność zachowania komórek nabłonka sutka. Podczas posiewania komórek, ta sama liczba komórek powinna być siana w każdym dołku dla każdego eksperymentu. Komórki powinny być stosunkowo rzadkie podczas posiewu, aby kultury nie zlewały się zbyt szybko, co umożliwiłoby śledzenie wielu pojedynczych komórek za pomocą obrazów seryjnych. Istotne jest, aby płytka ...

Genetycznie modyfikowane modele myszy są narzędziami do badania i zrozumienia, w jaki sposób różne zmiany genetyczne przyczyniają się do ryzyka rozwoju raka piersi. Na przykład genetycznie zmodyfikowane myszy wykazały, że połączenie trzech czynników: utraty pełnej długości raka piersi 1, genu wczesnego początku (Brca1) w komórkach nabłonka sutka, haploinsucji linii zarodkowej białka nowotworowego p53 (Tp53) i ukierunkowanej w górę ekspresji receptora estrogenowego alfa (ERa) komórek nabłonka sutka powoduje rozwój raka sutka w 100% Brca1floksowany (f) 11 / f11 / Wirus guza sutka myszy (MMTV)-Cre / p53 +/-/tetracyklina operator (tet-op) -ER / MMTV - odwrotny transaktywator tetracykliny (myszy rtTA w wieku 12 miesięcy w porównaniu z niższymi odsetkami zgłaszanymi u myszy Brca1f11 / f11 / MMTV-Cre / p53 + / - bez nadekspresji ERa (~ 50-60%) i myszy Brca1f11 / f11 / MMTV-Cre bez haploinsucji Tp53 (<5%). 1
Dynamiczne obrazowanie poklatkowe zachowania przednowotworowych pierwotnych komórek nabłonka sutka ujawnia różnice w zachowaniu komórek, które są trudniejsze do zauważenia w statycznych skrawkach tkanki. Zmiany w proliferacji i różnicowaniu obserwuje się w pierwotnych komórkach sutka pochodzących od ludzkich nosicieli mutacji BRCA1. 2 Tworzenie jednokomórkowych zawiesin pierwotnych komórek nabłonka sutka u normalnych i genetycznie modyfikowanych myszy jest generowane przez enzymatyczną dysocjację wyciętej tkanki gruczołu sutkowego. 3 Obrazy poklatkowe są przeglądane w celu oceny mechanizmu i czasu pojawienia się kolonii komórkowej oraz występowania zmian morfologicznych w komórkach, w tym przejścia nabłonkowo-mezenchymalnego (EMT) i apoptozy. Generowanie map losu komórek, ilościowe określanie czasu między podziałami komórek (czas życia komórek) oraz określanie wzorców podziału komórek jest ułatwione dzięki zastosowaniu śledzenia pojedynczych komórek. Timm's Tracking Tool (TTT) to publicznie dostępne oprogramowanie służące do generowania map losu pojedynczych komórek. Ustalono jego przydatność w wyjaśnianiu mechanizmów losu komórek4,5 badając prawidłowy rozwój krwiotwórczych komórek macierzystych6-9 oraz powstawanie neuronów. 10

<table><tbody><tr><td>EpiCult-B Basal Medium Mouse</td><td>StemCell Technologies</td><td>05610</td><td></td></tr><tr><td>EpiCult-B Suplementy proliferacyjne Mysie</td><td>technologie komórek macierzystych</td><td>05612</td><td></td></tr><tr><td>rekombinowany ludzki naskórkowy czynnik wzrostu (rhEGF)</td><td>Technologie komórek macierzystych StemCell</td><td>02633</td><td></td></tr><tr><td>Kolagenaza/hialuronidaza</td><td>Technologie komórek macierzystych</td><td>07912</td><td></td></tr><tr><td>Jednorazowe Scapels</td><td>Feather</td><td>2975#10</td><td></td></tr><tr><td>Zrównoważony roztwór soli Hanksa</td><td>StemCell Technologies</td><td>37150</td><td></td></tr><tr><td>Chlorek amonu</td><td>StemCell Technologies</td><td>07800</td><td></td></tr><tr><td>Tryspin-EDTA</td><td>StemCell Technologies</td><td>07901</td><td></td></tr><tr><td>Dispase</td><td>StemCell Technologies</td><td>07913</td><td></td></tr><tr><td>Technologie DNase I</td><td>StemCell</td><td>07900</td><td></td></tr><tr><td>40 &mu; m sitko do komórek</td><td>StemCell Technologies</td><td>27305</td><td></td></tr><tr><td>FBS</td><td>StemCell Technologies</td><td>06100</td><td></td></tr><tr><td>PenStrep</td><td>Gibco</td><td>15140</td><td></td></tr></tbody></table>

obrazowanie poklatkowe pierwotnych przednowotworowych komórek nabłonka sutka pochodzących z genetycznie zmodyfikowanych mysich modeli raka piersi

Time-lapse Imaging of Primary Preneoplastic Mammary Epithelial Cells Derived from Genetically Engineered Mouse Models of Breast Cancer

Obrazowanie poklatkowe może być użyte do porównania zachowania hodowanych pierwotnych komórek nabłonka sutka prenowotwórczego pochodzących z różnych genetycznie modyfikowanych mysich modeli raka piersi. Na przykład czas między podziałami komórek (czas życia komórek), apoptoza liczby komórek, ewolucja zmian morfologicznych i mechanizm tworzenia kolonii mogą być określone ilościowo i porównane w komórkach z określonymi zmianami genetycznymi. Pierwotne hodowle komórek nabłonka sutka są generowane z gruczołów sutkowych bez wyczuwalnego guza. Gruczoły są starannie wycinane z wyraźnym oddzieleniem od sąsiednich mięśni, węzły chłonne są usuwane, a jednokomórkowe zawiesiny wzbogaconych komórek nabłonka sutka są generowane przez mielenie tkanki sutka, a następnie dysocjację enzymatyczną i filtrację. Zawiesiny pojedynczych komórek są powlekane i umieszczane bezpośrednio pod mikroskopem w komorze inkubatora w celu obrazowania żywych komórek. Szesnaście pól o wymiarach 650 μm x 700 μm w konfiguracji 4x4 z każdej studzienki płytki 6-dołkowej jest obrazowanych co 15 minut przez 5 dni. Obrazy poklatkowe są badane bezpośrednio w celu zmierzenia zachowań komórek, które mogą obejmować mechanizm i częstotliwość tworzenia kolonii komórkowych w ciągu pierwszych 24 godzin od posiewu komórek (agregacja kontra proliferacja komórek), występowanie apoptozy i fazowanie zmian morfologicznych. Śledzenie pojedynczych komórek służy do generowania map losu komórek w celu pomiaru czasu życia poszczególnych komórek i badania wzorców podziałów komórek. Dane ilościowe są analizowane statystycznie w celu oceny istotnych różnic w zachowaniu skorelowanych z określonymi zmianami genetycznymi.

Komórki nabłonkowe i fibroblasty można rozróżnić na podstawie morfologii komórek. Komórki nabłonkowe mają kształt sześcienny (Rysunek 1A-B) i tworzą kolonie komórkowe (Rysunek 1A). Fibroblasty, będące rodzajem komórek zrębu, mają wydłużoną morfologię (Rysunek 1C).
Na początku obrazowania komórki były okrągłe i pływające (Rysunek 2A-D). Po przywiernięciu do płytki stały się płaskie i przyjęły wygląd sześcianowy (Rysune...

Obrazowanie poklatkowe służy do oceny zachowania pierwotnych komórek nabłonka sutka preneoplastycznego pochodzących z genetycznie modyfikowanych mysich modeli ryzyka raka piersi w celu określenia, czy istnieją korelacje między określonymi parametrami behawioralnymi a odrębnymi zmianami genetycznymi.

Obrazowanie poklatkowe pierwotnych przednowotworowych komórek nabłonka sutka pochodzących z genetycznie zmodyfikowanych mysich modeli raka piersi

Time-lapse  imaging can be used to compare behavior of cultured primary preneoplastic  mammary epithelial cells derived from different genetically ...

Ogólnym celem poniższego eksperymentu jest ustalenie, czy zmiany genetyczne, które predysponują do raka piersi, zmieniają zachowanie komórek pamięci szyszynki w hodowli pierwotnej. Osiąga się to poprzez wyizolowanie pierwotnych komórek nabłonka sutka od genetycznie modyfikowanych myszy. W drugim etapie obrazowanie poklatkowe na żywo komórek jest wykonywane w ciągu pięciu do siedmiu dni, tworząc film do analizy zachowania komórek.Następnie oprogramowanie, które śledzi pojedyncze komórki, jest wykorzystywane do ilościowego określenia i porównania zachowania komórek wyizolowanych z różnych genetycznie zmodyfikowanych mysich modeli raka piersi. Wyniki pokazują, że określone zmiany genetyczne wywołują różne zachowania w pamięci przednowotworowej. Komórki nabłonkowe na podstawie ilościowych analiz behawioralnych przeprowadzonych przy użyciu śledzenia pojedynczych komórek.Chociaż ta metoda może zapewnić wgląd w to, jak różne zmiany genetyczne zmieniają zachowanie komórek nabłonka przednowotworowego mamy. Może być również stosowany do innych systemów, takich jak prenowotwór, komórki z innych narządów, komórki rakowe z dowolnych narządów, w tym badanie możliwych zmian behawioralnych wywołan

time-lapse-imaging-primary-preneoplastic-mammary-epithelial-cells

Research

JoVE Journal

Medicine

Medycyna

Przedstawienie time-lapse obrazowania pierwotnych prenowotworzących komórek nabłonkowych sutka pochodzących z genetycznie zmodyfikowanych modeli mysich nowotworu piersi

Źródło:Marina Arantes Radicchi1, Victor Carlos Mello1,Victória Paz Machado1, Márcia Cristina Oliveira da Rocha1, Jaqueline Vaz de Oliveira1, Luana Cristina Camargo1,2, Luís Alexandre Muehlmann1, Ricardo Bentes Azevedo1, Sônia Nair Bao1, João Paulo Figueiró Longo11Instytut Nauk Biologicznych, Uniwersytet w Brasílii, 2Zakład Podstawowych Procesów Psychologicznych, Instytut Psychologii, Uniwersytet w BrasíliiTen film przedstawia procedurę śledzenia progresji guza in vivo poprzez wstrzyknięcie...

Obrazowanie bioluminescencyjne progresji guza piersi w modelu mysim płci żeńskiej

Opisujemy metodę obrazowania odpowiedzi na leczenie przeciwnowotworowe in vivo i w rozdzielczości pojedynczej komórki.

Obrazowanie na żywo odpowiedzi na leki w mikrośrodowisku guza w mysich modelach raka piersi

Aktywacja utajonych mutacji z adenowirusem-Cre w systemie przewodowym sutka powoduje klinicznie istotny przerzutowy rak piersi. Włączenie promotora YFP umożliwia śledzenie dystalnych komórek nowotworowych z przerzutami. Model ten jest przydatny do badania utajonych przerzutów, odporności przeciwnowotworowej oraz do projektowania nowych immunoterapii w leczeniu raka piersi.

Inicjacja przerzutowego raka piersi poprzez celowanie w nabłonek przewodowy za pomocą Adenovirus-Cre: nowy transgeniczny mysi model raka piersi

Pierwotna hodowla komórkowa przy użyciu nienaruszonych organoidów tkankowych dostarcza systemu modelowego, który naśladuje wielokomórkowe mikrośrodowisko in vivo. Opracowaliśmy model hodowli pierwotnej tkanki nabłonka piersi bez surowicy, który utrwala mieszane linie hodowli komórkowych i wykazuje zróżnicowaną morfologię, bez enzymatycznego rozerwania tkanki. Organoidy piersi zachowują żywotność przez &gt;6 miesięcy.

Nieenzymatyczna, pozbawiona surowicy hodowla tkankowa przedinwazyjnych zmian piersi do spontanicznego wytwarzania mammosfery

Opisany jest ortotopowy model pierwotnego guza raka piersi i chirurgiczne usunięcie pierwotnego guza w celu przedłużenia życia myszy w celu wytworzenia spontanicznych przerzutów. Wzrost i progresja guza są monitorowane i oznaczane ilościowo za pomocą obrazowania fluorescencyjnego lucyferazy.

Ortotopowy mysi model spontanicznych przerzutów raka piersi

Celem tego protokołu jest opisanie nowego podejścia do modelowania raka piersi opartego na doprzewodowym wstrzykiwaniu adenowirusa z ekspresją Cre do mysich gruczołów sutkowych. Takie podejście pozwala na manipulowanie zdarzeniami onkogennymi zarówno w zależności od typu komórki, jak i narządu, w sposób kontrolowany czasowo.

Modelowanie raka piersi poprzez doprzewodowe wstrzyknięcie adenowirusa z ekspresją Cre do mysiego gruczołu sutkowego

Ta praca wstępnie ustawia zaawansowany protokół do dokładnej oceny obciążenia guza poprzez detekcję zielonego białka fluorescencyjnego i sygnałów bioluminescencji, a także integrację ilościowej techniki wykrywania molekularnego.

Badanie potrójnie ujemnego raka piersi przy użyciu ortotopowego modelu raka piersi

Ten protokół opisuje nowatorskie okno obrazowania sutka z wymienną pokrywą (R.MIW). Mikroskopia przyżyciowa po wszczepieniu R.MIW pozwala na podłużne i wielodniowe obrazowanie zdrowego i chorego gruczołu sutkowego z rozdzielczością komórkową na różnych etapach rozwoju.

Podłużna mikroskopia przyżyciowa z wykorzystaniem okienka do obrazowania sutkowego z wymienną pokrywą

Opisana tutaj metoda obrazowania intravital wykorzystuje generowanie drugiej harmonii kolagenu i endogenną fluorescencję z metabolicznego kofaktora NAD(P)H do nieinwazyjnej segmentacji nieoznaczonego mikrośrodowiska guza na przedziały guza, zrębu i naczyń krwionośnych w celu dogłębnej analizy obrazów 4D intravital.

Bezznacznikowe podejście do segmentacji w obrazowaniu przyżyciowym mikrośrodowiska guza sutka

Niniejszy protokół opisuje łatwą technikę obrazowania gruczołu sutkowego myszy w okresie laktacji za pomocą skaningu laserowego, mikroskopii konfokalnej i wielofotonowej.

Mikroskopia subkomórkowa przyżyciowych gruczołu sutkowego

Manuskrypt opisuje metodologię ustalania oraz monitorowania wzrostu podłużnego spontanicznych przerzutów do płuc z ortotopowo wstrzykiwanych guzów piersi, które mogą być interwencyjne na wszystkich etapach kaskady przerzutowej.

In vivo (in vivo) Obrazowanie w celu pomiaru spontanicznych przerzutów do płuc komórek guza piersi wstrzykniętych ortotopowo

Poznaj obrazowanie poklatkowe pierwotnych przednowotworowych komórek nabłonka sutka z genetycznie zmodyfikowanych mysich modeli raka piersi. Ta metoda pozwala analizować dynamikę komórkową i zachowania zależne od zmian genetycznych.

Obrazowanie poklatkowe pierwotnych przednowotworowych komórek nabłonka sutka pochodzących z genetycznie zmodyfikowanych mysich modeli raka piersi (Wideo) | JoVE Journal

Obrazowanie poklatkowe pierwotnych przednowotworowych komórek nabłonka sutka pochodzących z genetycznie zmodyfikowanych mysich modeli raka piersi

Przeglądaj więcej filmów