Obrazowanie poklatkowe pierwotnych przednowotworowych komórek nabłonka sutka pochodzących z genetycznie zmodyfikowanych mysich modeli raka piersi

Ogólnym celem poniższego eksperymentu jest ustalenie, czy zmiany genetyczne, które predysponują do raka piersi, zmieniają zachowanie komórek pamięci szyszynki w hodowli pierwotnej. Osiąga się to poprzez wyizolowanie pierwotnych komórek nabłonka sutka od genetycznie modyfikowanych myszy. W drugim etapie obrazowanie poklatkowe na żywo komórek jest wykonywane w ciągu pięciu do siedmiu dni, tworząc film do analizy zachowania komórek.

Następnie oprogramowanie, które śledzi pojedyncze komórki, jest wykorzystywane do ilościowego określenia i porównania zachowania komórek wyizolowanych z różnych genetycznie zmodyfikowanych mysich modeli raka piersi. Wyniki pokazują, że określone zmiany genetyczne wywołują różne zachowania w pamięci przednowotworowej. Komórki nabłonkowe na podstawie ilościowych analiz behawioralnych przeprowadzonych przy użyciu śledzenia pojedynczych komórek.

Chociaż ta metoda może zapewnić wgląd w to, jak różne zmiany genetyczne zmieniają zachowanie komórek nabłonka przednowotworowego mamy. Może być również stosowany do innych systemów, takich jak prenowotwór, komórki z innych narządów, komórki rakowe z dowolnych narządów, w tym badanie możliwych zmian behawioralnych wywołanych terapią, a także porównania zachowania komórek zrębu z tkanki normalnej i nowotworowej demonstrujące procedurę. Dzisiaj będzie dr Priscilla Firth, starszy autor tej publikacji, oraz Pete Johnson, kierownik Centrum Badań nad Mikroskopią i Obrazowaniem w Centrum Badań nad Rakiem Lombardi na Uniwersytecie Georgetown.

Poddaj mysz eutanazji i natychmiast przystąp do sekcji zwłok. Umieść mysz na wznak na styropianowej platformie do sekcji zwłok i zabezpiecz wszystkie cztery kończyny tak, aby skóra brzuszna była napięta. Nasycić brzuszną skórę i włosy, w tym skórę kończyn, 70% etanolem.

Odsłoń gruczoły sutkowe numer dwa i trzy oraz numer cztery i pięć z nacięciem w linii środkowej przez skórę. Przedłuż nacięcie dwoma nacięciami y przez przyśrodkową skórę czterech kończyn. Uważaj, aby nie dostać się do otrzewnej za pomocą rozwarstwienia.

Oddziel skórę od leżącej pod nią otrzewnej. Pociągnij do tyłu skórę po obu stronach, aż będzie napięta i przypnij ją do platformy, zaczynając od zewnętrznej strony. Użyj nożyczek, aby wykonać rozwarstwienie, które izoluje nienaruszone gruczoły sutkowe i/lub piersiowe od leżącej poniżej tkanki łącznej i mięśni.

Umieść jeden lub dwa gruczoły sutkowe na 10-centymetrowej szalce Petriego i przenieś do kaptura do hodowli tkankowej. Teraz zbadaj gruczoły pod kątem węzłów chłonnych sutka. Małe, dobrze opisane guzki o żółtawym kolorze.

Za pomocą skalpela i kleszczy usuń je z otaczającego gruczołu. Zmiel tkankę sutka w milimetrową kostkę za pomocą dwóch skalpeli. Umieść zmieloną tkankę sutka w stożkowej probówce o pojemności 50 mililitrów z pięcioma mililitrami pożywki dysocjującej.

Wymieszaj go z delikatną tacją i inkubuj przez noc. Następnego dnia trzymaj nakrętkę luźną. Wyizoluj i hoduj pierwotne komórki nabłonka.

Natychmiast po posianiu komórek. Umieść płytkę sześciodołkową bezpiecznie na stoliku mikroskopu w komorze inkubacyjnej. Pozwól talerzowi zrównoważyć się przez co najmniej 15 minut.

Wyreguluj kondensator pod kątem oświetlenia Kohler i wyśrodkuj pierścienie fazowe. Otwórz oprogramowanie do akwizycji obrazów, takie jak velocity, a następnie utwórz i nazwij bibliotekę dla obrazów poklatkowych i zapisz je w lokalizacji z wystarczającą ilością miejsca na duże pliki. Obniż soczewki, aby uniknąć zakłóceń obiektywu stage.

Pod nagłówkiem stage wybierz kalibrację stage ponownie uzyskaj ustawienie płaszczyzny ogniskowej Z jest równe zero pod zakładką X, Y, Z. I oznacz punkty obrazowania, wybierając opcję dodaj punkt pod stołem montażowym. Nagłówek umieść punkty obrazowania w środku każdej studzienki.

Obrazowanie z kontrastem fazowym może być zniekształcone w pobliżu obrzeży studzienek plastikowych. Ułóż punkty w kwadracie w polach cztery na cztery, z których każde nakłada się na siebie w około 5%. Zapisz wybrane punkty pod stołem montażowym.

W obszarze stage wybierz opcję utwórz mapę ostrości i postępuj zgodnie z instrukcjami, aby ustawić fokus każdego punktu. Następnie ustaw czas akwizycji obrazu, aby przechwycił odpowiednią liczbę zdjęć na godzinę. Teraz zapisz mapę ostrości pod sceną.

Kontynuuj, klikając prawym przyciskiem myszy pobieranie obrazu na pasku narzędzi po prawej stronie. Następnie zapisz ustawienia obrazowania. Naciśnij przycisk nagrywania, aby rozpocząć proces obrazowania po godzinie, sprawdź ostrość obrazów, aby zobaczyć, czy potrzebna jest regulacja.

Monitoruj i kontynuuj obrazowanie na żywo przez pięć dni, gdy komórki zaczną się zlewać. Bardzo ważne jest, aby monitorować uzyskane obrazy cyfrowe i często dostosowywać mapę ostrości w ciągu pierwszych 24 godzin, ponieważ komórki będą następnie przyczepiane do płytki co najmniej dwa razy dziennie. Sprawdź, czy komórki są ostre, a kultury nie są zanieczyszczone.

Aby określić mechanizm początkowego tworzenia kolonii, zacznij od pojedynczego stosu obrazów reprezentującego jedno miejsce obrazowania na płytce. W początkowych klatkach komórki będą pływające, komórki nabłonkowe i fibroblasty można odróżnić na podstawie morfologii komórki. Komórki nabłonkowe mają kształt prostopadłościanu i tworzą kolonie komórkowe.

Fibroblasty, rodzaj komórek zrębu, mają wydłużoną morfologię. Postępuj zgodnie z obrazami seryjnymi, aby określić, kiedy pierwsza komórka nabłonka przylega do płytki. Na tym etapie komórki nabłonkowe można zidentyfikować i odróżnić od fibroblastów na podstawie ich bardziej prostopadłościennej morfologii.

Śledź tę pojedynczą komórkę nabłonkową za pomocą seryjnych obrazów i śledź jej los przez kolejne 24 godziny. Zwróć uwagę, czy komórka zostanie otoczona dodatkowymi komórkami nabłonkowymi, przejdzie podział komórkowy lub ulegnie apoptozie Jeśli jest otoczona komórkami nabłonkowymi, mechanizm tworzenia kolonii można określić na podstawie agregacji otoczenia lub podziału komórki. Zapisz liczbę kolonii utworzonych przez agregację komórek w porównaniu z podziałem komórek w ciągu pierwszych 24 godzin, aby określić liczbę początkowo przylegających komórek, które ulegają apoptozie w określonym czasie.

Postępuj zgodnie z obrazami seryjnymi, aby zobaczyć klasyczne cechy apoptozy rozwijające się w komórce, która przylegała z biegiem czasu. Komórki nabłonkowe w hodowli zmieniają swoją morfologię z początkowego prostopadłościennego kształtu na bardziej wydłużony wygląd. Zgodny z EMT.

Postępuj zgodnie z obrazami seryjnymi, aby określić dzień i godzinę po poszyciu W takim przypadku zacznij od uruchomienia programu TTT. Wybierz inicjały użytkownika i kliknij przycisk Kontynuuj. Naciśnij ustaw NAS, wybierz folder eksportu TTT utworzony przez użytkownika i kliknij OK.

W przeglądarce wybierz folder eksperymentu. Wybierz folder pozycji, a następnie naciśnij przycisk załaduj pozycję. Wyślij czynnik oczny do 10 razy.

Załaduj wymaganą liczbę obrazów, która zazwyczaj jest to wszystkie obrazy. Podczas korzystania z tej analizy. Po raz pierwszy w oknie edytora komórek wybierz nową kolonię w menu plik w oknie filmu.

Naciśnij przycisk komórki ścieżki lub naciśnij F dwa. Aby rozpocząć śledzenie komórki. Zidentyfikuj komórkę w oknie filmu i umieść kursor nad tą komórką.

Kółko z numerem komórki powinno pojawić się po kliknięciu F dwa. Użyj zero na klawiaturze numerycznej, aby śledzić położenie komórki i przejść do następnego obrazu. Przesuń kursor, aby śledzić położenie każdej komórki w każdej klatce.

Aby usunąć ścieżkę i powrócić do poprzedniego obrazu, naciśnij Delete na klawiaturze numerycznej, aby przejść do kolejnych klatek bez śledzenia komórki, naciśnij przycisk Trzy. Aby przejść do tyłu bez śledzenia, naciśnij jeden. Aby oznaczyć podział komórki w oknie filmu, kliknij przycisk dzielenia Aby oznaczyć śmierć komórki W oknie filmu kliknij w przycisk śmierci komórki.

Po dokonaniu podziału komórki potomne można śledzić na tej samej mapie losu komórek. Aby to zrobić, przejdź do okna edytora komórek i kliknij prawym przyciskiem myszy symbol okręgu wyznaczonej komórki kropki. Spowoduje to automatyczne uruchomienie trybu śledzenia, teraz naciśnij F 10, aby zapisać drzewo.

Każde drzewo zostanie zapisane w wyznaczonym folderze wyjściowym. Aby uruchomić nową mapę siarczanów w oknie edytora komórek, wybierz menu otwierania, kliknij plik i kliknij. Nowe komórki kolonii były zaokrąglone i unosiły się w powietrzu na początku obrazowania.

Pręty o rozmiarze równym 200 mikronom Po przymocowaniu do płyty stały się płaskie i wykazywały wygląd typu prostopadłościanu. Po czterech dniach hodowli większość komórek nabłonka wydłużyła się do morfologii podobnej do EMT. Zmiana ta nastąpiła w tej samej chronologii we wszystkich badanych genotypach: pływające komórki rozwinęły się w zdefiniowane indywidualne kolonie komórek nabłonkowych.

Po 24 godzinach od posiewu analiza obrazu seryjnego wykazała, że kolonie te były generowane przez agregację komórek, a nie podział komórek. Podczas gdy zakłócenie BRCA samo w sobie nie zmieniło liczby utworzonych kolonii. Dodanie niewydolności haplo TP 53 znacznie zmniejszyło liczbę tworzonych kolonii.

Podobnie, dodanie ER alfa do ekspresji znacznie zwiększyło liczbę kolonii utworzonych po tej procedurze. Inne metody, które wykorzystują obrazowanie poklatkowe w połączeniu ze śledzeniem pojedynczych komórek, można wykonać w celu uzyskania odpowiedzi na dodatkowe pytania, takie jak to, w jaki sposób określone podejścia terapeutyczne lub dodatkowe zmiany genetyczne zmieniają zachowanie komórek i mogą wpływać na odpowiedź terapeutyczną lub progresję raka.