Name: Angiogeneza w niedokrwiennym płucu szczura (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-02-08T13:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 36 s
Description: Poznaj metodę wiązania lewej tętnicy płucnej u szczura w celu indukcji niedokrwienia i oceny neowaskularyzacji oskrzelowej. Technika umożliwia badanie odpowiedzi naczyniowych płuc na isemię przy użyciu fluorescencji i analizy histologicznej.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Doceniamy pracę dr Adlah Sukkar, M.D. w asystowaniu przy zalewaniu płuc. Prace te zostały sfinansowane przez NHLBI, HL088005.

Wszystkie protokoły przeprowadzone na szczurach zostały zatwierdzone przez Komitet ds. Opieki i Użytkowania Zwierząt Uniwersytetu Johnsa Hopkinsa oraz zgodne z wytycznymi NIH. O ile to możliwe, zwierzę powinno być chirurgicznie przygotowane w obszarze oddzielonym od obszaru operacyjnego, aby zminimalizować zanieczyszczenie pola operacyjnego.
1. Znieczulenie/analgezja
<ol>
	<li>Miejsce szczura (samce szczurów Sprague Dawley, 125-150 g; Harlan, Indianapolis, IN) w komorze indukcyjnej z 3% izofluranem.</li>
	<li>Umieść znieczulonego szczura na tablicy operacyjnej przymocowanej do stożka nosowego i respiratora z 3% znieczuleniem izofluranem. Do wszystkich zabiegów używaj sterylnej techniki. Ułóż szczura, aby zapewnić sterylne pole operacyjne.</li>
</ol>
2. Intubacja
<ol>
	<li>Unieruchomić przydatki w pozycji leżącej na plecach za pomocą taśmy chirurgicznej.</li>
	<li>Usuń szczura ze stożka nosa, rozciągnij język za pomocą wyściełanych kleszczyków.</li>
	<li>Użyj kawnika o rozmiarze 14 z metalowym szpilką jako prowadnicą. Wsuń za język, do tchawicy.</li>
	<li>Usuń metalową szpilkę, pozostawiając białą plastikową rurkę śródkatechową w tchawicy. Upewnij się, że szczur oddycha, a powietrze przepływa przez rurkę.</li>
	<li>Zastąp stożek nosowy bezpośrednim adapterem do cewnika, podłącz szczura do respiratora (90 oddechów/min; 8 ml/kg objętości oddechowej; Respirator dla gryzoni model 683, Harvard Apparatus, Holliston, Massachusetts).</li>
	<li>Nałóż maść weterynaryjną Puralube (Butler Schein, Dublin, OH) na oczy.</li>
</ol>
3. Torakotomia
<ol>
	<li>Umieść szczura prawą stroną do dołu, unieruchomij przydatki za pomocą taśmy chirurgicznej.</li>
	<li>Ogolić lewą stronę klatki piersiowej.</li>
	<li>Usuń nadmiar sierści za pomocą małego podciśnienia.</li>
	<li>Zrób sterylne pole, przecierając je alkoholem, a następnie wacikiem z widonu i jodu (Dynarex Corporation, Orangebur, NY). Powtórz ten proces jeszcze dwa razy (w sumie trzy peelingi).</li>
	<li>Wykonaj poprzeczne nacięcie sterylnymi nożyczkami preparacyjnymi lub sterylnym skalpelem na środku pola.</li>
	<li>Tępo przeciąć warstwy tkanki i tłuszczu aż do żeber (ostatnia warstwa to cienka błona pokrywająca żebra).</li>
	<li>Policz żebra, aby określić 3. przestrzeń międzyżebrową.</li>
	<li>Za pomocą sterylnych kleszczy Graefe 45 ° wykonaj nacięcie między 3a 4żebrem.</li>
	<li>Włóż separatory żeber, delikatnie pociągnij, tworząc otwartą pustkę z pełną wizualizacją płuc, umieść taśmę na szwach, aby pozostały otwarte.</li>
</ol>
4. Podwiązanie lewej tętnicy płucnej
<ol>
	<li>Za pomocą kleszczy Graefe 90 ° cofnij lewe płuco prawą ręką.</li>
	<li>Używając kleszczy prostych Dumont wzór #5, chwyć lewą ręką lewą tętnicę płucną i drogi oddechowe. Lewa tętnica płucna będzie leżeć na drogach oddechowych. Upewnij się, że kleszcze są bezpośrednio prostopadłe do stołu. Dodatkowo najskuteczniejsze jest podniesienie lewej tętnicy płucnej / lewego oskrzela głównego w najbardziej dystalnym położeniu (najbliżej miąższu). Odepchnij wentylowane lewe płuco na bok za pomocą tego manewru lewą ręką.</li>
	<li>Użyj kleszczyków zakrzywionych Dumont #5 45 °, aby oddzielić lewą tętnicę płucną od lewego oskrzela głównego na ich naturalnych granicach. Ta linia separacji wydaje się cienka i biała między dwiema pojedynczymi strukturami.</li>
	<li>Oddzielić bezpośrednio pod tętnicą bez przechodzenia przez naczynie; płynnie przesuwaj końcówki kleszczy trzymane razem wzdłuż separacji.</li>
	<li>Kontynuuj, aż końcówki kleszczy widocznie oddzielą lewą tętnicę płucną od lewego oskrzela głównego pnia. Tylko mały punkt końcówki musi być w pełni przepuszczony. Jeśli krew można uwidocznić na czubku kleszczy, oznacza to, że nie jest ona w pełni zakończona i nie należy podejmować prób podwiązania. Po przejściu przez przestrzeń lewa tętnica płucna będzie leżeć na krzywiźnie kleszczy. Przytrzymaj w tej pozycji.</li>
	<li>Delikatnie zwolnij prosty, uchwyt kleszczowy (lewa ręka) i chwyć kawałek wstępnie przyciętego szwu (~ 2-3 cale; szew polipropylenowy rozmiar 6-0; Myco Medical, Cary, Karolina Północna).</li>
	<li>Otwórz zakrzywione kleszcze obejmujące lewą tętnicę płucną i szew chwytający. Delikatnie przeciągnij szew przez przestrzeń między lewą tętnicą płucną a lewym oskrzelem pnia głównego ruchem w górę w stosunku do krzywizny kleszczy.</li>
	<li>Zawiąż zasłaniając lewy płucny kwadratowym węzłem, ostrożnie odetnij pozostałą część szwu.</li>
	<li>Zamknij żebra za pomocą kleszczyków, aby przytrzymać żebro i zszyj dwukrotnie za pomocą polipropylenu (niebieskiego monofilamentu) w rozmiarze 4-0 przymocowanego do igły do odwrotnego cięcia 19 mm, 3/8 koła (Myco Medical, Cary, NC ) w hemostacie, uważając, aby nie zszyć skóry (tylko żebra).</li>
	<li>Wypełnij luźny kwadratowy węzeł, napompuj płuco, umieść dodatnie ciśnienie wydechowe (PEEP; 2-5 cmH2O), przepompuj płuco, a następnie mocno zamocuj węzeł i wykonaj kolejny pełny węzeł przed przecięciem pozostałej części szwu. Usuń z PEEP i wizualizuj przez 30 sekund, aby upewnić się, że płuco się nie zapadnie. Zastosuj 5 kropli Bupiwakainy (APP Pharmaceuticals, Schaumbur, IL).</li>
	<li>Zamknij skórę, nakładając klej tkankowy na ranę i dociśnij skórę do siebie za pomocą tylnego końca aplikatora z bawełnianą końcówką. Podawać bupiwakainę (2,0 mg/kg podskórnie) w miejscu nacięcia, a następnie co 8 godzin przez 24 godziny lub do momentu, gdy zwierzę powróci do normalnej aktywności. Ponieważ warstwa podskórna w tym obszarze jest bardzo cienka, nie jest łatwo zszyć samodzielnie. Po nałożeniu kleju tkankowego i dociśnięciu skóry do siebie, zamyka on również warstwę podskórną.</li>
	<li>Wyłącz gaz izofluranowy, ale kontynuuj wietrzenie szczura przez 1-2 minuty na powietrzu w pomieszczeniu, aż powróci dobrowolny ruch. Odłącz rurkę dotchawiczą od respiratora i upewnij się, że szczur oddycha spontanicznie przed jej usunięciem.</li>
	<li>Wytrzyj Puralube z oczu bawełnianym wacikiem i monitoruj ruch i regenerację. Wstrzyknąć chlorowodorek buprenorfiny (0,05 mg/kg dootrzewnowy, Butler Schein, Dublin OH). Kontynuuj podawanie leków przeciwbólowych co 12 godzin przez 48 godzin po zabiegu.</li>
</ol>
5. Kaniulacja lewej tętnicy szyjnej
Aby ocenić wielkość perfuzji oskrzelowej niedokrwiennego lewego płuca w pożądanych punktach czasowych po podwiązaniu lewej tętnicy płucnej, wstrzyknij oznaczone mikrosfery przez lewą tętnicę szyjną do łuku aorty. Przygotuj szczury jak wyżej 1-2.
<ol>
	<li>Przeciąć linię środkową wzdłuż szyi, tępo rozciąć, aby odsłonić tchawicę i lewą tętnicę szyjną (miejsce wstrzyknięcia mikrosfery).</li>
	<li>Wprowadzić cewnik wypełniony heparynizowaną solą fizjologiczną, końcówką rurki PE20 (Becton Dickinson, Sparks MD) do naczynia podłączonego do igły 25 g, 4-kierunkowego kranu, strzykawki 1 ml.</li>
	<li>Umieść butelkę z mikrosferami (15 μm szkarłatnych polistyrenowych mikrosfer fluorescencyjnych, 1 x 106 kulek/ml; Invitrogen, Eugene, OR) w sonikatorze wodnym przez 30 sek.</li>
	<li>Wyjąć butelkę, odwirować i pobrać 0,5 ml (500 000 mikrosferek) do szklanej strzykawki Hamilton o pojemności 1 ml (Hamilton Company, Reno, NV) za pomocą igły o wadze 20 g.</li>
	<li>Podłączyć strzykawkę Hamilton do 4-kierunkowego kranu i zainfuzjować mikrosfery za pomocą pompy strzykawkowej (szybkość: 500 μl/min; Genie Plus, Kent Scientific, Torrington, CT).</li>
	<li>Wyjąć strzykawkę Hamiltona i aparat do płukania 1 ml soli fizjologicznej z heparzyzacją o stężeniu 500 μl/min.</li>
	<li>Wykonaj pełną torakotomię klatki piersiowej i wykrwawij szczura, przecinając żyłę główną dolną.</li>
	<li>Usuń lewe płuco i inne interesujące tkanki.</li>
	<li>Aby wyekstrahować mikrosfery z tkanki, weź całe lewe płuco szczura po wykrwawieniu i umieść je w 2M KOH (4-6 ml). Umieścić w łaźni wodnej o temperaturze 55 °C i pozostawić na noc do trawienia tkankowego. Dodaj Tween 80 (0,25%), aby umyć kulki, wirować (10 sekund) i odwirować (2 000 obr./min; 20 °C przez 10 min). Usunąć sklarowany osad, dodać octan 2-etoksyetylu (1 ml), odstawić i odstawić na 1 godzinę. Wirować zawiesinę i odwirować (2,000 obr./min; (20 °C przez 10 min). Usunąć warstwę wodną octanu 2-etoksyetylu zawierającą fluorescencję, umieścić w kuwecie i zmierzyć za pomocą spektrofotometru fluorescencyjnego Hitachi F-2500 (wzbudzenie 612/emisja 618; Digilab, Holliston, MA).</li>
</ol>

<ol><li>Weibel, E. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Early+stages+in+the+development+of+collateral+circulation+to+the+lung+in+the+rat%5BTitle%5D)+AND+%22Circulation+Research%22%5BJournal%5D)">Early stages in the development of collateral circulation to the lung in the rat.</a> Circulation Research. 8, 353-376 (1960).</li>
<li>Li, X., Wilson, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Increased+vascularity+of+the+bronchial+mucosa+in+mild+asthma%5BTitle%5D)+AND+%22Am.+J.+Respir.+Crit.+Care+Med%22%5BJournal%5D)">Increased vascularity of the bronchial mucosa in mild asthma.</a> Am. J. Respir. Crit. Care Med. 156, 229-233 (1997).</li>
<li>Turner-Warwick, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Precapillary+systemic-pulmonary+anastomoses%5BTitle%5D)+AND+%22Thorax%22%5BJournal%5D)">Precapillary systemic-pulmonary anastomoses.</a> Thorax. 18, 225-237 (1963).</li>
<li>Muller, K. M., Meyer-Schwickerath, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bronchial+arteries+in+various+stages+of+bronchogenic+carcinoma%5BTitle%5D)+AND+%22Pathol.+Res.+Pract%22%5BJournal%5D)">Bronchial arteries in various stages of bronchogenic carcinoma.</a> Pathol. Res. Pract. 163, 34-46 (1978).</li>
<li>Remy-Jardin, M., Duhamel, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Systemic+Collateral+Supply+in+Patients+with+Chronic+Thromboembolic+and+Primary+Pulmonary+Hypertension%3A+Assessment+with+Multi-Detector+Row+Helical+CT+Angiography%5BTitle%5D)+AND+%22Radiology%22%5BJournal%5D)">Systemic Collateral Supply in Patients with Chronic Thromboembolic and Primary Pulmonary Hypertension: Assessment with Multi-Detector Row Helical CT Angiography.</a> Radiology. , 274-281 (2005).</li>
<li>Karsner, H., Ghoreyeb, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Studies+in+infarction%3A+The+circulation+in+experimental+pulmonary+embolism%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Exp.+Med%22%5BJournal%5D)">Studies in infarction: The circulation in experimental pulmonary embolism.</a> J. Exp. Med. 18, 507-522 (1913).</li>
<li>Endrys, J., Hayat, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparison+of+bronchopulmonary+collaterals+and+collateral+blood+flow+in+patients+with+chronic+thromboembolic+and+primary+pulmonary+hypertension%5BTitle%5D)+AND+%22Heart%22%5BJournal%5D)">Comparison of bronchopulmonary collaterals and collateral blood flow in patients with chronic thromboembolic and primary pulmonary hypertension.</a> Heart. 78, 171-176 (1997).</li>
<li>Virchow, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Uber+die+Standpunkte+in+den+Wissenschaftlichen+Medizin%5BTitle%5D)+AND+%22Virchow+Archiv%22%5BJournal%5D)">Uber die Standpunkte in den Wissenschaftlichen Medizin.</a> Virchow Archiv. 1, 1-19 Forthcoming.</li>
<li>Fadel, E., Mazmanian, G. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lung+reperfusion+injury+after+chronic+or+acute+unilateral+pulmonary+artery+occlusion%5BTitle%5D)+AND+%22Am.+J.+Respir.+Crit.+Care+Med%22%5BJournal%5D)">Lung reperfusion injury after chronic or acute unilateral pulmonary artery occlusion.</a> Am. J. Respir. Crit. Care Med. 157, 1294-1230 (1998).</li>
<li>Charan, N. B., Carvalho, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Angiogenesis+in+bronchial+circulatory+system+after+unilateral+pulmonary+artery+obstruction%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Appl.+Physiol%22%5BJournal%5D)">Angiogenesis in bronchial circulatory system after unilateral pulmonary artery obstruction.</a> J. Appl. Physiol. 82, 284-291 (1997).</li>
<li>Shi, W., Hu, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Altered+reactivity+of+pulmonary+vessels+in+postobstructive+pulmonary+vasculopathy%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Appl.+Physiol%22%5BJournal%5D)">Altered reactivity of pulmonary vessels in postobstructive pulmonary vasculopathy.</a> J. Appl. Physiol. 88, 17-25 (2000).</li>
<li>Shi, W., Giaid, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Increased+reactivity+to+endothelin+of+pulmonary+arteries+in+long-term+post-obstructive+pulmonary+vasculopathy+in+rats%5BTitle%5D)+AND+%22Pulm.+Pharmacol.+Ther%22%5BJournal%5D)">Increased reactivity to endothelin of pulmonary arteries in long-term post-obstructive pulmonary vasculopathy in rats.</a> Pulm. Pharmacol. Ther. 11, 189-196 (1998).</li>
<li>Sukkar, A., Jenkins, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inhibition+of+CXCR2+Attenuates+Bronchial+Angiogenesis+in+the+Ischemic+Rat+Lung%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Appl.+Physiol%22%5BJournal%5D)">Inhibition of CXCR2 Attenuates Bronchial Angiogenesis in the Ischemic Rat Lung.</a> J. Appl. Physiol. 104, 1470-1475 (2008).</li>
<li>Mitzner, W., Lee, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Angiogenesis+in+the+mouse+lung%5BTitle%5D)+AND+%22Am.+J.+Pathol%22%5BJournal%5D)">Angiogenesis in the mouse lung.</a> Am. J. Pathol. 157, 93-101 (2000).</li>
<li>Wagner, E. M., Jenkins, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lung+and+vascular+function+during+chronic+severe+pulmonary+ischemia%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Appl.+Physiol%22%5BJournal%5D)">Lung and vascular function during chronic severe pulmonary ischemia.</a> J. Appl. Physiol. 110, 538-544 (2011).</li>
<li>Remy-Jardin, M., Bouaziz, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bronchial+and+nonbronchial+systemic+arteries+at+multi-detector+row+CT+angiography%3A+comparison+with+conventional+angiography%5BTitle%5D)+AND+%22Radiology%22%5BJournal%5D)">Bronchial and nonbronchial systemic arteries at multi-detector row CT angiography: comparison with conventional angiography.</a> Radiology. 233, 741-749 (2004).</li>
<li>Baluk, P., Tammela, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pathogenesis+of+persistent+lymphatic+vessel+hyperplasia+in+chronic+airway+inflammation%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Clin.+Invest%22%5BJournal%5D)">Pathogenesis of persistent lymphatic vessel hyperplasia in chronic airway inflammation.</a> J. Clin. Invest. 115, 247-257 (2005).</li>
<li>Bailey, S. R., Boustany, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Airway+vascular+reactivity+and+vascularisation+in+human+chronic+airway+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Pulm.+Pharmacol.+Ther%22%5BJournal%5D)">Airway vascular reactivity and vascularisation in human chronic airway disease.</a> Pulm. Pharmacol. Ther. 22, 417-425 (2009).</li>
</ol>

Nie stwierdzono konfliktu interesów.

Podwiązanie lewej tętnicy płucnej u wszystkich badanych gatunków prowadzi do solidnej ogólnoustrojowej neowaskularyzacji niedokrwionego płuca. Przedstawiliśmy szczegóły dostępu chirurgicznego na modelu szczurzym. Nasze wyniki uzyskane za pomocą odlewu naczyniowego, histopatologii i znakowania in vivo pokazują, że tętnice oskrzelowe proliferują i perfundują miąższ płucny. W ten sposób mechanizmy angiogenezy oskrzeli można badać w modelu zwierzęcym, który jest równoległy do stanu ludzkiego przewlekłej choroby zak...

Angiogeneza układowa w płucach jest dobrze rozpoznana. W stanach chorobowych, takich jak astma 2, śródmiąższowe zwłóknienie płuc 3, rak 4 i przewlekła choroba zakrzepowo-zatorowa płuc 5, układowe naczynia krwionośne w płucach i otaczających je rozrastają się i atakują miąższ płucny. Jednak modele zwierzęce do badania tej zróżnicowanej aktywacji krążenia ogólnoustrojowego, a nie płucnego, są nieliczne. Być może najbardziej powtarzalnym modelem ogólnoustrojowej neowaskularyzacji w płucach dorosłego ssaka jest ten, który występuje po wywołaniu przewlekłego niedokrwienia tętnicy płucnej. Reakcją na niedrożność lewej tętnicy płucnej u ludzi w wieku 5-7 lat, psów 8, świń 9, owiec 10, świnek morskich 11, szczurów 1, 12, 13 i myszy 14 jest szybka proliferacja tętnicy oskrzelowej oraz tętnic międzyżebrowych. Mechanizmy odpowiedzialne za ogólnoustrojową neowaskularyzację płuc po niedokrwieniu płuc są w dużej mierze nieznane i nie zostały szeroko zbadane. Przebieg angiogenezy oskrzelowej u szczura po niedrożności lewej tętnicy płucnej został dokładnie opisany w pracy histologicznej Weibela 1. Rozszerzając tę pracę na szczurach, nasze laboratorium skupiło się zarówno na czynnikach wzrostu ważnych w tym procesie, jak i na fizjologicznym wyniku tej neowaskulatury w płucach. Wyniki pokazują, że chemokina CXC CINC-3 jest podwyższona wcześnie po niedokrwieniu, a leczenie szczurów przeciwciałem neutralizującym CXCR2, receptor dla CINC-3, osłabia angiogenezę 13. Wykazano, że nowo utworzone unaczynienie oskrzeli 14 dni po wystąpieniu niedokrwienia płuc jest nieprawidłowe ze znacznie zwiększoną przepuszczalnością białka 15. Czynność lewego płuca nie była prawidłowa, wykazując zmniejszoną zdolność dyfuzyjną i zmniejszenie objętości płuc 15. Chociaż neowaskulatura mogła przyczynić się do zachowania tkanki płucnej podczas przewlekłego niedokrwienia płuc, wydaje się, że nie jest normalna i może przyczyniać się do trwałego pogorszenia czynności płuc.
Być może jednym z najciekawszych aspektów tego modelu jest przestrzenny rozkład proliferujących naczyń krwionośnych. Pomimo uwalniania czynników wzrostu w miąższu płucnym z powodu niedokrwienia, neowaskulatura pochodzi ze stosunkowo dużych tętnic oskrzelowych znajdujących się w górnym strumieniu. Normalna tętnica oskrzelowa powstaje jako mała gałąź z aorty i atakuje drzewo dróg oddechowych w carina. Tak więc mechanizm, za pomocą którego czynniki wzrostu indukują początkową fazę arteriogenezy, nie jest jasny. Sugerujemy, że szczur, o anatomii naczyniowej podobnej do ludzkiej, daje wyjątkową okazję do zbadania mechanizmów odpowiedzialnych za angiogenezę układową podczas niedokrwienia płuc. Chociaż całkowita niedrożność lewej tętnicy płucnej jest rzadkim zjawiskiem u ludzi, zwiększone unaczynienie oskrzeli wydaje się być podobnie indukowane u pacjentów, niezależnie od miejsca i wielkości niedrożności tętnicy płucnej 16. W związku z tym przedstawiamy szczegółowy opis podejścia chirurgicznego do podwiązania lewej tętnicy płucnej u szczurów oraz sposób ilościowego określenia wielkości angiogenezy.

<table><tbody><tr><td>chlorowodorek buprenorfiny, Puralube</td><td>Butler Schein</td><td></td><td></td></tr><tr><td>bupiwakaina</td><td>APP Pharmaceuticals</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Wacik powidonowo-jodowy</td><td>Dynarex Corporation</td><td></td><td></td></tr> szew <tr><td>polipropylenowy rozmiar 6-0, igła do odwróconego cięcia 3/8 koła</td><td>rurka Myco Medical</td><td></td><td></td></tr><tr><td>PE20</td><td>Becton Dickinson</td><td></td><td></td></tr><tr><td>15 &mu; m szkarłatne fluorosfery polistyrenowe</td><td>Invitrogen</td><td></td><td></td></tr><tr><td>1 ml Szklana strzykawka</td><td>Hamilton <</td><td></td><td></td></tr><tr><td>strong> Sprzęt: </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Genie Plus</td> Spektrofotometr fluorescencyjny <td>Kent Scientific</td><td></td><td></td></tr> Respirator dla gryzoni <tr><td></td><td>Digilab</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Model 683</td><td>Aparat</td><td></td><td></td></tr><tr> Harvarda<td colspan="4"><silny>Tabela 1. Tabela konkretnych odczynników i sprzętu.</td></tr></tbody></table>

angiogeneza w niedokrwiennym płucu szczura

Angiogenesis in the Ischemic Rat Lung

Płuco dorosłego człowieka jest perfundowane zarówno przez tętnicę oskrzelową systemową, jak i przez cały powrót żylny przepływający przez tętnice płucne. W większości patologii płuc to mniejsze ugrupowanie naczyniowe reaguje na potrzebę zwiększonej perfuzji płuc i wykazuje solidną neowaskularyzację. Wykazano, że niedokrwienie naczyń płucnych wywołane niedrożnością tętnicy płucnej powoduje szybką układową angiogenezę tętniczą u ludzi, a także w kilku modelach zwierzęcych. Chociaż histologiczna ocena przebiegu proliferacji tętnic oskrzelowych u szczurów została dokładnie opisana przez Weibela 1, mechanizmy odpowiedzialne za ten zorganizowany wzrost nowych naczyń krwionośnych nie są jasne. Przedstawiamy szczegóły chirurgiczne indukowania niedokrwienia lewej tętnicy płucnej u szczura, które prowadzi do neowaskularyzacji oskrzeli. Kwantyfikacja zakresu angiogenezy stanowi dodatkowe wyzwanie ze względu na obecność dwóch łożysk naczyniowych w płucach. Podano metody określania funkcjonalnej angiogenezy na podstawie znakowanych iniekcji mikrosfery.

Odlew naczyniowy: Wyniki efektów niedokrwienia lewej tętnicy płucnej u szczura przedstawiono na Rysunku 1. Przedstawiono odlew z metakrylanu unaczynienia oskrzelowego oraz rozległe unaczynienie drzewa dróg oddechowych po lewej stronie 28 dni po LPAL. Aby uzyskać ten odlew, do unaczynienia systemowego wstrzyknięto mieszaninę metakrylanu (czerwona), wstecznie do aorty zstępującej, a tchawicę kaniulowano i wstrzyknięto do niej materiał na bazie silikonu w kolorze białym. Ten odlew naczyniowy zapewnia wyjątk...

Płuco jest perfundowane zarówno przez tętnicę oskrzelową systemową, jak i tętnice płucne. W większości patologii płuc to mniejsze uczynki układowe wykazują solidną neowaskularyzację. Zatrzymanie przepływu krwi w płucach sprzyja energicznej angiogenezie oskrzeli. Zapewniamy chirurgiczne szczegóły indukowania niedokrwienia lewej tętnicy płucnej, które sprzyja neowaskularyzacji oskrzeli.

Angiogeneza w niedokrwiennym płucu szczura

The  adult lung is perfused by both the systemic bronchial artery and the entire  venous return flowing through the pulmonary arteries. In most lung ...

Ogólnym celem tej procedury jest podwiązanie lewej tętnicy płucnej. Osiąga się to poprzez najpierw intubację i wentylację znieczulonego szczura. Następnie wykonywana jest torakotomia i podwiązanie lewej tętnicy płucnej.Po podwiązaniu klatka piersiowa jest zamykana i szczur może dojść do siebie. Ostatecznie zakres neowaskularyzacji w lewym płucu można ocenić, mierząc poziom fluorescencji w tkance lub innymi metodami histologicznymi. Główną zaletą tej techniki jest to, że daje ona możliwość zbadania rozwoju in vivo i neowaskularyzacji krążenia oskrzelowego w płucach.Daje to możliwość zbadania złożonej struktury 3D tego nowego układu krwionośnego w wentylowanym płucu. Jest to bardzo różne od tego, co obecnie robi większość badaczy, którzy tworzą WHO, którzy przeprowadzają badania in vitro badające proliferację komórek śródbłonka i chemotaksję lub tworzenie rurek. Ogólnie rzecz biorąc, osoby, które dopiero zaczynają tę procedurę, będą miały trudności z próbą wykonania rozwarstwienia między lewą tętnicą płucną a lewym oskrzelem.Jedyna rada, jaką mogę zaoferować, to ćwiczyć, uzbroić się w cierpliwość i często oglądać ten film, aby sprawdzić, czy w podejściu chirurgicznym nie ma drobnych zmian. Demonstruje tę procedurę John Jenkins, technik z mojego laboratorium. Aby rozpocząć, umieść znieczulonego szczura na tablicy operacyjnej i przymocuj stożek nosowy w celu kontynuacji znieczulenia, zaintubuj zwierzę plastikowym cewnikiem i podłącz szczura do respiratora.Po nałożeniu maści na oczy połóż szczura na prawym boku i zaklej przydatki. Usuń włosy z obszaru operacyjnego i przygotuj skórę za pomocą wielokrotnych peelingów Betadine i alkoholu. Gdy będziesz gotowy, wykonaj poprzeczne nacięcie przez skórę.Następnie tępo przeprowadź przez warstwy tłuszczu i tkanki, aby odsłonić klatkę piersiową. Po odsłonięciu zidentyfikuj trzecią przestrzeń międzyżebrową i użyj kleszczy, aby wykonać nacięcie między trzecim a czwartym żebrem. Włóż separatory żeber do otworu i delikatnie pociągnij żebra, aż płuco będzie widoczne.Zabezpiecz otwór. Najpierw przesuń lewe płuco do tyłu prawą ręką. Następnie za pomocą prostych kleszczy chwyć lewą tętnicę płucną i drogi oddechowe lewą stroną.Lewa tętnica płucna powinna leżeć na górze dróg oddechowych, a kleszcze powinny być prostopadłe do stołu. Po wyrównaniu prawidłowo użyj rzeźbionych kleszczy, aby oddzielić tętnicę od lewego głównego oskrzela pnia na ich naturalnych granicach. Ta linia separacji wydaje się cienka i biała między dwiema pojedynczymi strukturami.Uważając, aby nie przejść przez statek. Przesuń końcówki kleszczy wzdłuż separacji. Kontynuuj w ten sposób, aż lewa tętnica płucna znajdzie się na krzywiźnie kleszczy.Lewą ręką delikatnie zwolnij proste kleszcze i chwyć kawałek wstępnie przyciętego szwu. Otwórz zakrzywione kleszcze, obejmując tętnicę na tyle, aby chwycić szew. Delikatnie przeciągnij szew ruchem do góry w stosunku do krzywizny kleszczy.Po przejściu zaciśnij szew, aby zamknąć lewą tętnicę płucną i odetnij pozostały szew, trzymając je razem kleszczami. Zszyj żebra. Uważając, aby nie zszyć skóry luźno.Zawiąż kwadratowy węzeł, który później zamknie żebra. Nadmiernie napompuj płuco, na krótko zamykając linię wydechową respiratora, a następnie zaciśnij szew. Zabezpiecz szew, wykonując kolejny pełny węzeł przed odcięciem końcówek.Usuń końcowe ciśnienie wydechowe i obserwuj przez 30 sekund, aby upewnić się, że płuca się nie zapadną. Na koniec nałóż pięć kropli. Bupiwakainę, zamknij skórę klejem tkankowym.Wyłącz jonizację fluoru, ale kontynuuj wentylację szczura przez jedną do dwóch minut na powietrzu w pomieszczeniu, aż spontaniczne oddychanie powróci do stanu ustalonego. Następnie odłącz rurkę dotchawiczą od respiratora i upewnij się, że szczur oddycha spontanicznie przed jej usunięciem. Miejscowy lek przeciwbólowy należy podawać okresowo przez następne 24 godziny.Na koniec wytrzyj maść z oczu i monitoruj zwierzę, aż wyzdrowieje w pożądanym czasie. Punkty po niedokrwieniu znakowane mikrosferami mogą być wstrzykiwane. Aby ocenić wielkość perfuzji oskrzeli, stosuje się pompę infuzyjną o małej objętości, która dostarcza znakowane mikrosfery do lewej tętnicy szyjnej ze stałą szybkością.Podłącz cewnik do igły o rozmiarze 25 i czterokierunkowego kranu odcinającego. Na początek postępuj zgodnie z przygotowanymi wcześniej przygotowaniami chirurgicznymi. Gdy będziesz gotowy, wykonaj nacięcie nad linią środkową wzdłuż szyi.Wypreparuj tkankę, aby odsłonić tchawicę i lewą tętnicę szyjną. Po odizolowaniu od dwóch szwów pod tętnicą szyjną mocno zawiąż szew proksymalny. Następnie wykonaj małe nacięcie w tętnicy i wprowadź cewnik wypełniony solą fizjologiczną.Zabezpiecz to na miejscu za pomocą szwu poprzedzającego. Ten odlew naczyniowy zapewnia niezwykłą wizualizację angiogenezy oskrzeli w płucach. 28 dni po podwiązaniu lewej tętnicy w tym miejscu pokazany jest odcinek dróg oddechowych z lewego płuca trzy dni po zabiegu.Zwróć uwagę na dwa wystające naczynia oskrzelowe wypełnione czerwonymi krwinkami znajdującymi się w ścianie dróg oddechowych. Wstawka jest barwiona, aby pokazać proliferujące komórki śródbłonka tętnicy oskrzelowej. Ten przykład pokazuje wycinek lewego płuca pobrany 14 dni po podwiązaniu.Należy zwrócić uwagę na zwiększony rozmiar naczyń oskrzelowych w tym punkcie czasowym i zwiędłą fluorescencję tętnicy płucnej używaną do oceny wielkości perfuzji ogólnoustrojowej była praktycznie niewykrywalna w lewym płucu nieleczonych szczurów. Jednak u szczurów w lewym płucu mierzony był znaczny, znaczący i stały poziom. Studiował 14 dni po podwiązaniu Raz opanowane.Tę technikę można wykonać w mniej niż godzinę, jeśli zostanie wykonana prawidłowo. Po obejrzeniu tego filmu powinieneś dobrze zrozumieć, jak zaintubować szczura, wykonać torakotomię i pomyślnie podwiązać tętnicę płucną. W zależności od zmiennej wynikowej powinieneś być w stanie kaniulować lewą tętnicę szyjną i podać znakowane mikrosfery do analizy perfuzji.

Research

JoVE Journal

Medicine

Medycyna

Angiogeneza w niedokrwionym płucu szczura

Normalna unaczyniona tkanka ssaka dorosłego, w której nie zachodzi fizjologiczna angiogeneza i która nie była poddana interwencji chirurgicznej, jest wykorzystywana do badania: (i) inicjacji i rozwoju angiogenezy po podaniu środków testowych do jamy otrzewnej; oraz (ii) modyfikacji angiogenezy po systemowym podaniu wybranych środków testowych.

Test angiogenezy w krezoni szczura

Zacznij od szczura poddanego niedrożności tętnicy środkowej mózgu, zabiegowi chirurgicznemu, który tymczasowo blokuje przepływ krwi do tkanki mózgowej.Wywołuje to udar niedokrwienny, prowadzący do uszkodzenia tkanki mózgowej.Następnie usuń blokadę, aby przywrócić przepływ krwi.Wybierz szczury, które wykazują deficyty neurologiczne, aby zapewnić przydatność do badania.Następnie podaj badany lek grupie eksperymentalnej, jednocześnie wstrzykując sól fizjologiczną drugiej grupie.Powtórz podawanie...

Ocena efektów angiogenezy badanego leku w szczurzym modelu udaru niedokrwiennego

Izolowany preparat płucny z perfuzją krwi umożliwia wizualizację sieci mikronaczyń na powierzchni płuc. W tym miejscu opisujemy podejście do ilościowego określania przepuszczalności pojedynczych mikronaczyń w izolowanych płucach za pomocą obrazowania fluorescencyjnego w czasie rzeczywistym.

Kwantyfikacja przepuszczalności pojedynczych mikronaczyń w izolowanym preparacie płuc szczura z perfuzją krwi

Rekapitulacja mikrośrodowiska specyficznego dla danego narządu, która stymuluje miejscową angiogenezę, jest niezbędna do skutecznej regeneracji uszkodzonych tkanek. W niniejszym raporcie przedstawiono nowatorską metodę wszczepiania żeli fibrynowych na powierzchnię płuc żywej myszy w celu zbadania, w jaki sposób mikrośrodowisko specyficzne dla płuc moduluje angiogenezę i regenerację pęcherzyków płucnych u dorosłych myszy.

Implantacja żelu fibrynowego do płuca myszy w celu zbadania angiogenezy specyficznej dla płuc

Ten protokół wykorzystuje cewnik balonowy do spowodowania uszkodzenia śródświetlnego tętnicy szyjnej szczura i wywołania przerostu neointimalu. Jest to dobrze ugruntowany model do badania mechanizmów przebudowy naczyń krwionośnych w odpowiedzi na uraz. Jest również szeroko stosowany do określania ważności potencjalnych podejść terapeutycznych.

Uszkodzenie balonu naczyniowego i podanie śródświetlne w tętnicy szyjnej szczura

Podawanie leków na przywrócenie funkcji nerek wymaga kontroli lokalizacji i dystrybucji związku terapeutycznego. Tutaj szczegółowo opisujemy prostą technikę donerkowego podawania leków szczurom. Procedura ta może być łatwo wykonana bez śmiertelności i z wysoką odtwarzalnością.

Donaczyniowe podawanie leków biologicznych do nerki szczura

Tutaj prezentowany jest krytyczny eksperymentalny model niedokrwienia kończyn tylnych, a następnie przeprowadzany jest zestaw testów funkcjonalnych, histologicznych i molekularnych w celu oceny skuteczności terapii angiogennych.

Ocena angiogenezy terapeutycznej w mysim modelu niedokrwienia kończyn tylnych

Retinopatia indukowana tlenem (OIR) może być używana do modelowania chorób niedokrwiennych siatkówki, takich jak retinopatia wcześniaków i proliferacyjna retinopatia cukrzycowa, a także służyć jako model dla badań potwierdzających słuszność koncepcji w ocenie leków antyangiogennych w chorobach neowaskularnych. OIR indukuje solidną i powtarzalną neowaskularyzację w siatkówce, którą można określić ilościowo.

Model retinopatii indukowanej tlenem w chorobach niedokrwiennych siatkówki u gryzoni

Tutaj prezentujemy optymalizacje modelu przeszczepu płuc szczurów, które służą poprawie wyników. Zapewniamy przewodnik po rozmiarach mankietów w oparciu o masę ciała, strategię pomiaru w celu ustalenia 4. przestrzeni międzyżebrowej oraz metody zamykania ran i pobierania płynu BAL (płukanie oskrzelowo-pęcherzykowe) i tkanek.

Model przeszczepu płuc szczura uszkodzenia cieplnego niedokrwienia/reperfuzji: optymalizacje w celu poprawy wyników

Protokół przedstawia wykonalną, niezawodną i powtarzalną metodę zaciskania wnęki lewej płucy, która może być wykorzystana do badania uszkodzenia niedokrwienno-reperfuzyjnego płuc w modelach mysich.

Mysi lewy klamra płucny Hilar Clamp Urazu Reperfuzyjnego Niedokrwienia Płuc

Opisano szczegółową metodologię tworzenia minimalnie inwazyjnego szczurzego modelu zatorowości płucnej przy użyciu autologicznych skrzepów krwi. Podano również dodatkowe metody ilościowego określania obszaru zawału i wizualizacji drzewa tętnicy płucnej.

Opracowanie małoinwazyjnego szczurzego modelu zatorowości płucnej przy użyciu autologicznych skrzepów krwi

Poznaj metodę wiązania lewej tętnicy płucnej u szczura w celu indukcji niedokrwienia i oceny neowaskularyzacji oskrzelowej. Technika umożliwia badanie odpowiedzi naczyniowych płuc na isemię przy użyciu fluorescencji i analizy histologicznej.

Angiogeneza w niedokrwiennym płucu szczura

Przeglądaj więcej filmów