Name: Preparat liposomów olbrzymich do obrazowania i elektrofizjologii patch-clamp (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-06-21T12:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 3 s
Description: Poznaj metodę przygotowania olbrzymich jednowarstwowych liposomów zachowujących integralność białek błonowych. Technika obejmuje osadzanie lipidów na przewodzącej powierzchni, odparowanie rozpuszczalnika, rehydratację i elektroformowanie.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Dziękujemy Bryanowi Venemie i Ericowi Martinsonowi za skonstruowanie urządzenia do elektroformacji. Praca ta została sfinansowana z grantów Narodowych Instytutów Ogólnych Nauk Medycznych Narodowych Instytutów Zdrowia (R01GM100718 SEG) oraz Narodowego Instytutu Oka Narodowych Instytutów Zdrowia (R01EY017564 SEG).

1. Osadzanie lipidów z rozpuszczalników organicznych: Klasyczny protokół
<ol>
	<li>Usunąć lipidy z magazynu w temperaturze -20 °C lub -80 °C; ogrzać do temperatury słonecznej. Uwaga: lipidy są wyjątkowo higroskopijne, a wiele z nich jest wrażliwych na tlen. Pokryj lipidy suchym argonem lub azotem i na wszystkich etapach zminimalizuj narażenie na działanie powietrza.</li>
	<li>Jeśli to konieczne, zawiesić lipidy w chloroformie lub cykloheksanie w stężeniu 1-10 mg/ml; należy pamiętać, że podane przez producenta stężenia są zazwyczaj tylko nominalne. UWAGA: Podczas stosowania rozpuszczalników organicznych należy nosić odpowiednie rękawice i inne środki ochrony osobistej. W przypadku rozlania na nie rozpuszczalnika należy szybko zdjąć środki ochrony indywidualnej, ponieważ większość materiałów jest nadal przepuszczalna dla tych rozpuszczalników i zapewniają one tylko tymczasową ochronę.</li>
	<li>Wyczyść obie strony dwóch szkiełek szklanych z powłoką ITO o wymiarach 25 x 37,5 mm za pomocą etanolu</li>
	<li>Wymieszaj lipidy, aby uzyskać pożądane proporcje molowe. Na każde 1cm2 powierzchni szkiełek ITO, które mają być pokryte lipidem, należy wymieszać ~15-20 μg lipidów. Na przykład, jeśli oba szkiełka o wymiarach 25 x 37,5 mm miałyby być w pełni pokryte, zwykle używalibyśmy 30 μl mieszaniny lipidów o stężeniu 10 mg/ml. Uwaga: dodać 0,1% mol Texas Red-DPPE do obrazowania fluorescencyjnego i zapoznać się z poniższymi ostrzeżeniami dotyczącymi barwników fluorescencyjnych.</li>
	<li>Sprawdź, czy strona szkiełek pokryta ITO jest skierowana do góry, mierząc rezystancję powierzchniową za pomocą omomierza lub multimetru.</li>
	<li>Odessać lipidy do strzykawki odpornej na działanie rozpuszczalników. ostrożność: Żadne kleje ani tworzywa sztuczne, inne niż PTFE, nie powinny mieć kontaktu z rozpuszczalnikiem organicznym.</li>
	<li>Gdy igła strzykawki nie dotyka całkowicie powierzchni ITO, powoli nakładaj lipid, przesuwając igłę w przód iw tył po szkiełku. Pokryj powierzchnię tak równomiernie, szukając "tęczowego połysku" na szklanej powierzchni.</li>
	<li>Umieść szkiełka szybko pod < 1 torr (1 mmHg) próżnię na 0,5-1 godziny, aby usunąć wszelkie śladowe ilości rozpuszczalnika. Uwolnić próżnię za pomocą gazu obojętnego.</li>
	<li>Nałożyć silikonową uszczelkę z cienką warstwą silikonowego smaru próżniowego po obu stronach. Pozostaw co najmniej 5 mm odkrytego szkiełka odsłoniętego odsłoniętego na jednym końcu szkiełka.</li>
	<li>Przejdź natychmiast do sekcji 4.</li>
</ol>
2. Preparat do małego liposomu do kontrolowanego odwodnienia
<ol>
	<li>Przygotować mieszaninę lipidów jak w krokach 1.1-1.4.</li>
	<li>Wysuszyć lipidy za pomocą strumienia argonu lub azotu w probówce hodowlanej o średnicy 10-15 mm. W przypadku małych ilości lipidów, ≤0,5 mg, powstały film można uwodnić bezpośrednio po umieszczeniu go w próżni na 0,5-1 godziny w celu usunięcia pozostałości rozpuszczalnika; Przejdź do kroku 2.5. Większe ilości lipidów mają tendencję do zatrzymywania rozpuszczalników organicznych w gęstym żelu, nawet w próżni, i są lepiej przygotowywane przez liofilizację; Zobacz kroki 2.3-4.</li>
	<li>Zawiesić wysuszony film lipidowy w cykloheksanie, pokryć argonem i zamknąć korkiem, umieścić probówkę w zimnym bloku i zamrażać w temperaturze -80 °C przez minimum 1 godzinę.</li>
	<li>Umieścić zimny blok i próbkę lipidów w układzie próżniowym zdolnym do osiągnięcia 100 mTorr. Zastosuj próżnię; "zatrzyma się" na około 1 Torr, gdy rozpuszczalnik sublimuje. Po całkowitym usunięciu rozpuszczalnika (~1 godzina) próżnia spadnie poniżej tego poziomu. Uwolnić próżnię gazem obojętnym i natychmiast uszczelnić rurkę lub uwodnić.</li>
	<li>Podczas gdy lipidy są pod próżnią, odgazowuj bufor hydratacyjny za pomocą próżni i spryskiwania15-17.</li>
	<li>Uwodnić lipidy za pomocą odgazowanego buforu o końcowym stężeniu 1-10 mg/ml. Pozwól lipidom powoli się uwodnić. Po 30 min-1 godz. przeprowadź wir, aby rozbić pozostałe grudki. Odczekaj dodatkowe 0,5-1 godziny, aby zapewnić pełne nawodnienie. Użyj środka osmotycznego, takiego jak sorbitol lub sacharoza do 200 mM, aby zapobiec całkowitemu odwodnieniu w poniższych krokach.</li>
	<li>Przygotuj liposomy o średnicy 100-200 nm przez wytłaczanie. Szczegółowe informacje można znaleźć w protokole wytłaczania producenta. Należy pamiętać, że bufor musi mieć siłę jonową mniejszą niż ~25 mM, w przeciwnym razie potrzebne będą specjalne protokoły napięcia elektroformacji w sekcji 4.</li>
</ol>
3. Odkładanie lipidów przez kontrolowane odwodnienie małych liposomów
<ol>
	<li>Uwaga: Nasz protokół wymaga, aby lipidy były umieszczone w równowadze parowej z nasyconymi roztworami soli przez wiele godzin. Zdecydowanie zalecamy wykonanie protokołu w atmosferze gazu obojętnego, przy użyciu schowka rękawicowego lub podobnej obudowy.</li>
	<li>Uwaga: Przygotowując próbki zawierające białka, unikaj całkowitego odwodnienia. Nawodnij atmosferę w dowolnej obudowie za pomocą zlewki z ciepłą wodą lub nawilżacza opartego na sonikatorze. Użyj higrometru, aby upewnić się, że wilgotność względna wynosi co najmniej 30%. Użyj sorbitolu lub sacharozy w małym buforze liposomowym jako dodatkowy środek ostrożności, aby zapobiec całkowitemu odwodnieniu.</li>
	<li>Przygotować nasycony roztwór soli o odpowiedniej wilgotności względnej. Wilgotność docelowa zależy od osmolarności preparatu pęcherzykowego. W przypadku preparatów o fizjologicznej wilgotności względnej należy stosować 30-45% wilgotności względnej, podczas gdy preparaty pęcherzykowe o niskiej osmolarności można odpowiednio odwodnić w równowadze z wilgotnością względną 75-90% (patrz również tabela 1).</li>
	<li>Nasycony roztwór soli i nadmiar soli umieść w szczelnie zamykanym pojemniku z wewnętrzną półką. Bardzo dobrze sprawdzają się komercyjne pojemniki na jogurt i granolę. Po napełnieniu wymień półkę i upewnij się, że płyn znajduje się 5-10 mm poniżej półki.</li>
	<li>Wyczyść szkiełka z powłoką ITO, jak w rozdziale 1. Użyj multimetru, aby określić, która strona jest przewodząca, i oznacz stronę nieprzewodzącą nazwą próbki.</li>
	<li>Lekko nasmaruj obie strony silikonowej (USP Grade VI) uszczelki (uszczelek) z jednym lub wieloma otworami.</li>
	<li>Umieść szkiełka przewodzącą stroną do góry na stole i nałóż silikonową uszczelkę (uszczelki) na każde szkiełko, na które zostanie nałożony lipid, upewniając się, że na jednym końcu znajduje się co najmniej 5 mm odsłoniętego szkiełka, które można podłączyć do aparatu do elektroformacji. Wygładź uszczelkę, aby zapewnić dobre uszczelnienie.</li>
	<li>Rozcieńczyć preparat pęcherzykowy w buforze izosmotycznym o niskiej zawartości soli do ~1-2 mg/ml. Okazuje się, że wyższe stężenia dają słabe wyniki.</li>
	<li>Nałóż lipid na szkiełko w kroplach 1-10 μl. Mniejsze krople na ogół dają lepsze rezultaty.</li>
	<li>Umieść szkiełko na wewnętrznej półce nad nasyconym roztworem soli i szczelnie zamknij pojemnik. Wyjazd w RT na 3 godziny do O/N. Pojemnik można umieścić w temperaturze 4 °C, ale należy pamiętać, że w przypadku niektórych soli wilgotność względna zależy silnie od temperatury, a zimno wydłuży czas równowagi.</li>
	<li>Powstały film może mieć lekki tęczowy połysk, ale w każdym razie powinien wyglądać na prawie wysuszony. Wysoce osmotyczne roztwory wyjściowe mogą być niemożliwe do całkowitego wyschnięcia do filmu lipidowego; Nie wpłynie to negatywnie na wyniki.</li>
</ol>
4. Elektroformacja gigantycznych liposomów
<ol>
	<li>Filmy lipidowe, zwłaszcza te powstałe z odwodnionych liposomów, łatwo się usuwają. Ostrożnie nawodnij każdą studzienkę, umieszczając igłę strzykawki o strzykawce 27 G na krawędzi uszczelki i powoli nakładając bufor. mogą zawierać wodę, ≤200 mM sacharozy, ≤1 M sorbitolu i ≤5 mM HEPES. Roztwór soli o stężeniu większym niż 10 mM może wymagać alternatywnych protokołów napięcia galwanizacji. Przepełnij dobrze każdą uszczelkę o ~10%.</li>
	<li>Uwaga: po uwodnieniu lipidów szybko przejdź przez pozostałe kroki, ponieważ filmy lipidowe zaczynają się natychmiast rozwarstwiać. Wydajność i wielkość są maksymalizowane, jeśli elektroformacja rozpocznie się szybko.</li>
	<li>Jednym płynnym ruchem nałóż drugi szkiełko ITO, przewodząc od wewnątrz do wewnątrz, na górną część uszczelki. Upewnij się, że co najmniej 5 mm zwisu znajduje się poza obszarem uszczelki i naprzeciwko pierwszego zwisu. Delikatnie dociśnij, aby zapewnić dobre uszczelnienie.</li>
	<li>Oczyść dwa zwisy za pomocą etanolu i sprawdź, czy boki skierowane w stronę uszczelki przewodzą prąd z multimetrem.</li>
	<li>W razie potrzeby komorę można dodatkowo zabezpieczyć za pomocą parafilmu lub lekkich klipsów sprężynowych naciągowych.</li>
	<li>Podłącz komorę galwanoformacyjną do źródła napięcia, zabezpieczając pręty aluminiowe lub miedziane, "piankę uszczelniającą EMI" lub przewodzącą taśmę klejącą do przewodzących powierzchni dwóch szkiełek. Używamy pianki uszczelniającej EMI. Plany przyrządu i zacisku pokazano na rysunku 5.</li>
	<li>Sprawdź, czy nie ma zwarcia elektrycznego między stykami i czy styki są prawidłowo połączone z powierzchniami ITO za pomocą multimetru.</li>
	<li>Podgrzać komorę o 10 °C powyżej najwyższej temperatury topnienia spośród wszystkich obecnych lipidów; np. w przypadku DPPC podgrzać co najmniej do 52 °C, 10 °C powyżej temperatury topnienia łańcucha wynoszącej 42 °C.</li>
	<li>W przypadku o niskiej zawartości soli należy zastosować falę sinusoidalną 10 Hz, ~0,7 Vrms na każdy milimetr przerwy między dwiema powierzchniami pokrytymi ITO, przez 60-90 minut. W przypadku o wysokiej zawartości soli należy stosować inne protokoły napięciowe (patrz referencje).</li>
</ol>
5. Obrazowanie i rozwiązywanie problemów
<ol>
	<li>Zobrazuj liposom za pomocą odwróconego mikroskopu wyposażonego w kostkę filtrującą do barwników Rhodamine lub Texas Red. Liposom powinien być kulisty, przeważnie jednopłytkowy na oko i wolny od wad, takich jak "sznurki" zwisające z liposomu.</li>
	<li>Jeśli liposomy są zbyt małe, użyj mniej lipidów.</li>
	<li>Jeśli występuje wiele wad lub niewiele liposomów, może to być spowodowane lipidami w fazie żelowej. Rozważ podniesienie temperatury elektroformacji.</li>
	<li>Jeśli z odwodnionych małych liposomów powstało niewiele gigantycznych liposomów lub nie ma ich wcale, zmniejsz siłę osmotyczną buforu liposomowego lub zwiększ siłę osmotyczną buforu elektroformacyjnego. Wlew buforu do stężonego śródmiąższowego roztworu buforowego może spowodować rozwarstwienie zdeponowanego filmu lipidowego.</li>
	<li>Jeśli wydajność, jakość lub rozmiar pęcherzyków jest niska, a do elektroformacji lub liposomów włączono sole lub pH, rozważ alternatywne protokoły napięcia elektroformacji. Na przykład Pott i wsp.11, zaleca trzyetapowy protokół przy użyciu fali sinusoidalnej 500 Hz, podnosząc napięcie z 50-1,300 Vpp / m przez 30 minut, utrzymując przez 90 minut, a następnie zmniejszając częstotliwość do 50 Hz w ciągu 30-60 minut. W takim przypadku mogą być potrzebne elektrody platynowe lub tytanowe, ale nie zmieni to zasadniczo protokołu.</li>
</ol>

<ol><li>Dimova, R., Aranda, S., Bezlyepkina, N., Nikolov, V., Riske, K. A., Lipowsky, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+practical+guide+to+giant+vesicles.+Probing+the+membrane+nanoregime+via+optical+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Physics-Condensed+Matter%22%5BJournal%5D)">A practical guide to giant vesicles. Probing the membrane nanoregime via optical microscopy.</a> Journal of Physics-Condensed Matter. 18 (28), S1151-S1176 (2006).</li>
<li><a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=%22Giant+Vesicles%22">Giant Vesicles</a>. Luisi, P. L., Walde, P. , John Wiley & Sons Ltd. (2000).</li>
<li>Riquelme, G., Lopez, E., Garcia-Segura, L. M., Ferragut, J. A., Gonzalez-Ros, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Giant+liposomes%3A+a+model+system+in+which+to+obtain+patch-clamp+recordings+of+ionic+channels%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Giant liposomes: a model system in which to obtain patch-clamp recordings of ionic channels.</a> Biochemistry. 29 (51), 11215-11222 (1990).</li>
<li>Walde, P., Cosentino, K., Engel, H., Stano, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Giant+vesicles%3A+preparations+and+applications%5BTitle%5D)+AND+%22Chembiochem%22%5BJournal%5D)">Giant vesicles: preparations and applications.</a> Chembiochem. 11 (7), 848-865 (2010).</li>
<li>Aimon, S., Manzi, J., Schmidt, D., Poveda Larrosa, J. A., Bassereau, P., Toombes, G. E. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functional+reconstitution+of+a+voltage-gated+potassium+channel+in+giant+unilamellar+vesicles%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS.+One%22%5BJournal%5D)">Functional reconstitution of a voltage-gated potassium channel in giant unilamellar vesicles.</a> PLoS. One. 6 (10), e25529(2011).</li>
<li>Girard, P., Pecreaux, J., Lenoir, G., Falson, P., Rigaud, J. L., Bassereau, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+new+method+for+the+reconstitution+of+membrane+proteins+into+giant+unilamellar+vesicles%5BTitle%5D)+AND+%22Biophys.+J%22%5BJournal%5D)">A new method for the reconstitution of membrane proteins into giant unilamellar vesicles.</a> Biophys. J. 87 (1), 419-429 (2004).</li>
<li>Manley, S., Gordon, V. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Making+giant+unilamellar+vesicles+via+hydration+of+a+lipid+film%5BTitle%5D)+AND+%22Curr.+Protoc.+Cell.+Biol%22%5BJournal%5D)">Making giant unilamellar vesicles via hydration of a lipid film.</a> Curr. Protoc. Cell. Biol. 24, 1-13 (2008).</li>
<li>Rodriguez, N., Pincet, F., Cribier, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Giant+vesicles+formed+by+gentle+hydration+and+electroformation%3A+a+comparison+by+fluorescence+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Colloids.+Surf.+B.+Biointerfaces%22%5BJournal%5D)">Giant vesicles formed by gentle hydration and electroformation: a comparison by fluorescence microscopy.</a> Colloids. Surf. B. Biointerfaces. 42 (2), 125-130 (2005).</li>
<li>Angelova, M. I., Soleau, S., Meleard, P., Faucon, J. F., Bothorel, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Preparation+of+giant+vesicles+by+external+AC+electric+fields.+Kinetics+and+applications%5BTitle%5D)+AND+%22Progressin+Colloid+%26+Polymer+Science%22%5BJournal%5D)">Preparation of giant vesicles by external AC electric fields. Kinetics and applications.</a> Progressin Colloid & Polymer Science. 89, 127-131 (1992).</li>
<li>Politano, T. J., Froude, V. E., Jing, B., Zhu, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((AC-electric+field+dependent+electroformation+of+giant+lipid+vesicles%5BTitle%5D)+AND+%22Colloids.+Surf.+B.+Biointerfaces%22%5BJournal%5D)">AC-electric field dependent electroformation of giant lipid vesicles.</a> Colloids. Surf. B. Biointerfaces. 79 (1), 75-82 (2010).</li>
<li>Pott, T., Bouvrais, H., Méléard, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Giant+unilamellar+vesicle+formation+under+physiologically+relevant+conditions%5BTitle%5D)+AND+%22Chem.+Phys.+Lip%22%5BJournal%5D)">Giant unilamellar vesicle formation under physiologically relevant conditions.</a> Chem. Phys. Lip. 154 (2), 115-119 (2008).</li>
<li>Sens, P., Isambert, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Undulation+Instability+of+Lipid+Membranes+under+an+Electric+Field%5BTitle%5D)+AND+%22Phys.+Rev.+Lett%22%5BJournal%5D)">Undulation Instability of Lipid Membranes under an Electric Field.</a> Phys. Rev. Lett. 88 (12), (2002).</li>
<li>Green, N. G., Ramos, A., González, A., Morgan, H., Castellanos, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fluid+flow+induced+by+nonuniform+ac+electric+fields+in+electrolytes+on+microelectrodes.+I.+Experimental+measurements%5BTitle%5D)+AND+%22Phys.+Rev.+E%22%5BJournal%5D)">Fluid flow induced by nonuniform ac electric fields in electrolytes on microelectrodes. I. Experimental measurements.</a> Phys. Rev. E. 61 (4), 4011-4018 (2000).</li>
<li>Baykal-Caglar, E., Hassan-Zadeh, E., Saremi, B., Huang, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Preparation+of+giant+unilamellar+vesicles+from+damp+lipid+film+for+better+lipid+compositional+uniformity%5BTitle%5D)+AND+%22Biochim.+Biophys.+Acta%22%5BJournal%5D)">Preparation of giant unilamellar vesicles from damp lipid film for better lipid compositional uniformity.</a> Biochim. Biophys. Acta. 1818 (11), 2598-2604 (2012).</li>
<li>Bakalyar, S. R., Bradley, M. P. T., Honganen, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+role+of+dissolved+gases+in+high+-performance+liquid+chromatography%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Chromatogr.+A%22%5BJournal%5D)">The role of dissolved gases in high -performance liquid chromatography.</a> J. Chromatogr. A. 158 (0), 277-293 (1978).</li>
<li>Brown, J. N., Hewins, M., Van Der Linden, J. H. M., Lynch, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Solvent+degassing+and+other+factors+affecting+liquid+chromatographic+detector+stability%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Chromatogr.+A%22%5BJournal%5D)">Solvent degassing and other factors affecting liquid chromatographic detector stability.</a> J. Chromatogr. A. 204, 115-122 (1981).</li>
<li>Dolan, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mobile+Phase+Degassing-Why%2C+When%2C+and+How%5BTitle%5D)+AND+%22LC-GC%22%5BJournal%5D)">Mobile Phase Degassing-Why, When, and How.</a> LC-GC. 17 (10), 909-912 (1999).</li>
<li>Cheng, H., Jiang, X., Han, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Alterations+in+lipid+homeostasis+of+mouse+dorsal+root+ganglia+induced+by+apolipoprotein+E+deficiency%3A+a+shotgun+lipidomics+study%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurochem%22%5BJournal%5D)">Alterations in lipid homeostasis of mouse dorsal root ganglia induced by apolipoprotein E deficiency: a shotgun lipidomics study.</a> J. Neurochem. 101 (1), 57-76 (2007).</li>
<li>Greenspan, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Humidity+fixed+points+of+binary+saturated+aqueous+solutions%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Res.+Natl.+Bur.+Stand%22%5BJournal%5D)">Humidity fixed points of binary saturated aqueous solutions.</a> J. Res. Natl. Bur. Stand. 81 (1), 89-96 (1977).</li>
<li>Rockland, L. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Saturated+Salt+Solutions+for+Static+Control+of+Relative+Humidity+between+5+%C2%B0+and+40+%C2%B0C%5BTitle%5D)+AND+%22Anal.+Chem%22%5BJournal%5D)">Saturated Salt Solutions for Static Control of Relative Humidity between 5 ° and 40 °C.</a> Anal. Chem. 32 (10), 1375-1376 (1960).</li>
<li>Washburn, E. W. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aWashburn%2C+EW+%22International+Critical+Tables+of+Numerical+Data%2C+Physics%2C+Chemistry+and+Technology+%281st+Electronic+Edition%29%22">International Critical Tables of Numerical Data, Physics, Chemistry and Technology (1st Electronic Edition)</a>. , 216-249 (2003).</li>
<li>Estes, D. J., Mayer, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Giant+liposomes+in+physiological+buffer+using+electroformation+in+a+flow+chamber%5BTitle%5D)+AND+%22Biochim.+Biophys.+Acta%22%5BJournal%5D)">Giant liposomes in physiological buffer using electroformation in a flow chamber.</a> Biochim. Biophys. Acta. 1712 (2), 152-160 (2005).</li>
<li>Ayuyan, A. G., Cohen, F. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lipid+Peroxides+Promote+Large+Rafts%3A+Effects+of+Excitation+of+Probes+in+Fluorescence+Microscopy+and+Electrochemical+Reactions+during+Vesicle+Formation%5BTitle%5D)+AND+%22Biophys.+J%22%5BJournal%5D)">Lipid Peroxides Promote Large Rafts: Effects of Excitation of Probes in Fluorescence Microscopy and Electrochemical Reactions during Vesicle Formation.</a> Biophys. J. 91 (6), 2172-2183 (2006).</li>
<li>Morales-Penningston, N. F., Wu, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((GUV+preparation+and+imaging%3A+minimizing+artifacts%5BTitle%5D)+AND+%22Biochim.+Biophys.+Acta%22%5BJournal%5D)">GUV preparation and imaging: minimizing artifacts.</a> Biochim. Biophys. Acta. 1798 (7), 1324-1332 (2010).</li>
<li>Grit, M., de Smidt, J. H., Struijke, A., Crommelin, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hydrolysis+of+phosphatidylcholine+in+aqueous+liposome+dispersions%5BTitle%5D)+AND+%22Int.+J.+Pharm%22%5BJournal%5D)">Hydrolysis of phosphatidylcholine in aqueous liposome dispersions.</a> Int. J. Pharm. 50 (1), 1-6 (1989).</li>
<li>Zhou, Y., Berry, C. K., Storer, P. A., Raphael, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Peroxidation+of+polyunsaturated+phosphatidyl-choline+lipids+during+electroformation%5BTitle%5D)+AND+%22Biomaterials%22%5BJournal%5D)">Peroxidation of polyunsaturated phosphatidyl-choline lipids during electroformation.</a> Biomaterials. 28 (6), 1298-1306 (2007).</li>
<li>Farkas, E. R., Webb, W. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multiphoton+polarization+imaging+of+steady-state+molecular+order+in+ternary+lipid+vesicles+for+the+purpose+of+lipid+phase+assignment%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Phys.+Chem.+B%22%5BJournal%5D)">Multiphoton polarization imaging of steady-state molecular order in ternary lipid vesicles for the purpose of lipid phase assignment.</a> J. Phys. Chem. B. 114 (47), 15512-15522 (2010).</li>
<li>Hauser, H. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+effect+of+ultrasonic+irradiation+on+the+chemical+structure+of+egg+lecithin%5BTitle%5D)+AND+%22Biochem.+Biophys.+Res.+Commun%22%5BJournal%5D)">The effect of ultrasonic irradiation on the chemical structure of egg lecithin.</a> Biochem. Biophys. Res. Commun. 45 (4), 1049-1055 (1971).</li>
<li>Hauser, H. Phospholipid vesicles. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aHauser%2C+H+%22Phospholipids+Handbook%22">Phospholipids Handbook</a>. Cevc, G. , Marcel Dekker, Inc. New York, New York. (1993).</li>
<li>Veatch, S. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Electro-formation+and+fluorescence+microscopy+of+giant+vesicles+with+coexisting+liquid+phases%5BTitle%5D)+AND+%22Meth.+Mol.+Biol%22%5BJournal%5D)">Electro-formation and fluorescence microscopy of giant vesicles with coexisting liquid phases.</a> Meth. Mol. Biol. 398, 59-72 (2007).</li>
<li>Kim, R. S., LaBella, F. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparison+of+analytical+methods+for+monitoring+autoxidation+profiles+of+authentic+lipids%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Lipid.+Res%22%5BJournal%5D)">Comparison of analytical methods for monitoring autoxidation profiles of authentic lipids.</a> J. Lipid. Res. 28 (9), 1110-1117 (1987).</li>
<li>Veatch, S. L., Leung, S. S. W., Hancock, R. E. W., Thewalt, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fluorescent+probes+alter+miscibility+phase+boundaries+in+ternary+vesicles%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Phys.+Chem.+B%22%5BJournal%5D)">Fluorescent probes alter miscibility phase boundaries in ternary vesicles.</a> J. Phys. Chem. B. 111 (3), 502-504 (2007).</li>
<li>Juhasz, J., Davis, J. H., Sharom, F. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fluorescent+probe+partitioning+in+GUVs+of+binary+phospholipid+mixtures%3A+implications+for+interpreting+phase+behavior%5BTitle%5D)+AND+%22Biochim.+Biophys.+Acta%22%5BJournal%5D)">Fluorescent probe partitioning in GUVs of binary phospholipid mixtures: implications for interpreting phase behavior.</a> Biochim. Biophys. Acta. 1818 (1), 19-26 (2012).</li>
<li>Herold, C., Chwastek, G., Schwille, P., Petrov, E. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Efficient+electroformation+of+supergiant+unilamellar+vesicles+containing+cationic+lipids+on+ITO-coated+electrodes%5BTitle%5D)+AND+%22Langmuir%22%5BJournal%5D)">Efficient electroformation of supergiant unilamellar vesicles containing cationic lipids on ITO-coated electrodes.</a> Langmuir. 28 (13), 5518-5521 (2012).</li>
</ol>

Autorzy oświadczają, że nie mają konkurencyjnych interesów finansowych.

Elektroformacja gigantycznych liposomów przekształciła się w elastyczną technikę kompatybilną z różnymi lipidami, preparatami i. Dokładna kontrola procesu odkładania się lipidów ma kluczowe znaczenie dla sukcesu. Przedstawiliśmy proste narzędzia, dzięki którym kontrolowane osadzanie lipidów z małych preparatów liposomowych staje się prostym procesem. Wilgotność względna ma kluczowe znaczenie dla prawidłowego odwodnienia początkowych liposomów, a optymalna wartość będzie się różnić w zależności od początkowego stężenia su...

Gigantyczne liposomy (często nazywane gigantycznymi pęcherzykami jednowarstwowymi lub GUV) były głównie używane do badania fizyki i chemii fizycznej dwuwarstw lipidowych, w tym do badań deformacji dwuwarstw, współistnienia faz bocznych ("tratwy"), fuzji błonowej, itp. 1-4. Mają one strukturę bardzo podobną do komórki: kulistą powłokę błony otaczającą wodne wnętrze, które można łatwo odróżnić od otaczającego go wodnego buforu. Z definicji mają średnicę ≈1-100 μm, dzięki czemu można je obrazować przy użyciu różnych metod mikroskopii świetlnej. Mogą być napięte za pomocą gradientów osmotycznych lub mechanicznie przyłożonego naprężenia, dzięki czemu choć na ogół miękkie, ich właściwościami można manipulować w celu łatwej obsługi. W szczególności kontrolowanie "sztywności" liposomu ułatwia tworzenie "przyczepionych do liposomów" lub wyciętych plam do elektrofizjologii. W przeszłości rekonstytucja kanałów jonowych była w dużej mierze wykonywana w płaskich dwuwarstwach lipidowych. Obecnie zdolność do tworzenia plam z gigantycznych liposomów i korzystania ze znacznego kołczanu narzędzi opracowanych dla konwencjonalnej elektrofizjologii (mikroskopia fluorescencyjna, aspiracja mikropipet, szybka perfuzja i kontrola temperatury itp.) sprawia, że gigantyczne liposomy stają się coraz bardziej atrakcyjne do badań nad rekonstytucją5,6.
Gigantyczne liposomy powstały dzięki wielu strategiom. W rzeczywistości gigantyczne liposomy tworzą się spontanicznie w procesie pęcznienia, gdy wysuszony film lipidowy jest ponownie uwodniony4,7,8. Chęć szybszego przygotowania większych, bardziej jednorodnych liposomów skłoniła naukowców do innych podejść, z których najważniejszym było elektroformowanie1,9. Elektroformacja również opiera się na uwodnieniu wysuszonego filmu lipidowego, ale przyspiesza ten proces poprzez zastosowanie oscylującego pola elektrycznego w poprzek filmu lipidowego. Pole jest podawane przez dwie elektrody, druty platynowe lub szkiełka szkiełkowe pokryte tlenkiem indu i cyny (ITO), oddzielone wodą lub buforem i na których osadza się lipidy. Przyspieszając pęcznienie liposomów, osiąga się wyższą wydajność większych liposomów. W ten sposób elektroformacja stała się domyślną metodą wytwarzania gigantycznych liposomów4.
Mechanizm elektroformacji nie jest w pełni zrozumiały, a większość protokołów jest rozwijana empirycznie (np. 10,11). Niemniej jednak możemy dowiedzieć się trochę o tym, czego się spodziewać, biorąc pod uwagę teorię i niektóre wyniki empiryczne. Powszechnie uważa się, że elektroformacja zachodzi poprzez sterowanie elektroosmotycznym przepływem buforu między poszczególnymi dwuwarstwami lipidowymi ułożonymi w osadzonym filmie lipidowym10,11. Prawdopodobnie w grę wchodzi również sprzężenie elektrostatyczne z fluktuacjami termicznymi dwuwarstw lipidowych12. Hipotezy te jakościowo przewidują górne granice częstotliwości i natężenia pola elektrycznego, które można zastosować10,12. W szczególności przewiduje się, że roztwory o wysokiej przewodności (tj. fizjologiczne roztwory soli) zmniejszają siły elektrohydrodynamiczne, które mogą inicjować elektrotworzenie liposomów12. Natężenia przepływu elektroosmotycznego na ogół zmniejszają się wraz ze wzrostem stężenia soli i często osiągają szczyt przy pewnej częstotliwości oscylacji pola elektrycznego (np. choć w innej geometrii, Green i wsp.13). Tak więc wyższe natężenie pola i wyższe częstotliwości są rozsądne dla roztworów o wysokiej przewodności, w granicach10.
Jednakże, białka błonowe mogą być niezgodne z tradycyjną metodą osadzania lipidów na elektrodach podczas procedury elektropęcznienia, a mianowicie w rozpuszczalnikach organicznych, które są następnie odparowywane, aby pozostawić cienki film lipidowy. Istnieją dwie główne drogi obejścia tej trudności: włączenie białek po utworzeniu gigantycznych liposomów lub dostosowanie sposobu odkładania lipidów. Nasze podejście opiera się na innych5,11 w celu zdeponowania lipidów i odtworzonego białka błonowego razem z zawiesiny małych lub dużych "proteoliposomów". Opisujemy długi i bardziej wymagający proces wytwarzania proteoliposomów z oczyszczonych białek i lipidów w innym miejscu (Collins i Gordon, w przeglądzie). Tutaj opisujemy protokół w przypadku braku jakiegokolwiek białka, ale jest on taki sam, gdy białko jest włączone; dołączamy wyniki pokazujące, że proteoliposomy zawierające kanał jonowy TRPV1 mogą być przekształcane w GUV i wykorzystywane do elektrofizjologii patch-clamp. W każdym podejściu do elektroformacji kontrola wzrokowa próbki lipidów podczas procesu osadzania lipidów ma kluczowe znaczenie dla sukcesu.
Nasze podejście może być istotne poza specjalistycznym zastosowaniem do odtwarzania kanałów jonowych. W czasie, który upłynął od czasu opracowania tego protokołu i obecnie, wykazano również, w jaki sposób sposób, w jaki lipidy są osadzane na elektrodach w celu elektroformacji, wpływa na niejednorodność składu powstałych GUV. Baykal-Caglar i wsp.14 wykazało, że GUV utworzone ze starannie odwodnionych liposomów miały 2,5 razy mniejszą zmienność temperatury mieszalności GUV utworzonych z mieszanin różnych fosfolipidów i cholesterolu. Ich praca wskazuje, że lipidy, a zwłaszcza cholesterol, mogą wytrącać się z mieszaniny lipidów po zdeponowaniu z rozpuszczalników organicznych, co powoduje duże przestrzenne zróżnicowanie składu zdeponowanego filmu lipidowego. Jest to szczególnie ważne dla badań nad zachowaniem fazy błony lipidowej, ale może mieć również kluczowe znaczenie dla eksperymentów ilościowych dotyczących funkcji kanałów jonowych. Baykal-Caglar i wsp." Protokół jest podobny, ale nie identyczny z naszym, a czytelnicy są zachęcani do jego studiowania.
Ten protokół (zobacz przegląd, Rysunek 1) jest jednym z wielu, które mogłyby być użyte. Zasadniczo powodzenie elektroformacji zależy od mieszaniny lipidów, hydratacji, temperatury, innych substancji rozpuszczonych (zwłaszcza jonów) i oczywiście napięcia i częstotliwości użytych do formacji. W miarę jak elektroformacja staje się coraz lepiej rozumiana, spodziewamy się jeszcze bardziej udoskonalić nasz protokół.
Na koniec, często występuje stroma krzywa uczenia się w gigantycznych liposomach do elektroformowania. Sugerujemy opanowanie konwencjonalnego protokołu (sekcje 1 i 4 oraz, jeśli to konieczne, sekcja 5) przed nauczeniem się deponowania lipidów z zawiesin liposomalnych (sekcje 2-5).

<table><tbody><tr><td>Multimetr cyfrowy</td><td>Agilent Technologies, <a href="http://www.agilent.com" target="_blank">www.agilent.com</a></td><td>U1232A lub podobny</td><td>Każdy multimetr będzie dobry, ale unikaj omomierzy analogowych starego typu, które przykładają znacznie większy prąd do testowanej rezystancji.</td></tr><tr><td></td><td>Fluke</td><td>117 lub 177</td><td>Każdy multimetr będzie odpowiedni, ale unikaj omomierzy analogowych starego typu, które przykładają znacznie większy prąd do testowanej rezystancji.</td></tr><tr><td>Generator funkcyjny</td><td>Agilent Technologies, <a href="http://www.agilent.com" target="_blank">www.agilent.com</a></td><td>33210A lub podobny</td><td>Większość generatorów funkcyjnych działa dla prostych protokołów. Ten programowalny model jest przydatny w zaawansowanych protokołach elektroformacji. Upewnij się, że generator może napędzać 10 V od szczytu do szczytu do 50 &#937; załaduj</td></tr><tr><td>szkiełka szklane powlekane ITO</td><td>Delta Technologies, Loveland, CO <a href="http://www.delta-technologies.com" target="_blank">www.delta-technologies.com</a></td><td>CB-90IN-S107 lub podobne</td><td>Przełam je na pół, aby utworzyć dwie prowadnice, 25 mm x 37 mm</td></tr><tr><td>Regulator temperatury</td><td>Omega Engineering Stamford, CT <a href="http://www.omega.com" target="_blank">www.omega.com</a> </td><td>CNi3233 lub podobny</td><td></td></tr><tr><td>Higrometr</td><td>Extech, Nashua, NH, <a href="http://www.extech.com" target="_blank">www.extech.com</a></td><td>445815</td><td></td></tr><tr><td>Arkusz kauczuku silikonowego</td><td>McMaster-Carr Elmhurst, IL <a href="http://www.mcmaster.com" target="_blank">www.mcmaster.com</a></td><td><a href="http://www.mcmaster.com/#87315K64" target="_blank">87315K64</a></td><td>Użyj silikonu USP Grade VI dla jego</td></tr><tr><td>uszczelki EMI</td> o wysokiej czystości <td>Laird Technologies <a href="http://www.lairdtech.com" target="_blank">www.lairdtech.com</a></td><td>4202-PA-51H-01800 lub podobne</td><td>Dystrybuowane przez Mouser <a href="http:// www.mouser.com" target="_blank">www.mouser.com</a></td></tr><tr><td>TxR-DHPE</td><td>Life Technologies, Carlsbad, CA <a href="http://www.lifetechnologies.com" target="_blank">www.lifetechnologies.com</a></td><td>T1395MP</td><td>Dostępne są inne fluorescencyjnie znakowane lipidy, ale TxR-DHPE jest jednym z najjaśniejszych i najbardziej fotostabilnych.</td></tr><tr><td>POPC</td><td>Avanti Polar Lipids, Alabaster, AL <a href="http://www.avantilipids.com" target="_blank">www.avantilipids.com</a></td><td>850457P lub 850457C</td><td>Lipidy można zamówić w postaci proszku (P) lub chloroformu (C)</td></tr><tr><td>POPS</td><td>Avanti Polar Lipids</td><td>840034P/C</td><td></td></tr><tr><td>Cholesterol</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C8667</td><td></td></tr></tbody></table>

preparat liposomów olbrzymich do obrazowania i elektrofizjologii patch-clamp

Giant Liposome Preparation for Imaging and Patch-Clamp Electrophysiology

Odtworzenie kanałów jonowych w chemicznie zdefiniowanych błonach lipidowych w celu zapisu elektrofizjologicznego było potężną techniką identyfikacji i badania funkcji tych ważnych białek. Jednak klasyczne preparaty, takie jak dwuwarstwy płaskie, ograniczają manipulacje i eksperymenty, które można przeprowadzić na odtworzonym kanale i jego środowisku błonowym. Bardziej przypominająca komórkę struktura gigantycznych liposomów pozwala na tradycyjne eksperymenty z klamrą bez poświęcania kontroli nad środowiskiem lipidowym.
Elektroformacja to skuteczny sposób na wytwarzanie gigantycznych liposomów o średnicy >10 μm, który polega na przyłożeniu zmiennego napięcia do cienkiego, uporządkowanego filmu lipidowego osadzonego na powierzchni elektrody. Ponieważ jednak klasyczny protokół wymaga osadzania lipidów z rozpuszczalników organicznych, nie jest on kompatybilny z mniej wytrzymałymi białkami błonowymi, takimi jak kanały jonowe, i musi zostać zmodyfikowany. Ostatnio opracowano protokoły elektroformowania gigantycznych liposomów z częściowo odwodnionych małych liposomów, które w naszym laboratorium dostosowaliśmy do liposomów zawierających białka.
Prezentujemy tutaj tło, sprzęt, techniki i pułapki elektroformacji gigantycznych liposomów z małych dyspersji liposomów. Zaczynamy od klasycznego protokołu, który należy opanować przed przystąpieniem do bardziej wymagających protokołów, które następują. Przedstawiono proces kontrolowanego częściowego odwodnienia małych liposomów za pomocą równowagi parowej z nasyconymi roztworami soli. Na koniec demonstrujemy sam proces elektroformacji. Opiszemy proste, niedrogie urządzenia, które można wykonać we własnym zakresie w celu produkcji wysokiej jakości liposomów, a także opiszemy oględziny preparatu na każdym etapie, aby zapewnić najlepsze rezultaty.

W naszych przykładach przygotowujemy liposomy z mieszaniny składającej się z około 55 mol% POPC (1-palmitoyl-2-oleoyl-sn-glycero-phosphocholine), 15 mol% POPS (1-palmitoyl-2-oleoyl-sn-glycero-phosphoserine), 30 mol% cholesterolu oraz 0,1 mol% Texas Red-labeled 1,2-dipalmitoyl-sn-phosphoethanolamine (TxR-DPPE). Skład ten wybrano jako reprezentatywny dla lipidów zwojów korzeni grzbietowych18. Zauważamy, że 15 mol% lipidów naładowanych (w tym przypadku POPS) jest bliskie granicy tego, c...

Przekształcanie funkcjonalnych białek błonowych w gigantyczne liposomy o określonym składzie jest potężnym podejściem w połączeniu z elektrofizjologią patch-clamp. Jednak konwencjonalna produkcja gigantycznych liposomów może być niezgodna ze stabilnością białka. Opisujemy protokoły wytwarzania gigantycznych liposomów z czystych lipidów lub małych liposomów zawierających kanały jonowe.

Preparat liposomów olbrzymich do obrazowania i elektrofizjologii patch-clamp

The reconstitution of ion channels into chemically defined lipid membranes for electrophysiological recording has been a powerful technique to identify ...

Ogólnym celem niniejszej procedury jest przygotowanie gigantycznych jednowarstwowych pęcherzyków (GUV) w sposób zapewniający zachowanie integralności funkcjonalnej białek błonowych włączonych w błonę pęcherzyka. Osiąga się to najpierw poprzez osadzenie lipidów lub małych liposomów na powierzchni przewodzącej, takiej jak szkiełko przedmiotowe pokryte warstwą ITO. Drugim krokiem jest kontrolowane odparowanie rozpuszczalnika w celu uzyskania jednorodnej warstwy lipidowej na powierzchni przewodzącej.Następnie należy ostrożnie rehydratyzować film lipidowy w odpowiednim buforze i przygotować komorę do elektroformowania. Ostatnim krokiem jest przyłożenie oscylującego napięcia do filmu lipidowego w celu wygenerowania gigantycznych jednowarstwowych pęcherzyków (GUVs). Ostatecznie pęcherzyki zostaną zobrazowane w celu określenia ich rozmiaru i jakości oraz porównania ich z pęcherzykami utworzonymi przy użyciu techniki klasycznej.Wizualna demonstracja tego protokołu jest pomocna, ponieważ nanoszenie lipidów może być trudne do opanowania, zależy od wielu zmiennych i najlepiej ocenić je poprzez inspekcję wizualną. Przed rozpoczęciem procedury należy wyjąć lipidy z przechowywania w temperaturze -20 °C lub -80 °C i ogrzać je do temperatury pokojowej. Jeśli to możliwe, eksperyment należy przeprowadzić w atmosferze gazu obojętnego, np. w komorze rękawicowej.Następnie przykryj lipidy suchym argonem lub azotem i na wszystkich etapach ogranicz ekspozycję na powietrze do minimum. Jeśli lipidy nie są dostarczone w rozpuszczalniku organicznym, zawieś 0,3 mg lipidów w chloroformie lub cykloheksanie w stężeniu 10 mg/ml. Należy pamiętać, że stężenia podawane przez producentów są zazwyczaj jedynie wartościami nominalnymi.Użyj etanolu do oczyszczenia obu stron dwóch szkiełek przedmiotowych o wymiarach 25 mm na 37,5 mm pokrytych warstwą ITO. Następnie dodaj do lipidów 0,1% Texas red DPPE w celu obrazowania fluorescencyjnego. Zmierz rezystancję powierzchni za pomocą multimetru, aby zweryfikować, czy strona szkiełek pokryta ITO jest skierowana do góry, co powinno być zasygnalizowane rezystancją rzędu kilkuset omów.Nessać lipidy do strzykawki odpornej na rozpuszczalniki, tak aby igła nie dotykała bezpośrednio powierzchni ITO. Powoli nanosić lipidy, przesuwając igłę w przód i w tył wzdłuż szkiełka. Równomiernie pokryć powierzchnię, aż na szkle pojawi się tęczowy połysk.Następnie szybko umieść slajdy w desykatorze próżniowym i pompuj komorę do ciśnienia poniżej 1 tor przez 0,5 do 1 godziny, aby usunąć wszelkie ślady rozpuszczalnika. Przerwij próżnię za pomocą gazu obojętnego.Nanieś cienką warstwę smaru silikonowego na obie strony uszczelki silikonowej, a następnie umieść uszczelkę na szkiełku. Pozostaw co najmniej 5 mm niezakrytej powierzchni szkiełka na jednym z jego końców. Następnie ostrożnie nawodnij każdą studzienkę, umieszczając igłę strzykawki o rozmiarze 27G przy krawędzi uszczelki i powoli aplikując bufor, aby przepełnić każdą studzienkę uszczelki o około 10% roztworem 3 mM.Po nawodnieniu lipidów należy szybko przejść do pozostałych etapów. Ponieważ filmy lipidowe zaczynają się odwarstwiać, należy natychmiast sprawdzić stronę przewodzącą szkiełka za pomocą multimetru. Następnie należy przymocować drugie szkiełko ITO stroną przewodzącą do górnej części uszczelki.Upewnij się, że poza obszarem uszczelki znajduje się co najmniej pięć milimetrów występu, po przeciwnej stronie pierwszego występu, a następnie lekko dociśnij, aby zapewnić szczelność. Oczyść oba występy za pomocą etanolu. Teraz przymocuj kanapkę z ciekłego kryształu na szkiełkach ITO do styków elektrycznych, takich jak miedziane szyny lub pianka uszczelniająca.Grafika ta przedstawia widok rozstrzelony komory oraz zestawu styków w celach referencyjnych. Szczegółowe plany znajdują się w tekście protokołu. Używając multimetru, należy zweryfikować brak zwarcia elektrycznego między stykami oraz upewnić się, że styki są prawidłowo połączone z powierzchniami ITO.Następnie umieść komorę elektroformowania w inkubatorze i podgrzej ją do temperatury o 10 °C wyższej niż najwyższa temperatura topnienia którejkolwiek z obecnych lipidów. Zmierz odstęp między dwiema powierzchniami powleczonymi ITO, aby określić amplitudę fali sinusoidalnej. Amplituda fali sinusoidalnej powinna wynosić około 0,7 V RMS. Na każdy milimetr odstępu między powierzchniami ITO przykładaj falę sinusoidalną o częstotliwości 10 Hz przez okres od 60 do 90 minut.Podłącz generator do komory elektroformowania i sprawdź napięcie za pomocą multimetru. Po 60 do 90 minutach elektroformowania powinny powstać gigantyczne jednołszyczne pęcherzyki (GUVs). Do obrazowania liposomów należy użyć mikroskopu odwróconego wyposażonego w kostkę filtracyjną do barwnika Texas red.Liposom powinien być sferyczny, w przeważającej mierze jednorodny w ocenie wizualnej i wolny od defektów, takich jak pasma odrywające się od liposomu. Poprzednie kroki obejmowały klasyczne przygotowanie gigantycznych liposomów z czystych lipidów. Przedstawiono również bardziej wymagającą metodę przygotowania z wykorzystaniem małych liposomów.W kolejnym kroku należy przygotować nasycony roztwór węglanu potasu zapewniający 44% wilgotności względnej w temperaturze 20°C. Należy użyć plastikowego pojemnika po jogurcie i granoli z dopasowanym kubkiem górnym, w którym wykonano otwory. Nasycony roztwór soli wraz z nadmiarem soli należy umieścić w szczelnie zamykanym pojemniku wyposażonym w wewnętrzną półkę.Włóż półkę z powrotem po napełnieniu i upewnij się, że poziom cieczy znajduje się od 5 do 10 mm poniżej półki. Umieść czujnik wilgotności w wycięciu z boku pojemnika. Oczyść obie strony szkiełek przedmiotowych powlekanych ITO etanolem.Użyj multimetru, aby ustalić, która strona jest przewodząca, a stronę nieprzewodzącą opisz nazwą próbki. Następnie lekko nasmaruj obie strony jednej lub kilku uszczelek silikonowych. Połóż slajd stroną przewodzącą do góry na blacie i nałóż uszczelki silikonowe na każdy slajd, na który będzie nakładany lipid.Należy upewnić się, że na jednym końcu pozostawiono co najmniej 5 mm odsłoniętego szkiełka w celu podłączenia do aparatury do elektroformowania. Wygładzić uszczelkę, aby zapewnić szczelność, a następnie rozcieńczyć preparat pęcherzyków w niskosolnym buforze izomodycznym do stężenia około 1–2 mg/mL. Nanieść lipidy na szkiełko w kroplach o objętości od 1 do 10 µL.Umieść preparat na wewnętrznej półce nad nasyconym roztworem soli i szczelnie zamknij pojemnik. Pozostaw w temperaturze pokojowej od trzech godzin do całej nocy. Preparat można teraz wykorzystać do elektroformowania gigantycznych liposomów, zgodnie z wcześniej opisanym klasycznym protokołem.Zwróć uwagę na tęczowy wygląd poszczególnych osadów. Obraz ten przedstawia liposomy uformowane elektrochemicznie z lipidów osadzonych z chloroformu; strzałki wskazują na liposomy gigantyczne. Obraz ten posiada bardzo mało rozmytych obszarów, co świadczy o prawidłowym przygotowaniu preparatu.Następny obraz zawiera wiele rozmytych obszarów, co wskazuje na ogólnie niską jakość preparatu. Należy zauważyć, że strzałka dwa wskazuje obszar z słabo rozróżnialnymi liposomami, a w obszarze wskazanym przez strzałkę trzy nie można ustawić ostrości na żadne liposomy. Przedstawiono tutaj 10-krotne powiększenie liposomów skutecznie uformowanych elektrochemicznie z lipidów naniesionych poprzez dehydratację małych liposomów.Strzałki wskazują trzy wysokiej jakości liposomy o rozmiarach od około 5 do 20 µm przy 40-krotnym powiększeniu. Na krawędzi liposomu widoczny jest wyraźny pierścień, co wskazuje na liposom jednowarstwowy lub prawie luminalny. Przedstawione są tutaj prądy jonowe TR PV one aktywowane kapsaicyną, zarejestrowane w płatach błon lipidowych wyciętych z utworzonych gigantycznych liposomów.Prąd upływu wskazywał na rezystancję uszczelnienia rzędu 500 MΩ przed dodaniem kapsaicyny. Nasycająca dawka kapsaicyny aktywowała duży prąd T RRP V one. Prąd powrócił do poziomu bliskiego bazowemu w miarę wypłukiwania kapsaicyny z patcha podczas wykonywania tej procedury.Ważne jest zachowanie elastyczności, ponieważ na sposób odparowywania lipidów i tworzenia jednorodnej warstwy na szklanym podłożu wpływa wiele czynników. Należy zapoznać się z naszą sekcją rozwiązywania problemów dostępną online oraz modyfikować temperaturę, wilgotność, stężenie lipidów i wielkość kropli, aby uzyskać najlepsze wyniki.

giant-liposome-preparation-for-imaging-patch-clamp

Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

Preparat gigantycznych liposomów do obrazowania i elektrofizjologii metodą patch-clamp

Ten film demonstruje technikę wizualizacji powstawania synapsy immunologicznej w komórkach NK na podpartej dwuwarstwie lipidowej (SLB). SLB jest najpierw znakowany ligandem receptora aktywującego komórki NK znakowanym fluoroforem, a następnie inkubacją z komórkami NK. Następnie komórki są barwione pod kątem spolimeryzowanych granulek litycznych aktyny i perforyno-dodatniej. Takie podejście umożliwia wizualizację powstawania synaps za pomocą mikroskopii wymuszonego zubożenia emisji (STED).

Obrazowanie w superrozdzielczości tworzenia synaps immunologicznych komórek NK na podpartej dwuwarstwie lipidowej

Użycie fluoroforów do obrazowania in vivo może być znacznie ograniczone przez opsonizację, szybki klirens, niską czułość wykrywania i cytotoksyczne działanie na gospodarza. Enkapsulacja fluoroforów w liposomach poprzez hydratację i ekstruzję filmu prowadzi do wygaszania i ochrony fluorescencji, co umożliwia obrazowanie in vivo o wysokiej czułości wykrywania.

Wygaszanie fluorescencji fluoroforu bliskiej podczerwieni w obudowie liposomalnej jako narzędzie do obrazowania optycznego in vivo

Rekonstytucja białka transbłonowego, KvAP, w gigantyczne pęcherzyki jednowarstwowe (GUVs) jest demonstrowana dla dwóch metod odwodnienia i ponownego nawodnienia — elektroformacji i pęcznienia wspomaganego żelem. W obu metodach małe jednowarstwowe pęcherzyki zawierające białko są łączone ze sobą, tworząc GUV, które można następnie badać za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej i elektrofizjologii patch-clamp.

Rekonstytucja białka transbłonowego, kanału jonowego bramkowanego napięciem, KvAP, w gigantycznych pęcherzykach jednowarstwowych do badań mikroskopowych i patch clamp

Opisujemy tutaj połączenie techniki tworzenia synaps immunologicznych z wykorzystaniem dwuwarstwowego lipidu na wspartym szkłem z techniką obrazowania w superrozdzielczości mikroskopii STED (Stimulated emission depletion). Celem tego protokołu jest dostarczenie użytkownikom instrukcji niezbędnych do pomyślnego przeprowadzenia tych dwóch technik.

Obrazowanie w superrozdzielczości synapsy immunologicznej komórek NK na płaskiej dwuwarstwie lipidowej na podłożu szklanym

Ten artykuł opisuje metody znakowania spinów kierowanych przez miejsce i odtwarzania pentamerycznych kanałów bramkowanych ligandem do badań elektronowego rezonansu paramagnetycznego. Protokół ten można dostosować do dowolnego białka błonowego. Opisana tutaj metoda rekonstytucji może być również stosowana do pomiarów patch-clamp prądów makroskopowych i jednokanałowych w zdefiniowanym układzie lipidowym.

Znakowanie spinowe skierowane w miejscu i badania spektroskopowe EPR kanałów jonowych bramkowanych ligandem pentamierycznym

Tutaj prezentujemy protokół do wykrywania pojedynczych, zapośredniczonych przez SNARE zdarzeń fuzji między liposomami a wspieranymi dwuwarstwami w kanałach mikroprzepływowych za pomocą spolaryzowanego TIRFM, z czułością pojedynczej cząsteczki i rozdzielczością czasową ~15 ms. Uwalnianie lipidów i rozpuszczalnego ładunku może być wykrywane jednocześnie. Mierzy się wielkość liposomów, dyfuzyjność lipidów i właściwości porów fuzyjnych.

Fuzja pojedynczych proteoliposomów za pośrednictwem SNARE z dwuwarstwami na uwięzi w mikroprzepływowej komórce przepływowej monitorowanej za pomocą spolaryzowanej mikroskopii TIRF

Liposomy zawierające amfifile jednołańcuchowe, szczególnie kwasy tłuszczowe, wykazują odmienne właściwości w porównaniu do tych zawierających diacylofosfolipidy ze względu na unikalne właściwości chemiczne amfifilów jednołańcuchowych. Tutaj opisujemy techniki przygotowania, oczyszczania i stosowania liposomów składających się z części lub całości tych amfifilów.

Przygotowanie, oczyszczanie i stosowanie liposomów zawierających kwasy tłuszczowe

Prezentujemy technikę bezdotykowej mikromanipulacji pęcherzykami, wykorzystując zlokalizowane gradienty jonów wapnia. Mikroiniekcja roztworu jonów wapnia w pobliżu gigantycznego pęcherzyka lipidowego jest wykorzystywana do przebudowy błony lipidowej, w wyniku czego powstają wypukłości rurki błonowe.

Przebudowa błony gigantycznych pęcherzyków w odpowiedzi na zlokalizowane gradienty jonów wapnia

Tutaj prezentujemy protokół tworzenia dwuwarstw lipidowych za pomocą metody dwuwarstwowej pęcherzyków kontaktowych. Pęcherzyk wody jest wdmuchiwany do rozpuszczalnika organicznego, w wyniku czego na granicy faz woda-olej tworzy się monowarstwa. Dwie pipety są manipulowane w celu zadokowania pęcherzyków w celu utworzenia dwuwarstwy.

Eksperymenty dwuwarstwowe lipidowe z dwuwarstwami pęcherzyków kontaktowych dla zacisków krosowych

Celem tego protokołu jest synteza liposomów znakowanych fluorescencyjnie i wykorzystanie cytometrii przepływowej do identyfikacji lokalizacji liposomów in vivo na poziomie komórkowym.

Przygotowanie, podawanie i ocena specyficznego tkankowo wychwytu komórkowego in vivo liposomów znakowanych barwnikiem fluorescencyjnym

Ten protokół szczegółowo opisuje metodę bezpośredniego pomiaru aktywności kanałów jonowych na wewnątrzkomórkowych pęcherzykach za pomocą ręcznego endolizosomalnego systemu patch-clamp. Ilustrujemy metodę polegającą na powiększaniu endolizosomów i ręcznym izolowaniu tych pęcherzyków. Takie podejście gwarantuje, że badacze mogą dokładnie odtworzyć i zastosować procedurę.

Techniki patch-clamp do analizy pojedynczych pęcherzyków endolizosomalnych

Poznaj metodę przygotowania olbrzymich jednowarstwowych liposomów zachowujących integralność białek błonowych. Technika obejmuje osadzanie lipidów na przewodzącej powierzchni, odparowanie rozpuszczalnika, rehydratację i elektroformowanie.

Preparat liposomów olbrzymich do obrazowania i elektrofizjologii patch-clamp

Przeglądaj więcej filmów