Preparat liposomów olbrzymich do obrazowania i elektrofizjologii patch-clamp

Ogólnym celem tej procedury jest przygotowanie gigantycznych pęcherzyków blaszkowatych uni w sposób zgodny z integralnością funkcjonalną białek błonowych włączonych do błony pęcherzyka. Osiąga się to poprzez pierwsze osadzenie lipidów lub małych liposomów na przewodzącej powierzchni, takiej jak szkiełko pokryte ITO. Drugim krokiem jest odparowanie rozpuszczalnika w kontrolowany sposób w celu uzyskania jednolitego filmu lipidowego na powierzchni przewodzącej.

Następnie należy ostrożnie uwodnić film lipidowy w odpowiednim buforze i przygotować komorę elektroformacyjną. Ostatnim krokiem jest przyłożenie oscylującego napięcia do warstwy lipidowej w celu wytworzenia gigantycznych pęcherzyków Millera. Ostatecznie pęcherzyki zostaną zobrazowane w celu określenia ich wielkości i jakości oraz porównania z pęcherzykami powstałymi przy użyciu klasycznej techniki.

Wizualna demonstracja tego protokołu jest przydatna, ponieważ osadzanie lipidów może być trudne do opanowania, zależy od wielu zmiennych i najlepiej jest je oznaczyć za pomocą oględzin. Przed rozpoczęciem tej procedury wyjmij lipidy z magazynu w temperaturze minus 20 stopni Celsjusza lub minus 80 stopni Celsjusza i ogrzej do temperatury pokojowej. Jeśli to możliwe, przeprowadź eksperyment w atmosferze gazu obojętnego, takiej jak komora rękawicowa.

Następnie przykryj lipidy suchym argonnem lub gazowym azotem i na wszystkich etapach zminimalizuj ekspozycję na powietrze. Jeśli lipidy nie są dostarczane w rozpuszczalniku organicznym, zawiesić 0,3 miligrama lipidów w chloroformie lub cyklohenie w ilości 10 miligramów na mililitr. Należy pamiętać, że stężenia podane przez producentów są zazwyczaj tylko nominalne.

Użyj etanolu do czyszczenia obu stron 2 szkiełek szklanych o wymiarach 25 milimetrów na 37,5 milimetra powlekanych ITO. Następnie dodaj 0,1 procent więcej teksańskiej czerwieni DPPE do lipidów w celu obrazowania fluorescencyjnego. Zmierz rezystancję powierzchniową za pomocą multimetru, aby sprawdzić, czy strona szkiełek pokryta ITO jest skierowana do góry, na co wskazuje rezystancja kilkuset omów.

Odessać lipidy do strzykawki odpornej na działanie rozpuszczalników, tak aby igła strzykawki nie dotykała całkowicie powierzchni ITO. Powoli nakładaj lipid, przesuwając igłę w przód iw tył po szkiełku. Pokryj powierzchnię równomiernie, szukając tęczowego połysku na szklanej powierzchni.

Następnie w tym miejscu szkiełka szybko przechodzą do próżni, wysuszają i pompują komorę do mniej niż jednego tor próżni przez 0,5 do jednej godziny. Aby usunąć wszelkie śladowe ilości rozpuszczalnika. Uwolnij próżnię za pomocą gazu obojętnego.

Nałóż cienką warstwę smaru silikonowego po obu stronach uszczelki silikonowej, a następnie umieść uszczelkę na prowadnicy. Pozostaw co najmniej pięć milimetrów odkrytego szkiełka odsłoniętego odsłoniętego na jednym końcu szkiełka. Następnie ostrożnie nawodnij każdą studzienkę, umieszczając igłę strzykawki o rozmiarze 27 na krawędzi uszczelki i powoli nałóż bufor, przepełnij każdą uszczelkę dobrze o około 10% trzema milimolowymi hałdami.

Po nawodnieniu lipidów szybko przejdź przez pozostałe kroki. Ponieważ folie lipidowe zaczynają się rozwarstwiać, natychmiast sprawdź przewodzącą stronę szkiełka za pomocą multimetru. Następnie nałóż drugą powierzchnię przewodzącą suwaka ITO na górną część uszczelki.

Upewnij się, że co najmniej pięć milimetrów wystających elementów poza obszar uszczelki i naprzeciwko pierwszego zwisu i delikatnie dociśnij, aby zapewnić dobre uszczelnienie. Oczyścić dwa zwisy za pomocą etanolu. Teraz przymocuj przekładkę ITO do styków elektrycznych, takich jak pręty miedziane lub pianka uszczelkowa.

Ta grafika przedstawia widok rozstrzelony na części na zespół komory i styków jako odniesienie. Szczegółowe plany można znaleźć w protokole tekstowym za pomocą multimetru. Sprawdź, czy między stykami nie ma zwarcia elektrycznego i czy styki są prawidłowo połączone z powierzchniami ITO.

Następnie umieść komorę elektroformacyjną w piekarniku i podgrzej komorę o 10 stopni Celsjusza powyżej najwyższej temperatury topnienia spośród wszystkich obecnych lipidów. Zmierz szczelinę między dwiema powierzchniami pokrytymi ITO, aby określić amplitudę fali sinusoidalnej. Amplituda fali sinusoidalnej powinna wynosić około 0,7 V RMS Na każdy milimetrowy odstęp między powierzchniami ITO należy zastosować sinusoidę o częstotliwości 10 Hz przez 60 do 90 minut.

Podłącz generator do komory elektroformacyjnej i potwierdź napięcie za pomocą multimetru. Po 60 do 90 minutach tworzenia się elektro powinny uformować się gigantyczne pęcherzyki jednojajowe. Użyj odwróconego mikroskopu wyposażonego w kostkę filtrującą do czerwonego barwnika z Teksasu, aby zobrazować liposomy.

Liposom powinien być kulisty, z przewagą Elli na oko i wolny od wad, takich jak sznurki zwisające z liposomu. Poprzednie kroki obejmowały klasyczne przygotowanie gigantycznych liposomów z czystych lipidów. Pokazano bardziej wymagający preparat przy użyciu małych liposomów.

Następnie najpierw przygotuj nasycony roztwór węglanu potasu o wilgotności względnej 44% w temperaturze 20 stopni Celsjusza. Użyj plastikowego pojemnika na jogurt i granolę z zagnieżdżonym górnym kubkiem, który został zmodyfikowany z otworami w górnym kubku. Nasycony roztwór soli i nadmiar soli umieścić w szczelnie zamykanym pojemniku z wewnętrzną półką.

Po napełnieniu wymień półkę i upewnij się, że płyn znajduje się od pięciu do 10 milimetrów poniżej półki. Umieść czujnik wilgotności w wcięciu z boku pojemnika. Oczyść obie strony szkiełek szklanych powlekanych ITO etanolem.

Użyj multimetru, aby określić, która strona jest przewodząca i oznacz stronę nieprzewodzącą nazwą próbki. Następnie delikatnie nasmaruj obie strony silikonowej uszczelki z jednym lub wieloma uchwytami. Umieść przewodzący szkiełko, umieść na stole i nałóż silikonowe uszczelki na każdy szkiełko, na które zostanie nałożony lipid.

Upewnij się, że na jednym końcu znajduje się co najmniej pięć milimetrów odsłoniętego szkiełka, które można podłączyć do aparatu do elektroformowania. Wygładź uszczelkę, aby zapewnić dobre uszczelnienie, rozcieńczyć preparat pęcherzykowy w buforze iso modic o niskiej zawartości soli do około jednego do dwóch miligramów na mililitr. Nałóż lipid na szkiełko w jednej do 10 mikrolitrowych kropli.

Umieść szkiełko na wewnętrznej półce nad nasyconym roztworem soli i szczelnie zamknij pojemnik. Pozostaw w temperaturze pokojowej na trzy godziny do nocy. Szkiełko może być teraz używane do elektrotworzenia gigantycznych liposomów, jak pokazano wcześniej w klasycznym protokole.

Zwróć uwagę na tęczowy wygląd poszczególnych złóż. Ten obraz pokazuje liposomy utworzone elektro z lipidów zdeponowanych z chloroformu, strzałki wskazują na gigantyczne liposomy. Ten obraz ma bardzo mało rozmytych obszarów, co wskazuje na dobre przygotowanie.

Następny obraz ma wiele rozmytych obszarów, co wskazuje na ogólnie słabe przygotowanie. Zwróć uwagę, że strzałka druga wskazuje obszar ze słabo rozróżnialnymi liposomami i że żadne liposomy nie mogą być ostre w obszarze wskazanym przez strzałkę trzecią. Pokazano tutaj 10-krotne powiększenie liposomów, które z powodzeniem uformowały się elektrolitycznie z lipidów zdeponowanych przez odwodnienie małych liposomów.

Strzałki wskazują trzy dobrej jakości liposomy o wielkości od około pięciu do 20 mikrometrów przy 40-krotnym powiększeniu. Na krawędzi liposomu można zobaczyć wyraźny pierścień, który wskazuje na liposom jednolity lub prawie lumalny. Aktywowane kapsaicyną prądy jonowe TR PV one zarejestrowane w plamach błony lipidowej wyciętych z utworzonych gigantycznych liposomów są pokazane tutaj.

Prąd upływowy wskazywał na 500 mega rezystancję uszczelnienia przed dodaniem kapsaicyny. Nasycenie kapsaicyny aktywowało duży prąd T RRP V. Prąd powraca do wartości zbliżonej do wartości wyjściowej, gdy kapsaicyna jest wypłukiwana z plastra podczas próby wykonania tej procedury.

Ważne jest, aby zachować elastyczność, ponieważ wiele czynników wpływa na to, jak lipidy odwadniają i tworzą równomierny film na szklanym podłożu. Zapoznaj się z naszą sekcją rozwiązywania problemów online i zmieniaj temperaturę, wilgotność, stężenie lipidów i wielkość kropel, aby osiągnąć najlepsze wyniki.