Test preferencji świetlnej w celu zbadania wrodzonego i okołodobowego regulowanego fotozachowania u larw Drosophila

Ogólnym celem następnego eksperymentu jest zbadanie wrodzonego i okołodobowego zachowania fototaktycznego larw Drosophila za pomocą testu preferencji światło-ciemność. Osiąga się to najpierw poprzez hodowlę larw eksperymentalnych w określonych warunkach oświetlenia i ciemności, aby ustanowić w larwach początkowy zegar okołodobowy. Następnie larwy przenosi się w warunki stałej ciemności, co pozwala na swobodny bieg larwalnego zegara okołodobowego.

Po osiągnięciu trzeciego stadium żerowania larwy są dzielone na grupy w celu przetestowania ich preferencji świetlnych w różnych punktach czasu okołodobowego. Wyniki wykazują wrodzoną i okołodobową preferencję świetlną, obliczoną na podstawie indeksu preferencji i porównaną pomiędzy punktami czasowymi a grupami eksperymentalnymi. Choć metoda ta pozwala uzyskać wgląd w wrodzoną i okołodobową regulację detekcji światła oraz przetwarzanie zachowań fototaktycznych, może być ona również zastosowana w innych systemach, takich jak węch, gustacja, chemotaksja i termotaksja.

Podobnie, można go zmodyfikować do testów uczenia się i pamięci. Procedurę zaprezentują Alina oraz studenci studiów magisterskich z mojego laboratorium. Aby zebrać jaja, należy pozwolić dorosłym muchom w okresie godowym składać jaja przez 12 godzin na świeżym podłożu, a następnie przenieść je do nowych probówek. Przenoszenie osobników dorosłych należy powtarzać co 12 godzin, stosując cykl 12 godzin światła i 12 godzin ciemności.

Przechowuj jaja zbierane w odstępach 12-godzinnych w inkubatorze. Na potrzeby eksperymentu hoduj zwierzęta do wczesnego stadium larwy L3. Są to larwy żerujące, dostępne od 84 do 108 godzin od złożenia jaj.

Prawidłowe przygotowanie etapu LAE jest krytyczne dla sukcesu eksperymentu. Ponieważ w późnej fazie L3 LAE zmieniło zachowanie fototaktyczne, aby przetestować okołodobowe komponenty zachowania wizualnego, na 48 godzin przed testowaniem oraz tuż przed subiektywnym świtem larw, należy umieścić zebrane larwy w kartonowym pudełku.

Następnie przenieś pudełko do inkubatora z zapewnioną stałą ciemnością na 48 godzin; do czasu zakończenia eksperymentu larwy te muszą pozostać niezakłócone w wyznaczonej dla nich przestrzeni. Przygotuj pokrywkę do dziewięciocentymetrowej szalki Petriego, wykorzystując kwadrat o boku 20 cm podzielony na cztery ćwiartki, który posłuży jako szablon.

Przyklej kwadraty z folii aluminiowej o boku 10 cm w przeciwległych ćwiartkach i zaklej je czarną taśmą. Upewnij się, że krawędź pokrywy została zakryta. Następnie przyklej do stołu, pod źródłem światła, kwadrat o boku 20 cm podzielony na cztery ćwiartki.

Zaznacz obrys naczynia testowego na arkuszu, aby służył jako prowadnica do zapewnienia spójnego przesunięcia. Zamontuj lampę LED nad szalką Petriego za pomocą statywu laboratoryjnego. Dostosuj wysokość tak, aby cała płyta testowa była równomiernie oświetlona.

Dostosuj natężenie światła w miejscu testowym do zakresu od 350 do 760 luxe, zmieniając wysokość lampy lub korzystając z regulowanego zasilacza. Pomieszczenie doświadczalne musi być oświetlone światłem czerwonym i posiadać taką samą temperaturę, jak ta panująca w miejscu hodowli zwierząt. Fiolki inkubowano przez dwa dni w całkowitej ciemności.

Zbierz lawę z pokarmu za pomocą szpatułki z górnych pięciu milimetrów pokarmu. Rozprowadź pokarm na zewnętrznej stronie pokrywki szalki Petriego. Dodaj do pokarmu niewielką ilość wody i delikatnie wymieszaj go szpatułką.

Używając pędzla, nanieś kroplę wody z kranu na nową szalkę. Przenieś larwy do kropli wody, aby je opłukać. Następnie zbierz larwy za pomocą wilgotnego pędzla.

Należy wybrać wyłącznie larwy w stadium L3 w fazie wczesnego karmienia i unikać larw w stadium L3 w fazie późnego wędrowania. Wybrane larwy należy przenieść na środek płytki testowej. Karmiące się larwy L3 posiadają otwarte i wystające na zewnątrz przednie sferule.

W formie palczastej. Tylne sferoidy posiadają po trzy otwory oraz cztery grupy dużych, rozgałęzionych włosków. Gruczoły ślinianowe sięgają drugiego segmentu odwłoka.

Po umieszczeniu 30 larw w centrum płyty testowej, należy przykryć ją przygotowaną pokrywką. Włączyć lampę LED. Następnie uruchomić stoper i pozwolić larwom swobodnie poruszać się po płycie przez pięć minut.

Następnie szybko zdejmij pokrywkę i policz liczbę larw w kwadrantach ciemnych i jasnych. Zaznaczenie pozycji każdej larwy może ułatwić liczenie. Pomocne może być również wykonanie szybkiej fotografii; larwy wykazujące niejednoznaczne preferencje świetlne, takie jak larwy pełzające po ściankach lub zagrzebujące się w agarze, należy uznać za neutralne i dodać do całkowitej liczby larw podczas obliczania indeksu preferencji świetlnej.

Po przeliczeniu larw należy wyrzucić płytkę i użyć nowej płytki testowej do kolejnego eksperymentu. Po przeprowadzeniu od 10 do 15 prób na genotyp, należy przystąpić do analizy zgodnie z protokołem. Preferencje świetlne (jasno-ciemne) larw Canton ES porównano w dwóch różnych punktach czasu okołodobowego.

Larwy w fazach CT 0 i CT 12 (subiektywnie odpowiednio świt i zmierzch) przetrzymywano przez 48 godzin w standardowych warunkach, a następnie przeniesiono do stałej ciemności na trzy dni. Testy cyklu światło-ciemność przy natężeniu 350 luxe wykazały, że fotoczułość była wyższa u larw badanych w CT 0 w porównaniu do larw badanych w CT 12. Zgodnie z zastosowanym wzorem, preferencja ciemności dla larw w CT 0 wyniosła 0,52 w porównaniu do 0,36.

Porównanie wskaźników dla larw CT 12 przy użyciu testu Wilcoxona daje istotną wartość P wynoszącą 0,023. Po obejrzeniu tego filmu powinni Państwo posiadać dobrą wiedzę na temat tego, jak w tym celu badać preferencje świetlne larw troficznych w różnych obwodach i punktach czasowych. Powinni Państwo być w stanie przeprowadzić entrainment larw oph w stadium F3, zbadać ich zachowanie fotofobiczne oraz obliczyć wskaźnik preferencji świetlnej do porównania statystycznego.