Name: Test preferencji świetlnej w celu zbadania wrodzonego i okołodobowego regulowanego fotozachowania u larw Drosophila (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-04-20T14:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 14 s
Description: Poznaj test preferencji świetlnej dla badania wrodzonego i okołodobowego fotozachowania larw Drosophila. Ta metoda pozwala mierzyć preferencje świetlne i analizować rytmy dobowe w neurobiologii.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Dziękujemy naszym kolegom z Wydziału Biologii Uniwersytetu we Fryburgu za owocne dyskusje. Dziękujemy Bloomington Stock Center za udostępnienie zapasów much. Prace te były wspierane finansowo przez Szwajcarską Narodową Fundację Nauki (PP00P3_123339) i Fundację Velux na rzecz S.G.S.

1. Hodowla larw
<ol>
 <li>Szczepy much lub krzyżówki genetyczne należy przechowywać w kulturze masowej w temperaturze 25 °C na pożywce z mączki kukurydzianej w 12-godzinnym cyklu światła i 12-godzinnej ciemności w inkubatorze dla much wyposażonym w światło i timer.</li>
 <li>Rozcieńczyć drożdże podkładowe w wodzie, aby uzyskać płynną pastę (10 g drożdży podkładowych rozcieńczonych 3-4 ml destylowanegoH2O). Dodaj małą kroplę do pokarmu z mąki kukurydzianej i przykryj fiolki. Pozostaw do wyschnięcia na co najmniej godzinę, aby uniknąć przyklejania się dorosłych much do pasty drożdżowej. Umieszczenie małej kropli drożdży rozcieńczonych w wodzie na powierzchni żywności może poprawić składanie jaj. Alternatywnie można użyć pasty drożdżowej piekarskiej, 20% kwasu octowego (AcOH) (Sigma Aldrich, Szwajcaria A6283-100ML). W tym celu zanurz końcówkę patyczka higienicznego w roztworze i rozprowadź na powierzchni żywności z mączki kukurydzianej. </li>
 <li>Umieść dorosłe muchy (w wieku co najmniej czterech dni, ale nie starsze niż dziesięć dni) w fiolkach z mąką kukurydzianą. Do każdej fiolki należy umieścić wystarczającą liczbę osobników dorosłych w celu uzyskania wystarczającej liczby larw, aby powtórzyć test preferencji kilka razy i umożliwić porównanie statystyczne. W przypadku krzyżówek genetycznych zazwyczaj używamy co najmniej 20 samic i 5-10 samców na fiolkę, ale niektóre linie wymagają więcej samic, aby uzyskać wystarczającą ilość potomstwa larwnego.</li>
 <li>Pozwól dorosłym osobnikom złożyć jaja przez 12 godzin i przenieś je do nowych fiolek. Dorośli mogą być przenoszeni rano i wieczorem. Zazwyczaj przenosimy dorosłe osoby na siedem do dziesięciu dni i w razie potrzeby przyjmujemy nowe osoby dorosłe. </li>
 <li>Przechowuj kolekcje jaj pobierane co 12 godzin w inkubatorze i pozwól larwom rosnąć w temperaturze 25 °C, 12-godzinnym cyklu światła i 12-godzinnym ciemnym cyklu i wilgotności 60%. Aby przetestować okołodobowe składniki zachowania wzrokowego, przenieś larwy do stałej ciemności (DD) 48 godzin po zebraniu jaj (co odpowiada cyklom dwóch świateł-ciemność). W tym celu użyj oddzielnego inkubatora bez światła, ale wszystkie inne warunki, takie jak temperatura i wilgotność, powinny być identyczne. Należy pamiętać, aby przenieść fiolki do inkubatora DD tuż przed przejściem do fazy ciemnej. Przed przeniesieniem fiolek do innego inkubatora należy umieścić fiolki w pudełku tekturowym lub owinąć je folią aluminiową, aby zapobiec ekspozycji na światło podczas przenoszenia (pakowanie w pudełko tekturowe lub owijanie musi odbywać się w "fazie światła" przed zmianą między inkubatorami). Po tym czasie i do czasu rozpoczęcia eksperymentów należy chronić zwierzęta przed jakąkolwiek ekspozycją na światło.</li>
 <li>Po 4 dniach (od 84 do 108 godzin od złożenia jaj) należy zebrać wczesne L3 (żerujące larwy) w punktach czasowych, które mają być badane (patrz 4. Test preferencji światła, punktowy. pkt 4.4.). </li>
</ol>
2. Konfiguracja testowa
<ol>
 <li>Wykonuj eksperymenty w ciemnym pomieszczeniu o stałej temperaturze i wilgotności. </li>
 <li>Aby utrzymać dwie ćwiartki szalki Petriego w ciemności, przykryj pokrywkę czarną taśmą i folią aluminiową. W tym celu zaznacz środek obwodu powieki. Zaznacz również cztery punkty na obramowaniu pokrywy z 90 ° separacji między nimi. Aby to ułatwić, narysuj kwadrat o długości 20 cm podzielony na cztery ćwiartki o długości 10 cm na kartce papieru lub za pomocą komputera. Wytnij 10 cm kwadraty folii aluminiowej i czarnej taśmy (Rysunek 1A). Przykryj dwie przeciwległe ćwiartki, przyklejając kwadrat folii aluminiowej, jako pierwszą warstwę i czarną taśmę zakrywającą go, uważając, aby zakryć również krawędź pokrywy. 
 W przeszłości stosowano dwie nieco odmienne formy tych testów. Używamy tutaj testu "ćwiartki płytki", w którym szalka Petriego jest podzielona na cztery równe ćwiartki10. W alternatywnym teście "półpłytkowym" szalkę Petriego dzieli się na pół (połowa wystawiona na działanie światła, połowa w ciemności)1,7,8. Do dnia dzisiejszego nie opublikowano żadnych istotnych różnic między tymi dwoma testami.</li>
 <li>Przyklej arkusz ćwiartki, taki jak ten używany do oznaczania pokrywek, tuż pod źródłem światła na stole. Zaznacz obwód szalki Petriego wyśrodkowanej na przecięciu kwadrantów. Użyj znaków jako odniesienia, aby umieścić płytkę testową zawsze w tej samej pozycji pod źródłem światła. </li>
 <li>Zainstaluj lampę, zwykłą białą żarówkę (Phillips, Softtone 5W) lub lampę LED (LED lamp, 80012 White, Osram) nad szalką Petriego za pomocą żelaznej podstawki (Fisher Scientific, S47808). Wyreguluj wysokość w taki sposób, aby cała płytka testowa była równomiernie oświetlona. Zdecydowanie zalecamy stosowanie lamp LED, ponieważ emitują one bardziej określone długości fal niż konwencjonalne żarówki. Co więcej, diody LED emitują mniej ciepła. </li>
 <li>Dostosuj natężenie światła za pomocą fotometru (Environment Meter PCE EM882). Aby osiągnąć wymagane natężenie światła 350-760 luksów, przesuń lampę w górę lub w dół w zależności od potrzeb. Podłączenie lampy do regulowanego źródła zasilania zapewnia większą elastyczność w zakresie zmiany intensywności bez przesuwania lampy (Rysunek 1B). </li>
</ol>
3. Przygotowanie talerzy 
<ol>
 <li>Przygotować 200 ml 2,5% agaru (Sigma-Aldrich, Szwajcaria A5093-500G) z podwójnie destylowaną wodą (Millipore). </li>
 <li>Umieść szalki Petriego na stole (średnica 90 mm; Greiner Bio-One GmbH, 4550 Kremsmeinster, Austria) w rzędach, aby umożliwić nalewanie gorącej agarozy. </li>
 <li>Gotuj agarozę w kuchence mikrofalowej, aż roztwór będzie całkowicie przezroczysty i płynny. Upewnij się, że płynny roztwór nie zawiera pęcherzyków. ostrożność: Ostrożnie przetransportuj na stół, ponieważ roztwór może być bardzo gorący! </li>
 <li>Wlej gorącą agarozę do szalek Petriego, aż cała powierzchnia zostanie jednorodnie pokryta cienką warstwą roztworu, wystarczą około dwóch lub trzech milimetrów. Bądź szybki, aby zapobiec krzepnięciu agarozy przed pokryciem wszystkich płytek. Pozwól talerzom ostygnąć. Przechowuj talerze w temperaturze pokojowej i używaj ich tylko w tym samym dniu przygotowania. </li>
</ol>
4. Test preferencji światła 
<ol>
 <li>Pracuj w warunkach czerwonego światła w pomieszczeniu eksperymentalnym, aby zapobiec wpływowi światła przed testem, ponieważ Drosophila nie jest w stanie wyczuć czerwonych długości fal światła. Użyj czerwonej żarówki (Phillips, PFE712E*8) zamontowanej w lampie, aby oświetlić miejsce pracy.</li>
 <li>Utrzymywać temperaturę w temperaturze 25 °C przez wszystkie doświadczenia. W razie potrzeby kontrolować temperaturę w pomieszczeniu za pomocą grzałki lub urządzenia chłodzącego.</li>
 <li>Weź trochę pokarmu z fiolek hodowanych przez dwudniowe cykle w ciągłej ciemności (z sekcji 1). Ponieważ larwy zwykle kopią na powierzchni pokarmu, weź najwyższą warstwę (o głębokości około 5 mm) za pomocą szpatułki (Fisher Scientific, 14-373-25A). Rozłóż jedzenie na zewnętrznej stronie pokrywki szalki Petriego, dodaj trochę wody i delikatnie wymieszaj szpatułką. </li>
 <li>Zbierz karmiące larwy L3 z pożywienia. Ponieważ preferencja świetlna zostanie przetestowana, wybór tylko wczesnych/żerujących larw L3 ma kluczowe znaczenie, ponieważ zapewniona jest ujemna fototaksja. Spóźnione/wędrujące larwy L3 lub duże larwy pełzające po pożywieniu prawdopodobnie już zmieniły swoje fotozachowanie. Żerowanie larw L3 (negatywowa fototaktyka) można rozpoznać po tym, że ich przednie przetchlinki są otwarte i wystają na zewnątrz w formie przypominającej palec. Przetchlinki tylne mają po trzy otwory i cztery grupy dużych rozgałęzionych włosów. Gruczoły ślinowe rozciągają się do drugiego segmentu brzusznego11. Hodowla larw pod mikroskopem jest wygodna, podczas gdy nie należy używać białego światła. Lampa światła czerwonego jest niezbędna do oświetlenia larw, jeśli są one poddawane ocenie pod mikroskopem stereoskopowym przed rozpoczęciem eksperymentów.</li>
 <li>Umyj larwy krótko w wodzie z kranu i zbierz wcześnie żerujące larwy w trzecim stadium (nadal w czerwonym świetle). Przed przeniesieniem larw na płytkę testową należy pobrać larwy mokrym pędzlem i ostrożnie wchłonąć nadmiar wody ręcznikiem papierowym lub bibułą filtracyjną. Nie susz larw zbyt mocno, ponieważ może to zaszkodzić zwierzęciu i wpłynąć na jego zachowanie.</li>
 <li>Za pomocą mokrego pędzla ostrożnie przenieś larwy na talerze. Umieść grupę około 30 larw na środku płytki. Przykryć płytkę przykrytą pokrywką już przygotowaną z kwadrantami i umieścić płytkę pod źródłem światła, aby była gotowa do eksperymentu (patrz sekcja 2). </li>
 <li>Włącz białe światło lamp i uruchom timer. Pozwól larwie swobodnie poruszać się po płytce przez 5 minut, a następnie szybko zdejmij pokrywkę i policz liczbę larw w ciemności i jasnych kwadrantach. Oznaczenie pozycji każdej larwy markerem może ułatwić liczenie. Alternatywnie zrób zdjęcie płytki i policz a posteriori. Larwy wykazujące niejasną preferencję świetlną, takie jak larwy pełzające po ścianach lub zagrzebujące się w agarze powinny być traktowane jako preferencje neutralne i po prostu powinny być uwzględniane w całkowitej liczbie larw przy obliczaniu wskaźnika preferencji świetlnej. </li>
 <li>Po policzeniu wyrzuć płytkę z larwami i zastąp ją nową płytką testową do następnego eksperymentu. Zbierz zużyte talerze w plastikowej torbie autoklawu do późniejszej obsługi i utylizacji.</li>
 <li>Po przeprowadzeniu wystarczającej liczby eksperymentów można przetestować nowy genotyp. Do analizy wystarczy 10-15 prób na genotyp. </li>
</ol>
5. Analiza danych 
<ol>
 <li>Dla wygody przenieś dane do arkusza danych w formacie Excel (Microsoft) lub Origin (Origin Lab) na komputerze w celu dalszej analizy statystycznej. Ułóż w jednej kolumnie liczbę zwierząt w ciemności, w drugiej liczbę zwierząt w jasnych kwadrantach, a w trzeciej całkowitą liczbę zwierząt na tablicy (w tym "neutralne" larwy).</li>
 <li>Oblicz wskaźnik preferencji (PREF) dla ciemności dla każdego eksperymentu, korzystając z następującego wzoru: 
 PREF(ciemność) = (liczba larw w ciemności - liczba larw w świetle)/całkowita liczba larw </li>
 <li>Porównaj statystycznie zestaw danych z odpowiednią analizą dla grup. Tutaj używamy testu Wilcoxona, aby porównać statystycznie dwie grupy. Test ANOVA z wielokrotnym porównaniem Tukeya post hoc można przeprowadzić, jeśli w porównaniu grup rozmaitości spełnione jest założenie rozkładu normalnego. </li>
 <li>Twórz wykresy, które wyraźnie pokazują porównania między liniami i punktami czasowymi w całym cyklu dnia. Korzystamy z oprogramowania Origin (Origin Lab) do testowania istotności statystycznej i generowania odpowiednich wykresów, ale każde inne oprogramowanie statystyczne może być pomocne.</li>
</ol>

<ol><li>Sawin-McCormack, E. P., Sokolowski, M. B., Campos, A. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+and+genetic+analysis+of+Drosophila+melanogaster+photobehavior+during+larval+development%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurogenet%22%5BJournal%5D)">Characterization and genetic analysis of Drosophila melanogaster photobehavior during larval development.</a> J. Neurogenet. 10, 119-135 (1995).</li>
<li>Sprecher, S. G., Pichaud, F., Desplan, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Adult+and+larval+photoreceptors+use+different+mechanisms+to+specify+the+same+Rhodopsin+fates%5BTitle%5D)+AND+%22Genes+Dev%22%5BJournal%5D)">Adult and larval photoreceptors use different mechanisms to specify the same Rhodopsin fates.</a> Genes Dev. 21, 2182-2195 (2007).</li>
<li>Sprecher, S. G., Desplan, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Switch+of+rhodopsin+expression+in+terminally+differentiated+Drosophila+sensory+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Switch of rhodopsin expression in terminally differentiated Drosophila sensory neurons.</a> Nature. 454, 533-537 (2008).</li>
<li>Xiang, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Light-avoidance-mediating+photoreceptors+tile+the+Drosophila+larval+body+wall%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Light-avoidance-mediating photoreceptors tile the Drosophila larval body wall.</a> Nature. 468, 921-926 (2010).</li>
<li>Diaz, N. N., Sprecher, S. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Photoreceptors%3A+unconventional+ways+of+seeing%5BTitle%5D)+AND+%22Curr.+Biol%22%5BJournal%5D)">Photoreceptors: unconventional ways of seeing.</a> Curr. Biol. 21, R25-R27 (2011).</li>
<li>Emery, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Drosophila+CRY+is+a+deep+brain+circadian+photoreceptor%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Drosophila CRY is a deep brain circadian photoreceptor.</a> Neuron. 26, 493-504 (2000).</li>
<li>Mazzoni, E. O., Desplan, C., Blau, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Circadian+pacemaker+neurons+transmit+and+modulate+visual+information+to+control+a+rapid+behavioral+response%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Circadian pacemaker neurons transmit and modulate visual information to control a rapid behavioral response.</a> Neuron. 45, 293-300 (2005).</li>
<li>Keene, A. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Distinct+visual+pathways+mediate+Drosophila+larval+light+avoidance+and+circadian+clock+entrainment%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Distinct visual pathways mediate Drosophila larval light avoidance and circadian clock entrainment.</a> J. Neurosci. 31, 6527-6534 (2011).</li>
<li>Gong, Z. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Two+Pairs+of+Neurons+in+the+Central+Brain+Control+Drosophila+Innate+Light+Preference%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Two Pairs of Neurons in the Central Brain Control Drosophila Innate Light Preference.</a> Science. 330, 499-502 (2010).</li>
<li>Lilly, M., Carlson, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((smellblind%3A+a+gene+required+for+Drosophila+olfaction%5BTitle%5D)+AND+%22Genetics%22%5BJournal%5D)">smellblind: a gene required for Drosophila olfaction.</a> Genetics. 124, 293-302 (1990).</li>
<li>Bodenstein, D. The postembryonic development of Drosophila. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aBodenstein%2C+D+%22Biology+of+Drosophila%22">Biology of Drosophila</a>. Demerec, M. , John Wiley & Sons. 275-367 (1950).</li>
<li>Pittendrigh, C. S. Circadian systems: Entrainment. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aPittendrigh%2C+CS+%22Biological+Rhythms%22">Biological Rhythms</a>. 4 Handbook of Behavioral Neurobiology, Plenum. 95-124 (1981).</li>
<li>Collins, B., Kane, E. A., Reeves, D. C., Akabas, M. H., Blau, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Balance+of+Activity+between+LN%28v%29s+and+Glutamatergic+Dorsal+Clock+Neurons+Promotes+Robust+Circadian+Rhythms+in+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Balance of Activity between LN(v)s and Glutamatergic Dorsal Clock Neurons Promotes Robust Circadian Rhythms in Drosophila.</a> Neuron. 74, 706-718 (2012).</li>
<li>Keene, A. C., Sprecher, S. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Seeing+the+light%3A+photobehavior+in+fruit+fly+larvae%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Seeing the light: photobehavior in fruit fly larvae.</a> Trends Neurosci. 35, 104-110 (2012).</li>
<li>von Essen, A. M., Pauls, D., Thum, A. S., Sprecher, S. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Capacity+of+visual+classical+conditioning+in+Drosophila+larvae%5BTitle%5D)+AND+%22Behav.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Capacity of visual classical conditioning in Drosophila larvae.</a> Behav. Neurosci. 125, 921-929 (2011).</li>
</ol>

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Opisany test preferencji świetlnej wykorzystuje wrodzone fotozachowanie larw. Test jest łatwy do ustalenia, pozwala na wiele powtórzeń przy niskich kosztach i dostarcza cennych informacji na temat wykrywania i przetwarzania światła. Paradygmat eksperymentalny pozwala na stosunkowo szybkie określenie ilościowe, ile osób preferuje światło lub ciemność. Taka preferencja może być wyświetlana jako surowe wartości procentowe lub alternatywnie jako wskaźnik preferencji (PREF). PREF jest wyrażony jako różnica między zwierzętami,...

Tutaj opisujemy test behawioralny oparty na preferencjach larw dla ciemności (lub światła). Larwy reagują silną i stereotypową reakcją fotonegatywną na etapach żerowania (od L1 do wczesnego L3)1. Test ma na celu ocenę światłowstrętnego zachowania larwy i porównuje preferencje dotyczące światła lub ciemności grupy larw poruszających się swobodnie na szalce Petriego pokrytej agarem. Ten test behawioralny nie tylko dostarcza informacji o wrażliwości, integracji i plastyczności czasowej układu wzrokowego, ale także dostarcza wskazówek na temat tego, w jaki sposób wrażliwość na światło i jej proces są kontrolowane przez system okołodobowy.
Oko larwalne Drosophila (zwane również Organem Bowliga; BO), jest głównym narządem percepcji światła. Każde oko składa się z 12 fotoreceptorów (PR), osiem PR wyraża wrażliwą na zieleń rodopsynę6 (rh6), a cztery PR wyrażają wrażliwą na niebiesko rodopsynę5 (rh5)2,3. Oprócz PR zidentyfikowano również neurony wielodendrytyczne klasy IV, które pokrywają ścianę ciała larwy, reagują na szkodliwe natężenia światła4,5. Wiadomo również, że neurony rozrusznika serca znajdujące się w centralnym mózgu larwy wyrażają wrażliwe na światło białko kryptochromu (Cry), które działa jako wewnętrzny czujnik niebieskiego światła w mózgu6,7. Intrygująco fotofobowość zwierząt typu dzikiego wykazuje komponent okołodobowy w różnych punktach czasowych w ciągu dnia i nocy podczas testowania za pomocą tego testu. Reakcje na światło żerujących larw L3 wykazały silniejszą fotofobiczność o świcie i niższą fotofobię o zmierzchu, gdy testowano ją pod kątem preferencji jasnej i ciemnej7. Co ciekawe, tylko Rh5-PR są wymagane do unikania światła, podczas gdy Rh6-PR są zbędne. Zarówno Rh5-PR, jak i Rh6-PR biorą udział w resetowaniu zegara molekularnego przez światło8. Ścieżka Cry musi być skoordynowana z innymi ścieżkami wyczuwania światła, aby zaaranżować odpowiednie wyjście behawioralne w ciągu dnia. Acetylocholina w PR odgrywa istotną rolę w unikaniu światła, a także w porywaniu zegara molekularnego. Blokowanie neurotransmisji acetylocholiny z PR do neuronów okołodobowego rozrusznika serca zmniejsza odpowiedź fotofobową w teście preferencji światłai ciemności 8. Stosując ten sam test, niedawno zidentyfikowano dwie symetryczne pary neuronów, które zmieniają preferencje świetlne trzeciego stadium larwalnego Drosophila9. Te dwie pary neuronów mogą funkcjonować w późnych stadiach larwalnych, kiedy zwierzęta opuszczają pokarm, aby przypuszczalnie znaleźć odpowiednie miejsce do przepoczwarzenia. Jednak pytanie, w jaki sposób szlaki wzrokowe oddziałują na siebie i kontrolują zachowanie wzrokowe larw w sposób okołodobowy, pozostaje w dużej mierze bez odpowiedzi. Test preferencji świetlnej umożliwia porównania między okołodobowymi punktami czasowymi, liniami muchowymi i stanem okołodobowym przy różnych jakościach światła. Test jest łatwy w przygotowaniu i niedrogi, a wcześniej był przydatny w kilku laboratoriach do opisywania i badania zachowania larw w świetle pochodzącym ze światła.

<table><tbody><tr><td>Agar</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A5093-500G</td><td>2,5%; Sigma-Aldrich, 9471 Buchs, Szwajcaria Szalki </td></tr><tr><td>Petriego</td><td>Greiner Bio-One GmbH</td><td>633180</td><td>średnica 90 mm; Greiner Bio-One GmbH, 4550 Kremsmeinster, Austria</td></tr><tr><td>Lampa LED</td><td>OSARAM</td><td>80012 Biała</td><td>lampa LED, 80012</td></tr><tr><td>Biały miernik środowiska</td><td>PCE</td><td>PCE EM882</td><td>Lux, Temp, RH%</td></tr><tr><td>Szafa termostatyczna</td><td>Aqua Lytic (Liebherr)</td><td>ET636-6</td><td></td></tr><tr><td>Zegar świetlny</td><td>Timer T</td><td>6185.104</td><td>230V/50HZ (sprawdź specyfikacje dla swojego kraju)</td></tr><tr><td>Uniwersalny termostat</td><td>Conrad</td><td>UT200</td><td></td></tr><tr><td>Nawilżacz</td><td>Boneco</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Taśma Balck</td> Tesa <td>5 cm </td>Klej <td>Lampa</td><td></td></tr> <tr><td>inkubatora</td><td>Uhu</td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr> Phillips Softtone 5W <tr><td>Zegar czasowy</td><td>Ziliss</td><td></td><td>Ziliss, Szwajcaria</td></tr><tr><td>Excel Oprogramowanie</td><td>Microsoft</td><td></td><td>Excel</td></tr><tr><td>Origin Software 8.5</td><td>OriginLab</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Backer Yeast</td><td>Migros Szwajcaria</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Żelazny stojak 17X28CM</td><td>Fisher Scientific</td><td>S47808</td><td></td></tr><tr><td>Kwas octowy</td><td>Sigma Aldrich</td><td>A6283-100ML</td><td>20% kwas octowy rozcieńczony w H2O</td></tr><tr><td>Lampa światła czerwonego</td><td>Phillips</td><td>PFE712E*8C</td><td></td></tr><tr><td>Szpatułka </td><td>Fisher Scientific</td><td>14-373-25A</td><td></td></tr><tr><td>Zasilacz</td><td>EA</td><td>EA PS 2042-06B</td><td>Opcjonalnie</td></tr><tr><td>Folia aluminiowa</td><td>Grzejnik Prix Coop</td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td> Kuchenka mikrofalowa GOON NSB200C <td></td></tr><tr><td></td><td>Intertronic</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Standardowa mączka kukurydziana Pokarm</td><td></td><td></td><td></td>dla much</tr><tr><td>Woda </td><td>destylowana</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

test preferencji świetlnej w celu zbadania wrodzonego i okołodobowego regulowanego fotozachowania u larw drosophila

Light Preference Assay to Study Innate and Circadian Regulated Photobehavior in Drosophila Larvae

Światło działa jak sygnał środowiskowy do kontrolowania zachowania zwierząt na różnych poziomach. Układ nerwowy larw Drosophila jest używany jako unikalny model do odpowiedzi na podstawowe pytania dotyczące tego, w jaki sposób informacje świetlne są przetwarzane i udostępniane między szybkimi i okołodobowymi zachowaniami. Larwy Drosophila wykazują stereotypowe zachowanie unikające pod wpływem światła. Aby zbadać zachowania zależne od światła, można zastosować porównywalnie proste testy preferencji światła i ciemności. U kręgowców i stawonogów szlaki neuronalne zaangażowane w wyczuwanie i przetwarzanie bodźców wzrokowych częściowo pokrywają się z tymi, które przetwarzają fototyczne informacje okołodobowe. Fascynujące pytanie, w jaki sposób system wykrywania światła i system okołodobowy współdziałają w celu utrzymania koordynacji wyników behawioralnych, pozostaje w dużej mierze niezbadane. Drosophila jest modelem biologicznym, który ma wpływ na podejście do tych pytań, ze względu na niewielką liczbę neuronów w mózgu i dostępność narzędzi genetycznych do manipulacji neuronami. Przedstawiony test preferencji jasnego i ciemnego pozwala na zbadanie szeregu zachowań wzrokowych, w tym dobowej kontroli fototaksji.

Zgodnie z opisanym powyżej protokołem, przebadaliśmy preferencje świetlne (jasno-ciemne) we wczesnej trzeciej fazie larwalnej much dzikiego typu Canton-S w dwóch różnych czasach cyrkadialnych: CT0 i CT12. Osobniki dorosłe hodowano w cyklu 12 h światła i 12 h ciemności, pozostawiając je do składania jaj przez 12 h. Larwy rozwijały się przez pierwsze dwa dni w tym samym reżimie oświetlenia. Ponieważ chcieliśmy zbadać modulację cyrkadialną w warunkach stałych (wolnobieżny rytm zegara cyrkadialnego), larwy przeniesiono nastę...

Tutaj opisujemy test preferencji jasno-ciemnej dla larw Drosophila. Test ten dostarcza informacji na temat wrodzonej i okołodobowej regulacji wykrywania światła i przetwarzania fotozachowania.

Test preferencji świetlnej w celu zbadania wrodzonego i okołodobowego regulowanego fotozachowania u larw Drosophila

Light acts as environmental signal to control animal behavior at various levels. The Drosophila larval nervous system is used as a unique model to answer ...

Ogólnym celem następnego eksperymentu jest zbadanie wrodzonego i okołodobowego zachowania fototaktycznego larw Drosophila za pomocą testu preferencji światło-ciemność. Osiąga się to najpierw poprzez hodowlę larw eksperymentalnych w określonych warunkach oświetlenia i ciemności, aby ustanowić w larwach początkowy zegar okołodobowy. Następnie larwy przenosi się w warunki stałej ciemności, co pozwala na swobodny bieg larwalnego zegara okołodobowego.Po osiągnięciu trzeciego stadium żerowania larwy są dzielone na grupy w celu przetestowania ich preferencji świetlnych w różnych punktach czasu okołodobowego. Wyniki wykazują wrodzoną i okołodobową preferencję świetlną, obliczoną na podstawie indeksu preferencji i porównaną pomiędzy punktami czasowymi a grupami eksperymentalnymi. Choć metoda ta pozwala uzyskać wgląd w wrodzoną i okołodobową regulację detekcji światła oraz przetwarzanie zachowań fototaktycznych, może być ona również zastosowana w innych systemach, takich jak węch, gustacja, chemotaksja i termotaksja.Podobnie, można go zmodyfikować do testów uczenia się i pamięci. Procedurę zaprezentują Alina oraz studenci studiów magisterskich z mojego laboratorium. Aby zebrać jaja, należy pozwolić dorosłym muchom w okresie godowym składać jaja przez 12 godzin na świeżym podłożu, a następnie przenieść je do nowych probówek. Przenoszenie osobników dorosłych należy powtarzać co 12 godzin, stosując cykl 12 godzin światła i 12 godzin ciemności.Przechowuj jaja zbierane w odstępach 12-godzinnych w inkubatorze. Na potrzeby eksperymentu hoduj zwierzęta do wczesnego stadium larwy L3. Są to larwy żerujące, dostępne od 84 do 108 godzin od złożenia jaj.Prawidłowe przygotowanie etapu LAE jest krytyczne dla sukcesu eksperymentu. Ponieważ w późnej fazie L3 LAE zmieniło zachowanie fototaktyczne, aby przetestować okołodobowe komponenty zachowania wizualnego, na 48 godzin przed testowaniem oraz tuż przed subiektywnym świtem larw, należy umieścić zebrane larwy w kartonowym pudełku.Następnie przenieś pudełko do inkubatora z zapewnioną stałą ciemnością na 48 godzin; do czasu zakończenia eksperymentu larwy te muszą pozostać niezakłócone w wyznaczonej dla nich przestrzeni. Przygotuj pokrywkę do dziewięciocentymetrowej szalki Petriego, wykorzystując kwadrat o boku 20 cm podzielony na cztery ćwiartki, który posłuży jako szablon.Przyklej kwadraty z folii aluminiowej o boku 10 cm w przeciwległych ćwiartkach i zaklej je czarną taśmą. Upewnij się, że krawędź pokrywy została zakryta. Następnie przyklej do stołu, pod źródłem światła, kwadrat o boku 20 cm podzielony na cztery ćwiartki.Zaznacz obrys naczynia testowego na arkuszu, aby służył jako prowadnica do zapewnienia spójnego przesunięcia. Zamontuj lampę LED nad szalką Petriego za pomocą statywu laboratoryjnego. Dostosuj wysokość tak, aby cała płyta testowa była równomiernie oświetlona.Dostosuj natężenie światła w miejscu testowym do zakresu od 350 do 760 luxe, zmieniając wysokość lampy lub korzystając z regulowanego zasilacza. Pomieszczenie doświadczalne musi być oświetlone światłem czerwonym i posiadać taką samą temperaturę, jak ta panująca w miejscu hodowli zwierząt. Fiolki inkubowano przez dwa dni w całkowitej ciemności.Zbierz lawę z pokarmu za pomocą szpatułki z górnych pięciu milimetrów pokarmu. Rozprowadź pokarm na zewnętrznej stronie pokrywki szalki Petriego. Dodaj do pokarmu niewielką ilość wody i delikatnie wymieszaj go szpatułką.Używając pędzla, nanieś kroplę wody z kranu na nową szalkę. Przenieś larwy do kropli wody, aby je opłukać. Następnie zbierz larwy za pomocą wilgotnego pędzla.Należy wybrać wyłącznie larwy w stadium L3 w fazie wczesnego karmienia i unikać larw w stadium L3 w fazie późnego wędrowania. Wybrane larwy należy przenieść na środek płytki testowej. Karmiące się larwy L3 posiadają otwarte i wystające na zewnątrz przednie sferule.W formie palczastej. Tylne sferoidy posiadają po trzy otwory oraz cztery grupy dużych, rozgałęzionych włosków. Gruczoły ślinianowe sięgają drugiego segmentu odwłoka.Po umieszczeniu 30 larw w centrum płyty testowej, należy przykryć ją przygotowaną pokrywką. Włączyć lampę LED. Następnie uruchomić stoper i pozwolić larwom swobodnie poruszać się po płycie przez pięć minut.Następnie szybko zdejmij pokrywkę i policz liczbę larw w kwadrantach ciemnych i jasnych. Zaznaczenie pozycji każdej larwy może ułatwić liczenie. Pomocne może być również wykonanie szybkiej fotografii; larwy wykazujące niejednoznaczne preferencje świetlne, takie jak larwy pełzające po ściankach lub zagrzebujące się w agarze, należy uznać za neutralne i dodać do całkowitej liczby larw podczas obliczania indeksu preferencji świetlnej.Po przeliczeniu larw należy wyrzucić płytkę i użyć nowej płytki testowej do kolejnego eksperymentu. Po przeprowadzeniu od 10 do 15 prób na genotyp, należy przystąpić do analizy zgodnie z protokołem. Preferencje świetlne (jasno-ciemne) larw Canton ES porównano w dwóch różnych punktach czasu okołodobowego.Larwy w fazach CT 0 i CT 12 (subiektywnie odpowiednio świt i zmierzch) przetrzymywano przez 48 godzin w standardowych warunkach, a następnie przeniesiono do stałej ciemności na trzy dni. Testy cyklu światło-ciemność przy natężeniu 350 luxe wykazały, że fotoczułość była wyższa u larw badanych w CT 0 w porównaniu do larw badanych w CT 12. Zgodnie z zastosowanym wzorem, preferencja ciemności dla larw w CT 0 wyniosła 0,52 w porównaniu do 0,36.Porównanie wskaźników dla larw CT 12 przy użyciu testu Wilcoxona daje istotną wartość P wynoszącą 0,023. Po obejrzeniu tego filmu powinni Państwo posiadać dobrą wiedzę na temat tego, jak w tym celu badać preferencje świetlne larw troficznych w różnych obwodach i punktach czasowych. Powinni Państwo być w stanie przeprowadzić entrainment larw oph w stadium F3, zbadać ich zachowanie fotofobiczne oraz obliczyć wskaźnik preferencji świetlnej do porównania statystycznego.

light-preference-assay-to-study-innate-circadian-regulated

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Neuronauka

Badanie preferencji świetlnych w celu badania wrodzonego i regulowanego dobowo fotozachowania w larwach Drosophila

Opisujemy procedury rejestracji dobowych rytmów aktywności lokomocyjnej Drosophila oraz późniejszej analizy danych. Rytmy aktywności lokomocyjnej są wiarygodnym behawioralnym wskaźnikiem zegarów okołodobowych zwierząt i są wykorzystywane jako standardowy odczyt funkcji zegara podczas badania mutantów okołodobowych lub analizowania wpływu środowiska na regulację systemu okołodobowego.

Oznaczanie aktywności lokomotorycznej w celu badania rytmów okołodobowych i parametrów snu u Drosophila

Larwy Drosophila są wrażliwe na światło i reagują na zmiany w otaczającym świetle. Ten film opisuje test, który testuje ich zdolność do unikania światła, zwany testem plamki świetlnej. Prezentowany protokół pokazuje, jak skonfigurować test z niebieską diodą LED i pokazuje, jak rejestrować zachowanie zwierzęcia w odpowiedzi na spotkanie ze światłem.

Test plamki świetlnej: metoda badania zachowania fototaktycznego Drosophila

Ten film pokazuje hodowlę Drosophila melanogaster w określonych warunkach oświetleniowych, aby zbadać rolę białek Bruchpilot w uwalnianiu neuroprzekaźników i wynikającej z tego modulacji aktywności synaptycznej.

Modulacja synaptyczna u Drosophila po ekspozycji na długotrwałe światło

Ten protokół opisuje test o wysokiej przepustowości do testowania preferencji składania jaj przez Drosophila melanogaster w rozdzielczości pojedynczego zwierzęcia.  Ten test zapewnia prostą, wydajną i skalowalną platformę do identyfikacji genów i składników obwodów, które kontrolują prosty proces podejmowania decyzji.

Wysokoprzepustowy test do badania preferencji składania jaj u poszczególnych Drosophila melanogaster

Celem tego protokołu jest stworzenie ex vivo hodowli mózgu larw Drosophila zoptymalizowanej do monitorowania okołodobowych rytmów molekularnych za pomocą długoterminowego fluorescencyjnego obrazowania poklatkowego. Omówiono również zastosowanie tej metody do testów farmakologicznych.

Obrazowanie na żywo fluorescencji w rozdzielczości pojedynczej komórki zegarów okołodobowych Drosophila w hodowli mózgu larw

Ten protokół wprowadza test plamki świetlnej do zbadania fototaktycznego zachowania larw Drosophila. W tym teście plamka świetlna jest generowana jako stymulacja światłem, a proces unikania światła larwalnego jest rejestrowany przez system obrazowania oparty na świetle podczerwonym.

Test punktowy świetlny do analizy fototaksji larw Drosophila

Tutaj szczegółowo opisujemy, jak zsynchronizować Drosophila z dniem okołodobowym. Jest to pierwszy i najważniejszy krok niezbędny do badania rytmów biologicznych i chronobiologii.

Okołodobowe porywanie Drosophila melanogaster

Ten protokół opisuje, jak stworzyć prostą komorę obserwacyjną zachowania dorosłego Drosophila i jak robić zdjęcia/filmy w wysokiej rozdzielczości morfologii lub zachowania różnych typów muszek owocowych w komorze obserwacyjnej za pomocą stosunkowo prostych i niedrogich metod.

Regulowany system obrazowania w wysokiej rozdzielczości do badań behawioralnych dorosłych Drosophila

Przedstawiamy protokół do elektrofizjologicznego charakterystyki bistabilnych fotopigmentów: (i) wykorzystanie przemieszczeń ładunku w cząsteczkach fotopigmentu po absorpcji fotonów i ich ogromnej ilości w fotoreceptorach, oraz (ii) wykorzystanie różnic w widmach absorpcyjnych rodopsyny i metarodopsyny. Protokoły te są przydatne do badań przesiewowych pod kątem mutacji wpływających na bistabilne systemy fotopigmentowe.

Elektrofizjologiczne metody pomiaru poziomu fotopigmentu w fotoreceptorach Drosophila

Ten artykuł przedstawia metody manipulacji optogenetycznej u Drosophila melanogaster, wykorzystując CsChrimson i GtACR2 do aktywacji i wyciszania określonych neuronów. Opisano cztery eksperymenty wykorzystujące optogenetykę do badania zachowań termotaktycznych i smakowych, dostarczając wglądu w podstawowe mechanizmy neuronalne rządzące tymi procesami.

Testy behawioralne do optogenetycznej manipulacji obwodami neuronalnymi u Drosophila melanogaster

Poznaj test preferencji świetlnej dla badania wrodzonego i okołodobowego fotozachowania larw Drosophila. Ta metoda pozwala mierzyć preferencje świetlne i analizować rytmy dobowe w neurobiologii.

Test preferencji świetlnej w celu zbadania wrodzonego i okołodobowego regulowanego fotozachowania u larw Drosophila

Przeglądaj więcej filmów