Test preferencji świetlnej w celu zbadania wrodzonego i okołodobowego regulowanego fotozachowania u larw Drosophila

Ogólnym celem poniższego eksperymentu jest przetestowanie wrodzonego i okołodobowego zachowania fotograficznego lawy Drosophila za pomocą testu preferencji jasnej ciemności. Osiąga się to poprzez najpierw hodowlę eksperymentalnych larw w określonych jasnych, ciemnych warunkach, aby ustalić początkowy zegar okołodobowy larw. Następnie larwy są przełączane w ciągłą ciemność, co pozwala larwom na swobodny bieg zegara okołodobowego.

Po osiągnięciu etapu karmienia L trzy lawa jest sortowana na grupy, aby przetestować ich preferencje świetlne w różnych punktach czasowych okołodobowych. Uzyskuje się wyniki, które pokazują wrodzoną i okołodobową preferencję światła w oparciu o obliczenie wskaźnika preferencji i porównanie punktów czasowych i grup eksperymentalnych. Chociaż metoda ta może zapewnić wgląd we wrodzoną i okołodobową regulację wykrywania światła i przetwarzania zachowania zdjęć, można ją również zastosować do innych systemów, takich jak węch, kasacja, chemia, taksówka termiczna.

Podobnie można go zmodyfikować pod kątem testów uczenia się i pamięci. Demonstracją procedury będzie Alina i BMA Do absolwentów z mojego laboratorium Aby zebrać jaja, pozwól kryjącym się dorosłym muchom składać przez 12 godzin na świeżych plikach i przenieś je do nowych fiolek. Przenoś dorosłe osobniki co 12 godzin na 12-godzinny cykl światła i 12-godzinnego ciemnego cyklu.

Przechowuj 12-godzinne kolekcje jaj w inkubatorze. Na potrzeby eksperymentu należy wyhodować zwierzęta we wczesnym stadium larwy L. Są to karmienie dostępne od 84 do 108 godzin od jaja.

Układanie Prawidłowa inscenizacja LAE ma kluczowe znaczenie dla powodzenia eksperymentu. Od końca L Three, LAE zmieniło zachowanie zdjęcia, aby przetestować okołodobowe składniki zachowania wzrokowego. Na 48 godzin przed badaniem i tuż przed subiektywnym pojawieniem się larw, świtu, włóż zebrane larwy do kartonowego pudełka.

Następnie przenieś pudełko do inkubatora ze stałą ciemnością na 48 godzin do eksperymentu, larwy te muszą pozostać niezakłócone w przeznaczonej do tego przestrzeni. Przygotuj pokrywkę dziewięciocentymetrowej szalki Petriego, używając kwadratu o boku 20 centymetrów podzielonego na cztery ćwiartki. Jako przewodnik.

Przyklej 10 centymetrowych kwadratów folii aluminiowej na przeciwległych kwadrantach i przykryj je czarną taśmą. Pamiętaj, aby zakryć krawędź pokrywy. Następnie klej, 20-centymetrowy kwadrat podzielony na cztery ćwiartki pod źródłem światła na stole.

Zaznacz obwód naczynia testowego na arkuszu, aby działał jako prowadnica dla spójnego przemieszczenia. Zainstaluj lampę LED nad szalką Petriego za pomocą żelaznego stojaka. Wyreguluj wysokość w taki sposób, aby cała płytka testowa była równomiernie oświetlona.

Dostosuj natężenie światła w miejscu testowym do zakresu od 350 do 760 luksów, dodatkowo regulując wysokość lampy lub używając regulowanego zasilacza. Pomieszczenie doświadczalne wymaga oświetlenia światłem czerwonym i musi mieć taką samą temperaturę, jak w miejscu, w którym zwierzęta są hodowane. Fiolki wyrosły dwa dni w ciągłej ciemności.

Zbierz lawę w ich jedzeniu za pomocą szpatułki z górnych pięciu milimetrów jedzenia. Rozłóż jedzenie na zewnętrznej stronie pokrywki szalki Petriego. Dodaj trochę wody do jedzenia i delikatnie wymieszaj ją szpatułką.

Dodaj kroplę wody z kranu do nowego naczynia za pomocą pędzla. Przenieś larwy do kropli wody, aby je umyć. Następnie za pomocą mokrego pędzla zbierz larwy za pomocą mokrego pędzla.

Wybieraj tylko wcześnie żerujące larwy L trzy i unikaj późno wędrujących larw L trzy. Przenieś wybrane larwy na środek płytki testowej. Karmienie L trzy larwy mają przednie kuliste, które są otwarte i wystają na zewnątrz.

W formie przypominającej palec. Tylne kuliste części mają po trzy otwory i cztery grupy dużych rozgałęzionych włosów. Gruczoły ślinowe rozciągają się do drugiego segmentu brzusznego.

Po umieszczeniu 30 larw na środku płytki testowej przykryj ją przygotowaną pokrywką. Włącz diodę LED lamp. Uruchom minutnik i pozwól larwom swobodnie poruszać się po talerzu przez pięć minut.

Następnie szybko zdejmij pokrywkę i policz liczbę larw w ciemności i jasnych kwadrantach. Oznaczenie pozycji każdej lawy może ułatwić liczenie. Szybkie zdjęcie może również pomóc larwy wykazujące niewyraźną preferencję świetlną, takie jak larwy pełzające po ścianach lub zapożyczające się do agaru, powinny być liczone jako preferencje neutralne i dodawane do całkowitej liczby larw przy obliczaniu wskaźnika preferencji świetlnej.

Po policzeniu larw wyrzuć płytkę i użyj nowej płytki testowej do następnego eksperymentu. Po wykonaniu od 10 do 15 prób dla każdego genotypu, przystąp do analizy zgodnie z protokołem. Preferencje jasno-ciemnej lawy Canton ES porównano w dwóch różnych okresach okołodobowych.

CT zero i CT 12, subiektywnie, larwy świtu i zmierzchu lub jęczą przez 48 godzin w standardowych warunkach, a następnie przełączają się w ciągłą ciemność na trzy dni. Testy jasno-ciemne poniżej 350 luxe wykazały, że wrażliwość na światło była wyższa u larw badanych w CT zero w porównaniu z larwami testowanymi w CT 12. Korzystając z tego wzoru, preferencja ciemności dla CT zero lawy wynosiła 0,52 w porównaniu do 0,36.

Larwy CT 12 porównujące indeksy za pomocą testu Wilcoxona dają znaczącą wartość P wynoszącą 0,023. Po obejrzeniu tego filmu powinieneś dobrze zrozumieć, jak przetestować preferencję świetlną larw trofii w różnych obwodach i punktach czasowych prowadzących do tego celu. Powinieneś być w stanie porwać na stadium F trzy larwy oph, przetestować ich światłowstrętne zachowanie i obliczyć wskaźnik preferencji świetlnej do porównania statystycznego.