Monitorowanie migracji komórek dendrytycznych za pomocą rezonansu magnetycznego ¹⁹F / ¹H

Ogólnym celem poniższego eksperymentu jest wizualizacja migracji komórek dendrytycznych do drenującego węzła chłonnego za pomocą nieinwazyjnego obrazowania metodą fluorowego rezonansu magnetycznego lub MRI w połączeniu z konwencjonalnym rezonansem magnetycznym protonowym. Osiąga się to poprzez najpierw przygotowanie mysich komórek dendrytycznych pochodzących ze szpiku kostnego i znakowanie w pełni zróżnicowanych komórek cząstkami bogatymi w fluor. W drugim etapie komórki znakowane fluorem są podawane doskórnie do tylnych kończyn myszy, zapewniając efektywną transmigrację podanych komórek.

Następnie obszar anatomiczny będący przedmiotem zainteresowania jest obrazowany za pomocą fluoru, protonowego rezonansu magnetycznego, w celu monitorowania migracji komórek dendrytycznych ze skóry do drenujących węzłów chłonnych. Ostatecznie migrację komórek dendrytycznych z obszaru aplikacji do drenującego węzła chłonnego można uwidocznić za pomocą fluorowego rezonansu magnetycznego. Główną zaletą tej metody w porównaniu z innymi technikami śledzenia komórek, takimi jak te wymagające nanocząstek tlenku żelaza, jest to, że podłoga związana węglem jest praktycznie nieobecna we wszystkich żywych organizmach.

W ten sposób uzyskuje się kompletne obrazy wolne od tła i pełną selektywność komórek po zastosowaniu komórek znakowanych fluorem in vivo. Metoda ta może pomóc odpowiedzieć na pytania z zakresu immunologii, np. jaki jest wpływ kandydatów molekularnych na migrację komórek dendrytycznych in vivo. Demonstracją metody jest technik Yulia Kovski i Helma VIIs, starszy naukowiec z mojego laboratorium W 10 dniu hodowli komórek dendrytycznych szpiku kostnego.

Aktywuj komórki dendrytyczne za pomocą LPS przez 24 godziny. Oznacz komórki dendrytyczne jednym milimolowym fluorem bogatym w fluor 15 koronuj również w tym czasie pięć cząstek eteru, aby potwierdzić, że komórki dendrytyczne zostały pomyślnie oznakowane, sprawdź właściwości fizykochemiczne komórek za pomocą cytometrii przepływowej. Komórki oznaczone fluorem są tutaj pokazane jako czerwone zdarzenia na wykresie punktowym do przodu i na bok, a nieoznaczone komórki są pokazane jako zdarzenia niebieskie.

W następnej pozycji umieść czarną szóstkę myszy C 57 w uchwycie, a następnie załaduj strzykawkę tuberkulinową o pojemności 0,5 mililitra za pomocą igły o rozmiarze 26 i pół z fluorescencyjnie znakowanymi komórkami dendrytycznymi o objętości od 50 do 100 mikrolitrów. Teraz ostrożnie wbij igłę w górne warstwy skóry w każdej z tylnych kończyn zwierzęcia, aby podać komórki. Po znieczuleniu myszy ułóż zwierzę na łóżku myszy skanera MR dla małych zwierząt.

Po zabezpieczeniu zwierzęcia na uchwycie obrazowania i połączeniach z systemem monitorowania, przesuń uchwyt na środek cewki RF z fluoru protonowego w celu potwierdzenia prawidłowego położenia zwierzęcia i skanera. A później planowanie geometrii przekroju obrazu. Pozyskiwanie obrazów zwiadowczych w trzech standardowych orientacjach przy użyciu szybkich metod pozyskiwania obrazów o niskiej rozdzielczości w oprogramowaniu MR Scanner.

Dostrój cewkę RF do częstotliwości rezonansu protonów i częstotliwości rezonansu fluoru. Użyj monitora strojenia skanera MR dla zwierząt, aby dopasować impedancję charakterystyczną cewki do 50 omów. Następnie ustaw niezbędne ustawienia systemów automatycznych, w tym podkładkowanie, aby precyzyjnie dostroić jednorodność regulacji częstotliwości systemu pola magnetycznego, aby dostroić RF do określonej częstotliwości LA systemu MR dla protonów i wzmocnienia referencyjnego.

Aby dostosować amplitudę RF, skonfiguruj turbo rzadki protokół 3D dla skanowania protonów, używając TR 1500 milisekund i TE 53 milisekund, matrycy 400 na 200 na 200 i rzadkiego czynnika 16. Dostosuj pole widzenia za pomocą obrazów zwiadowczych. Następnie rozpocznij skanowanie.

Załaduj pojedynczą impulsową sekwencję FID o TR co najmniej 1000 milisekund, a następnie otwórz skan edycji i ustaw jądro na fluor w metodzie edycji przybornika. Usuń zaznaczenie automatycznego wzmocnienia referencyjnego za pomocą ustawień go. Rozpocznij pomiar bez rejestrowania danych, aby wyświetlić sygnał MR w czasie rzeczywistym.

Dostosuj częstotliwość podstawową, aby wyśrodkować pik widmowy fluoru na zero herców w oknie akwizycji. Następnie wybierz, zastosuj częstotliwość podstawową i naciśnij teraz stop. Sklonuj turbo rzadki protokół 3D z poprzedniego skanowania protonów.

Przejdź do metody edycji, a następnie odznacz automatyczne wzmocnienie referencyjne, jak pokazano w edycji skanowania. Ustaw jądro fluoru, a następnie zmień matrycę na 1 28 na 64 na 64, a rzadki czynnik na co najmniej 40. Po zakończeniu skanowania schowaj uchwyt myszy ze skanera MR i użyj view menu, aby nałożyć obrazy fluoru na obrazy protonów.

Po poświęceniu myszy usuń interesujący Cię węzeł chłonny popal i umieść go w pięciomilimetrowej probówce NMR zawierającej 100 mikrolitrów 2% PFA. Następnie umieść rurkę w cewce do spektroskopii fluorowej i przesuń cewkę do środka ISO magnesu. Dostrój cewkę RF do częstotliwości rezonansu fluoru, a następnie na monitorze strojenia skanera MR dla zwierząt dopasuj charakterystyczną impedancję cewki do 50 omów w zestawie narzędzi do podkładek.

Ustaw wszystkie parametry podkładki na zero i naciśnij Zastosuj. Następnie załaduj pojedynczą impulsową sekwencję FID z TR co najmniej 1000 milisekund. Otwórz edycję, skan i ustaw jądro na fluor.

Teraz za pomocą konfiguracji go rozpocznij sekwencję, dostosuj częstotliwość podstawową tak, aby pik widmowy fluoru znajdował się w środku okna akwizycji przy zerowych hercach i zastosuj częstotliwość podstawową. Następnie ponownie wyreguluj tłumik impulsów, aby zmaksymalizować sygnał do osiągnięcia 90 stopni wzbudzenia. Gdy sygnał osiągnie maksimum, naciśnij stop.

Na koniec, w metodzie edycyjnej, ustaw średnie między 64 a 256 w zależności od sygnału, a następnie za pomocą go pipeline. Akwizycję należy rozpocząć od 18 do 21 godzin po podaniu doskórnym. Komórki dendrytyczne znakowane fluorem migrują do drenującego węzła chłonnego popala.

Ruch komórek dendrytycznych przez przewody limfatyczne do drenującego węzła chłonnego publicznego można docenić poprzez nałożenie obrazów anatomicznych protonów na fluorowe komórki dendrytyczne. Obrazy, komórki dendrytyczne są pokazane jako fluorowy rezonans magnetyczny. Sygnał jest zaznaczony na czerwono, natomiast węzły chłonne i przewody limfatyczne są pokazane na protonowym obrazie anatomicznym MR w skali szarości. W celu ilościowego określenia zakresu migracji komórek dendrytycznych do drenujących węzłów chłonnych, węzły chłonne są ekstrahowane i przeprowadza się MRS fluoru, jak pokazano poniżej, gdy sygnał fluorowy uzyskany z każdego węzła chłonnego jest porównywany z sygnałem fluorowym uzyskanym z różnej liczby komórek dendrytycznych znakowanych na 15 korony fluoru pięcioma cząstkami eteru, jak pokazano za pomocą tej krzywej kalibracyjnej, Liczbę komórek dendrytycznych znakowanych fluorem, które docierają do drenującego węzła chłonnego, można wydedukować dla tego reprezentatywnego eksperymentu.

Można oszacować, że 7,5 razy 10 do czwartej komórki dendrytyczne, które nie były obciążone antygenem, docierały do lewego węzła chłonnego, podczas gdy 3,6 razy 10 do piątego antygenu komórek dendrytycznych dociera do prawego węzła chłonnego. Chociaż ma to znaczenie może zapewnić wgląd w molekularne mechanizmy migracji komórek odpornościowych w normalnych warunkach, może być również wykorzystywane w modelach zwierzęcych, takich jak choroby autoimmunologiczne. Co więcej, implikacje tej techniki rozciągają się w kierunku terapii nowotworów.

Wszelkie zidentyfikowane cele molekularne można wykorzystać do manipulowania komórkami dendrytycznymi w terapii nowotworów.