Name: Monitorowanie migracji komórek dendrytycznych za pomocą rezonansu magnetycznego 19F / 1H (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-03-20T13:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 12 s
Description: Poznaj metodę śledzenia migracji komórek dendrytycznych do węzłów chłonnych za pomocą nieniwazyjnego rezonansu magnetycznego fluoru i protonu. Technika ta umożliwia badanie dynamiki ruchu komórek odpornościowych w organizmie myszy.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

To badanie zostało sfinansowane przez Deutsche Forschungsgemeinschaft dla S.W. (DFG WA 2804) oraz grant uniwersytecki dla S.W. z Centrum Badań Eksperymentalnych i Klinicznych, współpracy Centrum Medycyny Molekularnej im. Maxa Delbrücka i Wydziału Medycznego Charité w Berlinie. Fundatorzy nie odgrywali żadnej roli w projektowaniu badania, gromadzeniu i analizie danych, podejmowaniu decyzji o publikacji lub przygotowaniu manuskryptu. Dziękujemy Panu Robertowi Westphalowi za wsparcie techniczne podczas stażu w naszym laboratorium.

Wszystkie procedury dotyczące zwierząt muszą zostać zatwierdzone przez lokalny instytucjonalny komitet ds. dobrostanu zwierząt przed ich wykonaniem. Podczas pomiarów MR niezbędny jest odpowiedni poziom znieczulenia i monitorowanie fizjologiczne (temperatura ciała, częstość oddechów).
1. Generacja komórek dendrytycznych pochodzących ze szpiku kostnego myszy
<ol>
	<li>Wyodrębnij komórki szpiku kostnego od myszy C57BL / 6, jak opisano wcześniej 12. Protokół ten pochodzi z 1992 roku 13 i został pierwotnie opisany przez grupę Ralpha M. Steinmana (1943-2011), odkrywcy komórki dendrytycznej 14.</li>
	<li>Krótko mówiąc, wyekstrahuj piszczel i strzałkę wkrótce po złożeniu w ofierze myszy. Pracując pod okapem z przepływem laminarnym (aby zapobiec skażeniu mikrobiologicznemu), przepłucz szpik kostny na małą szalkę Petriego z pożywką płuczącą (5% FBS, 1% penicyliny/streptomycyny i 1% HEPES w RPMI) 12.</li>
	<li>Przenieść zawiesinę komórkową przez sitko do komórek (oczka o rozmiarze 100 μm, nylon) do sterylnej probówki wirówkowej o pojemności 50 ml w celu usunięcia kości i resztek tkanki. Po kilku etapach płukania i etapie lizy 12 policz żywotne komórki za pomocą błękitu trypanowego i hemocytometru.</li>
	<li>Zawiesić komórki szpiku kostnego w stężeniu 400 000 komórek ml-1 w pożywce hodowlanej (RPMI uzupełnione 10% FBS, 1% penicyliny/streptomycyny, 1% HEPES i 1% L-glutaminy) zawierające 75 ng ml-1 mysiego czynnika stymulującego tworzenie makrofagów granulocytów (mGM-CSF) uzyskanych z supernatantów komórek 293FT HEK transfekowanych mysim plazmidem GMCSF. Przenieść 10 ml zawiesiny komórek (4 x 106 komórek) na szalki Petriego (100 mm x 20 mm) i inkubować w inkubatorze CO2 (37 °C, 5 % CO2 ). W dniu 3 uzupełnij starą pożywkę 10 ml świeżej pożywki (utrzymując końcowe stężenie mGM-CSF na poziomie 75 ng ml-1). W dniu 6 usuń 10 ml starej pożywki i uzupełnij 10 ml świeżej pożywki (stężenie końcowe mGM-CSF = 75 ng ml-1). W dniu 8 usuń 10 ml starej pożywki i uzupełnij 10 ml świeżej pożywki (stężenie końcowe mGM-CSF = 150 ng ml-1).</li>
	<li>W 10 dniu należy dojrzeć zróżnicowany prąd stały za pomocą 1 μg lipopolisacharydu ml-1 (LPS) przez 24 godziny.</li>
</ol>
2. Znakowanie komórek dendrytycznych za pomocą 19cząstek bogatych w F
<ol>
	<li>Podczas 24-godzinnego etapu dojrzewania (1,5) oznaczyć prąd stały cząstkami 1 mM bogatego w fluor perfluoro-15-crown-5-etheru (PFCE) (500-560 nm) również przez 24 godziny. Przygotować duże cząstki znakowane fluorem przez emulgację PFCE w Pluronic F-68 (całkowita objętość 2,5 ml) przy użyciu sonotrody tytanowej zaburzającej działanie komórek i stosując ciągły program impulsowy (amplituda 100%, moc = 250 W) przez 60 sekund.</li>
	<li>Postępując zgodnie z powyższymi etapami inkubacji, zebrać dojrzałe i znakowane fluorem DC za pomocą skrobaka do komórek hodowli tkankowych, przenieść do probówki wirówkowej o pojemności 50 ml i odwirować przy 500 × g przez 5 minut w temperaturze pokojowej.</li>
	<li>Aby zmyć wszelkie resztki cząstek i martwe komórki, pozostaw zebrane komórki do przylegania na naczyniach z poli-L-lizyny. Aby przygotować się do tego etapu, należy pokryć szalki Petriego poli-L-lizyną (1 mg ml-1) w temperaturze 37 °C przez 1 godzinę, a następnie zmyć niezwiązaną poli-L-lizynę PBS.</li>
	<li>Inkubować nad pobranymi komórkami na płytkach pokrytych poli-L-lizyną w podłożu niezawierającym surowicy i pozostawić komórkom do przylegania (1 godzina w temperaturze 37 °C, 5% CO2 ).</li>
	<li>Zmyć pożywkę, aby usunąć nieprzylegające komórki, pozostałe cząstki i martwe komórki, a następnie przemyć trzykrotnie wstępnie podgrzanym (37 °C) PBS.</li>
	<li>Zebrać przylegające komórki przez traktowanie trypsyną-EDTA (0,25% trypsyna-EDTA, 3 minuty inkubacji w temperaturze 37 °C).</li>
	<li>Po kolejnym etapie wirowania z płukaniem, ponownie zawiesić wymaganą ilość dojrzałego DC w sterylnym PBS bez surowicy.</li>
	<li>Aby ustalić, czy komórki zostały pomyślnie znakowane, zaleca się sprawdzenie charakterystyki fizykochemicznej komórek za pomocą cytometrii przepływowej (FACS). Rozproszenie boczne (SSC) powinno ujawnić zwiększoną ziarnistość w tych komórkach, jak opisano wcześniej 11. Należy również pamiętać, że fibroblasty mogą zanieczyszczać kultury DC i mogą również równolegle pobierać cząstki 19F. Dlatego czystość DC powinna być oceniana (poprzez pomiar procentowej zawartości komórek CD11c+CD11b+ za pomocą FACS) przed zastosowaniem in vivo.</li>
</ol>
3. Aplikacja in vivo 19komórek dendrytycznych znakowanych F
<ol>
	<li>Podawać DC (10,6 - 10,7) w objętości 50 - 100 μl śródskórnie do tylnych kończyn myszy C57BL/6, umieszczając mysz w uchwycie i ostrożnie wkładając igłę 26 1/2 G w górne warstwy skóry przed aplikacją (użyć strzykawek tuberkulinowych o pojemności 0,5 ml z przymocowanymi na stałe igłami, aby zminimalizować martwą objętość). Aby zapewnić odpowiednią aplikację śródskórną, ważne jest, aby wprowadzona część igły była częściowo widoczna pod skórą. Jeśli igła nie jest już widoczna, oznacza to, że igła została wprowadzona zbyt głęboko w warstwy skóry. W przypadku osoby nieprzeszkolonej aplikacja śródskórna może być wykonywana w znieczuleniu.</li>
	<li>Zobrazuj kończyny za pomocą rezonansu magnetycznego in vivo fluor (19F) / proton (1H) (patrz następna sekcja) 21 godzin po wstrzyknięciu.</li>
</ol>
4. Rezonans magnetyczny in vivo 19f/1h
Szczegółowe instrukcje dotyczące konfiguracji skanów MR odnoszą się do skanera MR Bruker korzystającego z oprogramowania sterującego Paravison (wersja 5.1). Nazwy odnoszące się do funkcji i elementów specyficznych dla dostawcy zostały wyróżnione kursywą. W przypadku innych skanerów MR może być konieczne dostosowanie tych czynności zgodnie z wytycznymi producenta.
<ol>
	<li>Zorganizuj dostęp do dedykowanego skanera MR dla małych zwierząt. Aby uzyskać odpowiednią jakość obrazu, system o natężeniu pola magnetycznego 9,4 Tesli lub większym oraz dostosowane cewki o częstotliwości radiowej (np. cewka RF 1H/19F o podwójnej regulowanej objętości, średnica wewnętrzna 35 mm, długość 50 mm; Rapid Biomed, Würzburg, Niemcy).</li>
	<li>Przed wykonaniem rezonansu magnetycznego należy przygotować konfigurację skanera MRI do znieczulenia i monitorowania fizjologicznego. Upewnij się, że maska oddechowa legowiska/uchwytu dla zwierząt jest podłączona do systemu izofluranu, a sonda temperatury i podkładka oddechowa są podłączone do zdalnego systemu monitorowania zwierząt (np. Model 1025, SA Instruments Inc., Nowy Jork, USA). Ten ostatni służy do monitorowania parametrów życiowych zwierzęcia, takich jak temperatura ciała i oddychanie.</li>
	<li>Znieczulenie myszy za pomocą narkozy wziewnej za pomocą komory myszy podłączonej do systemu izofluranu. Dostosuj natężenie przepływu powietrza iO2 odpowiednio na poziomie 0,2 l min-1 i 0,1 l min-1 oraz 3% izofluranu (dostosowanego z parownika) przez około 2 minuty, aż do osiągnięcia wymaganego poziomu znieczulenia (brak reakcji po uszczypnięciu palca). Optymalne natężenia przepływu mogą się różnić w zależności od używanej konfiguracji. Należy pamiętać, że wysokie natężenie przepływu może prowadzić do odwodnienia. Jak wspomniano powyżej, przez cały czas wymagane jest dokładne monitorowanie stanu zwierząt.</li>
	<li>Umieść mysz na brzuchu na łóżku/uchwycie skanera MR dla małych zwierząt (Rysunek 1).</li>
	<li>Utrzymując stałe natężenie przepływu powietrza iO2, wyreguluj parownik izofluranu na 0,8 - 1,5%, aż do osiągnięcia optymalnego wzorca oddychania. Zalecana częstość oddechów wynosi 50 - 70 oddechów na minutę.</li>
	<li>Podczas eksperymentu utrzymuj temperaturę ciała na poziomie 36-37 °C, stosując system cyrkulacji ciepłej wody (lub alternatywnie ciepłego powietrza).</li>
	<li>Podczas pomiaru utrzymuj oczy myszy wilgotne sterylną maścią nawilżającą oczy.</li>
	<li>Po zabezpieczeniu zwierzęcia na uchwycie obrazowania i połączeniach z systemem monitorowania, przesuń uchwyt na środek cewki RF 1H/19F (która znajduje się w izośrodku magnesu skanera zwierząt).</li>
	<li>Ustaw pozycję myszy w taki sposób, aby kolano leżało w izośrodku magnesu, albo metodą automatyczną (np. za pomocą lasera pozycjonującego połączonego z napędzanym silnikiem uchwytem na zwierzęta), albo poprzez ręczne obliczenie odległości, na jaką uchwyt musi zostać przesunięty do magnesu, aby dotrzeć do izocentrum.</li>
	<li>W celu potwierdzenia prawidłowego ułożenia zwierzęcia w skanerze i późniejszego zaplanowania geometrii wycinka obrazu (tj. rozmiaru, położenia i obrotu w przestrzeni), należy pozyskać obrazy zwiadowcze w trzech standardowych orientacjach (osiowej, czołowej, strzałkowej) przy użyciu metod akwizycji obrazów o szybkiej i niskiej rozdzielczości (np. protokół TriPilot, który wykorzystuje sekwencję impulsów FLASH).</li>
	<li>Dostrój cewkę RF do częstotliwości rezonansowej 1H (np. 400.1 MHz dla 9.4 T) i do częstotliwości rezonansowej 19F (np. 376.3 MHz dla 9.4 T) i dopasuj impedancję charakterystyczną cewki do 50 Ohm za pomocą monitora strojenia skanera MR dla zwierząt. Dostrajanie i dopasowywanie jest konieczne, aby osiągnąć optymalne warunki do nadawania i odbioru sygnału.</li>
	<li>Wykonaj niezbędne automatyczne ustawienia systemowe, w tym podkładkowanie w celu precyzyjnego dostrojenia jednorodności pola magnetycznego (np. ADJ_SHIM), regulację częstotliwości systemowej w celu dostrojenia RF do częstotliwości Lamor myszy (np. ADJ_SF) oraz wzmocnienie referencyjne w celu dostosowania amplitudy RF (np. ADJ_REFG). Wszystkie te ustawienia są ważne, aby statyczne i zmienne pola magnetyczne (B0, B1) w obszarze zainteresowania były jak najbardziej jednorodne.</li>
	<li>Zdobądź drugi zestaw obrazów zwiadowczych (jak powyżej) wzdłuż trzech orientacji ortogonalnych, po ustawieniu pola widzenia (FOV) tak, aby obie kończyny dolne były widoczne od miednicy do stopy (dł. x szer. x wys. = 50 x 25 x 25 mm). Obrazy te służą do zaplanowania orientacji końcowych skanów 3D 1H/19F.</li>
	<li>Ustaw protokół TurboRARE 3D dla 1H-scan: TR/TE = 1,500/53 ms, FOV = 50x25x25 mm, Matrix = 400x200x200, RARE Factor = 16 (czas skanowania ok. 60 min). Dostosuj FOV za pomocą obrazów zwiadowczych, rozpocznij skanowanie (sygnalizacja świetlna).</li>
	<li>Załaduj pojedynczą impulsową sekwencję FID z TR co najmniej 1,000 ms. Otwórz Edit Scan i ustaw nucleus na 19F. Użyj ręcznych ustawień wzmocnienia, usuwając zaznaczenie automatycznego wzmocnienia referencyjnego w Metodzie edycji w Przyborniku.</li>
	<li>Rozpocznij pomiar bez rejestrowania danych, aby wyświetlić sygnał MR w czasie rzeczywistym przy użyciu GSP (go setup). Jeśli sygnał spektralny 19F w oknie akwizycji jest zbyt niski, dodaj więcej średnich w metodzie edycji i/lub moduluj tłumik impulsów (suwak TX0 lub SP0), aż sygnał będzie wyraźnie widoczny. Dostosuj częstotliwość podstawową, aby wyśrodkować pik widmowy 19F przy 0 Hz w oknie akwizycji. Zastosuj częstotliwość podstawową i naciśnij Stop. Należy pamiętać, że izofluran stosowany jako znieczulenie może generować sygnał tła. Przy rezonansie magnetycznym 9,4 Tesli przesunięcie chemiczne między 19cząstkami zawierającymi F a izofluranem wynosi około 1800 Hz. Upewnij się, że szerokość pasma wzbudzenia jest mniejsza niż 3600 Hz, aby uniknąć wzbudzenia izofluranu razem z 19komórkami lub cząstkami znakowanymi F. Częstotliwość podstawowa powinna być ustawiona prawidłowo na sygnale generowanym przez 19ogniw znakowanych F. Alternatywnie, inna metoda znieczulenia może być użyta według własnego uznania.</li>
	<li>Sklonuj (zduplikuj) protokół TurboRARE 3D z poprzedniego skanowania 1H. Przejdź do opcji Edit Method (Edytuj metodę) i odznacz automatyczne wzmocnienie referencyjne (jak wyżej). Ustaw jądro 19F z Edytuj skanowanie. Zmień macierz na 128x64x64, a współczynnik RARE-Factor na co najmniej 40 (do 64). Dla TR/TE 1,000/6 ms i 64 średnich czas skanowania wynosi około 70 minut. Ustaw wzmocnienie odbiornika na 101 (przybornik) i rozpocznij skanowanie bez żadnych dalszych regulacji za pomocą GOP (go pipeline).</li>
	<li>Po zakończeniu skanowania schowaj uchwyt myszy ze skanera MR. Ostrożnie odłącz mysz od uchwytu. Jeśli mysz nie zostanie uśmiercona do analizy ex vivo (np. histologii lub spektroskopii, patrz poniżej) bezpośrednio po pomiarach MR, należy ją ściśle monitorować, aż do całkowitego wyzdrowienia po znieczuleniu. Znieczulenie ma wpływ na regulację temperatury ciała, dlatego podczas procesu rekonwalescencji umieść mysz w osobnej klatce, która jest umieszczona na ciepłej podkładce o regulowanej temperaturze. Gdy mysz całkowicie wyzdrowieje ze znieczulenia, wróć do klatki i do pokoju dla zwierząt.</li>
	<li>Aby nałożyć 19obrazów F na obrazy 1H, użyj opcji View Menu w tym samym oprogramowaniu (Paravison). Funkcję Podkładanie można znaleźć w obszarze Korygować. Zapisz podkładanie, załaduj nowy obraz i podświetl warstwę 19F, definiując nowy kolor z tabeli Lookup table. Aby odróżnić skany 19F od 1H, zmień próg dla wybranego koloru (wytnij tabelę przeglądową) tak, aby sygnał 19F miał wybrany kolor, a obraz tła 1H pozostał w skali szarości. Dostępne są inne programy do przetwarzania końcowego (np. ImageJ) do tworzenia nakładek obrazów 1H/19F.</li>
	<li>Jeżeli konieczne jest ilościowe oznaczanie in vivo sygnału 19F, należy postępować zgodnie z prostym protokołem ilościowym, jak opisano wcześniej 15,16. Krótko mówiąc, kwantyfikacja może być przeprowadzona poprzez umieszczenie probówki referencyjnej ze znanym stężeniem emulsji PFCE w polu widzenia obok myszy. Po uzyskaniu obrazów MR określ ilościowo intensywność sygnałów 19F za pomocą analizy obszaru zainteresowania (ROI) i porównaj z krzywą kalibracji in vitro, jak pokazano na rysunku 2.</li>
</ol>
5. Spektroskopia rezonansu magnetycznego węzłów chłonnych (MRS)
<ol>
	<li>Po poświęceniu myszy należy usunąć węzeł chłonny podkolanowy i umieścić w małej probówce NMR o średnicy 5 mm i dodać 100 μl 2% PFA.</li>
	<li>Zainstalować cewkę spektroskopową 19F (np. cewkę toroidalną), która ma otwór co najmniej 5 mm do przytrzymania rurki NMR zawierającej węzeł chłonny.</li>
	<li>Umieść rurkę NMR wewnątrz cewki i przesuń cewkę do izocentrum magnesu.</li>
	<li>Dostrój cewkę RF do częstotliwości rezonansowej 19F (np. 376.3 MHz dla 9.4 T) i dopasuj impedancję charakterystyczną cewki do 50 Ohm za pomocą monitora strojenia skanera MR dla zwierząt. Dostrajanie i dopasowywanie jest konieczne, aby osiągnąć optymalne warunki do nadawania i odbioru sygnału.</li>
	<li>Ustaw wszystkie parametry podkładki regulacyjnej w przyborniku Cieniowanie na 0 i naciśnij przycisk Zastosuj. Zwykle nie jest konieczne stosowanie metod podkładkowania, ponieważ objętość próbki jest stosunkowo niewielka. Jeśli dostępny jest wystarczający sygnał 19F, można zastosować zautomatyzowane metody podkładkowania, częstotliwości systemu i wzmocnienia odbiornika, jak opisano powyżej.</li>
	<li>Załaduj pojedynczą impulsową sekwencję FID z TR co najmniej 1,000 ms. Otwórz Edit Scan i ustaw jądro na 19F. Użyj ręcznych ustawień wzmocnienia, usuwając zaznaczenie automatycznego wzmocnienia referencyjnego w Metodzie edycji w Przyborniku. Ustaw liczbę średnich na 1.</li>
	<li>Rozpocznij sekwencję przy użyciu protokołu GSP. Jeśli sygnał spektralny 19F w oknie akwizycji jest zbyt niski, dodaj więcej średnich w metodzie edycji i/lub moduluj tłumik impulsów (suwak TX0 lub SP0), aż sygnał będzie wyraźnie widoczny. Dostosuj częstotliwość podstawową tak, aby pik widmowy 19F znajdował się w środku okna akwizycji przy 0 Hz i zastosuj częstotliwość podstawową. Ponownie wyreguluj tłumik impulsów, aby zmaksymalizować sygnał, aby osiągnąć wzbudzenie 90 °. Gdy sygnał osiągnie maksimum, naciśnij Stop.</li>
	<li>Ustaw średnie w metodzie edycji między 64 a 256 (lub więcej, jeśli to konieczne, w zależności od sygnału) i rozpocznij akwizycję za pomocą GOP. Wykryty sygnał koreluje liniowo z liczbą średnich. Podczas kwantyfikacji należy pamiętać, że wykryty sygnał musi zostać znormalizowany do jednej średniej. Ponadto do obliczenia liczby komórek ze znormalizowanego sygnału 19F niezbędny jest wzorzec kalibracyjny znanego stężenia lub krzywa kalibracyjna (rysunek 2).</li>
	<li>Po zakończeniu skanowania usuń próbkę, umieść następną próbkę i przejdź do kroku 5.3.</li>
</ol>

<ol><li>Yeh, T. C., Zhang, W., Ildstad, S. T., Ho, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+dynamic+MRI+tracking+of+rat+T-cells+labeled+with+superparamagnetic+iron-oxide+particles%5BTitle%5D)+AND+%22Magn.+Reson.+Med%22%5BJournal%5D)">In vivo dynamic MRI tracking of rat T-cells labeled with superparamagnetic iron-oxide particles.</a> Magn. Reson. Med. 33 (2), 200-208 (1995).</li>
<li>Weissleder, R., Cheng, H. C., Bogdanova, A., Bogdanov, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Magnetically+labeled+cells+can+be+detected+by+MR+imaging%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Magn.+Reson.+Imaging%22%5BJournal%5D)">Magnetically labeled cells can be detected by MR imaging.</a> J. Magn. Reson. Imaging. 7 (1), 258-263 (1997).</li>
<li>Franklin, R. J., Blaschuk, K. L., Bearchell, M. C., Prestoz, L. L., Setzu, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Magnetic+resonance+imaging+of+transplanted+oligodendrocyte+precursors+in+the+rat+brain%5BTitle%5D)+AND+%22NeuroReport%22%5BJournal%5D)">Magnetic resonance imaging of transplanted oligodendrocyte precursors in the rat brain.</a> NeuroReport. 10 (18), 3961-3965 (1999).</li>
<li>de Vries, I. J., Lesterhuis, W. J., Barentsz, J. O., Verdijk, P., van Krieken, J. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Magnetic+resonance+tracking+of+dendritic+cells+in+melanoma+patients+for+monitoring+of+cellular+therapy%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Magnetic resonance tracking of dendritic cells in melanoma patients for monitoring of cellular therapy.</a> Nat. Biotechnol. 23 (11), 1407-1413 (2005).</li>
<li>Liu, W., Frank, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Detection+and+quantification+of+magnetically+labeled+cells+by+cellular+MRI%5BTitle%5D)+AND+%22Eur.+J.+Radiol%22%5BJournal%5D)">Detection and quantification of magnetically labeled cells by cellular MRI.</a> Eur. J. Radiol. 70 (2), 258-264 (2009).</li>
<li>Ahrens, E. T., Flores, R., Xu, H., Morel, P. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+imaging+platform+for+tracking+immunotherapeutic+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">In vivo imaging platform for tracking immunotherapeutic cells.</a> Nat. Biotechnol. 23 (8), 983-987 (2005).</li>
<li>Holland, G. N., Bottomley, P. A., Hinshaw, W. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((F-19+Magnetic-Resonance+Imaging%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Magnetic+Resonance%22%5BJournal%5D)">F-19 Magnetic-Resonance Imaging.</a> Journal of Magnetic Resonance. 28 (1), 133-136 (1977).</li>
<li>Partlow, K. C., Chen, J., Brant, J. A., Neubauer, A. M., Meyerrose, T. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((19F+magnetic+resonance+imaging+for+stem%2Fprogenitor+cell+tracking+with+multiple+unique+perfluorocarbon+nanobeacons%5BTitle%5D)+AND+%22FASEB+J%22%5BJournal%5D)">19F magnetic resonance imaging for stem/progenitor cell tracking with multiple unique perfluorocarbon nanobeacons.</a> FASEB J. 21 (8), 1647-1654 (2007).</li>
<li>Ruiz-Cabello, J., Walczak, P., Kedziorek, D. A., Chacko, V. P., Schmieder, A. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+%22hot+spot%22+MR+imaging+of+neural+stem+cells+using+fluorinated+nanoparticles%5BTitle%5D)+AND+%22Magn.+Reson.+Med%22%5BJournal%5D)">In vivo "hot spot" MR imaging of neural stem cells using fluorinated nanoparticles.</a> Magn. Reson. Med. 60 (6), 1506-1511 (2008).</li>
<li>Srinivas, M., Morel, P. A., Ernst, L. A., Laidlaw, D. H., Ahrens, E. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fluorine-19+MRI+for+visualization+and+quantification+of+cell+migration+in+a+diabetes+model%5BTitle%5D)+AND+%22Magn.+Reson.+Med%22%5BJournal%5D)">Fluorine-19 MRI for visualization and quantification of cell migration in a diabetes model.</a> Magn. Reson. Med. 58 (4), 725-734 (2007).</li>
<li>Waiczies, H., Lepore, S., Janitzek, N., Hagen, U., Seifert, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Perfluorocarbon+particle+size+influences+magnetic+resonance+signal+and+immunological+properties+of+dendritic+cells%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+ONE%22%5BJournal%5D)">Perfluorocarbon particle size influences magnetic resonance signal and immunological properties of dendritic cells.</a> PLoS ONE. 6 (7), e21981(2011).</li>
<li>Matheu, M. P., Sen, D., Cahalan, M. D., Parker, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generation+of+Bone+Marrow+Derived+Murine+Dendritic+Cells+for+Use+in+2-photon+Imaging%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis.+Exp%22%5BJournal%5D)">Generation of Bone Marrow Derived Murine Dendritic Cells for Use in 2-photon Imaging.</a> J. Vis. Exp. (17), e773(2008).</li>
<li>Inaba, K., Inaba, M., Romani, N., Aya, H., Deguchi, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generation+of+large+numbers+of+dendritic+cells+from+mouse+bone+marrow+cultures+supplemented+with+granulocyte%2Fmacrophage+colony-stimulating+factor%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Experimental+Medicine%22%5BJournal%5D)">Generation of large numbers of dendritic cells from mouse bone marrow cultures supplemented with granulocyte/macrophage colony-stimulating factor.</a> Journal of Experimental Medicine. 176 (6), 1693-1702 (1992).</li>
<li>Lanzavecchia, A., Sallusto, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ralph+M.+Steinman.+1943-2011%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Ralph M. Steinman. 1943-2011.</a> Cell. 147 (6), 1216-1217 (1943).</li>
<li>Srinivas, M., Turner, M. S., Janjic, J. M., Morel, P. A., Laidlaw, D. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+cytometry+of+antigen-specific+t+cells+using+19F%5BTitle%5D)+AND+%22MRI.+Magn.+Reson.+Med%22%5BJournal%5D)">In vivo cytometry of antigen-specific t cells using 19F.</a> MRI. Magn. Reson. Med. 62 (3), 747-753 (2009).</li>
<li>Srinivas, M., Heerschap, A., Ahrens, E. T., Figdor, C. G., de Vries, I. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((%2819%29F+MRI+for+quantitative+in+vivo+cell+tracking%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">(19)F MRI for quantitative in vivo cell tracking.</a> Trends Biotechnol. 28 (7), 363-370 (2010).</li>
<li>Lammermann, T., Bader, B. L., Monkley, S. J., Worbs, T., Wedlich-Soldner, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid+leukocyte+migration+by+integrin-independent+flowing+and+squeezing%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Rapid leukocyte migration by integrin-independent flowing and squeezing.</a> Nature. 453 (7191), 51-55 (2008).</li>
<li>Liu, M. S., Long, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Perfluoroctylbromide+as+a+diagnostic+contrast+medium+in+gastroenterography%5BTitle%5D)+AND+%22Radiology%22%5BJournal%5D)">Perfluoroctylbromide as a diagnostic contrast medium in gastroenterography.</a> Radiology. 122 (1), 71-76 (1977).</li>
<li>Kwiatkowska, K., Sobota, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Signaling+pathways+in+phagocytosis%5BTitle%5D)+AND+%22Bioessays%22%5BJournal%5D)">Signaling pathways in phagocytosis.</a> Bioessays. 21 (5), 422-431 (1999).</li>
<li>Mitragotri, S., Lahann, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Physical+approaches+to+biomaterial+design%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Mater%22%5BJournal%5D)">Physical approaches to biomaterial design.</a> Nat. Mater. 8 (1), 15-23 (2009).</li>
<li>Hoult, D. I., Richards, R. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+signal-to-noise+ratio+of+the+nuclear+magnetic+resonance+experiment%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Magn.+Reson%22%5BJournal%5D)">The signal-to-noise ratio of the nuclear magnetic resonance experiment.</a> J. Magn. Reson. 24 (1), 71-85 (1976).</li>
<li>Kovacs, H., Moskau, D., Spraul, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cryogenically+cooled+probes+-+a+leap+in+NMR+technology%5BTitle%5D)+AND+%22Prog.+Nucl.+Magn.+Reson.+Spectrosc%22%5BJournal%5D)">Cryogenically cooled probes - a leap in NMR technology.</a> Prog. Nucl. Magn. Reson. Spectrosc. 46 (2-3), 131-155 (2005).</li>
<li>Waiczies, H., Millward, J. M., Lepore, S., Infante-Duarte, C., Pohlmann, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+Cellular+Infiltrates+during+Early+Stages+of+Brain+Inflammation+with+Magnetic+Resonance+Microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+ONE%22%5BJournal%5D)">Identification of Cellular Infiltrates during Early Stages of Brain Inflammation with Magnetic Resonance Microscopy.</a> PLoS ONE. 7 (3), e32796(2012).</li>
<li>Haacke, E. M. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aHaacke%2C+EM+%22Magnetic+resonance+imaging+physical+principles+and+sequence+design%22">Magnetic resonance imaging physical principles and sequence design</a>. , John Wiley & Sons. (1999).</li>
</ol>

Autorzy oświadczają, że nie mają konkurencyjnych interesów finansowych.

Ta metoda wykorzystująca 19F/1H MRI do śledzenia ruchu prądu stałego do węzła chłonnego daje możliwość zbadania wzorców migracji komórek odpornościowych in vivo. Komórki dendrytyczne są doskonałymi przykładami szybko migrujących komórek odpornościowych, które są w stanie manewrować przez trójwymiarowe struktury bez ścisłego przylegania do określonych substratów 17. Chociaż niska rozdzielczość przestrzenna (zakres μm) opisywanej techniki nie jest porównywalna z wysoką rozdzielczoś...

Śledzenie komórek in vivo jest kluczowym aspektem w kilku dziedzinach biomedycyny. W tym celu niezwykle cenne są nieinwazyjne techniki obrazowania, które mogą selektywnie lokalizować komórki przez pewien czas. Przed opracowaniem trójwymiarowego obrazowania metodą rezonansu magnetycznego (MRI) śledzenie migracji komórek odpornościowych ograniczało się do analiz mikroskopowych lub biopsji tkanek. Śledzenie komórek za pomocą rezonansu magnetycznego zyskało ogromne zainteresowanie w ciągu ostatnich kilku lat, nie tylko dla immunologów badających zachowanie komórek odpornościowych in vivo, ale także dla badaczy klinicznych i komórek macierzystych. W połowie lat 90. XX wieku pierwsze badania nad nanocząstkami tlenku żelaza 1 zapoczątkowały kaskadę osiągnięć w zakresie śledzenia komórek za pomocą rezonansu magnetycznego. Cząsteczki tlenku żelaza skracają czas relaksacji MR (T2*) znakowanych komórek, a tym samym powodują zubożenie sygnału w obrazach MR. Cząsteczki tlenku żelaza zostały wykorzystane do znakowania makrofagów 2, progenitorów oligodendrocytów 3 i wielu innych typów komórek. Niektóre z tych cząstek zostały również klinicznie zatwierdzone przez FDA do oznaczania szczepionek komórkowych u pacjentów z czerniakiem 4. Ponieważ znakowanie in vivo lub ex vivo komórek cząstkami tlenku żelaza opiera się na skróceniu sygnału T2*, a to ostatnie może być również spowodowane efektami T2 * związanymi z podatnością in vivo, takimi jak mikrokrwawienia, złogi żelaza lub pęcherzyki powietrza, identyfikacja znakowanych komórek in vivo na podstawie innych wygaszań sygnału T2* w tle może być trudna 5.
W tym artykule opisujemy technikę śledzenia komórek dendrytycznych (DC) in vivo za pomocą rezonansu magnetycznego (MRI) 19F/1H. Ta technologia śledzenia komórek została wprowadzona dopiero w 2005 roku6, kilka lat po tym, jak zgłoszono pierwsze rozpoznane zastosowania 19F w MRI. Jedną z ważnych zalet 19F w porównaniu ze znakowaniem komórek cząstek tlenku żelaza jest niskie biologiczne występowanie 19F w tkance; Umożliwia to bardzo selektywne śledzenie komórek za pomocą obrazów w zasadzie pozbawionych tła. Ponadto możliwe jest nałożenie sygnału 19F MR z przeszczepionych znakowanych komórek na obrazy anatomiczne uzyskane z konwencjonalnego rezonansu magnetycznego 1H. Rozdział 19Rezonans magnetyczny F/1H jest zatem istotny dla badań nad migracją komórek in vivo. Komórki badane tą metodą znakuje się 19cząstkami bogatymi w F. Do przygotowania cząstek powszechnie stosuje się perfluorowęglowodory pochodzenia syntetycznego (PFC) składające się głównie z atomów węgla i fluoru. Związki te są nierozpuszczalne w wodzie i muszą być emulgowane przed zastosowaniem in vitro lub in vivo. Typowa wielkość cząstek PFC, które zostały wykorzystane przez inne grupy do eksperymentów śledzenia in vivo 19F-MRI, waha się od 100 nm do 245 nm 6,8-10. Wykazaliśmy jednak, że skuteczność znakowania komórek dendrytycznych cząstkami perfluoro-15-crown-5-ether (PFCE) wzrasta wraz ze wzrostem wielkości cząstek (>560 nm). 11

<table><tbody><tr><td colspan="4">ODCZYNNIKI</td></tr><tr><td>C57BL/6 myszy</td><td>Charles River, Berlin</td><td></td><td></td></tr><tr><td>RPMI</td><td>Gibco</td><td>21875-091</td><td></td></tr><tr><td>FBS Superior</td><td>Biochrom AG</td><td>S 0615</td><td></td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Gibco-Invitrogen</td><td>15630-056</td><td></td></tr><tr><td>Penicylina-Streptomycyna</td><td>Gibco</td><td>15140-122</td><td></td></tr><tr><td>L-glutamina</td><td>Gibco</td><td>25030-024</td><td></td></tr><tr><td>Dulbecco's PBS</td><td>Sigma Aldrich</td><td>D8662</td><td></td></tr><tr><td>PFA</td><td>Santa Cruz</td><td>sc-281692</td><td></td></tr><tr><td>Perfluoro-15-crown-5-ether </td><td>ChemPur</td><td>391-1996</td><td></td></tr><tr><td>Pluronic F-68 </td><td>Sigma Aldrich</td><td>P5556</td><td></td></tr><tr><td>Szalki Petriego (35 x 10 mm)</td><td>VWR, Niemcy</td><td>391-1996</td><td></td></tr><tr><td>27 & frac12; Strzykawki G</td><td>VWR, Niemcy</td><td>612-0151</td><td></td></tr><tr><td>Nylonowe sitka do komórek (100 &mu; m mesh) </td><td>VWR, Niemcy</td><td>734-0004</td><td></td></tr><tr><td>Rurki NMR </td><td>VWR, Niemcy</td><td>634-0461</td><td></td></tr><tr><td colspan="4">EQUIPMENT</td></tr><tr><td>Narzędzia do preparowania</td><td>Inkubator FST</td><td></td><td></td></tr><tr><td>CO2 </td><td>Binder</td><td></td><td></td></tr><tr><td>System MR dla małych zwierząt</td><td>Bruker Biospin</td><td></td><td>9.4T BioSpec 94/20 USR, Oprogramowanie do akwizycji i przetwarzania ParaVision<</td></tr><tr><td>sup>1H/19F podwójnie przestrajalna cewka RF </td><td>Rapid Biomed, W&#252; rzburg, Niemcy</td><td></td><td>średnica wewnętrzna 35 mm, długość 50 mm</td></tr><tr><td>19F cewka spektroskopowa </td><td>z</td><td></td><td>własną pętlą strojenia/dopasowania, 4 zwoje, średnica wewnętrzna 5 mm, długość 10 mm, dwa kondensatory do strojenia i dopasowania</td></tr><tr><td>systemu inhalacji izofluranu</td><td>F&#246; hr Medical Instruments GmbH</td><td></td><td></td></tr><tr><td>System monitorowania zwierząt Model 1025</td><td>SA Instruments Inc., Nowy Jork, USA</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

monitorowanie migracji komórek dendrytycznych za pomocą rezonansu magnetycznego 19f / 1h

Monitoring Dendritic Cell Migration using 19F / 1H Magnetic Resonance Imaging

Ciągły postęp w nieinwazyjnych metodach obrazowania, takich jak rezonans magnetyczny (MRI), znacznie poprawił naszą zdolność do badania procesów fizjologicznych lub patologicznych w organizmach żywych. Rezonans magnetyczny okazuje się również cennym narzędziem do wychwytywania przeszczepionych komórek in vivo. Początkowe strategie znakowania komórek w MRI wykorzystywały środki kontrastowe, które wpływają na czas relaksacji MR (T1, T2, T2*) i prowadzą do wzmocnienia (T1) lub wyczerpania (T2*) sygnału w miejscach, w których obecne są znakowane komórki. Środki wzmacniające T2*, takie jak ultramałe środki tlenku żelaza (USPIO), zostały wykorzystane do badania migracji komórek, a niektóre z nich zostały również zatwierdzone przez FDA do zastosowań klinicznych. Wadą czynników T2* jest trudność w odróżnieniu wygaszania sygnału tworzonego przez znakowane komórki od innych artefaktów, takich jak skrzepy krwi, mikrokrwawienia lub pęcherzyki powietrza. W tym artykule opisujemy pojawiającą się technikę śledzenia komórek in vivo, która opiera się na znakowaniu komórek cząstkami bogatymi w fluor (19F). Cząstki te są przygotowywane przez emulgowanie związków perfluorowęglowodorowych (PFC), a następnie wykorzystywane do znakowania komórek, które następnie można zobrazować za pomocą 19F MRI. Do ważnych zalet PFC do śledzenia komórek in vivo należą: (i) brak związanego z węglem 19F in vivo, co daje obrazy bez tła i pełną selektywność komórek oraz (ii) możliwość ilościowego określenia sygnału komórkowego za pomocą spektroskopii 19F MR.

Od osiemnastu do dwudziestu jeden godzin po aplikacji śródskórnej, znakione 19F komórki dendrytyczne (DC) migrują do drenażowego węzła chłonnego podkolanowego. Ruch komórek DC przez naczynia limfatyczne do drenażowego węzła chłonnego podkolanowego można zaobserwować, nakładając anatomiczne obrazy 1H na obrazy 19F DC (Rysunek 2A). Wcześniej raportowaliśmy migrację tych komórek in vivo, a także wpływ wielkości cząsteczek 19F na immunobiologię DC, w tym n...

Śledzenie komórek za pomocą MRI zyskało niezwykłą uwagę w ostatnich latach. Protokół ten opisuje znakowanie komórek dendrytycznych cząstkami bogatymi w fluor (19F), zastosowanie tych komórek in vivo oraz monitorowanie zakresu ich migracji do drenującego węzła chłonnego za pomocą 19F/1H MRI i 19F MRS.

Monitorowanie migracji komórek dendrytycznych za pomocą rezonansu magnetycznego 19F / 1H

Continuous  advancements in noninvasive imaging modalities such as magnetic resonance  imaging (MRI) have greatly improved our ability to study ...

Ogólnym celem poniższego eksperymentu jest wizualizacja migracji komórek dendrytycznych do drenującego węzła chłonnego przy użyciu nieinwazyjnego obrazowania rezonansu magnetycznego fluoru (MRI) w połączeniu z konwencjonalnym MRI protonowym. Osiąga się to poprzez wstępne przygotowanie mysich komórek dendrytycznych pochodzących z szpiku kostnego i znakowanie w pełni zróżnicowanych komórek cząsteczkami bogatymi w fluor. W drugim kroku komórki znakowane fluorem są podawane do skóry kończyn tylnych myszy, co zapewnia efektywną transmigrację podanych komórek.Następnie obszar anatomiczny zainteresowania jest obrazowany za pomocą rezonansu magnetycznego (MRI) fluoru i protonów, aby monitorować migrację komórek dendrytycznych ze skóry do drenujących węzłów chłonnych. Ostatecznie migracja komórek dendrytycznych z miejsca aplikacji do drenującego węzła chłonnego może zostać zwizualizowana za pomocą MRI fluoru. Główną zaletą tej metody w porównaniu z innymi technikami śledzenia komórek, takimi jak te wymagające nanocząsteczek tlenku żelaza, jest fakt, że fluor związany z węglem jest praktycznie nieobecny we wszystkich żywych organizmach.Pozwala to na uzyskanie obrazów całkowicie pozbawionych tła oraz pełną selektywność komórkową po zastosowaniu komórek znakowanych fluorem in vivo. Metoda ta może pomóc w udzieleniu odpowiedzi na pytania z zakresu immunologii, takie jak wpływ kandydatów molekularnych na migrację komórek dendrytycznych in vivo. Metodę demonstrują Yulia Kovski, technik, oraz Helma VIIs, starszy naukowiec z mojego laboratorium, w 10. dniu hodowli komórek dendrytycznych szpiku kostnego.Aktywuj komórki dendrytyczne za pomocą LPS przez 24 godziny. W tym samym czasie znakuj komórki dendrytyczne cząsteczkami perfluorowanego eteru 15-koronowego bogatym w fluor o stężeniu 1 mM. Aby potwierdzić pomyślne znakowanie komórek dendrytycznych, sprawdź fizykochemiczne właściwości komórek za pomocą cytometrii przepływowej. Komórki znakowane fluorem przedstawiono tutaj jako czerwone zdarzenia na wykresie rozproszenia w przód i w bok, natomiast komórki nieznakowane przedstawiono jako zdarzenia niebieskie.W następnej kolejności umieść mysz szczepu C 57 black six w uchwycie, a następnie nabierz do strzykawki tuberkulinowej o pojemności 0,5 ml z igłą o rozmiarze 26,5 G komórki dendrytyczne znakowane fluorescencyjnie w objętości od 50 do 100 µL. Teraz ostrożnie wprowadź igłę w górne warstwy skóry w każdej z tylnych kończyn zwierzęcia, aby podać komórki wewnątrzskórnie. Po znieczuleniu myszy umieść zwierzę w pozycji brzusznej na podkładce do myszy w skanerze MR dla małych zwierząt.Po unieruchomieniu zwierzęcia w uchwycie obrazującym i podłączeniu go do systemu monitorowania, przesuń uchwyt do centrum cewki RF dla fluoru protonowego, aby potwierdzić prawidłowe ustawienie zwierzęcia i skanera. Służy to również do późniejszego zaplanowania geometrii przekrojów obrazowania. Pozyskaj obrazy lokalizacyjne w trzech standardowych orientacjach, korzystając z szybkich metod akwizycji obrazów o niskiej rozdzielczości w oprogramowaniu skanera MR.Nastroić cewkę RF na częstotliwość rezonansową protonów oraz na częstotliwość rezonansową fluoru. Użyć monitora strojenia skanera MR dla zwierząt, aby dopasować impedancję charakterystyczną cewki do 50 ohmów. Następnie ustawić niezbędne parametry systemów automatycznych, w tym shimming w celu precyzyjnego dostrojenia homogeniczności pola magnetycznego, regulacje częstotliwości systemu w celu dostrojenia RF do konkretnej częstotliwości LA systemu MR dla protonów oraz wzmocnienie referencyjne.Aby dostosować amplitudę RF, należy skonfigurować protokół turbo rare 3D dla skanowania protonowego, stosując TR wynoszące 1500 milliseconds i TE wynoszące 53 milliseconds, macierz o wymiarach 400 by 200 by 200 oraz współczynnik rare równy 16. Dostosuj pole widzenia (FOV) za pomocą obrazów scout. Następnie rozpocznij skanowanie.Załaduj sekwencję FID z pojedynczym impulsem i TR wynoszącym co najmniej 1000 milisekund, a następnie otwórz edycję skanowania i w metodzie edycji narzędziowej ustaw jądrem fluor. Odznacz automatyczne wzmocnienie referencyjne w ustawieniach (go setup). Rozpocznij pomiar bez rejestracji danych, aby wyświetlić sygnał MR w czasie rzeczywistym.Dostrój częstotliwość podstawową, aby wycentrować piki widma fluoru na wartości zero herców w oknie akwizycji. Następnie wybierz i zastosuj częstotliwość podstawową, a potem naciśnij stop now. Sklonuj protokół turbo rare 3D z poprzedniego skanowania protonów.Przejdź do edycji metody, a następnie odznacz automatyczne wzmocnienie referencyjne (automatic reference gain), tak jak pokazano przed chwilą w edycji skanowania. Wybierz jądro fluoru, a następnie zmień macierz na 1 28 by 64 by 64 oraz współczynnik uśredniania (rare factor) na co najmniej 40. Po zakończeniu skanowania wyjmij uchwyt dla myszy ze skanera MR i użyj menu widoku, aby nałożyć obrazy fluoru na obrazy protonów.Po uśmierceniu myszy należy wyciąć odpowiedni węzeł chłonny poplitowy i umieścić go w pięciomilimetrowej probówce NMR zawierającej 100 µL 2%PFA. Następnie probówkę należy umieścić w cewce do spektroskopii fluoru, a cewkę przesunąć do centrum izocentrycznego (ISO) magnesu. Należy nastroić cewkę RF na częstotliwość rezonansową fluoru, a następnie, korzystając z monitora strojenia skanera MR dla zwierząt, dopasować impedancję charakterystyczną cewki do 50 ohmów w narzędziach do shimowania.Ustaw wszystkie parametry shimowania na zero i naciśnij apply. Następnie załaduj sekwencję FID z pojedynczym impulsem przy TR wynoszącym co najmniej 1000 milliseconds. Otwórz edit scan i ustaw jądro na fluor.Teraz, korzystając z go setup, uruchom sekwencję, dostrój częstotliwość podstawową tak, aby pik widma fluoru znajdował się w centrum okna akwizycji przy zero herców, a następnie zastosuj częstotliwość podstawową. Następnie ponownie dostrój tłumik impulsu, aby zmaksymalizować sygnał i osiągnąć wzbudzenie 90 stopni. Gdy sygnał osiągnie maksimum, naciśnij stop.Na koniec w metodzie edycji (edit method) ustaw liczbę uśrednień (averages) w zakresie od 64 do 256 w zależności od sygnału, a następnie użyj funkcji go pipeline. Rozpocznij akwizycję od 18 do 21 godzin po aplikacji dokutkowej. Komórki dendrytyczne znakowane fluorem migrują do drenażowego węzła chłonnego poplitowego.Ruch komórek dendrytycznych poprzez naczynia chłonne do drenującego węzła chłonnego krocza można zaobserwować poprzez nałożenie anatomicznych obrazów protonowych na obrazy komórek dendrytycznych znakowanych fluorem. Na obrazach komórki dendrytyczne są przedstawione jako sygnał MR fluoru w kolorze czerwonym, natomiast węzły chłonne i naczynia chłonne są widoczne na anatomicznym obrazie MR protonowym w skali szarości. Aby ilościowo określić zakres migracji komórek dendrytycznych do drenujących węzłów chłonnych, węzły chłonne są wyodrębniane, a następnie przeprowadza się MRS fluoru, tak jak właśnie zademonstrowano. Gdy sygnał fluoru uzyskany z każdego węzła chłonnego zostanie porównany z sygnałem fluoru uzyskanym z różnych liczb komórek dendrytycznych znakowanych cząstkami perfluoro-15-crown-5-ether, co zilustrowano na tej krzywej kalibracyjnej, można wywnioskować liczbę znakowanych fluorem komórek dendrytycznych, które dotarły do drenującego węzła chłonnego w tym reprezentatywnym eksperymencie.Można oszacować, że 7,5 × 10⁴ komórek dendrytycznych, które nie zostały obciążone antygenem, dotarły do lewego węzła chłonnego, podczas gdy 3,6 × 10⁵ komórek dendrytycznych obciążonych antygenem dotarły do prawego węzła chłonnego. Choć kwestie te mogą dostarczyć wiedzy na temat molekularnych mechanizmów migracji komórek odpornościowych w warunkach prawidłowych, mogą one być również wykorzystane w modelach zwierzęcych, takich jak modele chorób autoimmunologicznych. Co więcej, zastosowania tej techniki rozciągają się na dziedzinę terapii nowotworów.Wszelkie zidentyfikowane cele molekularne mogą zostać wykorzystane do manipulowania komórkami dendrytycznymi w celu terapii nowotworowej.

monitoring-dendritic-cell-migration-using-19f-1h-magnetic-resonance

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Immunologia i infekcje

Monitorowanie migracji komórek dendrytycznych przy użyciu 19F / 1H Obrazowania rezonansowego magnetycznego

Metody obrazowania biologicznego stosowane do oceny biodystrybucji komórkowej nanocząsteczek znajdują zastosowanie w monitorowaniu terapeutycznym i diagnostycznym związków sformułowanych w nanostruktury. Metody opisane w niniejszym opracowaniu są czułe i swoiste w ocenie za pomocą korejestracji histologicznej. Przedstawione metodologie zapewniają ścieżkę translacyjną od zastosowań na modelach gryzoni do zastosowań u ludzi.

Rejestrowane obrazowanie biomedyczne nanomateriałów w monitorowaniu diagnostyki i terapii

Komórki dendrytyczne pobierają antygeny i migrują w stronę organów odpornościowych, aby zaprezentować przetworzone antygeny limfocytom T. Markowanie nanokryształami Qdot zapewnia długotrwały i stabilny sygnał fluorescencyjny. Umożliwia to śledzenie komórek dendrytycznych w różnych organach za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej.

Generowanie i znakowanie nanocząsteczkami kropek kwantowych komórek dendrytycznych pochodzących z szpiku kostnego myszy na potrzeby badań śledzących

Opisujemy ogólny protokół śledzenia komórek in vivo za pomocą MRI w modelu mysim z komórkami oznaczonymi ex vivo. Dołączony jest typowy protokół do znakowania komórek, przetwarzania akwizycji obrazu i kwantyfikacji.

Rezonans magnetyczny in vivo 19F do śledzenia komórek

Opisano ilościową metodę badania spontanicznej migracji komórek w jednowymiarowym, zamkniętym mikrośrodowisku. Metoda ta wykorzystuje mikrofabrykowane kanały i może być stosowana do badania migracji dużej liczby komórek w różnych warunkach w pojedynczych eksperymentach.

Badanie migracji komórek w kanałach mikroprefabrykowanych

Monocyty są kluczowymi regulatorami odporności wrodzonej i odgrywają kluczową rolę w odnowie obwodowego jednojądrzastego systemu fagocytarnego oraz w przypadku stanów zapalnych. W artykule opisano procedurę obrazowania w czasie rzeczywistym szpiku kostnego kalwarii myszy w celu zbadania mechanizmu mobilizacji monocytów.

Śledzenie monocytów szpiku kostnego myszy in vivo

Mechanizmy rządzące ruchliwością śródmiąższową komórek T efektorowych CD4 w miejscach zapalenia są stosunkowo nieznane. Przedstawiamy nieinwazyjne podejście do wizualizacji i manipulacji limfocytami T CD4 przygotowanymi in vitro w zapalnej skórze właściwej ucha, co pozwala na badanie dynamicznego zachowania tych komórek in situ.

Obrazowanie migracji śródmiąższowej komórek T CD4 w stanie zapalnym skóry właściwej

Protokoły ilościowej oceny chemotaksji i migracji limfocytów są ważnymi narzędziami do badań immunologicznych. Opisano w nim protokół in vitro, który umożliwia multipleksowaną ocenę migracji komórek w czasie rzeczywistym, a także komplementarną technikę in vivo umożliwiającą śledzenie komórek natywnych do śledziony.

Kwantyfikacja chemotaksji ludzkich monocytów in vitro i handlu mysimi limfocytami in vivo

Prezentowany tutaj jest protokół dostarczania i śledzenia nieinwazyjnych mezenchymalnych komórek macierzystych (MSC) w mysim modelu urazowego uszkodzenia mózgu. Superparamagnetyczne nanocząstki tlenku żelaza są wykorzystywane jako sonda rezonansu magnetycznego (MRI) do znakowania MSC i nieinwazyjnego śledzenia in vivo po podaniu donosowym za pomocą rezonansu magnetycznego w czasie rzeczywistym.

Śledzenie superparamagnetycznych mezenchymalnych komórek macierzystych znakowanych tlenkiem żelaza za pomocą rezonansu magnetycznego po dososowym podaniu w mysim modelu urazowego uszkodzenia mózgu

Ten artykuł szczegółowo opisuje metodologię znakowania radioaktywnego przeciwciała monoklonalnego anty-CD19 specyficznego dla człowieka i jak go używać do ilościowego oznaczania limfocytów B w ośrodkowym układzie nerwowym i tkankach obwodowych mysiego modelu stwardnienia rozsianego przy użyciu obrazowania in vivo PET, zliczania gamma ex vivo i metod autoradiograficznych.

Obrazowanie limfocytów B CD19 + w eksperymentalnym mysim modelu autoimmunologicznego zapalenia mózgu i rdzenia przy użyciu pozytonowej tomografii emisyjnej

Tłumaczenie wyników mikroskopii przyżyciowej jest utrudnione ze względu na jego płytką głębokość penetracji w tkanki. W tym miejscu opisujemy mysi model komory z oknem grzbietowym, który umożliwia jednoczesną rejestrację mikroskopii przyżyciowej i klinicznie stosowanych metod obrazowania (np. CT, MRI) w celu bezpośredniej korelacji przestrzennej, potencjalnie usprawniając kliniczne tłumaczenie wyników mikroskopii przyżyciowej.

Mysi model guza w komorze grzbietowego fałdu skórnego do połączonej mikroskopii przyżyciowej i obrazowania metodą rezonansu magnetycznego w translacyjnych badaniach nad rakiem

Terapia komórkowa oferuje obiecujące leczenie dla pacjentów z przewlekłą chorobą płuc poprzez zastosowanie komórek progenitorowych do naprawy uszkodzonych tkanek i poprawy funkcji płuc. Ponieważ obrazowanie odgrywa kluczową rolę w śledzeniu integracji komórek, opisujemy tutaj śledzenie in vivo terapii komórkowej dla przewlekłej choroby płuc w modelu mysim z wykorzystaniem obrazowania cząstek magnetycznych.

Zobrazenie in vivo sterydowane obrazem śledzenia przeszczepowanych komórek macierzystych nabłonka odległych płuc w przypadku zwłóknienia płuc przy użyciu obrazowania z zastosowaniem cząstek magnetycznych

Poznaj metodę śledzenia migracji komórek dendrytycznych do węzłów chłonnych za pomocą nieniwazyjnego rezonansu magnetycznego fluoru i protonu. Technika ta umożliwia badanie dynamiki ruchu komórek odpornościowych w organizmie myszy.

Monitorowanie migracji komórek dendrytycznych za pomocą rezonansu magnetycznego ¹⁹F / ¹H

Przeglądaj więcej filmów