Name: Wysokoprzepustowe funkcjonalne badania przesiewowe przy użyciu domowego testu lucyferazy o podwójnym blasku (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-06-01T14:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 55 s
Description: Poznaj metodę wysokoprzepustowego badania przesiewowego do identyfikacji regulatorów transkrypcyjnych przy użyciu domowego testu lucyferazy o podwójnym blasku w komórkach 293T. Ta technika umożliwia szybkie generowanie danych funkcjonalnych dla tysięcy genów.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Dziękujemy Johnowi Dardze z MGH DNA Core za przygotowanie biblioteki badań DNA. Christopher Chigas z firmy Perkin Elmer zapewnił nieocenione wsparcie dla naszego luminometru Wallac 1420. Steven Ciacco i Martin Thomae z firmy Agilent zapewnili wsparcie dla robota Bravo. Dziękujemy Ronowi Johnsonowi i Steve'owi Titusowi z NIH za hojne dostarczenie protokołu testu lucyferazy z podwójnym blaskiem.

Przegląd eksperymentalny, zobacz Rysunek 1.
1. Przygotowanie plazmidów reporterowych zawierających promotor alfa-synukleiny
Elementy regulatorowe genu alfa-synukleiny (Rysunek 2) obejmują około 10 kb, od sekwencji powtórzeń dinukleotydowych NACP (non-A beta składnik peptydu amyloidowego)1,2 przez intron 2 3. Uwzględniamy część tego regionu w naszym zestawie reporterskim. Odkryliśmy, że plazmidy zawierające intron 2 wymagały specjalnych procedur wzrostu, jak opisano poniżej. Plazmidy lucyferazy, pGL4.10 i pGL4.75 (ryc. 3), są komercyjnie dostępne w Promega i mogą być rozmnażane przy użyciu konwencjonalnych protokołów biologii molekularnej.
<ol>
	<li>Amplifikować 2 składniki promotora alfa-synukleiny w oddzielnych PCR, stosując wzór w Tabeli 1 i startery w Tabeli 2.</li>
	<li>Sprawdź produkty PCR na żelu agarozowym i wyczyść za pomocą zestawu do oczyszczania Qiaquick PCR (Qiagen), eluując w 50 μl TE (Tris-EDTA). Uwolniony fragment o wielkości 0,9 kb należy przechowywać w temperaturze -20 °C do wykorzystania w przyszłości.</li>
	<li>Strawić całą objętość fragmentu PCR o objętości 3,4 kb, a także 5 μg pGL4.10 za pomocą SacI i XhoI. Potraktuj wektor fosfatazą alkaliczną jelita cielęcego (Roche) i oczyść żelem za pomocą zestawu do szybkiej ekstrakcji żelem PureLink (Invitrogen).</li>
	<li>Zliguj fragment i wektor za pomocą ligazy DNA T4 (NEB). Oczyść zakończoną reakcję za pomocą zestawu PureLink PCR Micro (Invitrogen), eluując w 10 μl buforu TE.</li>
	<li>Przekształć 2 μl oczyszczonej reakcji ligacji w 20 μl kompetentnych ogniw ElectroMAX Stbl4 (Invitrogen) i elektroporować zgodnie z instrukcjami producenta. Wytrząsać w inkubatorze o temperaturze 30 °C przy 225 obr./min przez 90 min. Rozprowadzić 2 objętości na płytkach LB zawierających 100 mg/ml ampicyliny i inkubować w temperaturze 30 °C przez 2 dni.</li>
	<li>Za pomocą wykałaczki wybierz 4-6 małych kolonii do zaszczepienia w 2 ml TB (Terrific Broth). Uprawiaj te miniprep kultury w wytrząsarce o temperaturze 30 °C O/N.</li>
	<li>Oczyść plazmidowe DNA z 1,5 ml każdej kultury miniprep za pomocą zestawu PureLink HiPure Plasmid Miniprep (Invitrogen).</li>
	<li>Trawić minipreparaty z BamHI i elektroforezą na żelu agarozowym. Prawidłowy klon powinien wytworzyć fragmenty o wielkości 2,8 kb i 4,9 kb.</li>
	<li>Pozostałą kulturę miniprep z odpowiedniego klonu należy ponownie umieścić na świeżej płytce LB (bulion Luria) i rosnąć w temperaturze 30 °C przez 2 dni.</li>
	<li>Wybierz małą kolonię i zaszczep 1,5 ml kultury starterowej gruźlicy. Wstrząsnąć O/N w temperaturze 30 °C. Nie pozwól, aby kultura starterowa urosła do nasycenia.</li>
	<li>Rozcieńczyć całą kulturę starterową w 150 ml podgrzanej gruźlicy i wstrząsać w temperaturze 30 °C przez 2 dni. Przed przejściem do następnego kroku użyj 1,5 ml tej kultury do dodatkowego miniprzygotowania i trawienia, aby potwierdzić, że klon nie zmutował podczas replikacji.</li>
	<li>Oczyść plazmidowe DNA z pozostałej kultury za pomocą zestawu PureLink HiPure Plasmid Maxiprep (Invitrogen). Oczekiwana wydajność tego plazmidu pośredniego wynosi 50-150 μg na 150 ml hodowli.</li>
	<li>Rozmrozić fragment o rozmiarze 0,9 kb zamrożony w kroku 1.2. Powtórz kroki od 1.3 do 1.12, aby sklonować fragment o wielkości 0,9 kb do plazmidu pośredniego, trawiąc zamiast tego za pomocą KpnI i SacI. Ligate, transformuj, wybieraj i rozwijaj dla maxipreps, jak powyżej. Trawienie z BamHI powinno dać fragmenty o wielkości 5,8 kb i 2,8 kb. Jest to plazmid, który zostanie użyty do badania przesiewowego.</li>
</ol>
2. Przygotowanie komórek 293T, plazmidów reporterowych i DNA biblioteki do badań przesiewowych
293T komórki są najpierw wysiewane na 96-dołkowe płytki i transfekowane następnego dnia. Plazmidy reporterowe i DNA bibliotek rozcieńcza się na 96-dołkowych płytkach. Uzyskaliśmy płytki z DNA z biblioteki transfekcyjnej z DNA Core w Massachusetts General Hospital (<a href="http://dnacore.mgh.harvard.edu" target="_blank">dnacore.mgh.harvard.edu</a>). Protokół ten transfekuje pojedynczą płytkę biblioteczną na 2 identyczne płytki komórek 293T (ryc. 1), dlatego należy zasiać 2 płytki komórek dla każdej płytki biblioteki, która ma być przesiewana.
Uwaga: Hoduj komórki w pożywkach bez czerwieni fenolowej lub antybiotyków, ponieważ zakłócają one testy lucyferazy i zwiększają toksyczność podczas transfekcji.
<ol>
	<li>Dla każdej płytki bibliotecznej, która ma być poddana badaniom przesiewowym, ponownie zawiesić trypsynizowane komórki 293T do stężenia 1,5 x 105 komórek/ml w DMEM zawierającym 14% FBS. Wlać do sterylnego zbiornika (Axygen).</li>
	<li>Umieść zbiornik, 2 96-dołkowe płytki z przezroczystym dnem (Corning) i pudełko z końcówkami do pipet filtrujących (Agilent) na pokładzie robota. Dozować 100 μl komórek do każdego dołka obu płytek, aby uzyskać gęstość 1,5 x 104 komórek na dołek.</li>
	<li>Odwirować płytki komórkowe przy 50 x g przez 2 minuty, używając niskich prędkości rampy, aby zapewnić równą gęstość komórek w każdym dołku. Inkubować w temperaturze 37 °C i 10% CO2 O/N.</li>
	<li>Rozcieńczyć plazmidy reporterowe świetlika i Renilla do 5 ng/μl w pożywce bez surowicy. Połączyć rozcieńczenia w stosunku 5:3 świetlika do plazmidu Renilla (objętościowo) w stożkowej probówce o pojemności 15 ml.</li>
	<li>Odpipetować połączone plazmidy do każdej studzienki 96-dołkowej płytki, dozując 17 μl na płytkę biblioteczną plus 2-10 μl nadmiaru do każdej studzienki.</li>
	<li>Uzyskać płytki biblioteki DNA klasy transfekcyjnej, jak powyżej, i rozcieńczyć do 13,3 ng/μl wodą wolną od endotoksyn. Minimalna objętość na studzienkę powinna wynosić 28 μl.</li>
</ol>
3. Wykonywanie operacji
W drugim dniu ekranu, plazmidy reporterowe i DNA biblioteki są transfekowane do komórek 293T.
<ol>
	<li>Na każdą płytkę biblioteczną należy wymieszać 107,5 μl RT Optifect (Invitrogen) z 4,3 ml podłoża bez surowicy (rozcieńczenie 1:40) w probówce polistyrenowej. Inkubować przez 5 minut w temperaturze pokojowej, a następnie dozować 44 μl (na płytkę biblioteczną) do każdego dołka 96-dołkowej płytki z polistyrenem w kształcie litery V (Greiner).</li>
	<li>Umieść płytkę z rozcieńczonym Optifect, plazmidy reporterowe (krok 2.5), DNA biblioteki (krok 2.6) i pudełko końcówek do pipet na pokładzie robota.</li>
	<li>Odessać 17 μl plazmidów reporterowych, 43 μl rozcieńczonego Optifect i 26 μl DNA z biblioteki, wprowadzając 5 μl szczeliny powietrznej między każdą aspiracją. DNA biblioteki powinno być odsysane jako ostatnie, aby zapobiec zanieczyszczeniu krzyżowemu. Dozuj zawartość końcówek do nowej polistyrenowej płytki z dnem w kształcie litery V, wymieszaj, przykryj i odstaw na 20 minut, aby umożliwić utworzenie kompleksów lipidowo-DNA. W przypadku transfekcji wielu płytek bibliotecznych wymień końcówki pipet i płytkę biblioteczną, a następnie powtórz czynność.</li>
	<li>Odkryj płytkę z mieszaniną Optifect/DNA i umieść ją na pokładzie robota z 2 płytkami z komórkami 293T. Za pomocą jednego pudełka z końcówkami do pipet odessać 80 μl mieszaniny Optifect:DNA i powoli dozować 40 μl na każdą płytkę komórkową. W przypadku transfekcji wielu płytek bibliotecznych powtórz tę czynność dla wszystkich płytek Optifect:DNA. Zakryj komórki.</li>
	<li>Odwirować płytki komórkowe o masie 1 200 x g przez 30 minut. Przykryć i włożyć z powrotem do inkubatora.</li>
	<li>Inkubuj komórki przez 4-6 godzin. Podczas tej inkubacji należy przygotować świeże pożywki, mieszając 12 ml DMEM zawierającego 10% FBS i 10 μg/ml cyprofloksacyny (CellGro) dla każdej transfekowanej płytki bibliotecznej. Wlej świeżą pożywkę do sterylnego zbiornika.</li>
	<li>Umieść 2 pudełka z końcówkami robota, pojedynczą płytkę z ogniwami, zbiornik zawierający świeże media i zbiornik na odpady na pokładzie robota. Odessać 100 μl pożywki z komórek i dozować do zbiornika na odpady częściowo wypełnionego 70% etanolem. Za pomocą świeżych końcówek odessać 100 μl świeżej pożywki i powoli dozować na komórki. Powtórz te czynności dla wszystkich płytek komórek.</li>
	<li>Umieść płytki z powrotem w inkubatorze na 48 godzin.</li>
</ol>
4. Wykonaj testy podwójnej lucyferazy
W 4 dniu ekranu przeprowadzane są testy lucyferazy świetlika i Renilla.
Uwaga: Test podwójnej lucyferazy wymaga sekwencyjnego dodawania 2 testowych, 3X buforu testowego świetlika i 3X bufora testu Renilla, jak opisano w Tabeli 3. Lucyferazy świetlików i Renilla nie są wydzielane, dlatego komórki muszą zostać poddane lizie przed pomiarem aktywności lucyferazy. Bufor testu świetlików lizuje komórki i dostarcza substrat dla lucyferazy świetlika; Bufor testowy Renilla tłumi sygnał świetlika i zapewnia substrat dla lucyferazy Renilla.
<ol>
	<li>Dla każdej płytki bibliotecznej przygotować 8 ml buforu do oznaczania świetlików 3X z roztworów podstawowych, jak opisano w Tabeli 3, i dozować 82 μl do każdego dołka 96-dołkowej płytki z dnem w kształcie litery V.</li>
	<li>Dla każdej płytki bibliotecznej należy również przygotować 12 ml buforu 3X do testu Renilla i dozować 122 μl do każdej studzienki 96-dołkowej płytki z dnem w kształcie litery V. Odłóż na bok zarówno testowe świetlika, jak i Renilla.</li>
	<li>Umieść pudełko z końcówkami do pipet, zbiornik na odpady i 2 płytki z komórkami (transfekowane z tej samej płytki bibliotecznej) na pokładzie robota.</li>
	<li>Odessać 60 μl pożywki z każdej płytki i wyrzucić do zbiornika na odpady częściowo wypełnionego 70% etanolem. Przykryj talerze i odłóż na bok. W przypadku transfekcji wielu płyt bibliotecznych powtórz te czynności dla wszystkich zestawów płyt.</li>
	<li>Umieść 2 pudełka z końcówkami do pipet, płytkę bufora do oznaczania świetlików 3X i zestaw płytek komórkowych na pokładzie robota.</li>
	<li>Odessać 40 μl buforu do oznaczania świetlików 3X i dodać go do pierwszej płytki komórek, dokładnie mieszając. Przełączając na nowe końcówki pipet, powtórzyć te czynności dla drugiej płytki komórkowej. Umieść komórki w RT na 10 minut, aby zakończyć lizę. W przypadku transfekcji wielu płytek bibliotecznych wymień pudełka końcówek i płytek komórek i powtórz czynność.</li>
	<li>Rejestruj luminescencję z każdej studzienki każdej płytki komórkowej na luminometrze, rejestrując przez 1 sekundę na studzienkę. Umieść płyty zwrotne na pokładzie robota.</li>
	<li>Umieść 2 pudełka końcówek do pipet, płytkę z buforem testowym 3X Renilla i zestaw płytek komórkowych na pokładzie robota.</li>
	<li>Odessać 60 μl 3X buforu testowego Renilla i dodać go do pierwszej płytki z komórkami, dokładnie mieszając. Przełączając się na nowe pudełko końcówek do pipet, powtórz te czynności dla drugiej płytki komórkowej. W przypadku transfekcji wielu płytek bibliotecznych powtórz tę czynność dla wszystkich zestawów płytek komórek.</li>
	<li>Zapisz luminescencję ze wszystkich płytek na luminometrze, rejestrując każdą studzienkę przez 1 sekundę, jak powyżej. Wyrzuć talerze.</li>
</ol>
5. Analiza danych
<ol>
	<li>Oblicz stosunek luminescencji świetlika:Renilla ("stosunek F:R") dla każdej studzienki, dzieląc liczbę sygnału świetlika przez liczbę sygnału Renilla.</li>
	<li>Oblicz wartość indukcji, dzieląc stosunek F:R każdego dołka przez średni stosunek F:R płytki, z wyłączeniem najwyższych i najniższych 25% dołków.</li>
	<li>Uśrednić wartości indukcji w powtórzeniach dla pojedynczej transfekowanej płytki bibliotecznej. Geny indukujące lub hamujące alfa-synukleinę więcej niż trzykrotnie są uważane za "trafienia" na tym ekranie i podlegają dalszej walidacji i wtórnym badaniom przesiewowym.</li>
</ol>

<ol><li>Chiba-Falek, O., Nussbaum, R. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effect+of+allelic+variation+at+the+NACP-Rep1+repeat+upstream+of+the+%CE%B1-synuclein+gene+%28SNCA%29+on+transcription+in+a+cell+culture+luciferase+reporter+system%5BTitle%5D)+AND+%22Hum.+Mol.+Genet%22%5BJournal%5D)">Effect of allelic variation at the NACP-Rep1 repeat upstream of the α-synuclein gene (SNCA) on transcription in a cell culture luciferase reporter system.</a> Hum. Mol. Genet. 10 (26), 3101-3109 (2001).</li>
<li>Chiba-Falek, O., Touchman, J. W., Nussbaum, R. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functional+analysis+of+intra-allelic+variation+at+NACP-Rep1+in+the+alpha-synuclein+gene%5BTitle%5D)+AND+%22%22%5BJournal%5D)">Functional analysis of intra-allelic variation at NACP-Rep1 in the alpha-synuclein gene.</a> 113 (5), 426-431 (2003).</li>
<li>Scherzer, C. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((GATA+transcription+factors+directly+regulate+the+Parkinson%27s+disease-linked+gene+%CE%B1-synuclein%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+USA%22%5BJournal%5D)">GATA transcription factors directly regulate the Parkinson's disease-linked gene α-synuclein.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 105 (31), 10907-10912 (2008).</li>
<li>Spillantini, M. G., Schmidt, M. L., Lee, V. M. Y., Trojanowski, J. Q., Jakes, R., Goedert, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((%CE%B1-Synuclein+in+Lewy+Bodies%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">α-Synuclein in Lewy Bodies.</a> Nature. 388 (6645), 839-840 (1997).</li>
<li>Pankratz, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Meta-analysis+of+Parkinson%27s+disease%3A+identification+of+a+novel+locus%2C+RIT2%5BTitle%5D)+AND+%22Ann.+Neurol%22%5BJournal%5D)">Meta-analysis of Parkinson's disease: identification of a novel locus, RIT2.</a> Ann. Neurol. 71 (3), 370-384 (2012).</li>
<li>Satake, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genome-wide+association+study+identifies+common+variants+at+four+loci+as+genetic+risk+factors+for+Parkinson%27s+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Genet%22%5BJournal%5D)">Genome-wide association study identifies common variants at four loci as genetic risk factors for Parkinson's disease.</a> Nat. Genet. 41 (12), 1303-1307 (2009).</li>
<li>Simón-Sánchez, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genome-wide+association+study+reveals+genetic+risk+underlying+Parkinson%27s+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Genet%22%5BJournal%5D)">Genome-wide association study reveals genetic risk underlying Parkinson's disease.</a> Nat. Genet. 41 (12), 1308-1312 (2009).</li>
<li>Polymeropoulos, M. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mutation+in+the+alpha-synuclein+gene+identified+in+families+with+Parkinson%27s+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Mutation in the alpha-synuclein gene identified in families with Parkinson's disease.</a> Science. 276 (5321), 2045-2047 (1997).</li>
<li>Ibáñez, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Causal+relationship+between+a-synuclein+gene+duplication+and+familial+Parkinson%27s+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Lancet%22%5BJournal%5D)">Causal relationship between a-synuclein gene duplication and familial Parkinson's disease.</a> Lancet. 364 (9440), 1169-1171 (2004).</li>
<li>Chartier-Harlin, M. -C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((a-Synuclein+locus+duplication+as+a+cause+of+familial+Parkinson%27s+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Lancet%22%5BJournal%5D)">a-Synuclein locus duplication as a cause of familial Parkinson's disease.</a> Lancet. 364 (9440), 1167-1169 (2004).</li>
<li>Singleton, A. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((a-Synuclein+locus+triplication+causes+Parkinson%27s+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">a-Synuclein locus triplication causes Parkinson's disease.</a> Science. 302 (5646), 841 (2003).</li>
<li>Ahn, T. -B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((a-Synuclein+gene+duplication+is+present+in+sporadic+Parkinson+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Neurology%22%5BJournal%5D)">a-Synuclein gene duplication is present in sporadic Parkinson disease.</a> Neurology. 70 (1), 43-49 (2008).</li>
<li>Boyce, F. M., Bucher, N. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Baculovirus-mediated+gene+transfer+into+mammalian+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Nat.+Acad.+USA%22%5BJournal%5D)">Baculovirus-mediated gene transfer into mammalian cells.</a> Proc. Nat. Acad. USA. 93 (6), 2348-2352 (1996).</li>
<li>Montigny, W. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Parameters+influencing+high-efficiency+transfection+of+bacterial+artificial+chromosomes+into+cultured+mammalian+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechniques%22%5BJournal%5D)">Parameters influencing high-efficiency transfection of bacterial artificial chromosomes into cultured mammalian cells.</a> Biotechniques. 35, 796-807 (2003).</li>
<li>Gorman, C. M., Moffat, L. F., Howard, B. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Recombinant+genomes+which+express+chloramphenicol+acetyltransferase+in+mammalian+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Cell.+Biol%22%5BJournal%5D)">Recombinant genomes which express chloramphenicol acetyltransferase in mammalian cells.</a> Mol. Cell. Biol. 2 (9), 1044-1051 (1982).</li>
<li>Li, J. J., Herskowitz, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+of+ORC6%2C+a+Component+of+the+Yeast+Origin+Recognition+Complex+by+a+One-Hybrid+System%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Isolation of ORC6, a Component of the Yeast Origin Recognition Complex by a One-Hybrid System.</a> Science. 262, 1870-1874 (1993).</li>
<li>Dejardin, J., Kingston, R. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Purification+of+Proteins+Associated+with+Specific+Genomic+Loci%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Purification of Proteins Associated with Specific Genomic Loci.</a> Cell. 136, 175-186 (2009).</li>
<li>Shen, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+map+of+the+cis-regulatory+sequences+in+the+mouseGenome%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">A map of the cis-regulatory sequences in the mouseGenome.</a> Nature. 488, 116-120 (2012).</li>
<li>Fan, F., Wood, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bioluminescent+assays+for+high-throughput+screening%5BTitle%5D)+AND+%22Assay+Drug+Dev.+Technol%22%5BJournal%5D)">Bioluminescent assays for high-throughput screening.</a> Assay Drug Dev. Technol. 5 (1), 127-136 (2007).</li>
<li>Hampf, M., Gossen, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+protocol+for+combined+Photinus+and+Renilla+luciferase+quantification+compatible+with+protein+assays%5BTitle%5D)+AND+%22Anal.+Biochem%22%5BJournal%5D)">A protocol for combined Photinus and Renilla luciferase quantification compatible with protein assays.</a> Anal. Biochem. 356 (1), 94-99 (2006).</li>
<li>Auld, D. S., Thorne, N., Maguire, W. F., Inglese, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanism+of+PTC124+activity+in+cell-based+luciferase+assays+of+nonsense+codon+suppression%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+USA%22%5BJournal%5D)">Mechanism of PTC124 activity in cell-based luciferase assays of nonsense codon suppression.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 106 (9), 3585-3590 (2009).</li>
<li>Pearlberg, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Screens+using+RNAi+and+cDNA+expression+as+surrogates+for+genetics+in+mammalian+tissue+culture+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cold+Spring+Harb.Symp.+Quant.+Biol%22%5BJournal%5D)">Screens using RNAi and cDNA expression as surrogates for genetics in mammalian tissue culture cells.</a> Cold Spring Harb.Symp. Quant. Biol. 70, 449-459 (2005).</li>
</ol>

Praca ta była wspierana przez tantiemy uzyskane z licencji BacMamreagents (patent USA 5,731,182).

Alfa-synukleina jest zaangażowana w chorobę Parkinsona (PD) jako składnik ciał Lewy'ego4, inkluzji wewnątrzkomórkowych uważanych za patognomiczne dla choroby. Liczne badania asocjacyjne całego genomu powiązały polimorfizmy pojedynczego nukleotydu w alfa-synukleinie ze zwiększonym ryzykiem sporadycznego PD5,6,7. Chociaż choroba Parkinsona jest mniej powszechna niż sporadyczna, rodzinna choroba Parkinsona może być również spowodowana mutacjami w alfa-synukleinie8, a także duplikacją i potro...

Zdolność do identyfikacji kluczowych genetycznych elementów regulacyjnych i czynników, które na nie działają, jest fundamentalna dla eksploracji licznych procesów biologicznych. Jednak identyfikacja czynników regulujących ekspresję genów w rzadkich typach komórek, takich jak określone populacje neuronów, może być wyzwaniem. W tym miejscu przedstawiamy protokół identyfikacji nowych regulatorów transkrypcji alfa-synukleiny (SNCA), genu związanego z chorobą Parkinsona i ulegającego ekspresji w neuronach dopaminergicznych w regionie substantianigra pars compacta śródmózgowia. Osiągamy to za pomocą wysokoprzepustowego, podwójnego lucyferazy, badania reporterowego in vitro, aby zdekonstruować ekspresję alfa-synukleiny w komórkach 293T. Promotor alfa-synukleiny jest najpierw klonowany do plazmidu reporterowego zawierającego gen lucyferazy świetlika. Komercyjnie dostępny plazmid zawierający lucyferazy Renilla pod kontrolą konstytutywnie aktywnego promotora służy jako kontrola wewnętrzna. Te konstrukty reporterowe są kotransfekowane do komórek 293T w mikropłytkach z plazmidami z biblioteki ekspresji DNA, tak że każda studzienka jest transfekowana plazmidem z jednej biblioteki. Po 48 godzinach aktywność lucyferazy dla każdego reportera jest mierzona sekwencyjnie za pomocą testu podwójnego świecenia. Względna ekspresja alfa-synukleiny w odpowiedzi na każdy gen biblioteczny jest wnioskowana na podstawie stosunku aktywności lucyferazy świetlika:Renilla w każdym dołku (stosunek F:R) po normalizacji na płytce.
Ten protokół zapewnia możliwość badania przesiewowego dużej liczby genów (~2,500 tygodniowo) pod kątem ich zdolności do transaktywacji genu reporterowego przy użyciu minimalnej siły roboczej (1-2 osoby) i minimalnych kosztów (około 3 $ koszt odczynnika za test mikropłytki). Regulatory transkrypcji genów neuronalnych (np. alfa-synukleiny), które są trudne do zbadania w hodowanych neuronach opornych na manipulacje genetyczne, można porównać obok siebie w tym bezpośrednim teście funkcjonalnym. Do naszego protokołu dołączamy szczegółową metodę klonowania i wzrostu plazmidów zawierających promotor alfa-synukleiny, ponieważ odkryliśmy, że plazmidy zawierające ten region są niestabilne, gdy są hodowane przy użyciu konwencjonalnych procedur (patrz Dyskusja). Dołączamy również niedrogą alternatywę dla dostępnych na rynku odczynników z podwójną lucyferazy do testów wysokoprzepustowych. Protokół ten można łatwo dostosować do innych elementów regulacyjnych będących przedmiotem zainteresowania lub do dowolnego procesu wymagającego transfekcji przejściowych o wysokiej przepustowości.

<table><tbody><tr><td colspan="4">Materiał</td></tr><tr><td>QIAQuick Zestaw do oczyszczania PCR</td><td>Qiagen</td><td>28106</td><td></td></tr><tr><td>Zestaw do szybkiej ekstrakcji żelu PureLink</td><td>Invitrogen</td><td>K2100-12</td><td></td></tr><tr><td>Zestaw Micro PureLink PCR</td><td>Invitrogen</td><td>K310250</td><td></td></tr><tr><td>Zestaw minipreparatu PureLinkHiPure Plasmid</td><td>Invitrogen</td><td>K2100-03</td><td></td></tr><tr><td>PureLinkHiPure Plasmid Maxiprep Kit</td><td>Invitrogen</td><td>K2100-07</td><td></td></tr><tr><td>Bravo Robot</td><td>Agilent-Robot</td><td></td><td></td></tr> <tr><td>Końcówki do pipet z filtrem</td><td>Agilent</td><td>19477-022</td><td></td></tr><tr><td>Końcówki do pipet robotów bez filtra</td><td>Agilent</td><td>19477-002</td><td></td></tr><tr><td>Płytki 96-dołkowe z przezroczystym dnem</td><td>Zbiorniki Corning</td><td>3610</td><td></td></tr><tr><td></td><td>Axygen</td><td>RES-SW96-HP-SI</td><td></td></tr><tr><td>Polistyrenowa płytka 96-dołkowa z dnem w kształcie litery V</td><td>Greiner</td><td>651101</td><td></td></tr><tr><td>Polipropylenowa płytka 96-dołkowa z dnem w kształcie litery V</td><td>Greiner</td><td>651201</td><td></td></tr><tr><td>Samoprzylepne pokrywy płytek</td><td>CryoStuff</td><td>#FS100</td><td></td></tr><tr><td colspan="4">Reagent</td></tr><tr><td>Phusion DNA Polymeraza New</td><td>England Biolabs</td><td>M0530L</td><td></td></tr><tr><td>BAC 2002-D6</td><td>Invitrogen</td><td>2002-D6</td><td></td></tr><tr><td>Fosfataza alkaliczna w jelicie cielęcym</td><td>Roche</td><td>10713023001</td><td></td></tr><tr><td>Ligaza DNA T4</td><td>Nowa Anglia Biolabs</td><td>M0202L</td><td></td></tr><tr><td>pGL4.10</td><td>Promega</td><td>E6651</td><td></td></tr><tr><td>pGL4.74</td><td>Promega</td><td>E6931</td><td></td></tr><tr><td>ElectroMAX Stbl4 Kompetentne komórki</td><td>Invitrogen</td><td>11635-018</td><td></td></tr><tr><td>Wydajność subklonowania DH5 i alfa; Competent Cells</td><td>Invitrogen</td><td>18265-017</td><td></td></tr><tr><td>DMEM bez czerwieni fenolowej</td><td>Invitrogen</td><td>31053-028</td><td></td></tr><tr><td>Optifect</td><td>Invitrogen</td><td>12579017</td><td></td></tr><tr><td>Ciprofloksacyna</td><td>CellGro</td><td>61-277-RF</td><td></td></tr><tr><td>Chlorowodorek trisu w proszku</td><td>Sigma</td><td>93287</td><td></td></tr><tr><td>Tris-Base Powder </td><td>Sigma</td><td>93286</td><td></td></tr><tr><td>Triton X-100 Pure Liquid</td><td>Fisher</td><td>BP151-100</td><td></td></tr><tr><td>DTT</td><td>Invitrogen</td><td>15508-013</td><td></td></tr><tr><td>C&#8211; nzyme A</td><td>Nanolight</td><td>309</td><td></td></tr><tr><td>ATP</td><td>Sigma</td><td>A6419</td><td></td></tr><tr><td>Lucyferyna</td><td>Invitrogen</td><td>L2912</td><td></td></tr><tr><td>h-CTZ</td><td>Nanolight</td><td>301</td><td></td></tr><tr><td>PTC124</td><td>SelleckBiochemicals</td><td>S6003</td><td></td></tr></tbody></table>

wysokoprzepustowe funkcjonalne badania przesiewowe przy użyciu domowego testu lucyferazy o podwójnym blasku

High-throughput Functional Screening using a Homemade Dual-glow Luciferase Assay

Prezentujemy szybki i tani protokół wysokoprzepustowego badania przesiewowego w celu identyfikacji regulatorów transkrypcji alfa-synukleiny, genu związanego z chorobą Parkinsona. Komórki 293T są przejściowo transfekowane plazmidami z biblioteki ekspresji ORF, razem z plazmidami reporterowymi lucyferazy, w formacie mikropłytki z jednym genem na dołek. Aktywność lucyferazy świetlików jest oznaczana po 48 godzinach w celu określenia wpływu każdego genu bibliotecznego na transkrypcję alfa-synukleiny, znormalizowaną do ekspresji z konstruktu kontroli wewnętrznej (promotor hCMV kierujący lucyferazą Renilla). Protokół ten jest ułatwiony przez robota stołowego zamkniętego w szafie bezpieczeństwa biologicznego, który wykonuje aseptyczną obsługę cieczy w formacie 96-dołkowym. Nasz zautomatyzowany protokół transfekcji można łatwo dostosować do wysokoprzepustowej produkcji biblioteki lentiwirusowej lub innych funkcjonalnych protokołów przesiewowych wymagających potrójnej transfekcji dużej liczby unikalnych plazmidów bibliotecznych w połączeniu ze wspólnym zestawem plazmidów pomocniczych. Przedstawiamy również niedrogą i zweryfikowaną alternatywę dla dostępnych na rynku, podwójnych odczynników lucyferazy, które wykorzystują PTC124, EDTA i pirofosforan do tłumienia aktywności lucyferazy świetlików przed pomiarem lucyferazy Renilla. Korzystając z tych metod, przebadaliśmy 7670 ludzkich genów i zidentyfikowaliśmy 68 regulatorów alfa-synukleiny. Protokół ten można łatwo modyfikować, aby celować w inne geny będące przedmiotem zainteresowania.

Typowe wartości lucyferazy, stosunki F:R oraz wartości indukcji dla pojedynczej połowy płytki przedstawiono na Rysunku 4. Należy zwrócić uwagę na wynik w studzience H2, będący induktorem 32-krotnym. Geny powodujące nadmierną toksyczność (na przykład studzienka E3) lub studzienki słabo transfekowane dadzą niskie wartości zarówno dla lucyferazy świetlika, jak i Renilla, ale średnią wartość indukcji. Geny powodujące nieswoistą indukcję aktywności lucyferazy, być może via interakcję ze szki...

Prezentujemy szybką i tanią metodę przesiewową do identyfikacji regulatorów transkrypcji za pomocą wysokoprzepustowych transfekcji robotycznych i domowego testu lucyferazy o podwójnym świeceniu. Protokół ten szybko generuje bezpośrednie dane funkcjonalne dla tysięcy genów i można go łatwo modyfikować w celu ukierunkowania na dowolny gen będący przedmiotem zainteresowania.

Wysokoprzepustowe funkcjonalne badania przesiewowe przy użyciu domowego testu lucyferazy o podwójnym blasku

We present a rapid and inexpensive high-throughput screening protocol to identify transcriptional regulators of alpha-synuclein, a gene associated with ...

Ogólnym celem tej procedury jest identyfikacja regulatorów transkrypcji dowolnego genu będącego przedmiotem zainteresowania przy użyciu prostego protokołu transfekcji o wysokiej przepustowości i domowego testu lucyferazy o podwójnym blasku. Osiąga się to poprzez najpierw zaprojektowanie i sklonowanie unikalnego zestawu podwójnych plazmidów reporterowych lucyferazy. Plazmidy te są transfekowane na 2 9 3 limfocyty T w mikropłytce z plazmidami z biblioteki ekspresji DNA, tak że każda studzienka jest transfekowana plazmidem z jednej biblioteki.Po 48 godzinach bada się aktywność lucyferazy świetlika, a następnie testuje się aktywność lucyferazy waniliowej. Ostatnim krokiem jest obliczenie współczynników aktywności lucyferazy świetlika do wanilii. Ostatecznie, względna indukcja interesującego genu w odpowiedzi na każdą bibliotekę.Gen jest wnioskowany na podstawie stosunku aktywności świetlika do lucyferazy waniliowej w każdym dołku po normalizacji na płytce. Główną zaletą tej techniki w porównaniu z istniejącymi protokołami testów reporterowych jest jej zdolność do szybkiego generowania danych funkcjonalnych dla dużej liczby genów przy minimalnym nakładzie pracy i kosztów. Na jeden dzień

high-throughput-functional-screening-using-homemade-dual-glow

Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

Wysokowydajne badanie funkcjonalne z wykorzystaniem domowej wersji testu luciferase z podwójnym świeceniem

W niniejszej pracy opisujemy procedury badania zmian w ekspresji genów indukowanej fagocytozą z wykorzystaniem podejścia opartego na genach reporterowych lucyferazy, stosując system Dual-GloTM Luciferase Assay System firmy Promega.

Badanie biogenezy błon za pomocą testu z genem reporterowym opartym na lucyferazie

Zegary okołodobowe funkcjonują w obrębie poszczególnych komórek, tzn. są autonomiczne komórkowo. W niniejszej pracy opisujemy metody tworzenia autonomicznych komórkowo modeli zegara z wykorzystaniem nieinwazyjnej technologii bioluminescencji w czasie rzeczywistym opartej na lucyferazie. Komórki reporterowe stanowią praktyczne, funkcjonalne systemy modelowe do badania biologii okołodobowej.

Monitorowanie komórkowych autonomicznych rytmów okołodobowych ekspresji genów z wykorzystaniem reporterów bioluminescencyjnych lucyferazy

W tym filmie opisujemy metodę podkreślającą użyteczność testu bioluminescencyjnego do czułych i szybkich badań przesiewowych leków. Leki te mogą być testowane samodzielnie lub w połączeniu w celu oceny synergizmu w ich sposobie działania.

Test oparty na bioluminescencji komórkowej: wysokoprzepustowa metoda kombinatorycznych badań przesiewowych leków

Film demonstruje test lucyferazy używany do ilościowego oznaczania białek znakowanych lucyferazy. W teście wykorzystuje zmodyfikowany enzym lucyferazy składający się z dużego fragmentu, który wiąże się z małym fragmentem, który jest sprzężony z interesującym białkiem. Związane podjednostki tworzą aktywny enzym, który w obecności substratu uwalnia sygnał luminescencyjny. Sygnał ten jest następnie oznaczany ilościowo za pomocą luminometru.

Test lucyferazy: wysokoprzepustowy test do pomiaru sygnałów luminescencyjnych przy użyciu zaprojektowanych bioreporterów opartych na systemie nanolucyferazy

Osiągnięcie zrozumienia procesów komórkowych na poziomie systemowym jest celem współczesnej biologii komórki. Opisujemy tutaj strategie multipleksowania reporterów lucyferazy różnych punktów końcowych funkcji komórkowych w celu zbadania funkcji genów przy użyciu bibliotek RNAi w skali genomu.

Multipleksowana platforma przesiewowa oparta na lucyferazie do badania transdukcji sygnału związanego z rakiem w hodowanych komórkach

Testy in vitro do pomiaru replikacji wirusa zostały znacznie ulepszone dzięki rozwojowi rekombinowanych wirusów RNA wyrażających lucyferazy lub inne enzymy zdolne do bioluminescencji. W tym miejscu szczegółowo opisujemy wysokoprzepustową linię badań przesiewowych, która łączy takie rekombinowane szczepy wirusów odry i chikungunya w celu wyizolowania leków przeciwwirusowych o szerokim spektrum działania z bibliotek chemicznych.

Wysokoprzepustowe badania przesiewowe w kierunku chemicznych inhibitorów wirusów RNA o szerokim spektrum działania

Ten artykuł przedstawia wysokoprzepustową metodę miareczkowania różnych wirusów RNA i DNA opartą na ekspresji lucyferazy przy użyciu automatycznych i ręcznych płynów.

Wysokoprzepustowe miareczkowanie rekombinowanych wirusów eksprymujących lucyferazy

Tutaj opisujemy komórkowy test genu reporterowego jako cenne narzędzie do badania bibliotek chemicznych pod kątem związków modulujących mechanizmy kontroli potranskrypcyjnej wywieranej przez 3' UTR.

Wysokoprzepustowe badania przesiewowe pod kątem chemicznych modulatorów genów regulowanych potranskrypcyjnie

Opracowano test czasu rzeczywistego o wysokiej przepustowości, aby jednocześnie zidentyfikować (1) środki przeciwdrobnoustrojowe penetrujące komórki eukariotyczne skierowane na wewnątrzkomórkowy patogen bakteryjny i (2) ocenić cytotoksyczność komórek eukariotycznych. Wariant tej samej technologii został następnie połączony z technologią cyfrowego dozowania, aby umożliwić łatwe badania w wysokiej rozdzielczości, zależności od dawki oraz dwu- i trójwymiarowej synergii.

Wysokowydajne testy w czasie rzeczywistym z podwójnym odczytem wewnątrzkomórkowej aktywności przeciwdrobnoustrojowej i cytotoksyczności komórek eukariotycznych

Prezentujemy w obecnym badaniu nowatorski test oparty na fluorescencji, wykorzystujący limfocyty pochodzące od transgenicznej myszy. Test ten nadaje się do wysokoprzepustowych badań przesiewowych (HTS) małych cząsteczek obdarzonych zdolnością hamowania lub promowania aktywacji limfocytów.

Test limfocytów oparty na fluorescencji, odpowiedni do wysokoprzepustowych badań przesiewowych małych cząsteczek

Aby zidentyfikować nowe regulatory czynników transkrypcyjnych, opracowaliśmy podejście do badania przesiewowego bibliotek RNAi lentiwirusowych lub retrowirusowych za pomocą testu reporterowego opartego na podwójnej lucyferazie. Takie podejście oferuje szybki i stosunkowo niedrogi sposób na przebadanie przesiewowe setek kandydatów w jednym eksperymencie.

Identyfikacja regulatorów czynników transkrypcyjnych za pomocą średnioprzepustowego badania przesiewowego bibliotek tablicowych i reportera opartego na podwójnej lucyferazie

Poznaj metodę wysokoprzepustowego badania przesiewowego do identyfikacji regulatorów transkrypcyjnych przy użyciu domowego testu lucyferazy o podwójnym blasku w komórkach 293T. Ta technika umożliwia szybkie generowanie danych funkcjonalnych dla tysięcy genów.

Wysokoprzepustowe funkcjonalne badania przesiewowe przy użyciu domowego testu lucyferazy o podwójnym blasku

Przeglądaj więcej filmów