Wysokoprzepustowe funkcjonalne badania przesiewowe przy użyciu domowego testu lucyferazy o podwójnym blasku

Ogólnym celem tej procedury jest identyfikacja regulatorów transkrypcji dowolnego genu będącego przedmiotem zainteresowania przy użyciu prostego protokołu transfekcji o wysokiej przepustowości i domowego testu lucyferazy o podwójnym blasku. Osiąga się to poprzez najpierw zaprojektowanie i sklonowanie unikalnego zestawu podwójnych plazmidów reporterowych lucyferazy. Plazmidy te są transfekowane na 2 9 3 limfocyty T w mikropłytce z plazmidami z biblioteki ekspresji DNA, tak że każda studzienka jest transfekowana plazmidem z jednej biblioteki.

Po 48 godzinach bada się aktywność lucyferazy świetlika, a następnie testuje się aktywność lucyferazy waniliowej. Ostatnim krokiem jest obliczenie współczynników aktywności lucyferazy świetlika do wanilii. Ostatecznie, względna indukcja interesującego genu w odpowiedzi na każdą bibliotekę.

Gen jest wnioskowany na podstawie stosunku aktywności świetlika do lucyferazy waniliowej w każdym dołku po normalizacji na płytce. Główną zaletą tej techniki w porównaniu z istniejącymi protokołami testów reporterowych jest jej zdolność do szybkiego generowania danych funkcjonalnych dla dużej liczby genów przy minimalnym nakładzie pracy i kosztów. Na jeden dzień przed transfekcją, wyznaczoną jako pierwszy dzień ekranu, 2 9 3 limfocyty T są umieszczane w 96.

Komórki studzienek są wymiarowane, liczone i ponownie zawieszane do stężenia 1,5 razy 10 do piątej komórki na mililitr. W DMEM zawierającym 14% FBS wlać komórki do sterylnego zbiornika. Umieść zbiornik z sześcioma przezroczystymi płytkami z dnem, 96 dołkami i pudełkiem końcówek do pipet filtracyjnych na pokładzie robota automatycznej obsługi cieczy.

Na każdą płytę biblioteczną, która ma być przesiewana, powinny być osadzone dwie płytki z komórkami. Dozować 100 mikrolitrów komórek do każdej studzienki każdej płytki, aby uzyskać gęstość 1,5 razy 10 do czwartej komórki na studzienkę. W ramach tego pokazu zostaną wyświetlone trzy tablice biblioteczne.

W związku z tym przygotowuje się sześć płytek z komórkami, odwirowuje płytki komórkowe pod ciśnieniem 50 razy G przez dwie minuty, używając niskich prędkości rampy, aby zapewnić równą gęstość komórek w każdym dołku. Ten obraz ilustruje, jak powinny wyglądać posiane komórki po odwirowaniu. Inkubuj komórki w temperaturze 37 stopni Celsjusza i 10% dwutlenku węgla przez noc.

Aby przygotować plazmidy reporterowe świetlika i wanilii, rozcieńczyć każdy z nich do pięciu nanogramów na mikrolitr w wodzie wolnej od endotoksyn w stożkowej probówce o pojemności 15 mililitrów. Połącz rozcieńczenia w stosunku pięć do trzech świetlików do plazmidu waniliowego objętościowo. Pipetować połączone plazmidy do każdej studzienki 96-dołkowej płytki, dozując 17 mikrolitrów na płytkę biblioteczną plus od dwóch do 10 mikrolitrów nadmiaru do każdej studzienki, komórki są transfekowane w drugim dniu ekranu.

Aby rozpocząć tę procedurę dla każdej płytki bibliotecznej, zmieszaj 107,5 mikrolitra defektu temperatury pokojowej z 4,3 mililitra pożywki wolnej od surowicy, rozcieńczeniem od jednego do 40 w probówce polistyrenowej inkubować przez pięć minut w temperaturze pokojowej, dozować 44 mikrolitry na płytkę biblioteczną do każdej studzienki 96-dołkowej płytki polistyrenowej z dnem. Umieść płytkę DNA biblioteki, rozcieńczoną płytkę z efektem opt, płytkę plazmidu reporterowego i pudełko końcówek do pipet na aspiracie pokładu robota. 17 mikrolitrów plazmidów reporterowych, 43 mikrolitry rozcieńczonego efektu opt i 26 mikrolitrów DNA biblioteki, wprowadzając pięciomikrolitrową szczelinę powietrzną między każdą aspiracją.

DNA biblioteki powinno być odsysane jako ostatnie, aby zapobiec zanieczyszczeniu krzyżowemu. Dozuj zawartość końcówek do nowej pokrywy z polistyrenem i dnem i odstaw na 20 minut, aby umożliwić utworzenie się lipidowych kompleksów DNA. W przypadku transektowania wielu płytek bibliotecznych wymień końcówki pipet i płytkę biblioteczną i powtórz czynność po 20 minutach, odkryj płytkę z mieszaniną DNA z efektem optycznym i umieść ją na pokładzie robota z dwiema płytkami po 2 9 3 limfocyty T za pomocą jednego pudełka końcówek do pipet.

Odessać 80 mikrolitrów mieszaniny DNA z efektem opt i powoli dozować 40 mikrolitrów na studzienkę na każdą płytkę komórek. Przykryj komórki po dodaniu mieszaniny DNA z efektem opt do komórek we wszystkich płytkach. Odwirować płytki w temperaturze 1 200 razy G przez 30 minut.

Umieść płytki z powrotem w inkubatorze i inkubuj komórki przez cztery do sześciu godzin. Podczas tej inkubacji przygotuj świeżą pożywkę, mieszając 12 mililitrów DMEM zawierającego 10% FBS i 10 mikrogramów na mililitr cyprofloksyny. Dla każdej transfekowanej płytki bibliotecznej wlej świeżą pożywkę do sterylnego zbiornika.

Następnie umieść na pokładzie robota dwa pudełka z końcówkami robota, pojedynczą płytkę z ogniwami, zbiornik zawierający świeże media i zbiornik na odpady. Następnie odessać 100 mikrolitrów pożywki z komórek i dozować do zbiornika na odpady, częściowo wypełnionego 70% etanolem. Za pomocą świeżych końcówek odessaj 100 mikrolitrów świeżej pożywki i powoli dozuj na komórki.

Umieść płytki z powrotem w inkubatorze na 48 godzin. Przeprowadzane są testy lucyferazy świetlika i wanilii. 48 godzin po transfekcji w czwartym dniu ekranu dla każdej płytki bibliotecznej, przygotuj osiem mililitrów trzech x buforu do testu świetlików i 12 mililitrów trzech x buforu do testu waniliowego z odpowiednich roztworów podstawowych, dozować 82 mikrolitry buforu do testu świetlików do każdej studzienki 96-dołkowej płytki z dnem w kształcie litery V dla każdej płytki bibliotecznej, która ma być oznaczona.

Podobnie, dozuj 122 mikrolitry buforu do oznaczania wanilii do każdej studzienki innej 96-dołkowej płytki z dnem w kształcie litery V. Dla każdej płytki, która ma być oznaczona, należy odłożyć na bok oba do oznaczania. Umieść pudełko końcówek do pipet, zbiornik na odpady i dwie płytki z komórkami transfekowanymi z tej samej płytki bibliotecznej na pokładzie robota, odessać 60 mikrolitrów pożywki z każdej płytki i wyrzucić do zbiornika na odpady częściowo wypełnionego płytkami pokrywowymi z 70% etanolu i odstawić na bok.

Następnie umieść dwa pudełka z końcówkami do pipet. Płytka z trzema x buforem testowym świetlików i zestawem płytek komórkowych na pokładzie robota. Odessać 40 mikrolitrów trzech x buforu do oznaczania świetlików i dodać go do pierwszej płytki komórek, dokładnie mieszając.

Przejście na nowe końcówki do pipet. Powtórz tę czynność dla drugiej płytki komórkowej. Umieść komórki w temperaturze pokojowej na 10 minut, aby zakończyć lizę.

Zapisuj luminescencję z każdej studzienki każdej płytki komórkowej na luminometrze, rejestrując przez jedną sekundę na studzienkę. Umieść płyty zwrotne na pokładzie robota. Umieść dwa pudełka końcówek do pipet, płytkę z trzema do testów i zestaw płytek komórkowych na pokładzie robota.

Odessać 60 mikrolitrów trzech x buforu do oznaczania wanilii i dodać go do pierwszej płytki komórek. Dokładnie wymieszać. Przejście na nowe pudełko końcówek do pipet.

Powtórz tę czynność dla drugiej płytki komórkowej. Zapisz luminescencję ze wszystkich płytek na luminometrze. Nagrywanie każdej studni przez jedną sekundę.

Typowe wartości lucyferazy dla pojedynczej połówki płytki są pokazane w tych tabelach. Stosunek luminescencji świetlika do odnowienia lub stosunek F dwa R dla każdej studzienki oblicza się, dzieląc liczbę sygnału świetlika przez liczbę uruchomionego sygnału odnowienia, a wyniki są pokazane w Panelu C. Panel D pokazuje wartość indukcji dla każdej studzienki obliczoną przez podzielenie stosunku F dwa R studzienki przez średni stosunek F dwa R płytki, z wyłączeniem najwyższych i najniższych 25% odwiertów. Wartości indukcji powinny być uśrednione z różnych powtórzeń dla pojedynczej transfekowanej płytki bibliotecznej.

A geny indukujące lub tłumiące alfa-synukleinę więcej niż trzykrotnie są uważane za trafienia. Zwróć uwagę na 32-krotny induktor w studzience H dwa w tym reprezentatywnym wyniku pokazanym tutaj jest graficznym przedstawieniem wartości indukcji dla pojedynczej płytki z dołkiem H dwa podświetlonym na niebiesko. Hi.H dwa jest neuronalnym czynnikiem transkrypcyjnym, który nie był wcześniej związany z ekspresją alfa synukleiny.

Ważne jest, aby sprawdzić, czy badanie przesiewowe jest wykonywane w liniowym zakresie testów reporterowych, tak aby klony, które powodują zwiększoną ekspresję, były mierzone, ponieważ zwiększona aktywność lucyferazy do tego celu komórki były transfekowane zwiększającymi się ilościami plazmidów lucyferazy świetlikowej i waniliowej pod kontrolą silnego promotora i testu H-C-M-V-I-E. Dzięki temu protokołowi zaobserwowano, że aktywność świetlików pozostaje liniowa w szerokim zakresie wartości. Podczas gdy krzywa aktywności wanilii spłaszcza się powyżej 15 nanogramów na studzienkę.

Ważne jest również, aby wykonać testy niezwłocznie po etapie inkubacji, aby uniknąć nieliniowości spowodowanej wyczerpaniem substratu. Sygnał przebiegu rozpadu w czasie dla testu lucyferazy świetlików ujawnił znaczącą aktywność lucyferazy świetlika do jednej godziny po dodaniu odczynników przy użyciu tego protokołu, przebadano 7 670 ludzkich genów i ostatecznie zidentyfikowano 68 nowych regulatorów alfa synukleiny w reprezentatywnych wynikach pokazanych tutaj. Każda linia pozioma reprezentuje stosunek indukcji pojedynczego trafienia genu w porównaniu z kontrolowanym induktorem neutralnym GFP.

Niebieskie linie reprezentują dodatnie induktory, podczas gdy jedyna czerwona linia reprezentuje supresor, wartości indukcji są obliczane jako stosunek promotora alfa synukleiny napędzającego aktywność lucyferazy świetlika do promotora CMV napędzającego aktywność lucyferazy każdego trafienia znormalizowanego do tego samego testu konstruktów lucyferazy za pomocą induktora GFP Postępując zgodnie z tą procedurą. Inne metody, takie jak ilościowy PCR w połączeniu z dalszymi testami nadekspresji i knockdown, mogą być wykonywane w celu zapewnienia, że zidentyfikowane trafienia regulują cel endogenny.