Name: Generowanie wysokiej jakości matrycy DNA do immunoprecypitacji chromatyny do sekwencjonowania wysokoprzepustowego (ChIP-seq) (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-04-19T13:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 52 s
Description: Naucz się przygotowywać wysokiej jakości matrycę DNA do ChIP-seq w celu identyfikacji regionów wiązania białek z chromatyną. Ta metoda pozwala badać interakcje białko-DNA w liniach komórkowych.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Praca jest wspierana przez Institute Development Award od The Children's Hospital of Philadelphia.

1. Chromatyna sieciowana
<ol>
 <li>Hoduj komórki w szalkach do hodowli komórkowych o wymiarach 100x20mm. Ilość komórek może wynosić od 1 do 10 milionów komórek na naczynie, w zależności od typu komórki. Do jednej immunoprecypitacji wystarcza około 2 miliony komórek.</li>
 <li>Usieciuj komórki w 1% formaldehydzie przez 10 minut w temperaturze pokojowej z okazjonalnym kołysaniem.</li>
 <li>Utwardzać sieciowanie, dodając końcowe stężenie 125 mM glicyny i inkubować przez 5 minut w temperaturze pokojowej.</li>
 <li>Umyj komórki dwukrotnie 1X solą fizjologiczną buforowaną fosforanami (PBS), zdekantuj PBS, a następnie dodaj 0,2 ml PBS.</li>
 <li>Zbierz komórki za pomocą plastikowego skrobaka do probówki mikrowirówkowej.</li>
 <li>Wirować komory z prędkością 2 000 obr./min przez 5 minut w temperaturze 4 °C.</li>
 <li>Odessać supernatant. Ponownie zawieś komórki w buforze SDS Lysis (1% SDS, 10mM EDTA, 50mM Tris-HCl pH 8,1) dla lizatu całych komórek lub zachowaj je jako osad do ekstrakcji jądrowej.</li>
 <li>Komórki można zapisać w temperaturze -80 °C lub natychmiast przystąpić do sonikacji.</li>
</ol>
2. Przygotowanie jąder (przejdź do kroku 3.5 dla lizatu całych komórek)
<ol>
 <li>Uzupełnij bufor do lizy komórek (5 mM PIPES pH 8,0, 85 mM KCl, 0,5% NP-40) z 1X inhibitorem proteinazy w każdym eksperymencie.</li>
 <li>Ponownie zawiesić rozmrożone osady komórkowe w około 10-krotności objętości osadu za pomocą buforu do lizy komórek.</li>
 <li>Odbić i homogenizować 10 razy tłuczkiem, a następnie inkubować na lodzie przez 10 minut.</li>
 <li>Odwirować próbkę z prędkością 4 000 obr./min przez 5 minut w temperaturze 4 °C, odrzucić supernatant i zachować pastylkę jądrową.</li>
</ol>
3. Sonikacja*
<ol>
 <li>Rozgrzej bufor do lizy SDS i uzupełnij ilość buforu do użycia z inhibitorem proteinazy.</li>
 <li>Ponownie zawiesić pastylkę jądrową w buforze do lizy SDS (około 0,5 ml buforu na 1-10 milionów komórek)</li>
 <li>Inkubować na lodzie przez 10 minut.</li>
 <li>Dodać 0,5 ml porcji próbek do probówek do mikrowirówek.</li>
 <li>Sonikuj na mokrym lodzie za pomocą sonikatora Misonix z 30 sekundami włączenia i 45 sekund wyłączenia przy ustawieniu amplitudy 2. Liczbę cykli dla idealnej wielkości fragmentu można określić, wypróbowując najpierw różne numery cykli (np. 2, 4, 8, 12, 16 i 20 lub więcej cykli). Można użyć innego marki sonikatora, jednak warunki będą się różnić. Należy przeprowadzić eksperymenty z liczbą cykli i ilością czasu włączania i wyłączania, aby określić idealne warunki.</li>
 <li>Zebrać 20 μl każdej próbki w celu sprawdzenia wyników sonikacji i przeprowadzenia oceny ilościowej. Pozostała część próbki może być przechowywana w temperaturze -80 °C.</li>
 <li>Rozcieńczyć 20 μl próbki, dodając 30 μl 0,1X buforu TE.</li>
 <li>Badać próbkę 1 μl RNazy A w temperaturze 37 °C przez 1 godzinę, następnie dodać 1 μl proteinazy K i inkubować w temperaturze 62 °C przez 2 godziny.</li>
 <li>Umieścić 20 μl próbki na 2% żelu agarozowym.</li>
 <li>Oczyść pozostałą ilość próbki za pomocą zestawu do oczyszczania QIAquick PCR, a następnie określ ilościowo za pomocą spektrofotometru NanoDrop.</li>
</ol>
*Dla natywnego ChIP, trawienie nukleazy mikrokokowej może być stosowane alternatywnie do ścinania DNA.
4. Blok Koralików Agarozowych*
<ol>
 <li>Jeśli koraliki są już zablokowane, przejdź do kroku 5.1.</li>
 <li>Użyj białka A lub białka G agarozy. Dla 5 immunoprecypitacji (IP) użyj 600 μl 50% zawiesiny perełkowej (300 μl granulki kulek)</li>
 <li>Aby umyć kulki, odwiruj je z prędkością 800 obr./min przez 1 minutę w temperaturze 4 °C i wyrzuć supernatant. Dodaj nieco ponad 2 ml buforu rozcieńczającego ChIP (0,01% SDS, 1,2 mM EDTA, 167 mM NaCl, 1,1% Triton X-100, 16,7 mM Tris-HCl pH 8,1) i wymieszaj, powoli odwracając probówkę 10X. Odwirować ponownie z prędkością 800 obr./min przez 1 minutę w temperaturze 4 °C i odrzucić supernatant. Powtórz pranie jeszcze 2 razy.</li>
 <li>Blokować kulki, obracając je w temperaturze 4 °C przez noc w roztworze blokującym. Patrz Tabela 1, aby zapoznać się z recepturą roztworu blokującego.</li>
</ol>
5. Chromatyna wstępnie oczyszczona
<ol>
 <li>Rozmrozić sonikowaną chromatynę na lodzie.</li>
 <li>Wirować z prędkością 12 000 obr./min przez 10 minut w temperaturze 4 °C, a następnie od razu położyć na lodzie, aby usunąć SDS (biały granulek).</li>
 <li>Zebrać supernatant, wyrzucić osad i w razie potrzeby połączyć próbki.</li>
 <li>Wyjmij ilości potrzebne do eksperymentu na podstawie obliczeń (1-10 ug chromatyny na IP).</li>
 <li>Rozcieńczyć chromatynę 10X w buforze rozcieńczającym ChIP uzupełnionym inhibitorem proteinazy.</li>
 <li>Dodaj 100 μl zablokowanych kulek na IP.</li>
 <li>Obracać w temperaturze 4 °C przez 1 godzinę.</li>
</ol>
6. Immunoprecypitacja
<ol>
 <li>Odwirowywać próbki z prędkością 800 obr./min przez 1 minutę i przenieść supernatant do świeżej probówki.</li>
 <li>Odwiruj supernatant z prędkością 800 obr./min przez 1 minutę i przenieś do innej czystej probówki.</li>
 <li>Zachować 20 μl supernatantu, który służy jako kontrola wejściowa, w temperaturze -20 °C.</li>
 <li>Podwielokrotnić chromatynę do liczby IP, które mają być wykonane w eksperymencie.</li>
 <li>Dodać 2 g przeciwciała na 1-10 ug chromatyny do każdej próbki.</li>
 <li>Inkubować przez noc w temperaturze 4 °C z rotacją.</li>
 <li>Dodać 100 μl zablokowanych kulek do każdej próbki IP.</li>
 <li>Inkubować przez 1 godzinę w temperaturze 4 °C z rotacją.</li>
 <li>Granuluj kulki, obracając je z prędkością 800 obr./min przez 1 minutę i wyrzuć jak najwięcej supernatantu.</li>
 <li>Umyj koraliki raz za pomocą buforu myjącego Low Salt Immune Complex. Dodać 1 ml buforu do każdej probówki; obracać w temperaturze pokojowej przez 5-8 minut; Wirować z prędkością 800 obr./min przez 1 minutę, a następnie wyrzucić supernatant. Powtórzyć mycie raz z buforem do płukania High Salt Immune Complex i buforem do płukania LiCl Immune Complex oraz dwa razy z buforem TE, co daje w sumie 5 płukań (Tabela 2).</li>
</ol>
7. Elucja
<ol>
 <li>Rozmrozić próbki wejściowe z poprzedniego dnia, które mają być przetworzone z eluantami.</li>
 <li>Sprawić, by bufor elucyjny był świeży (Tabela 3).</li>
 <li>Przygotuj główną mieszankę wystarczającej ilości buforu elucyjnego potrzebnego dla IP i wejściowych próbek kontrolnych oraz 1-2 dodatkowych próbek.</li>
 <li>Dodać 100 μl buforu elucyjnego do każdej próbki IP i inkubować w temperaturze pokojowej przez 15 minut z rotacją.</li>
 <li>Wirować z prędkością 800 obr./min przez 1 minutę i dodać supernatant do świeżej probówki.</li>
 <li>Dodać kolejne 100 μl buforu elucyjnego do każdej probówki kulek i inkubować w temperaturze pokojowej przez 15 minut z rotacją.</li>
 <li>Wirować przez 15 sekund po inkubacji; wirować z prędkością 5 000 obr./min przez 1 minutę, a następnie połączyć supernatant z supernatantem z pierwszej elucji. (Upewnij się, że w supernatantach nie pozostały żadne kulki. Jeśli nie masz pewności, ponownie odkręć supernatant z prędkością 5,000 obr./min przez 1 minutę i zbierz supernatant do nowej probówki.</li>
 <li>Dodać 180 μl buforu elucyjnego do 20 μl wejściowych próbek kontrolnych.</li>
</ol>
8. Odwrotne usieciowanie krzyżowe
<ol>
 <li>Do 200 μl eluantów i kontrolnych danych wejściowych dodać 8 μl 5 M NaCl.</li>
 <li>Uszczelnić probówki parafilmem i inkubować w łaźni wodnej w temperaturze 65 °C przez noc.</li>
</ol>
9. Oczyszczanie DNA
<ol>
 <li>Każdą próbkę należy traktować 1 μl RNazy A przez 1 godzinę w temperaturze 37 °C.</li>
 <li>Dodać 4 μl 0,5 M EDTA, 8 μl 1M Tris-HCl, wymieszać, a następnie dodać 1 μl proteinazy K do każdej próbki i inkubować w temperaturze 45 °C przez 2 godziny.</li>
 <li>Oczyść próbki za pomocą zestawu do oczyszczania QIAquick PCR. Próbki można zapisać w temperaturze -20 °C, a kontrolę PCR można przeprowadzić w późniejszym terminie.</li>
</ol>
*Alternatywnie, zamiast agarozy można użyć kulek magnetycznych klasy ChIP do części immunoprecypitacyjnej.
10. Kontrola PCR
<ol>
 <li>Do kontroli PCR użyj starterów dla regionów, o których wiadomo, że są związane przez białko będące przedmiotem zainteresowania. Należy również stosować startery dla regionów niewiążących jako kontrole ujemne.</li>
 <li>Wymieszać odczynniki do reakcji. Rozcieńczyć próbkę wejściową w stosunku 1:100 (Tabela 3).</li>
 <li>Uruchom reakcję. Program PCR:</li>
</ol>
Krok 1: 94 °C 3 min
Krok 2: 94 °C 20 sek 
59 °C 30 sek 
72 °C 30 sek 
(Powtórz krok 2 przez co najmniej 30 cykli)
Krok 3: 72 °C 2 min
<ol start="4">
 <li>Uruchom próbki na 1% żelu agarozowym.</li>
 <li>Wzbogacenie można również określić ilościowo za pomocą PCR w czasie rzeczywistym.</li>
</ol>

<ol><li>Odom, D. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Control+of+pancreas+and+liver+gene+expression+by+HNF+transcription+factors%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Control of pancreas and liver gene expression by HNF transcription factors.</a> Science. 303, 1378-1381 (2004).</li>
<li>Johnson, D. S., Mortazavi, A., Myers, R. M., Wold, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genome-wide+mapping+of+in+vivo+protein-DNA+interactions%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Genome-wide mapping of in vivo protein-DNA interactions.</a> Science. 316, 1497-1502 (2007).</li>
<li>Robertson, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genome-wide+profiles+of+STAT1+DNA+association+using+chromatin+immunoprecipitation+and+massively+parallel+sequencing%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">Genome-wide profiles of STAT1 DNA association using chromatin immunoprecipitation and massively parallel sequencing.</a> Nature Methods. 4, 651-657 (2007).</li>
<li>Reich, N. C., Liu, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tracking+STAT+nuclear+traffic%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Rev.+Immunol%22%5BJournal%5D)">Tracking STAT nuclear traffic.</a> Nat. Rev. Immunol. 6, 602-612 (2006).</li>
<li>Lodige, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nuclear+export+determines+the+cytokine+sensitivity+of+STAT+transcription+factors%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Nuclear export determines the cytokine sensitivity of STAT transcription factors.</a> The Journal of Biological Chemistry. 280, 43087-43099 (2005).</li>
<li>Schroder, K., Sweet, M. J., Hume, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Signal+integration+between+IFNgamma+and+TLR+signalling+pathways+in+macrophages%5BTitle%5D)+AND+%22Immunobiology%22%5BJournal%5D)">Signal integration between IFNgamma and TLR signalling pathways in macrophages.</a> Immunobiology. 211, 511-524 (2006).</li>
<li>Vinkemeier, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Getting+the+message+across%2C+STAT%21+Design+principles+of+a+molecular+signaling+circuit%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Getting the message across, STAT! Design principles of a molecular signaling circuit.</a> The Journal of Cell Biology. 167, 197-201 (2004).</li>
<li>Brierley, M. M., Fish, E. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stats%3A+multifaceted+regulators+of+transcription%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Interferon+Cytokine+Res%22%5BJournal%5D)">Stats: multifaceted regulators of transcription.</a> J. Interferon Cytokine Res. 25, 733-744 (2005).</li>
<li>Bentley, D. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Whole-genome+re-sequencing%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Opinion+in+Genetics+%26+Development%22%5BJournal%5D)">Whole-genome re-sequencing.</a> Current Opinion in Genetics & Development. 16, 545-552 (2006).</li>
<li>Grant, S. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Variant+of+transcription+factor+7-like+2+%28TCF7L2%29+gene+confers+risk+of+type+2+diabetes%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Genetics%22%5BJournal%5D)">Variant of transcription factor 7-like 2 (TCF7L2) gene confers risk of type 2 diabetes.</a> Nature Genetics. 38, 320-323 (2006).</li>
<li>Sladek, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+genome-wide+association+study+identifies+novel+risk+loci+for+type+2+diabetes%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">A genome-wide association study identifies novel risk loci for type 2 diabetes.</a> Nature. 445, 881-885 (2007).</li>
<li><a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Wellcome+Trust+Case+Control+Consortium.+Genome-wide+association+study+of+14%2C000+cases+of+seven+common+diseases+and+3%2C000+shared+controls%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Wellcome Trust Case Control Consortium. Genome-wide association study of 14,000 cases of seven common diseases and 3,000 shared controls.</a> Nature. 447, 661-678 (2007).</li>
<li>Saxena, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genome-wide+association+analysis+identifies+loci+for+type+2+diabetes+and+triglyceride+levels%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Genome-wide association analysis identifies loci for type 2 diabetes and triglyceride levels.</a> Science. 316, 1331-1336 (2007).</li>
<li>Zeggini, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Replication+of+genome-wide+association+signals+in+UK+samples+reveals+risk+loci+for+type+2+diabetes%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Replication of genome-wide association signals in UK samples reveals risk loci for type 2 diabetes.</a> Science. 316, 1336-1341 (2007).</li>
<li>Scott, L. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+genome-wide+association+study+of+type+2+diabetes+in+Finns+detects+multiple+susceptibility+variants%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">A genome-wide association study of type 2 diabetes in Finns detects multiple susceptibility variants.</a> Science. 316, 1341-1345 (2007).</li>
<li>Steinthorsdottir, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+variant+in+CDKAL1+influences+insulin+response+and+risk+of+type+2+diabetes%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Genetics%22%5BJournal%5D)">A variant in CDKAL1 influences insulin response and risk of type 2 diabetes.</a> Nature Genetics. 39, 770-775 (2007).</li>
<li>Salonen, J. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Type+2+Diabetes+Whole-Genome+Association+Study+in+Four+Populations%3A+The+DiaGen+Consortium%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Human+Genetics%22%5BJournal%5D)">Type 2 Diabetes Whole-Genome Association Study in Four Populations: The DiaGen Consortium.</a> American Journal of Human Genetics. 81, 338-345 (2007).</li>
<li>Zeggini, E., McCarthy, M. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((TCF7L2%3A+the+biggest+story+in+diabetes+genetics+since+HLA%5BTitle%5D)+AND+%22Diabetologia%22%5BJournal%5D)">TCF7L2: the biggest story in diabetes genetics since HLA.</a> Diabetologia. 50, 1-4 (2007).</li>
<li>Weedon, M. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+importance+of+TCF7L2%5BTitle%5D)+AND+%22Diabet.+Med%22%5BJournal%5D)">The importance of TCF7L2.</a> Diabet. Med. 24, 1062-1066 (2007).</li>
<li>Hattersley, A. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Prime+suspect%3A+the+TCF7L2+gene+and+type+2+diabetes+risk%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Clinical+Investigation%22%5BJournal%5D)">Prime suspect: the TCF7L2 gene and type 2 diabetes risk.</a> The Journal of Clinical Investigation. 117, 2077-2079 (2007).</li>
<li>Yochum, G. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Serial+analysis+of+chromatin+occupancy+identifies+beta-catenin+target+genes+in+colorectal+carcinoma+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Serial analysis of chromatin occupancy identifies beta-catenin target genes in colorectal carcinoma cells.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 104, 3324-3329 (2007).</li>
<li>Duval, A., Busson-Leconiat, M., Berger, R., Hamelin, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Assignment+of+the+TCF-4+gene+%28TCF7L2%29+to+human+chromosome+band+10q25.3%5BTitle%5D)+AND+%22Cytogenet.+Cell+Genet%22%5BJournal%5D)">Assignment of the TCF-4 gene (TCF7L2) to human chromosome band 10q25.3.</a> Cytogenet. Cell Genet. 88, 264-265 (2000).</li>
<li>Pomerantz, M. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+8q24+cancer+risk+variant+rs6983267+shows+long-range+interaction+with+MYC+in+colorectal+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Genetics%22%5BJournal%5D)">The 8q24 cancer risk variant rs6983267 shows long-range interaction with MYC in colorectal cancer.</a> Nature Genetics. 41, 882-884 (2009).</li>
<li>Tuupanen, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+common+colorectal+cancer+predisposition+SNP+rs6983267+at+chromosome+8q24+confers+potential+to+enhanced+Wnt+signaling%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Genetics%22%5BJournal%5D)">The common colorectal cancer predisposition SNP rs6983267 at chromosome 8q24 confers potential to enhanced Wnt signaling.</a> Nature Genetics. 41, 885-890 (2009).</li>
<li>Zhao, J., Schug, J., Li, M., Kaestner, K. H., Grant, S. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Disease-associated+loci+are+significantly+over-represented+among+genes+bound+by+transcription+factor+7-like+2+%28TCF7L2%29+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Diabetologia%22%5BJournal%5D)">Disease-associated loci are significantly over-represented among genes bound by transcription factor 7-like 2 (TCF7L2) in vivo.</a> Diabetologia. 53, 2340-2346 (2010).</li>
<li>Benjamini, Y., Yekutieli, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantitative+trait+Loci+analysis+using+the+false+discovery+rate%5BTitle%5D)+AND+%22Genetics%22%5BJournal%5D)">Quantitative trait Loci analysis using the false discovery rate.</a> Genetics. 171, 783-790 (2005).</li>
</ol>

Autorzy oświadczają, że nie mają konkurencyjnych interesów finansowych.

Obecnie możliwe jest przeprowadzenie całego genomu profilu asocjacji interakcji białko-DNA przy użyciu ChIP-seq, jak to niedawno wykazano w przypadku innych czynników transkrypcyjnych2,3. Kluczem do pomyślnego wyniku sekwencjonowania jest wygenerowanie wysokiej jakości matrycy DNA do immunoprecypitacji chromatyny.
Po wygenerowaniu matrycy DNA i upewnieniu się, że jest ona odpowiednio wzbogacona, można ją następnie wykorzystać w bibliotece do późniejszego sekwencjonowania. Na przykła...

Przez wiele lat istniała niezaspokojona potrzeba identyfikacji zestawu genów związanych i regulowanych przez dany genom białka, w szczególności tych z klasy czynników transkrypcyjnych.
Odom et al.W badaniu 1 zastosowano immunoprecypitację chromatyny (ChIP) w połączeniu z mikromacierzami promotorów w celu systematycznej identyfikacji genów zajmowanych przez wcześniej określone regulatory transkrypcji w ludzkiej wątrobie i wyspach trzustkowych. Następnie Johnson i wsp.W ramach projektu 2 opracowano zakrojony na szeroką skalę test immunoprecypitacji chromatyny oparty na bezpośrednim sekwencjonowaniu DNA o ultraprzepustowości (ChIP-seq) w celu kompleksowego mapowania interakcji białko-DNA w całych genomach ssaków. W ramach testu zmapowali in vivo wiązanie czynnika tłumika ograniczającego neurony (NRSF) z lokalizacjami w 1946 roku w ludzkim genomie. Dane wykazały wyraźną rozdzielczość pozycji wiązania (+50 par zasad), co ułatwiło zarówno izolację motywów, jak i identyfikację motywów wiążących NRSF. Te dane ChIP-seq miały również wysoką czułość i swoistość oraz pewność statystyczną (P < 10−4), właściwości, które są ważne dla wnioskowania o nowych interakcjach kandydujących.
Robertson et al.W ramach projektu 3 wykorzystano również ChIP-seq w celu mapowania celów STAT1 w stymulowanych interferonem γ (IFN-γ) i niestymulowanych ludzkich komórkach HeLa S3 in vivo. Za pomocą ChIP-seq, wykorzystując 15,1 i 12,9 miliona unikalnie zmapowanych odczytów sekwencji oraz szacowany wskaźnik fałszywych odkryć mniejszy niż 0,001, zidentyfikowali 41 582 i 11 004 przypuszczalne regiony wiążące STAT1 odpowiednio w komórkach stymulowanych i niestymulowanych. Spośród 34 loci, o których wiadomo, że zawierają miejsca wiązania reagujące na interferon STAT14-8, ChIP-seq znalazł 24 (71%). Cele ChIP-seq zostały wzbogacone w sekwencje podobne do znanych motywów wiązania STAT1. Porównania z dwoma istniejącymi zestawami danych ChIP-PCR sugerowały, że czułość ChIP-seq wynosiła od 70% do 92%, a swoistość wynosiła co najmniej 95%. Ponadto było jasne, że ChIP-seq oferuje zarówno niską złożoność analityczną, jak i czułość, która wzrasta wraz z głębokością sekwencjonowania.
W związku z tym, technologie sekwencjonowania genomu "nowej generacji" zapewniają 1-2 rzędy wielkości wzrost ilości sekwencji, która może być efektywnie generowana w porównaniu ze starszymi technologiami9. Metody ChIP-seq zapewniają zatem bezpośrednie pokrycie całego genomu w celu skutecznego profilowania interakcji białko-DNA ssaków3.
W 2006 roku odkryto silne powiązanie wariantów genu czynnika transkrypcyjnego 7-like 2 (TCF7L2) z cukrzycą typu 210. Inni badacze już niezależnie powtórzyli to odkrycie w różnych grupach etnicznych i, co ciekawe, z pierwszych badań asocjacyjnych całego genomu cukrzycy typu 2 opublikowanych w Nature11,12, Science13-15 i gdzie indziej16,17, najsilniejszy związek był rzeczywiście z TCF7L2; Jest to obecnie uważane za najważniejsze odkrycie genetyczne w cukrzycy typu 2 dotej pory w wieku 18-20 lat. Ponadto TCF7L2 został powiązany z ryzykiem zachorowania na raka 21,22; w rzeczywistości związek ten stał się bardziej oczywisty, gdy okazało się, że locus 8q24 ujawniony w badaniach asocjacyjnych całego genomu wielu nowotworów, w tym raka jelita grubego, jest spowodowany ekstremalnym elementem wiążącym TCF7L2 napędzającym transkrypcję MYC23,24. W związku z tym istnieje duże zainteresowanie określeniem dalszych genów regulowanych przez ten kluczowy czynnik transkrypcyjny.
Opierając się na doświadczeniach z TCF7L2 jako przykładem metodologii, ten artykuł opisuje, jak wygenerować wysokiej jakości szablon DNA ChIP. Badanie ChIP przeprowadzono na linii komórkowej raka jelita grubego, HCT116, w celu późniejszego sekwencjonowania w celu zbudowania mapy o wysokiej rozdzielczości genów związanych przez TCF7L225 w celu uzyskania dalszych informacji na temat jego kluczowej roli w patogenezie złożonych cech.

<table><tbody><tr><td>Zestaw do oczyszczania QIAquick PCR</td><td>Qiagen</td><td>28104</td><td></td></tr><tr><td>Zestaw EZ-ChIP </td><td>Millipore</td><td>17-371</td><td></td></tr><tr><td>GoTaq Gorący start Polimeraza </td><td>Promega</td><td>M5001</td><td></td></tr><tr><td>Misonix Sonicator</td><td>Qsonica</td><td>XL-2000</td><td></td></tr><tr><td> NanoDrop 1000 Spektrofotometr </td><td>Thermo-Scientific</td><td></td><td></td></tr><tr><td colspan="4"><silne>Sekwencje starterów kontroli pozytywnej (TCF7L2-1) Forward- 5'-TCGCCCTGTCAATAATCTCC-3' Reverse- 5'-GCTCACCTCCTGTATCTTCG-3' Sekwencje starterów kontroli ujemnej (CTRL-1) Forward-5'-ATGTGGTGTCTCTGATGGGAAC-3' Reverse- 5'-CGAGCAATCGGTAAATAGGTCTGG-3'</td></tr></tbody></table>

generowanie wysokiej jakości matrycy dna do immunoprecypitacji chromatyny do sekwencjonowania wysokoprzepustowego (chip-seq)

Generation of High Quality Chromatin Immunoprecipitation DNA Template for High-throughput Sequencing (ChIP-seq)

Metody sekwencjonowania ChIP (ChIP-seq) bezpośrednio oferują pokrycie całego genomu, gdzie połączenie immunoprecypitacji chromatyny (ChIP) i sekwencjonowania masowo równoległego może być wykorzystane do identyfikacji repertuaru sekwencji DNA ssaków związanych czynnikami transkrypcyjnymi in vivo. Technologie sekwencjonowania genomu "nowej generacji" zapewniają 1-2 rzędy wielkości wzrost ilości sekwencji, którą można wygenerować w sposób opłacalny, w porównaniu ze starszymi technologiami, umożliwiając w ten sposób metodom ChIP-seq bezpośrednie pokrycie całego genomu w celu skutecznego profilowania interakcji białko-DNA ssaków.
Aby metody ChIP-seq były skuteczne, należy wygenerować wysokiej jakości szablon DNA ChIP, aby uzyskać najlepsze wyniki sekwencjonowania. Opis opiera się na doświadczeniach z produktem białkowym genu najsilniej zaangażowanego w patogenezę cukrzycy typu 2, a mianowicie czynnikiem transkrypcyjnym czynnika transkrypcyjnego 7-podobnego 2 (TCF7L2). Czynnik ten jest również związany z różnymi nowotworami.
Przedstawiono sposób generowania wysokiej jakości matrycy DNA ChIP pochodzącej z linii komórkowej raka jelita grubego, HCT116, w celu zbudowania mapy o wysokiej rozdzielczości poprzez sekwencjonowanie w celu określenia genów związanych przez TCF7L2, co daje dalszy wgląd w jego kluczową rolę w patogenezie złożonych cech.

Po sonikacji chromatyny i potraktowaniu jej RNazą oraz proteinazą, próbki poddane elektroforezie na 2% żelu agarozowym powinny wykazać rozmazanie z większością DNA w pożądanym zakresie wielkości. W przypadku przetestowania kilku różnych cykli, wraz ze wzrostem ich liczby powinno być widoczne stopniowe zmniejszenie wielkości fragmentów (Rysunek 2).
Po zakończeniu części protokołu dotyczącej immunoprecypitacji, wzbogacenie można sprawdzić za pomocą PCR lub PCR w czasie rzeczywis...

Połączenie immunoprecypitacji chromatyny i sekwencjonowania ultra-wysokoprzepustowego (ChIP-seq) może zidentyfikować i zmapować interakcje białko-DNA w danej tkance lub linii komórkowej. Przedstawiono sposób generowania wysokiej jakości szablonu ChIP do późniejszego sekwencjonowania, na przykładzie doświadczenia z czynnikiem transkrypcyjnym TCF7L2.

Generowanie wysokiej jakości matrycy DNA do immunoprecypitacji chromatyny do sekwencjonowania wysokoprzepustowego (ChIP-seq)

ChIP-sequencing (ChIP-seq) methods directly  offer whole-genome coverage, where combining chromatin immunoprecipitation  (ChIP) and massively parallel ...

Ogólnym celem tej procedury jest identyfikacja regionów wiązania białek w chromatynie. Osiąga się to najpierw poprzez sieciowanie białka z DNA. Drugim krokiem jest fragmentacja DNA.Następnie białko docelowe związane z DNA jest immunoprecypitowane, a następnie eluowane. Ostatnim krokiem jest odwrócenie sieciowania i wyizolowanie DNA. Ostatecznie immunoprecypitacja chromatyny jest wykorzystywana do wykazania lokalizacji wiązania białek w obrębie genomu.Metoda ta może pomóc w uzyskaniu odpowiedzi na kluczowe pytania w dziedzinie genomiki funkcjonalnej, takie jak identyfikacja i mapowanie oddziaływań białko-DNA w danej tkance lub linii komórkowej. Komórki do tej procedury hoduje się w szalkach hodowlanych o wymiarach 100 na 20 mm. Liczba komórek może wynosić od 1 do 10 milionów komórek na szalkę, w zależności od typu komórek. Około 2 milionów komórek jest wystarczające do przeprowadzenia jednej immunoprecypitacji w celu sieciowania białek i chromatyny w komórkach.Dodać formaldehyd do stężenia 1% i inkubować przez 10 minut w temperaturze pokojowej, okazjonalnie kołysząc naczyniem. Przerwać sieciowanie poprzez dodanie glicyny do stężenia końcowego 125 millimolar i inkubowanie przez pięć minut. W temperaturze pokojowej przemyć komórki dwukrotnie roztworem one x phosphate buffered saline. Po drugim przemyciu odlać PBS i dodać 0,2 milliliters świeżego PBS. Zebrać komórki za pomocą plastikowego skrobaka do probówki do mikrocentryfugi. Odwirować komórki przy 2000 RPM przez pięć minut w temperaturze czterech stopni Celsius.Odssać nadsącz do ekstrakcji jądrowej. Pozostawić komórki w formie osadu do przygotowania lizatu całych komórek, co zostanie zaprezentowane w następnej części. Zawiesić ponownie komórki w buforze lizującym SDS; lizaty całych komórek przygotowuje się z usieciowanych komórek poprzez sonikację na wilgotnym lodzie.Aby uzyskać optymalną wielkość fragmentów DNA, należy zoptymalizować tę procedurę, testując różne warunki sonikacji. Próbki muszą pozostawać w lodzie przez cały czas trwania procedury. Sonikuj każdą próbkę przy następujących ustawieniach: 30 sekund pracy i 45 sekund przerwy, przy amplitudzie ustawionej na dwa.W tym przykładzie do uzyskania idealnej wielkości fragmentu wymaganych jest 12 cykli. Należy pobrać 20 µL każdej próbki w celu sprawdzenia wyników sonikacji oraz do kwantyfikacji. Pozostałą część próbki można przechowywać w temperaturze -80 °C.Rozcieńcz 20 µL próbki, dodając 30 µL buforu 0,1 XTE. Następnie potraktuj próbkę jednym µL RNAs A w temperaturze 37 °C przez jedną godzinę. Następnie dodaj jeden µL proteinazy K i inkubuj w temperaturze 62 °C przez dwie godziny.Po traktowaniu proteinazą K nanieś 20 µL próbki na żel agarozowy 2%. Próbki powinny wykazać rozmycie (smear), przy czym większość DNA powinna znajdować się w pożądanym zakresie wielkości. W przypadku testowania kilku różnych cykli powinno być widoczne stopniowe zmniejszanie się wielkości fragmentów.Wraz ze wzrostem liczby cykli, pozostałą ilość próbki należy oczyścić za pomocą zestawu kaya quick PCR purification kit, a następnie określić jej ilość za pomocą spektrometru NanoDrop TER, aby rozpocząć tę procedurę. Próbki sonikowanej chromatyny Fava należy wirować na lodzie z prędkością 12 000 RPM przez 10 minut w temperaturze czterech stopni Celsjusza. Natychmiast umieścić na lodzie.Aby usunąć SDS, który występuje w postaci białego osadu, należy zebrać nadsącz i odrzucić osad z każdej próbki. W razie potrzeby należy połączyć próbki i odstawić ilości niezbędne do przeprowadzenia eksperymentu zgodnie z wcześniejszymi obliczeniami.Do jednej immunoprecypitacji wymagane jest od 1 do 10 µg chromatyny. Rozcieńczyć chromatynę w stosunku od 1:1 do 1:10 w buforze do rozcieńczania uzupełnionym inhibitorem proteaz. Dodać 100 µL zablokowanych kuleczek protein A/G na każdą immunoprecypitację i inkubować przy obrotach w temperaturze 4 °C przez jedną godzinę.Rozpocznij procedurę immunoprecypitacji chromatyny, wirowując próbki z prędkością 800 RPM przez jedną minutę w temperaturze 4 °C, a następnie przenosząc każdą nadsączkę do nowej probówki. Odwiruj nadsączkę z prędkością 800 RPM przez jedną minutę i przenieś ją do kolejnej czystej probówki. Odstaw 20 µL nadsączki w temperaturze -20 °C, aby służyła jako kontrola wejściowa (input).Następnie podziel pozostałą chromatynę na aliquoty zgodnie z liczbą immunoprecypitacji wymaganych w eksperymencie. Do każdej próbki dodaj 2 µg przeciwciała na 1-10 µg chromatyny i inkubuj przez noc w temperaturze 4 °C w rotacji. Następnego ranka do każdej próbki do immunoprecypitacji dodaj 100 µL zablokowanych kulek Protein A/G. Inkubuj przez jedną godzinę w temperaturze 4 °C w rotacji.Odwirować kuleczki przy 800 RPM przez jedną minutę, aby uzyskać osad. Odpić jak największą ilość supernatantu. Przemyć kuleczki.Przy użyciu buforu do przemywania kompleksów immunologicznych o niskim stężeniu soli, dodaj 1 mL buforu do każdej probówki. Inkubuj w rotacji w temperaturze pokojowej przez 5–8 minut, a następnie wiruj z prędkością 800 RPM przez 1 minutę i odlej nadsącz. Przemyj koraliki raz buforem do przemywania kompleksów immunologicznych o wysokim stężeniu soli, raz buforem do przemywania kompleksów immunologicznych z chlorkiem litu oraz dwukrotnie buforem TE, co daje łącznie pięć przemyć. Następnie przeprowadź elucję DNA z każdej próbki immunoprecypitacji, a także z próbek wejściowych.Aby odwrócić wiązania krzyżowe, należy dodać 8 µL 5 M NaCl do 200 µL każdego eluatu oraz kontroli wejściowej. Probiówki należy zamknąć Parafilmem i inkubować w kąpieli wodnej w temperaturze 65 °C przez noc. Następnego dnia każdą próbkę należy poddać działaniu 1 µL RNazy A przez jedną godzinę w temperaturze 37 °C.Po godzinie do każdej próbki należy dodać 4 µL 0,5 M EDTA oraz 8 µL 1 M tris HCL i wymieszać. Następnie dodać 1 µL proteinazy K i inkubować w temperaturze 45 °C przez dwie godziny. Próbki należy oczyścić przy użyciu zestawu kaya quick PCR purification kit.Próbki można przechowywać w temperaturze -20 °C do czasu przeprowadzenia analizy PCR. Wzbogacenie metodą immunoprecypitacji chromatyny można sprawdzić za pomocą PCR lub PCR w czasie rzeczywistym. W przypadku próbek PCR poddanych elektroforezie na żelu agarozowym, powinny pojawić się prążki w ścieżkach dla próbek wejściowych (input) i ChIP przy użyciu przeciwciała przeciwko białku docelowemu, którym w tym przypadku jest czynnik transkrypcyjny TCF7L2. W przeciwieństwie do tego, w ścieżce ujemnej kontroli IgG dla regionu wiązania pozytywnego nie powinno być nic lub co najwyżej bardzo słaby prążek.W przypadku ujemnego regionu wiązania powinna pojawić się bardzo słaba prążka lub brak prążka w ścieżkach kontroli IgG oraz chipa. W ścieżce wejściowej (input) powinna znajdować się prążka.Rysunek ten przedstawia wyniki z tych samych próbek przebadanych metodą real-time PCR. Podobnie jak w przypadku poprzedniego wyniku, powinno wystąpić znaczące wzbogacenie (fold enrichment) regionu wiązania pozytywnego dla próbki chip w stosunku do kontroli IgG.Dodatkowo, w regionie wiązania negatywnego powinno wystąpić bardzo niewielkie wzbogacenie lub całkowity jego brak. Po obejrzeniu tego filmu powinni Państwo posiadać gruntowną wiedzę na temat tego, jak sieciować białka wiążące z chromatyną w tkance lub linii komórkowej, co w praktyce oznacza wytrącanie docelowego białka, a następnie izolację DNA do dalszych analiz.

generation-high-quality-chromatin-immunoprecipitation-dna-template

Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

Generowanie wysokiej jakości szablonu DNA immunoprecypitacyjnego chromatyny do sekwencji wysokoprężnej (ChIP-seq)

Metoda Hi-C umożliwia bezstronną, genomową identyfikację oddziaływań chromatyny (1). Hi-C łączy ligację bliskościową z sekwencjonowaniem masowo równoległym. Wynikowe dane mogą być wykorzystane do badania architektury genomowej w wielu skalach: wstępne wyniki pozwoliły zidentyfikować takie cechy jak terytoria chromosomowe, segregacja chromatyny otwartej i zamkniętej oraz struktura chromatyny w skali megabazy.

Hi-C: Metoda badania trójwymiarowej architektury genomów.

W tym filmie demonstrujemy technikę immunoprecypitacji chromatyny w celu identyfikacji miejsc wiązania białek w określonych regionach genomowego DNA komórek prekursorowych oligodendrocytów poprzez selektywną immunoprecypitację fragmentów chromatyny związanych z białkiem. Metoda ta pomaga badać interakcje kilku białek regulatorowych, w tym czynników transkrypcyjnych zaangażowanych w regulację genów.

Immunoprecypitacja chromatyny w celu identyfikacji docelowych miejsc wiązania białek w genomowym DNA

Metody mapowania interakcji białko-DNA in vivo stają się kluczowe dla każdego aspektu badań genomicznych, ale są pracochłonne, kosztowne i czasochłonne. W artykule przedstawiono dostępny na rynku zrobotyzowany system obsługi cieczy, który automatyzuje immunoprecypitację chromatyny w celu mapowania in vivo interakcji białko-DNA z ograniczoną liczbą komórek.

Automatyzacja eksperymentów ChIP-seq w celu wygenerowania profili epigenetycznych na 10 000 komórek HeLa

Prezentujemy zmodyfikowaną metodologię sekwencjonowania immunoprecypitacji chromatyny natywnej (ChIP-seq) do generowania zestawów danych sekwencji odpowiednich dla struktury analitycznej gęstości nukleosomów ChIP-seq integrującej dostępność nukleazy mikrokokowej (MNazy) z pomiarami modyfikacji histonów.

Generowanie bibliotek sekwencjonowania immunoprecypitacji natywnej chromatyny do analizy gęstości nukleosomów

Tutaj opisujemy protokół immunoprecypitacji chromatyny (ChIP) i przygotowania biblioteki ChIP-seq do generowania globalnych profili epigenomicznych z próbek embrionalnych kurczaków o niskiej liczebności.

Protokół immunoprecypitacji chromatyny (ChIP) dla próbek embrionalnych o niskiej liczebności

Tutaj opisujemy zoptymalizowany protokół sekwencjonowania ChIP o wysokiej przepustowości oraz potok analiz obliczeniowych do określania wzorców stanu chromatyny w całym genomie z zamrożonych tkanek nowotworowych i linii komórkowych.

Zintegrowana platforma do mapowania stanów chromatyny w całym genomie przy użyciu wysokoprzepustowego sekwencjonowania ChIP w tkankach nowotworowych

Tutaj prezentujemy protokół, który jest przeznaczony do analizy całego genomu wiązania czynnika transkrypcyjnego oligodendrocytów 2 (Olig2) w ostro oczyszczonych komórkach prekursorowych oligodendrocytów mózgu (OPC) poprzez przeprowadzanie niskokomórkowej immunoprecypitacji chromatyny (ChIP), przygotowanie biblioteki, sekwencjonowanie wysokoprzepustowe i analizę danych bioinformatycznych.

Identyfikacja miejsc wiązania genomu czynnika transkrypcyjnego Olig2 w ostro oczyszczonych komórkach PDGFRα+ za pomocą analizy sekwencjonowania immunoprecypitacji chromatyny niskokomórkowej

Opisujemy krok po kroku protokół sekwencjonowania immunoprecypitacji chromatyny tandemowej (tChIP-Seq), który umożliwia analizę specyficznej dla typu komórki modyfikacji histonów w całym genomie.

TChIP-Seq: Profilowanie epigenomu specyficzne dla typu komórki

Tutaj opisujemy protokół efektywnej immunoprecypitacji chromatyny (ChIP), a następnie wysokoprzepustowego sekwencjonowania DNA (ChIP-seq) brunatnej tkanki tłuszczowej (BAT) wyizolowanej od myszy. Protokół ten nadaje się zarówno do mapowania modyfikacji histonów, jak i badania lokalizacji w całym genomie białek niehistonowych będących przedmiotem zainteresowania in vivo.

Immunoprecypitacja chromatyny mysiej brunatnej tkanki tłuszczowej

Ten artykuł opisuje półautomatyczny, mikroskalowany protokół ChIP-Seq regionów DNA związanych z specyficzną modyfikacją histonu (H3K27ac) przy użyciu platformy ChIP do obsługi cieczy, a następnie przygotowanie biblioteki za pomocą tagmentacji. Procedura obejmuje ocenę kontrolną pod względem jakościowym i ilościowym i może być dostosowana do innych modyfikacji histonów lub czynników transkrypcyjnych.

Półautomatyczna procedura ChIP-Seq do badań epigenetycznych na dużą skalę

Ten protokół opisuje metodę Capture Hi-C używaną do charakteryzowania organizacji 3D docelowych regionów genomowych o rozmiarach mega w wysokiej rozdzielczości, w tym granic topologicznie asojacujących domen (TADs) i interakcji chromatyny dalekiego zasięgu między regulatorowymi i innymi elementami sekwencji DNA.

Rozszyfrowywanie organizacji chromatyny 3D w wysokiej rozdzielczości za pomocą Capture Hi-C

Naucz się przygotowywać wysokiej jakości matrycę DNA do ChIP-seq w celu identyfikacji regionów wiązania białek z chromatyną. Ta metoda pozwala badać interakcje białko-DNA w liniach komórkowych.

Generowanie wysokiej jakości matrycy DNA do immunoprecypitacji chromatyny do sekwencjonowania wysokoprzepustowego (ChIP-seq)

Przeglądaj więcej filmów