Name: Oczyszczanie i profilowanie mikroRNA egzosomów pochodzących z krwi i pożywek hodowlanych (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-06-14T12:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 45 s
Description: Poznaj metodę oczyszczania egzosomów z krwi i pożywek hodowlanych oraz izolacji mikroRNA w celu ich identyfikacji i ilościowego oznaczania. Technika ta umożliwia badanie biomarkerów i potencjalnych zastosowań terapeutycznych.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

To badanie było wspierane przez fundusze z grantu Fundacji Rity Allen dla Seena Ajit. Autorzy pragną podziękować Eriki Balogh i dr Soumitrze Ghoshroy z Centrum Mikroskopii Elektronowej Uniwersytetu Południowej Karoliny za korzystanie z instrumentów, pomoc naukową i techniczną.

Wszystkie eksperymenty z użyciem próbek krwi od ludzi i gryzoni zostały przeprowadzone zgodnie ze wszystkimi odpowiednimi wytycznymi, przepisami i agencjami regulacyjnymi. Do badania włączono ludzi po wyrażeniu świadomej zgody, zatwierdzonej przez Instytucjonalną Komisję Rewizyjną Drexel University College of Medicine, a wszystkie procedury dotyczące badań przeprowadzanych na zwierzętach zostały zatwierdzone przez Instytucjonalną Komisję ds. Opieki nad Zwierzętami i Wykorzystania Zwierząt.
1. Oczyszczanie egzosomu z krwi (~5,5 godziny)
PORADY
<ul>
	<li class="jove_content">Ponownie zawieszamy egzosomy z jednej probówki krwi (~10 ml ludzkiej krwi i ~2 ml krwi myszy) w 300 μl buforze do lizy RNA z zestawu do izolacji miRNA mirVana.</li>
	<li class="jove_content">Aby oczyścić egzosomy z pożywki do hodowli komórkowych, pożywka jest wirowana z prędkością 500 x g przez 10 minut w celu usunięcia komórek, a następnie filtrowana przez filtr 0,22 μm po odwirowaniu przy 12 000 x g. Oczyszczanie egzosomów z pożywki do hodowli komórkowych nie wymaga rozcieńczania w PBS, płukania PBS ani drugiego etapu ultrawirowania.</li>
	<li class="jove_content">Jeśli oczyszczone egzosomy będą używane do badań proteomicznych, dodanie etapu wirowania gradientu sacharozy po etapie ultrawirowania zmniejszy ilość agregatów białkowych i zanieczyszczeń 15.</li>
	<li class="jove_content">Obserwowana morfologia egzosomów może się różnić w zależności od zarówno źródła, jak i etapów przetwarzania TEM. Nie zaobserwowaliśmy morfologii w kształcie miseczki dla egzosomów, która wcześniej była przypisywana różnicom w przetwarzaniu próbek 9,15. Nasze obrazy TEM, w tym znakowanie immunozłotem, są podobne do poprzednich doniesień z różnych źródeł, w tym egzosomów pochodzących z krwi, dróg żółciowych i kory mózgowej 9,16,17.</li>
</ul>
<ol>
	<li>Odwróć 5x rurkę pokrytą EDTA zawierającą krew i umieść pionowo w temperaturze pokojowej na 10-60 minut.</li>
	<li>Wirować przy 2 000 x g przez 15 minut w temperaturze 4 °C.</li>
	<li>Zebrać wierzchnią warstwę, osocze, w probówkach o pojemności 15 ml i trzymać na lodzie.</li>
	<li>Rozcieńczyć płyn o równej objętości PBS. Wirować 30 minut przy 2.000 x g w temperaturze 4 °C.</li>
	<li>Przenieść do probówek wirówkowych, dodać 1X PBS do całkowitej objętości 24 ml i odwirować 45 minut przy 12 000 x g w temperaturze 4 °C.</li>
	<li>Przenieść do probówek ultrawirówek i odwirować przez 2 godziny przy 110 000 x g w temperaturze 4 °C.</li>
	<li>Zawiesić osad w PBS i odwirować przez 1 godzinę przy 100 000 x g w temperaturze 4 °C.</li>
	<li>Zawiesić osad w odpowiednim buforze (bufor do lizy RNA).</li>
	<li>Zawiesić w buforze PBS lub RIPA odpowiednio do mikroskopii elektronowej i analizy western blot.</li>
</ol>
2. Oczyszczanie RNA za pomocą zmodyfikowanego zestawu do izolacji miRNA mirVana (~1 godz.)
PORADY
<ul>
	<li class="jove_content">Przygotuj obszar do izolacji RNA, nosząc środki ochrony osobistej (PPE), przecierając powierzchnie i pipety RNase Zap, oraz używając sterylnych końcówek i probówek filtrujących.</li>
	<li class="jove_content">Chociaż protokół od dostawcy daje możliwość oczyszczenia tylko miRNA, zawsze izolujemy całkowite RNA, w tym mRNA i miRNA, abyśmy mogli badać oba z tej samej próbki.</li>
	<li class="jove_content">Dodanie etapu leczenia DNazy na kolumnie usuwa ślady DNA, które mogą być obecne. W zależności od źródła egzosomów, doniesiono, że DNA jest nieobecne w egzosomach oczyszczonych z niektórych źródeł, w tym mysich i ludzkich linii komórek tucznych 8, ale chromosomalne sekwencje DNA wykryto w egzosomach oczyszczonych z pożywki hodowanych kardiomiocytów 18.</li>
	<li class="jove_content">Zmniejszyliśmy objętość roztworu myjącego 1 do 350 μl (Krok 2.4 poniżej), ponieważ sprzedawca dostarcza tylko tyle roztworu Wash 1 na jedno dodanie 700 μl. Jeśli objętość nie zostanie zmniejszona, nie pozostanie wystarczająca ilość roztworu do wykorzystania całej zawartości zestawu. Pozostałe kroki zostały wykonane zgodnie z zaleceniami producenta.</li>
</ul>
<ol>
	<li>Dodać 1/10 objętości dodatku homogenatu miRNA (30 μl) i inkubować na lodzie przez 10 minut.</li>
	<li>Ekstrakt o objętości kwas-fenol:chloroform równej początkowej objętości lizatu. Odwirować i odzyskać górną fazę w świeżej probówce.</li>
	<li>Dodać 1,25 objętości 100% etanolu (375 μl). Wir. Nakładać na wkład filtra i odwirowywać przez 15 sekund przy 10 000 x g.</li>
	<li>Dodać połowę zalecanej objętości roztworu miRNA Wash Solution 1 (350 μl) i odwirować przez 15 sekund przy 10 000 x g.</li>
	<li>Dodać 10 μl DNazy 1 do 70 μl buforu RDD (Qiagen) dla każdej próbki. Dodać 80 μl do kolumny i inkubować przez 15 minut w temperaturze pokojowej.</li>
	<li>Dodać roztwór płuczący 1 (350 μl) i odwirować przez 15 sekund przy 10 000 x g.</li>
	<li>Dodać roztwór płuczący 2/3 (500 μl) i odwirować przez 15 sekund przy 10 000 x g. POWTÓRZYĆ.</li>
	<li>Eluować za pomocą 40 μl 95 °C, wolnego od nukleazH2O.</li>
	<li>Oznaczyć stężenie RNA i rozcieńczyć RNA do 100 ng/μl.</li>
</ol>
3. Profilowanie miRNA egzosomów z krwi za pomocą kart TLDA (Taqman Low Density Array) (~6,5 godziny)
PORADY
<ul>
	<li class="jove_content">Przygotuj obszar do izolacji RNA, nosząc środki ochrony osobistej, przecierając powierzchnie i pipety RNase Zap, oraz używając sterylnych końcówek i probówek filtrujących.</li>
	<li class="jove_content">Etap pre-amplifikacji (pre-amp) jest zalecany dla 1-350 ng RNA (próbki 350-1,000 ng nie wymagają kroku pre-amp po syntezie cDNA). Ważne jest, aby określić, czy przedwzmacniacz jest niezbędny dla Twojej próbki, ponieważ wszystkie próbki muszą być traktowane w równych warunkach. Krok przedwzmacniacza zwiększa koszty, a wartości Ct mają dolną akceptowalną wartość odcięcia (32 zamiast 40).</li>
	<li class="jove_content">Przydatne jest przygotowanie reakcji cDNA w probówkach zamiast na płytce, w zależności od liczby kart, które można uruchomić w ciągu jednego dnia. Zminimalizuje to zamrażanie i rozmrażanie próbek cDNA, które nie zostaną przetworzone tego samego dnia.</li>
	<li class="jove_content">Egzosomy zebrane z różnych źródeł mają różne ilości RNA. Protokół ten pozwala na uzyskanie maksymalnie 3 μl matrycy RNA do reakcji syntezy cDNA. W zależności od źródła, ilość egzosomalnego RNA, którą można wyizolować, może być ograniczona. Podczas gdy typowa tkanka dałaby wystarczającą ilość RNA, aby cDNA zostało zbudowane ze 100 ng RNA w objętości 3 μl, egzosomy z ludzkiej krwi lub pożywki do hodowli komórek ludzkich często zawierają mniej RNA, a cDNA musi być wykonane z mniejszej ilości materiału wyjściowego. Egzosomy krwi myszy zawierają wyższe poziomy RNA i można uzyskać co najmniej 100 ng w 3 μl.</li>
</ul>
<ol>
	<li>Aby przygotować cDNA z oczyszczonego RNA przy użyciu starterów odwrotnej transkryptazy Megaplex Pools (grupa A i grupa B zawierają startery dla miRNA na kartach mikroprzepływowych Array A i B), rozmrozić składniki reakcji na lodzie.</li>
	<li>Oznacz dwie probówki o pojemności 1,5 ml bez RNaz do reakcji RT starterami z puli A lub starterami z puli B i dodaj składniki w kolejności wykresu. Dodać co najmniej jedną dodatkową objętość składników na 2 lub więcej reakcji lub przygotować mieszankę wzorcową zgodnie z zaleceniami dostawcy.</li>
</ol>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="zawsze">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Składnik reakcji RT</td>
			<td>Stężenie składników</td>
			<td>Objętość dla 1 próbki (całkowita V/próbka = 4,5 μl)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Woda wolna od nukleaz</td>
			<td> </td>
			<td>0,20 μl</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bufor Megaplex RT (10X)</td>
			<td>1X</td>
			<td>0,80 μl</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>dNTP (100 mM)</td>
			<td>4,4 mln</td>
			<td>0,20 μl</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MgCl2 (25 mM)</td>
			<td>5 mM</td>
			<td>0,90 μl</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Inhibitor RNazy (20U/μl)</td>
			<td>2 U</td>
			<td>0,10 μl</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Podkłady Megaplex RT A lub B (10X)</td>
			<td>1X</td>
			<td>0,80 μl</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Odwrotna transkryptaza MultiScribe</td>
			<td>75 U</td>
			<td>1,50 μl</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
<ol start="3">
	<li>Odwróć probówki 6 razy i krótko odwiruj. Następnie odpipetować 4,5 μl RT mieszać z 8-probówkowymi paskami MicroAmp lub 96-dołkową płytką reakcji optycznej MicroAmp.</li>
	<li>Dodać 100 ng RNA i dostosować objętość do 3 μl za pomocą wody uzdatnionej DEPC lub dodać 3 μl całkowitego RNA, wymieszać końcówką pipety i uszczelnić probówki lub płytkę. Krótko wirować i inkubować na lodzie przez 5 minut.</li>
	<li>Załaduj reakcję do maszyny PCR i uruchom ją w następujących warunkach (zgodnie z zaleceniami protokołu Applied Biosystems Megaplex Pools):</li>
</ol>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="zawsze">
	<tbody>
		<tr>
			<td>scena</td>
			<td>Najwyższa temp</td>
			<td>Godzina</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cykl (40x)</td>
			<td>16 °C</td>
			<td>Czas trwania: 2 min</td>
		</tr>
		<tr>
			<td> </td>
			<td>42 °C</td>
			<td>1 min</td>
		</tr>
		<tr>
			<td> </td>
			<td>50 °C</td>
			<td>1 sekund</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>trzymać</td>
			<td>85 °C</td>
			<td>Czas trwania: 5 min</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>trzymać</td>
			<td>4 °C</td>
			<td>∞</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
<ol start="6">
	<li>Przechowuj cDNA w temperaturze -20 °C (dobre przez co najmniej tydzień) lub kontynuuj etap pre-Amp, który może być przechowywany przez tydzień.</li>
	<li>Rozmrozić startery PreAmp dla puli A i grupy B na lodzie i odwrócić, aby wymieszać. Wiruj miks główny wzmacniacza Taqman Pre-Amp i utrzymuj go również na lodzie.</li>
	<li>Postępuj zgodnie z tabelą, dodając co najmniej jedną dodatkową objętość składników dla 2 lub więcej reakcji lub przygotuj mieszankę wzorcową zgodnie z zaleceniami dostawcy.</li>
</ol>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="zawsze">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Składnik reakcyjny przedwzmacniacza</td>
			<td>Objętość na 1 próbkę</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Woda wolna od nukleaz</td>
			<td>7,5 μl</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Taqman PreAmp Master Mix (2X)</td>
			<td>12,5 μl</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Megaplex PreAmp Primery A lub B (10X)</td>
			<td>2,5 μl</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
<ol start="9">
	<li>Odpipetować 2,5 μl produktu RT do 8-probówek MicroAmp lub 96-dołkowej płytki reakcji optycznej MicroAmp i dozować 22,5 μl mieszanki reakcyjnej PreAmp do każdej studzienki.</li>
	<li>Uszczelnij płytkę, inkubuj na lodzie przez 5 minut, a następnie załaduj próbkę do maszyny do PCR. Uruchom w następujących warunkach.</li>
</ol>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="zawsze">
	<tbody>
		<tr>
			<td>scena</td>
			<td>Najwyższa temp</td>
			<td>Godzina</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>trzymać</td>
			<td>95 °C</td>
			<td>Czas trwania: 10 min</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>trzymać</td>
			<td>55 °C</td>
			<td>Czas trwania: 2 min</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>trzymać</td>
			<td>72 °C</td>
			<td>Czas trwania: 2 min</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cykl (12x)</td>
			<td>95 °C</td>
			<td>15 sekund</td>
		</tr>
		<tr>
			<td> </td>
			<td>60 °C</td>
			<td>Czas trwania: 4 min</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>trzymać</td>
			<td>99.9 °C</td>
			<td>Czas trwania: 10 min</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>trzymać</td>
			<td>4 °C</td>
			<td>∞</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
<ol start="11">
	<li>Po zakończeniu reakcji przedwzmacniacza krótko odwirować probówki lub płytkę, a następnie dodać 75 μl 0,1X TE pH 8,0 do każdej studzienki lub probówki.</li>
	<li>Zamknij, wymieszaj i krótko odwiruj. Rozcieńczony produkt należy przechowywać przez tydzień w temperaturze -20 °C lub kontynuować ładowanie płytki.</li>
	<li>Połącz następujące elementy w probówce 1,5 ml na lodzie bez RNaz.</li>
</ol>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="zawsze">
	<tbody>
		<tr>
			<td>składnik</td>
			<td>Objętość na 1 kartę</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Taqman Uniwersalny PCR Master Mix, bez AmpErase UNG (2X)</td>
			<td>450 μl</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rozcieńczony produkt preAmp</td>
			<td>9 μl</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Woda wolna od nukleaz</td>
			<td>441 μl</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
<ol start="14">
	<li>Odwróć probówkę, aby wymieszać i krótko odwirować. Dozować 100 μl mieszanki reakcyjnej PCR do każdego portu karty Taqman MicroRNA Array.</li>
	<li>Odwirować kartę 2 x 1 000 x g przez 1 minutę. Zapieczętuj kartę i uruchom ją za pomocą szablonu dostarczonego ze starterami w instrukcji Applied Biosystems i 384-dołkowymi ustawieniami Taqman Low Density Array. Używamy systemu Applied Biosystems 7900HT Fast Real-Time PCR.</li>
</ol>
4. Analiza mRNA przez Taqmana (~1,5 godziny)
<ol>
	<li>Aby przygotować reakcję qPCR, należy wymieszać składniki reakcji w kolejności na wykresie. Wszystkie próbki zostaną przeanalizowane za pomocą sond starterowych dla interesującego nas genu, a także 18S rRNA jako genu normalizującego.</li>
</ol>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="zawsze">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Składnik reakcyjny Taqmana</td>
			<td>Objętość na 1 próbkę</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Woda wolna od nukleaz</td>
			<td>7 μl (dostosować na podstawie pojedynczej próbki)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Taqman Fast Master Mix (2X)</td>
			<td>10 μl</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sondy Taqman Primer (20x)</td>
			<td>1 μl</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>cDNA ze 100 ng RNA</td>
			<td>2 μl (dostosować na podstawie pojedynczej próbki)</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
<ol start="2">
	<li>Uruchom 96-dołkową płytkę za pomocą szybkiego bloku 96-dołkowego zgodnie z zaleceniami producenta (Applied Biosystems 7900HT Fast Real-Time PCR System).</li>
</ol>

<ol><li>Bartel, D. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MicroRNAs%3A+target+recognition+and+regulatory+functions%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">MicroRNAs: target recognition and regulatory functions.</a> Cell. 136, 215-233 (2009).</li>
<li>Mendell, J. T., Olson, E. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MicroRNAs+in+stress+signaling+and+human+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">MicroRNAs in stress signaling and human disease.</a> Cell. 148, 1172-1187 (2012).</li>
<li>Esteller, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Non-coding+RNAs+in+human+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+reviews.+Genetics%22%5BJournal%5D)">Non-coding RNAs in human disease.</a> Nature reviews. Genetics. 12, 861-874 (2011).</li>
<li>Mitchell, P. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Circulating+microRNAs+as+stable+blood-based+markers+for+cancer+detection%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Circulating microRNAs as stable blood-based markers for cancer detection.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 105, 10513-10518 (2008).</li>
<li>Chen, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+of+microRNAs+in+serum%3A+a+novel+class+of+biomarkers+for+diagnosis+of+cancer+and+other+diseases%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+research%22%5BJournal%5D)">Characterization of microRNAs in serum: a novel class of biomarkers for diagnosis of cancer and other diseases.</a> Cell research. 18, 997-1006 (2008).</li>
<li>Gilad, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Serum+microRNAs+are+promising+novel+biomarkers%5BTitle%5D)+AND+%22PloS+one%22%5BJournal%5D)">Serum microRNAs are promising novel biomarkers.</a> PloS one. 3, e3148(2008).</li>
<li>Mittelbrunn, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Unidirectional+transfer+of+microRNA-loaded+exosomes+from+T+cells+to+antigen-presenting+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Unidirectional transfer of microRNA-loaded exosomes from T cells to antigen-presenting cells.</a> Nature. 2, 282(2011).</li>
<li>Valadi, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Exosome-mediated+transfer+of+mRNAs+and+microRNAs+is+a+novel+mechanism+of+genetic+exchange+between+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Exosome-mediated transfer of mRNAs and microRNAs is a novel mechanism of genetic exchange between cells.</a> Nat Cell Biol. 9, 654-659 (2007).</li>
<li>Gyorgy, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Membrane+vesicles%2C+current+state-of-the-art%3A+emerging+role+of+extracellular+vesicles%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Mol+Life+Sci%22%5BJournal%5D)">Membrane vesicles, current state-of-the-art: emerging role of extracellular vesicles.</a> Cell Mol Life Sci. 68, 2667-2688 (2011).</li>
<li>Mathivanan, S., Ji, H., Simpson, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Exosomes%3A+extracellular+organelles+important+in+intercellular+communication%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Proteomics%22%5BJournal%5D)">Exosomes: extracellular organelles important in intercellular communication.</a> J. Proteomics. 73, 1907-1920 (2010).</li>
<li>Ramachandran, S., Palanisamy, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Horizontal+transfer+of+RNAs%3A+exosomes+as+mediators+of+intercellular+communication%5BTitle%5D)+AND+%22Wiley+Interdiscip+Rev.+RNA%22%5BJournal%5D)">Horizontal transfer of RNAs: exosomes as mediators of intercellular communication.</a> Wiley Interdiscip Rev. RNA. , (2011).</li>
<li>Record, M., Subra, C., Silvente-Poirot, S., Poirot, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Exosomes+as+intercellular+signalosomes+and+pharmacological+effectors%5BTitle%5D)+AND+%22Biochem+Pharmacol%22%5BJournal%5D)">Exosomes as intercellular signalosomes and pharmacological effectors.</a> Biochem Pharmacol. 81, 1171-1182 (2011).</li>
<li>Thery, C., Ostrowski, M., Segura, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Membrane+vesicles+as+conveyors+of+immune+responses%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Immunol%22%5BJournal%5D)">Membrane vesicles as conveyors of immune responses.</a> Nat Rev Immunol. 9, 581-593 (2009).</li>
<li>Ludwig, A. K., Giebel, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Exosomes%3A+small+vesicles+participating+in+intercellular+communication%5BTitle%5D)+AND+%22The+international+journal+of+biochemistry+%26+cell+biology%22%5BJournal%5D)">Exosomes: small vesicles participating in intercellular communication.</a> The international journal of biochemistry & cell biology. 44, 11-15 (2012).</li>
<li>Thery, C., Amigorena, S., Raposo, G., Clayton, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+and+characterization+of+exosomes+from+cell+culture+supernatants+and+biological+fluids%5BTitle%5D)+AND+%22Curr.+Protoc.+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Isolation and characterization of exosomes from cell culture supernatants and biological fluids.</a> Curr. Protoc. Cell Biol. Chapter 3, Unit 3 22(2006).</li>
<li>Masyuk, A. I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biliary+exosomes+influence+cholangiocyte+regulatory+mechanisms+and+proliferation+through+interaction+with+primary+cilia%5BTitle%5D)+AND+%22American+journal+of+physiology.+Gastrointestinal+and+liver+physiology%22%5BJournal%5D)">Biliary exosomes influence cholangiocyte regulatory mechanisms and proliferation through interaction with primary cilia.</a> American journal of physiology. Gastrointestinal and liver physiology. 299, G990-G999 (2010).</li>
<li>Fauré, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Exosomes+are+released+by+cultured+cortical+neurones%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+and+Cellular+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Exosomes are released by cultured cortical neurones.</a> Molecular and Cellular Neuroscience. 31, 642-648 (2006).</li>
<li>Waldenstrom, A., Genneback, N., Hellman, U., Ronquist, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cardiomyocyte+microvesicles+contain+DNA%2FRNA+and+convey+biological+messages+to+target+cells%5BTitle%5D)+AND+%22PloS+one%22%5BJournal%5D)">Cardiomyocyte microvesicles contain DNA/RNA and convey biological messages to target cells.</a> PloS one. 7, e34653(2012).</li>
<li>Simpson, R. J., Lim, J. W., Moritz, R. L., Mathivanan, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Exosomes%3A+proteomic+insights+and+diagnostic+potential%5BTitle%5D)+AND+%22Expert+Rev+Proteomics%22%5BJournal%5D)">Exosomes: proteomic insights and diagnostic potential.</a> Expert Rev Proteomics. 6, 267-283 (2009).</li>
<li>Turchinovich, A., Weiz, L., Langheinz, A., Burwinkel, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+of+extracellular+circulating+microRNA%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+acids+research%22%5BJournal%5D)">Characterization of extracellular circulating microRNA.</a> Nucleic acids research. 39, 7223-7233 (2011).</li>
<li>El-Andaloussi, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Exosome-mediated+delivery+of+siRNA+in+vitro+and+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Exosome-mediated delivery of siRNA in vitro and in vivo.</a> Nature. 7, 2112-2126 (2012).</li>
<li>Singh, P. P., Smith, V. L., Karakousis, P. C., Schorey, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Exosomes+isolated+from+mycobacteria-infected+mice+or+cultured+macrophages+can+recruit+and+activate+immune+cells+in+vitro+and+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Immunol%22%5BJournal%5D)">Exosomes isolated from mycobacteria-infected mice or cultured macrophages can recruit and activate immune cells in vitro and in vivo.</a> J. Immunol. 189, 777-785 (2012).</li>
<li>Etheridge, A., Lee, I., Hood, L., Galas, D., Wang, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Extracellular+microRNA%3A+A+new+source+of+biomarkers%5BTitle%5D)+AND+%22Mutat.+Res%22%5BJournal%5D)">Extracellular microRNA: A new source of biomarkers.</a> Mutat. Res. , (2011).</li>
<li>Stenvang, J., Silahtaroglu, A. N., Lindow, M., Elmen, J., Kauppinen, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+utility+of+LNA+in+microRNA-based+cancer+diagnostics+and+therapeutics%5BTitle%5D)+AND+%22Seminars+in+cancer+biology%22%5BJournal%5D)">The utility of LNA in microRNA-based cancer diagnostics and therapeutics.</a> Seminars in cancer biology. 18, 89-102 (2008).</li>
<li>Mathivanan, S., Fahner, C. J., Reid, G. E., Simpson, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((ExoCarta+2012%3A+database+of+exosomal+proteins%2C+RNA+and+lipids%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+acids+research%22%5BJournal%5D)">ExoCarta 2012: database of exosomal proteins, RNA and lipids.</a> Nucleic acids research. 40, D1241-D1244 (2012).</li>
</ol>

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

W tym protokole pokazujemy kwantyfikację miRNA i mRNA z egzosomów oczyszczonych przez wirowanie różnicowe z krwi i pożywek hodowlanych. Egzosomy mają różne składniki w zależności od ich pochodzenia i biorą udział w wielu funkcjach biologicznych, w tym w odpowiedzi immunologicznej, prezentacji antygenu, komunikacji wewnątrzkomórkowej oraz transferze RNA i białek 9,11,12,19,20. Podczas gdy rozmiar i kształt jest wyznacznikiem czystości egzosomów, szereg prac przedstawiających dane EM egzosomów wskazuje, że pęche...

Krótkie, niekodujące miRNA modulują ekspresję genów poprzez wiązanie się z docelowym mRNA. Komplementarność sekwencji zasiewu ~7 par zasad umożliwia miRNA wiązanie się z docelowym mRNA, co skutkuje zahamowaniem translacji lub zmniejszeniem stabilności mRNA, co może skutkować zmniejszoną ekspresją białka docelowego 1. Badania przeprowadzone w ciągu ostatniej dekady jednoznacznie dowiodły fundamentalnej roli miRNA w pośredniczeniu w funkcjach komórkowych. Podjęto również znaczne wysiłki w celu zbadania zmian molekularnych za pośrednictwem miRNA leżących u podstaw różnych chorób 2,3. Co więcej, niedawna identyfikacja stabilnych miRNA w płynach ustrojowych 4-6 utorowała drogę do ich wykorzystania jako nowych biomarkerów nadających się do diagnozy klinicznej.
Jednym ze sposobów transportu miRNA w płynach ustrojowych są egzosomy, małe pęcherzyki, które przenoszą mRNA, białka, mediatory lipidowe i miRNA do komórek biorcy poprzez ogólnoustrojowe krążenie krwi 7-14. Powoduje to modulację ekspresji genów w komórkach biorcy i stanowi nowy mechanizm komunikacji komórkowej. Na przykład komórki mogą modulować procesy immunoregulacyjne poprzez wydzielanie i / lub wchłanianie egzosomów zawierających biomolekuły biorące udział w zapaleniu, takie jak interleukina-1β (IL1β), czynnik martwicy nowotworu-α (TNFα), transformujący czynnik wzrostu-β5 (TGFβ5) oraz miRNA, które regulują te geny 13. Ponieważ nieprawidłowa ekspresja miRNA jest powszechną cechą w różnych chorobach człowieka, cząsteczki te oferują nowe, ekscytujące możliwości odkrywania i walidacji nowych celów terapeutycznych 2.
Krążące miRNA są obecne we wszystkich płynach ustrojowych i wiadomo, że skład egzosomów różni się w zależności od komórek źródłowych, z których zostały uwolnione. W ten sposób oferują one możliwość badania stanu fizjologicznego komórek i tego, jak komórki zmieniają zdarzenia sygnalizacyjne w odpowiedzi na stres, w tym choroby. Badanie zmian w składzie egzosomów może dostarczyć informacji na temat transdukcji sygnału i zbadać ich potencjalną przydatność jako biomarkerów lub dróg interwencji terapeutycznej.
Tutaj zademonstrujemy oczyszczanie egzosomów z wielu źródeł na podstawie opublikowanych protokołów. Te egzosomy zostaną wykorzystane do izolacji RNA, a następnie qPCR w celu identyfikacji i pomiaru poziomów miRNA obecnych w egzosomach.

<table><tbody><tr><td>Vacutainer powlekany EDTA (probówki 10 ml)</td><td>BD Diagnostics</td><td>366643</td><td>Do oczyszczania egzosomów z ludzkiej krwi</td></tr><tr><td>Vacutainer powlekany EDTA (probówki 2 ml)</td><td>BD Diagnostics</td><td>367841</td><td>Do oczyszczania egzosomów z krwi myszy</td></tr><tr><td>Probówka RNA krwi PAXgene</td><td>Diagnostyka BD 762165 Do</td><td></td><td>izolacji miRNA z całkowitej krwi</td></tr><tr><td>Zestaw do izolacji mikroRNA miRVana</td><td>Ambion</td><td>AM1561</td><td></td></tr><tr><td>Acid-Phenol: CHCl3</td><td>Ambion</td><td>9721G</td><td></td></tr><tr><td>DNaza 1</td><td>Qiagen</td><td>79254</td><td></td></tr><tr><td>TaqMan Universal PCR Master Mix, No AmpErase UNG</td><td>Applied Biosystems</td><td>4326614</td><td>Do kart TLDA</td></tr><tr><td>Megaplex RT Zestaw basenu dla gryzoni v3.0</td><td>Applied Biosystems</td><td>4444746</td><td></td></tr><tr><td>Megaplex preamp zestaw basenów dla gryzoni v3.0</td><td>Applied Biosystems</td><td></td><td></td>4444747</tr><tr><td>Zestaw mikroRNA A+B Taqman Array gryzoni V3.0</td><td>Applied Biosystems</td><td>4444909</td><td></td></tr><tr><td>Zestaw Megaplex RT Human Pool V3.0</td> Zestaw puli dla ludzi <td>Applied Biosystems</td><td>4444745</td><td></td></tr><tr><td>Megaplex Preamp v3.0</td><td>Applied Biosystems</td><td>4444748</td><td></td></tr><tr><td>Zestaw kart A + B Human MicroRNA Taqman Array v3.0</td><td>Applied Biosystems</td><td>4444913</td><td></td></tr><tr><td>Taqman Zestaw MicroRNA RT</td><td>Applied Biosystems</td><td>4366596</td><td></td></tr><tr><td>Taqman szybka uniwersalna mieszanka główna do PCR </td><td>Applied Biosystems</td><td>4366072</td><td>Do mRNA qRT-PCR</td></tr><tr><td>Czynnik martwicy nowotworu (sonda starterowa)</td><td>Applied Biosystems</td><td>Hs01113624_g1</td><td></td></tr><tr><td>Czynnik wzrostu śródbłonka naczyniowego A (sonda starterowa)</td><td>Applied Biosystems</td><td>Hs00900055_m1</td><td></td></tr><tr><td>Maxima Pierwsza nić cDNA Zestaw do syntezy dla RT-qPCR</td><td>Thermo Scientific</td><td>K1642</td><td>Do przeciwciała mRNA</td></tr><tr><td>HSP70</td><td>Abcam</td><td>ab94368</td><td>Do western blot</td></tr><tr><td>Anty-królik IgG-Gold</td><td>Sigma</td><td>G7402</td><td>Do mikroskopii elektronowej</td></tr><tr><td>Rabbit-anti CD81</td><td>Sigma</td><td>SAB3500454</td><td></td></tr><tr><td>Siatki węglowe o siatce niklu 300</td><td>Mikroskopia elektronowa Nauki</td><td>FCF300-Ni</td><td></td></tr><tr><td>Siatki węglowe miedziane 300 mesh</td><td>Mikroskopia elektronowa Nauki</td><td>FCF300-Cu</td><td></td></tr><tr><td colspan="4">Tabela 1. Tabela konkretnych odczynników.</td></tr></tbody></table>

oczyszczanie i profilowanie mikrorna egzosomów pochodzących z krwi i pożywek hodowlanych

Purification and microRNA Profiling of Exosomes Derived from Blood and Culture Media

Stabilne miRNA są obecne we wszystkich płynach ustrojowych, a niektóre krążące miRNA są chronione przed degradacją przez sekwestrację w małych pęcherzykach zwanych egzosomami. Egzosomy mogą łączyć się z błoną plazmatyczną, powodując transfer RNA i białek do komórki docelowej. Ich funkcje biologiczne obejmują odpowiedź immunologiczną, prezentację antygenu i komunikację wewnątrzkomórkową. Dostarczanie miRNA, które mogą regulować ekspresję genów w komórkach biorcy za pośrednictwem krwi, otworzyło nowe możliwości interwencji celowej. Oprócz oferowania strategii dostarczania leków lub środków terapeutycznych RNA, zawartość egzosomalna może służyć jako biomarkery, które mogą pomóc w diagnozie, określeniu opcji leczenia i rokowaniu.	Tutaj opiszemy procedurę ilościowej analizy miRNA i informacyjnych RNA (mRNA) z egzosomów wydzielanych we krwi i pożywkach do hodowli komórkowych. Oczyszczone egzosomy zostaną scharakteryzowane za pomocą analizy western blot dla markerów egzosomalnych i PCR dla interesujących mRNA. Transmisyjna mikroskopia elektronowa (TEM) i znakowanie immunozłotem zostaną wykorzystane do walidacji morfologii i integralności egzosomalnej. Całkowite RNA zostanie oczyszczone z tych egzosomów, aby zapewnić, że będziemy mogli badać zarówno mRNA, jak i miRNA z tej samej próbki. Po walidacji integralności RNA za pomocą bioanalizatora, przeprowadzimy ilościowy PCR w czasie rzeczywistym (qPCR) o średniej przepustowości w celu identyfikacji egzosomalnego miRNA za pomocą kart Taqman Low Density Array (TLDA) i badań ekspresji genów dla interesujących nas transkryptów.	
 Te protokoły mogą być używane do ilościowego określania zmian w egzosomalnych miRNA u pacjentów, modelach gryzoni i pożywkach do hodowli komórkowych przed i po interwencji farmakologicznej. Zawartość egzosomalna różni się ze względu na źródło pochodzenia i warunki fizjologiczne komórek wydzielających egzosomy. Różnice te mogą dostarczyć informacji na temat tego, jak komórki i systemy radzą sobie ze stresem lub zaburzeniami fizjologicznymi. Nasze reprezentatywne dane pokazują różnice w miRNA obecnych w egzosomach oczyszczonych z krwi myszy, krwi ludzkiej i pożywki do hodowli komórek ludzkich.	
 Tutaj opiszemy procedurę ilościowej analizy miRNA i informacyjnych RNA (mRNA) z egzosomów wydzielanych we krwi i pożywkach do hodowli komórkowych. Oczyszczone egzosomy zostaną scharakteryzowane za pomocą analizy western blot dla markerów egzosomalnych i PCR dla interesujących mRNA. Transmisyjna mikroskopia elektronowa (TEM) i znakowanie immunozłotem zostaną wykorzystane do walidacji morfologii i integralności egzosomalnej. Całkowite RNA zostanie oczyszczone z tych egzosomów, aby zapewnić, że będziemy mogli badać zarówno mRNA, jak i miRNA z tej samej próbki. Po walidacji integralności RNA za pomocą bioanalizatora, przeprowadzimy ilościowy PCR w czasie rzeczywistym (qPCR) o średniej przepustowości w celu identyfikacji egzosomalnego miRNA za pomocą kart Taqman Low Density Array (TLDA) i badań ekspresji genów dla interesujących nas transkryptów.
 Te protokoły mogą być używane do ilościowego określania zmian w egzosomalnych miRNA u pacjentów, modelach gryzoni i pożywkach do hodowli komórkowych przed i po interwencji farmakologicznej. Zawartość egzosomalna różni się ze względu na źródło pochodzenia i warunki fizjologiczne komórek wydzielających egzosomy. Różnice te mogą dostarczyć informacji na temat tego, jak komórki i systemy radzą sobie ze stresem lub zaburzeniami fizjologicznymi. Nasze reprezentatywne dane pokazują różnice w miRNA obecnych w egzosomach oczyszczonych z krwi myszy, krwi ludzkiej i pożywek do hodowli komórek ludzkich

Po wyizolowaniu egzosomów z krwi lub pośrodków hodowli komórkowej, czystość egzosomów można sprawdzić za pomocą mikroskopii elektronowej (EM) i western blot (Rysunki 1A i 1B). Potwierdziliśmy przygotowania egzosomów z różnych źródeł za pomocą EM i western blot, wykorzystując wiele przeciwciał. Rysunek 1A przedstawia obrazy EM potwierdzające, że egzosomy są nienaruszone, mają średnicę ~30 -100 nm i zawierają CD81, co wykazano poprzez znakowanie immunozłotem. Powszechnie s...

Obecność stabilnych mikroRNA (miRNA) w egzosomach wzbudziła ogromne zainteresowanie jako nowy sposób komunikacji międzykomórkowej, ze względu na ich potencjalną użyteczność jako biomarkery i jako droga do interwencji terapeutycznej. Tutaj demonstrujemy oczyszczanie egzosomów z krwi i pożywek hodowlanych, a następnie ilościowy PCR w celu identyfikacji transportowanych miRNA.

Oczyszczanie i profilowanie mikroRNA egzosomów pochodzących z krwi i pożywek hodowlanych

Stable miRNAs are present in all body fluids and some circulating miRNAs  are protected from degradation by sequestration in small vesicles called  ...

Ogólnym celem niniejszej procedury jest identyfikacja i oznaczanie ilościowe mikroRNA obecnych w egzosomach uzyskanych z krwi lub pożywek hodowli komórkowych. Jest to realizowane poprzez wstępne oczyszczanie egzosomów z krwi lub pożywek hodowli komórkowych przy użyciu wirowania różnicowego. Drugim krokiem jest izolacja całkowitego RNA egzosomalnego z wykorzystaniem zestawu do izolacji mikroRNA nirvana.Po potwierdzeniu integralności i stężenia oczyszczonego RNA, zostaje ono przekształcone w cDNA przy użyciu odczynników z zestawu do reakcji odwrotnej transkrypcji Megaplex. Następnie wykonuje się etap preamplifikacji z zastosowaniem starterów do preamplifikacji Megaplex oraz TaqMan preamp master mix. Aby amplifikować mikroRNA, w ostatnim kroku przeprowadza się reakcję Real-Time PCR z wykorzystaniem mikrofluidycznych kart z 384 dołkami lub kart TaqMan Low Density Array zawierających wysuszone sondy starterowe TaqMan.W rezultacie procedura ta umożliwi wykrycie do 758 znanych mikroRNA. Technika ta mierzy zmienność zawartości mikroRNA w egzosomach, która jest zależna od źródła oraz warunków fizjologicznych, w których są one wydzielane. Znaczenie ilościowego określania tych unikalnych sygn

purification-microrna-profiling-exosomes-derived-from-blood-culture

Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

Oczyszczanie i profilowanie microRNA eksosomów pochodzących z krwi i środowiska kulturalnego

Niniejsza praca przedstawia metody izolacji, oczyszczania i detekcji egzosomów, a także techniki analizy ich zawartości molekularnej. Metody te można dostosować do izolacji egzosomów zarówno z pożywek hodowli komórkowych, jak i z płynów biologicznych; poza analizą zawartości molekularnej mogą one być również przydatne w badaniach funkcjonalnych.

Izolacja i charakterystyka egzosomów zawierających RNA

Opisano techniki opisujące gradientową procedurę oddzielania egzosomów od cząsteczek ludzkiego wirusa niedoboru odporności (HIV). Procedura ta została wykorzystana do wyizolowania egzosomów z dala od cząstek HIV w ludzkim osoczu od osób zakażonych wirusem HIV. Wyizolowane egzosomy analizowano pod kątem zawartości cytokin/chemokin.

Izolacja egzosomów z osocza osób zakażonych wirusem HIV-1

Płyn żółciowy jest cennym źródłem pęcherzyków zewnątrzkomórkowych/egzosomów, które zawierają potencjalnie ważne biomarkery. Protokół ten stanowi solidną metodę izolowania egzosomów z ludzkiej żółci w celu dalszych analiz, w tym profilowania miRNA.

Izolacja i profilowanie egzosomów zawierających mikroRNA z ludzkiej żółci

MikroRNA odgrywają ważną rolę regulacyjną i stają się nowymi celami terapeutycznymi dla różnych chorób ludzkich. Wykazano, że miRNA są przenoszone w lipoproteinach o dużej gęstości. Opracowaliśmy uproszczoną metodę szybkiego izolowania oczyszczonego HDL nadającego się do analizy miRNA z ludzkiego osocza.

Szybka i uproszczona metoda wysokoprzepustowej izolacji miRNA z wysoko oczyszczonej lipoproteiny o wysokiej gęstości

Pęcherzyki zewnątrzkomórkowe obecne we krwi zostały zasugerowane jako nowe biomarkery różnych chorób. W tym miejscu przedstawiamy protokół izolacji dużych mikropęcherzyków pochodzących z błony plazmatycznej z próbek krwi obwodowej i ich późniejszej analizy za pomocą konwencjonalnej cytometrii przepływowej i Western Blotting.

Izolacja i charakterystyka mikropęcherzyków z krwi obwodowej

Tutaj prezentujemy protokół oczyszczania egzosomów zarówno z osocza, jak i surowicy z redukcją kooczyszczania nieegzosomalnych białek krwi. Zoptymalizowany protokół obejmuje ultrafiltrację, leczenie proteazą i chromatografię wykluczania wielkości. Ulepszone oczyszczanie egzosomów przynosi korzyści w dalszych analizach, w tym dokładniejszej kwantyfikacji pęcherzyków i charakterystyce proteomicznej.

Trawienie białek, ultrafiltracja i chromatografia wykluczania wielkości w celu optymalizacji izolacji egzosomów z ludzkiego osocza krwi i surowicy

Tutaj opisujemy dwa protokoły izolacji pęcherzyków zewnątrzkomórkowych, wirowanie ultrafiltracji i ultrawirowanie z wirowaniem gradientu gęstości, aby wyizolować pęcherzyki zewnątrzkomórkowe z próbek płynu z płukania oskrzelowo-pęcherzykowego myszy. Pęcherzyki zewnątrzkomórkowe pochodzące z mysiego płynu z płukania oskrzelowo-pęcherzykowego za pomocą obu metod są określane ilościowo i charakteryzowane.

Izolacja pęcherzyków zewnątrzkomórkowych z mysiego płynu płucnego z oskrzelowo-pęcherzykowego przy użyciu techniki wirowania ultrafiltracji

Ten protokół pokazuje, jak oczyszczać zewnątrzkomórkowe mikroRNA z pożywek do hodowli komórkowych w celu budowy małych bibliotek RNA i sekwencjonowania nowej generacji. Opisano różne punkty kontrolne kontroli jakości, aby umożliwić czytelnikom zrozumienie, czego można się spodziewać podczas pracy z próbkami o niskim poziomie wejściowym, takimi jak exRNA.

Izolowanie, sekwencjonowanie i analiza zewnątrzkomórkowych mikroRNA z ludzkich mezenchymalnych komórek macierzystych

Egzosom to nowa generacja nośników leków. Opracowaliśmy protokół izolacji egzosomów o wysokiej wydajności i czystości dostarczania siRNA. Otorbiliśmy również znakowane fluorescencyjnie niespecyficzne siRNA do egzosomów i zbadaliśmy wychwyt komórkowy egzosomów obciążonych siRNA w komórkach nowotworowych.

Przygotowanie egzosomów do dostarczania siRNA do komórek nowotworowych

Ten protokół ilustruje 1) izolację i hodowlę pierwotnych fibroblastów z mięśnia brzuchatego łydki dorosłej myszy, a także 2) oczyszczanie i charakterystykę egzosomów za pomocą różnicowej metody ultrawirowania w połączeniu z gradientami gęstości sacharozy, a następnie analizami western blot.

Izolacja i charakterystyka egzosomów z fibroblastów mięśni szkieletowych

Poznaj metodę oczyszczania egzosomów z krwi i pożywek hodowlanych oraz izolacji mikroRNA w celu ich identyfikacji i ilościowego oznaczania. Technika ta umożliwia badanie biomarkerów i potencjalnych zastosowań terapeutycznych.

Oczyszczanie i profilowanie mikroRNA egzosomów pochodzących z krwi i pożywek hodowlanych

Przeglądaj więcej filmów