Name: Protokół hodowli plastrów rdzenia kręgowego zarodków kurczaka (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-03-25T13:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 57 s
Description: Poznaj metodę hodowli plastrów zarodków kurczaka w celu badania rozwoju neuronów ruchowych rdzenia kręgowego. Protokół umożliwia utrzymanie prawidłowego rozwoju komórek nerwowych przez 24 godziny w kontrolowanych warunkach.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Chcielibyśmy podziękować Sharon Boast za wiele wnikliwych dyskusji oraz B. Novitch za uprzejmy dar przeciwciał dla Foxp1. Praca ta została sfinansowana ze stypendium Wellcome Trust dla KCT oraz grantu projektowego z Wellcome Trust dla SRP (numer referencyjny grantu 094399/B/10/Z).

1. Wprowadź wymagane rozwiązania
 <ol>
 <li>1 M bufor fosforanowy: Odważyć 109,4 g Na2HPO4 i 32 g NaH2PO4. H20, wymieszać i rozpuścić w wodzie do całkowitej objętości 1 litra.</li>
 <li>Sól fizjologiczna buforowana fosforanami (PBS): Przygotować 0,1 M bufor fosforanowy, 0,15 M NaCl. 100 ml PBS powinno wystarczyć do przetworzenia plastrów z 10 zarodków.</li>
 <li>Agaroza: Podgrzej roztwór PBS do około 70 °C i powoli dodawaj stałą agarozę o niskiej temperaturze topnienia, ciągle mieszając. Przygotować roztwór do końcowego stężenia 4% (w/v) agarozy. Zrób zapas 50 ml tego roztworu. Pozostawić ten roztwór w łaźni wodnej utrzymywanej w temperaturze 48 °C do czasu, gdy będzie on potrzebny. Każdy roztwór agarozy niewykorzystany po doświadczeniu może być przechowywany w temperaturze 4 °C przez kilka tygodni.</li>
 <li>Roztwór bloku przeciwciał: Dodać płodową surowicę cielęcą i tryton X-100 do końcowego stężenia 1% (v/v) płodowej surowicy cielęcej, 0,1% (v/v) Triton X-100 w PBS. 10 ml roztworu blokowego wystarczy do barwienia immunologicznego 5 szkiełek skrawków kriostatu.</li>
 <li>Utrwalacz: Przygotować 0,75 mm NaOH, 4% (w/v) paraformaldehydu (UWAGA). Aby przygotować niezbędne ciepło utrwalające ilość wody do 70 °C, dodać skoncentrowany NaOH do wymaganego stężenia końcowego, dodać stały paraformaldehyd i mieszać aż do rozpuszczenia. Schłodzić na lodzie do temperatury 4 °C. 10 ml tego roztworu wystarczy na 20 dołków z plastrami zarodków.</li>
 <li>Roztwór sacharozy: Przygotować 10 ml 30% (w/v) roztworu sacharozy zawierającego 0,1 M buforu fosforanowego. 10 ml tego roztworu wystarczy na 10 dołków plastrów zarodka.</li>
 <li>70% (v/v) etanolu. Rozcieńczyć 70 ml bezwzględnego etanolu w 30 ml wody.</li>
 <li>Pożywka hodowlana: Przygotować roztwór składający się z 1% ekstraktu z zarodków kurczaka, 1% penicyliny/streptomycyny, 0,35% L-glutaminy, 0,1% 2-merkaptoetanolu, 4% surowicy kurczaka, 2% suplementu witaminy B27 i 100 ng/ml rzęskowego neurotroficznego czynnika wzrostu (CNTF) rozcieńczonego w pożywce neuropodstawnej; przygotowanej na lodzie i użytej tego samego dnia. Na 20 dołków plastrów zarodków potrzeba 10 ml pożywki hodowlanej.</li>
 </ol>
 2. Przygotowanie zarodków piskląt
 <ol>
 <li>Zapłodnione jaja kurze należy umieścić najdłuższym bokiem poziomo w inkubatorze z wymuszonym ciągiem w temperaturze 38 °C, aż osiągną stadium15 24. Zwykle wymaga to około 4 dni inkubacji.</li>
 <li>W drugim dniu inkubacji wysterylizuj skorupkę jaja, przecierając ją bibułą nasączoną 70% etanolem. Ostrożnie przekłuć płaski koniec skorupki jaja za pomocą igły o rozmiarze 21 dołączonej do strzykawki o pojemności 5 ml i usunąć 5 ml albuminy. Powoduje to obniżenie zarodka z dala od skorupy, dzięki czemu zarodek nie ulega uszkodzeniu po otwarciu skorupy. Umieść jaja z powrotem w inkubatorze i wysiaduj je przez kolejne 2 dni.</li>
 <li>Za pomocą stępionych kleszczy dumont #5 ostrożnie przebij górną środkową część skorupy i usuń około 9cm2 skorupy. Przeciąć wokół zarodka i ostrożnie wyjąć zarodek i umieścić w HBSS podczas sekcji. Zarodki powinny być klasyfikowane według Hamburgera i Hamiltona (1992)15. Wszystkie wykorzystane zarodki powinny być w stadium zbliżonym do 24. Wszelkie zarodki, które wykazują jakiekolwiek oznaki nieprawidłowości, należy wyrzucić.</li>
 <li>Usuń błonę owodniową, błonę kosmówkowo-omocznikową, głowę i okrzewek za pomocą dwóch kleszczy Dumont #5. Wypatroszyć zarodek, aby usunąć wszystkie narządy wewnętrzne. Aby to zrobić, rozetnij brzuszną linię środkową zarodka za pomocą mikronożyczek preparujących, przytrzymaj zarodek wokół okolicy pnia rostralnego jedną parą kleszczy, chwyć rostralną część jelita i serca i pociągnij doogonowo. Ważne jest, aby odbywało się to czysto. Powinieneś być w stanie wyraźnie zobaczyć zarodki somitów. Przeciąć zarodek na pół, poprzecznie między zawiązkami kończyn górnych i dolnych. Teraz przytnij ścianę klatki piersiowej za pomocą nożyczek do mikrodysekcji.</li>
 </ol>
 3. Przygotowanie plastra zarodka
 <ol>
 <li>Usunąć roztwór agarozy z łaźni wodnej. Odetnij 5 cm od dna jednorazowej plastikowej pipety Pasteura o pojemności 3 ml.</li>
 <li>Delikatnie usuń lędźwiową połowę wypreparowanego zarodka za pomocą dwóch kleszczy, aby wyciągnąć zarodek z roztworu preparacyjnego i umieścić na suchej szalce Petriego. Za pomocą pipety Pasteura usuń około 2 ml agarozy, odpipetuj około 0,5 ml na wierzch zarodka, a następnie zassaj plasterek zarodka do pipety. Przenieś zarodek i agarozę do plastikowej formy do odklejania, uważając, aby nie wprowadzić żadnych pęcherzyków do agarozy. Delikatnie opuść zarodek na dno agarozy w plastikowej formie, z częścią piersiową skierowaną w dół. Zarodek należy ustawić tak, aby był prosty za pomocą igły o rozmiarze 21. Plastry będą również zawierały część rozwijającej się kończyny i ważne jest, aby orientacja zarodka w agarozie na to pozwoliła. Umieść łódź na lodzie, aby ustawić agarozę. Należy uważać, aby w tym okresie (około 2 min) zarodek nie zmienił orientacji.</li>
 <li>Wibratom Leica VT1000S (prędkość 3, częstotliwość 4, plastry o grubości 400 μm) powinien być ustawiony z komorą krojenia wypełnioną HBSS i otoczony lodowatą wodą. Blok agarozy jest następnie przyklejany do platformy wibratomu za pomocą super kleju. Blok agarozy przycina się żyletką, aby pozostawić kawałek zarodka z otaczającym go 1-3 mm agarozy. Wybiera się plastry, które zawierają sekcje pąków kończyn z wyraźnym wierzchołkowym rygorem ektodermalnym, a następnie umieszcza się je w HBSS. Ogólnie rzecz biorąc, na zarodek przypada tylko jeden do dwóch odpowiednich plasterków. Delikatnie usuń agarozę wokół plasterków tkanki za pomocą dwóch igieł. Ważne jest, aby zrobić to dokładnie i ostrożnie.</li>
 </ol>
 4. Hodowla plastrów zarodków
 <ol>
 <li>Dodać 500 ml roztworu hodowlanego (opisanego powyżej) do wymaganej liczby dołków 24-dołkowej płytki do hodowli tkankowej poddanej działaniu ultra niskiego przyłączenia. Ostrożnie przenieś plastry z roztworu HBSS do studzienki. Ogólnie rzecz biorąc, staramy się, aby w każdym dołku znajdowały się od dwóch do trzech plasterków. Umieścić 24-dołkową płytkę w inkubatorze do hodowli tkankowych w temperaturze 37 °C z 5% CO2 na 24 godziny.</li>
 </ol>
 5. Dzielenie plastrów na sekcje do barwienia immunologicznego
 <ol>
 <li>Po okresie hodowli dodać 500 μl niebuforowanego roztworu do każdego dołka z plastrów zarodków i pozostawić na lodzie na 20 minut. Cały roztwór jest następnie ostrożnie usuwany i przeprowadzane są trzy płukania PBS w odstępach 5-minutowych. Plastry pozostawia się następnie w roztworze sacharozy w temperaturze 4 °C, aż opadną, około 6 godzin, ale można je pozostawić na dłużej (np. na noc).</li>
 
<li>Usuń plastry i zetrzyj nadmiar roztworu sacharozy i zrównoważ w około 1 ml OCT przez około 5 minut w temperaturze 20 °C. Zamontuj każdy plasterek płasko w plastikowej foremce wypełnionej O.C.T. Po zamontowaniu umieść foremki pionowo na suchym lodzie do zastygnięcia.</li>
 
<li>Zamontuj bloki O.C.T. w kriostacie i równowaga w temperaturze -24 °C przez około 20 minut. Pokrój każdy plasterek za pomocą 15-milimetrowych odcinków zamontowanych na szkiełkach Superfrost-Plus. Szkiełka można przechowywać w temperaturze -80 °C do czasu, gdy będą potrzebne.</li>
 </ol>
 6. Immunofluorescencja
 <ol>
 <li>Pipetować 1-2 ml PBS na szkiełkach poziomych trzymanych w wilgotnej komorze z szkiełkami podniesionymi od spodu komory (używamy pipet plastikowych o pojemności 1 lub 2 ml przymocowanych taśmą autoklawową). Inkubować skrawki w PBS przez 5 minut w temperaturze 20 °C w celu usunięcia nadmiaru O.C.T. Usunąć roztwór PBS ze szkiełka i dodać 500 ml roztworu blokowego na skrawki, inkubować przez 30 minut w temperaturze 20 °C. Usunąć roztwór blokowy i natychmiast dodać 500 ml rozcieńczonego przeciwciała pierwszorzędowego dodanego do szkiełek, inkubować w temperaturze 4 °C przez 18-22 godzin.</li>
 <li>Usunąć roztwór przeciwciała pierwszorzędowego i natychmiast przemyć szkiełka 1 ml PBS przez 5 minut, trzykrotnie w temperaturze 20 °C w celu usunięcia nadmiaru roztworu przeciwciał pierwszorzędowych. Dodać 500 ml rozcieńczonego przeciwciała drugorzędowego na sekcje. Szkiełka pozostawia się w temperaturze 20 °C na 30 minut. Następnie usuwa się roztwór przeciwciała wtórnego i przemywa szkiełko 3 razy po 5 minut w PBS w temperaturze 20 °C.</li>
 <li>Po tych praniach usuń końcowe płukanie PBS, przetrzyj krawędź szkiełka, aby usunąć nadmiar PBS, dodaj dwie krople vectashield na szkiełka i delikatnie połóż szklane szkiełko nakrywkowe na sekcjach, unikając tworzenia się pęcherzyków. Nadmiar preparatu Vectashield należy usunąć z krawędzi szkiełek przed obrazowaniem.</li>
 </ol>
 7. Obrazowanie
 <ol>
 <li>Wyobraź sobie skrawki wybarwione immunologicznie. Używamy mikroskopu fluorescencyjnego Nikon Eclipse E80i wyposażonego w aparat cyfrowy Hamammatsu ORCA ER oraz soczewki obiektywowe 10 X, 20X i 40X.</li>
 </ol>

<ol><li>Jessell, T. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neuronal+specification+in+the+spinal+cord%3A+Inductive+signals+and+transcriptional+codes%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Genetics%22%5BJournal%5D)">Neuronal specification in the spinal cord: Inductive signals and transcriptional codes.</a> Nature Reviews Genetics. 1 (1), 20-29 (2000).</li>
<li>Landmesser, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Distribution+Of+Motoneurons+Supplying+Chick+Hind+Limb+Muscles%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Physiology-London%22%5BJournal%5D)">Distribution Of Motoneurons Supplying Chick Hind Limb Muscles.</a> Journal of Physiology-London. 284, 371-389 (1978).</li>
<li>Romanes, G. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+motor+pools+of+the+spinal+cord%5BTitle%5D)+AND+%22Progress+in+Brain+Research%22%5BJournal%5D)">The motor pools of the spinal cord.</a> Progress in Brain Research. 11, 93-119 (1964).</li>
<li>Dasen, J. S., De Camilli, A., Wang, B., Tucker, P. W., Jessell, T. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hox+repertoires+for+motor+neuron+diversity+and+connectivity+gated+by+a+single+accessory+factor%2C+FoxP1%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Hox repertoires for motor neuron diversity and connectivity gated by a single accessory factor, FoxP1.</a> Cell. 134 (2), 304-316 (2008).</li>
<li>Rousso, D. L., Gaber, Z. B., Wellik, D., Morrisey, E. E., Novitch, B. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Coordinated+actions+of+the+forkhead+protein+Foxp1+and+Hox+proteins+in+the+columnar+organization+of+spinal+motor+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Coordinated actions of the forkhead protein Foxp1 and Hox proteins in the columnar organization of spinal motor neurons.</a> Neuron. 59 (2), 226-240 (2008).</li>
<li>Tsuchida, T., Ensini, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Topographic+organization+of+embryonic+motor-neurons+defined+by+expression+of+limhomeobox+genes%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Topographic organization of embryonic motor-neurons defined by expression of limhomeobox genes.</a> Cell. 79 (6), 957-970 (1994).</li>
<li>Kania, A., Johnson, R. L., Jessell, T. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Coordinate+roles+for+LIM+homeobox+genes+in+directing+the+dorsoventral+trajectory+of+motor+axons+in+the+vertebrate+limb%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Coordinate roles for LIM homeobox genes in directing the dorsoventral trajectory of motor axons in the vertebrate limb.</a> Cell. 102 (2), 161-173 (2000).</li>
<li>Price, S. R., Garcia, N. V. D., Ranscht, B., Jessell, T. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulation+of+motor+neuron+pool+sorting+by+differential+expression+of+type+II+cadherins%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Regulation of motor neuron pool sorting by differential expression of type II cadherins.</a> Cell. 109 (2), 205-216 (2002).</li>
<li>Demireva, E. Y., Shapiro, L. S., Jessell, T. M., Zampieri, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Motor+Neuron+Position+and+Topographic+Order+Imposed+by+%CE%B2-+and+%CE%B3-Catenin+Activities%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Motor Neuron Position and Topographic Order Imposed by β- and γ-Catenin Activities.</a> Cell. 147 (3), 641-652 (2011).</li>
<li>Bello, S. M., Millo, H., Rajebhosale, M., Price, S. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Catenin-Dependent+Cadherin+Function+Drives+Divisional+Segregation+of+Spinal+Motor+Neurons%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Catenin-Dependent Cadherin Function Drives Divisional Segregation of Spinal Motor Neurons.</a> Journal of Neuroscience. 32 (2), 490-505 (2012).</li>
<li>Haase, G., Dessaud, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((GDNF+acts+through+PEA3+to+regulate+cell+body+positioning+and+muscle+innervation+of+specific+motor+neuron+pools%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">GDNF acts through PEA3 to regulate cell body positioning and muscle innervation of specific motor neuron pools.</a> Neuron. 35 (5), 893-905 (2002).</li>
<li>Hotary, K. B., Landmesser, L. T., Tosney, K. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Embryo+slices%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Embryo slices.</a> Methods in Cell Biology. 51 (51), 109-124 (1996).</li>
<li>Hotary, K. B., Tosney, K. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cellular+interactions+that+guide+sensory+and+motor+neurites+identified+in+an+embryo+slice+preparation%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+Biology%22%5BJournal%5D)">Cellular interactions that guide sensory and motor neurites identified in an embryo slice preparation.</a> Developmental Biology. 176 (1), 22-35 (1996).</li>
<li>Krull, C. E., Tosney, K. Embryo slices and strips: Guidance and adhesion assays in the avian embryo. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aKrull%2C+CE+%22Methods+in+Cell+Biology%3A+New+Methods+in+Avian+Embryology%22">Methods in Cell Biology: New Methods in Avian Embryology</a>. Bronner-Fraser, M. 87, 2nd Edition, Elsevier Academic Press Inc. San Diego. 97-113 (2008).</li>
<li>Hamburger, V., Hamilton, H. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+series+of+normal+stages+in+the+development+of+the+chick+embryo.+%28Reprinted+From+Journal+Of+Morphology%2C+Vol.+88%2C+1951%29%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+Dynamics%22%5BJournal%5D)">A series of normal stages in the development of the chick embryo. (Reprinted From Journal Of Morphology, Vol. 88, 1951).</a> Developmental Dynamics. 195 (4), 231-272 (1992).</li>
<li>Rakic, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+century+of+progress+in+corticoneurogenesis%3A+From+silver+impregnation+to+genetic+engineering%5BTitle%5D)+AND+%22Cerebral+Cortex%22%5BJournal%5D)">A century of progress in corticoneurogenesis: From silver impregnation to genetic engineering.</a> Cerebral Cortex. 16, I3-I17 (2006).</li>
<li>Bingham, S. M., Sittaramane, V., Mapp, O., Patil, S., Prince, V. E., Chandrasekhar, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multiple+mechanisms+mediate+motor+neuron+migration+in+the+zebrafish+hindbrain%5BTitle%5D)+AND+%22Dev.+Neurobiol%22%5BJournal%5D)">Multiple mechanisms mediate motor neuron migration in the zebrafish hindbrain.</a> Dev. Neurobiol. 70 (2), 87-99 (2010).</li>
<li>Brachmann, I., Jakubick, V. C., Shaked, M., Unsicker, K., Tucker, K. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+simple+slice+culture+system+for+the+imaging+of+nerve+development+in+embryonic+mouse%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+Dynamics%22%5BJournal%5D)">A simple slice culture system for the imaging of nerve development in embryonic mouse.</a> Developmental Dynamics. 236 (12), 3514-3523 (2007).</li>
<li>Das, R. M., Wilcock, A. C., Swedlow, J. R., Storey, K. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-resolution+Live+Imaging+of+Cell+Behavior+in+the+Developing+Neuroepithelium%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis.+Exp%22%5BJournal%5D)">High-resolution Live Imaging of Cell Behavior in the Developing Neuroepithelium.</a> J. Vis. Exp. (62), e3920(2012).</li>
<li>Barnes, S. H., Price, S. R., Wentzel, C., Guthrie, S. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cadherin-7+and+cadherin-6B+differentially+regulate+the+growth%2C+branching+and+guidance+of+cranial+motor+axons%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Cadherin-7 and cadherin-6B differentially regulate the growth, branching and guidance of cranial motor axons.</a> Development. 137 (5), 805-814 (2010).</li>
</ol>

Żaden z autorów nie ma sprzecznych interesów ani konfliktu interesów.

Opisany tutaj protokół pozwala na inkubację wycinka zarodka kurczaka przez więcej niż jeden dzień, przy jednoczesnym utrzymaniu przy życiu neuronów ruchowych i kontynuowaniu migracji w okresie hodowli. Wyjaśniając warunki utrzymania neuronów ruchowych przy życiu, zidentyfikowaliśmy kilka kluczowych wymaganych funkcji. Wydaje się, że do 4% surowicy piskląt ma kluczowe znaczenie dla przetrwania neuronów ruchowych, a jej zastąpienie surowicą innego gatunku nie jest tolerowane. Co ciekawe, odkryliśmy, że obecność wyższych stężeń surowicy była szkodliwa dla plastrów, ponieważ sprzyjała przerostowi tkanki, prowadząc do poważnych zniekształceń w kształcie plasterka. Co ważniejsze, kluczowa okazała się również obecność biodrowego czynnika neurotroficznego. Pozostaje wyraźna możliwość, że plastry mogą być hodowane przez znacznie dłuższe okresy niż tylko 24 godziny, być może nawet umożliwiając wizualizację sensorycznych danych doprowadzających do rdzenia kręgowego. Dodatkowo, tutejsze warunki hodowli mogą również okazać się przydatne do krojenia kultur rozwijającego się pnia mózgu i śródmózgowia/móżdżku.
	Być może największą potencjalną korzyścią płynącą ze stosowania tych warunków hodowli plastrów jest to, że ułatwiają one możliwość farmakologicznej manipulacji funkcją białka, jednocześnie minimalizując potencjalny niekorzystny wpływ na resztę zarodka, taką jak serce. Duża liczba inhibitorów i agonistów różnych szlaków sygnałowych może być wykorzystana do oceny migracji różnych podtypów neuronów rdzeniowych i, potencjalnie, ich wpływu na tworzenie się lokalnych obwodów rdzeniowych podczas rozwoju. Ponadto niektóre genetyczne zaburzenia ekspresji białek, takie jak te, które wykorzystują siRNA i oligonukleotydy morfolinooligonukleotydów, cierpią z powodu faktu, że mogą być wprowadzone tylko na wczesnym etapie rozwoju (ze względu na ograniczenia w procedurach elektroporacji in ovo ), a efekty utrzymują się tylko przez krótki czas (zwykle jeden dzień). Nasza hodowla plastrów rozpoczyna się na późniejszych etapach i daje możliwość wykorzystania tej technologii na późniejszym etapie rozwoju na etapie krojenia, aby zobaczyć ich efekty w okresie hodowli plastrów.
	Protokół hodowli warstwowej może również umożliwić wizualizację zarówno neuronu ruchowego rdzenia, jak i migracji międzyneuronów grzbietowych w czasie rzeczywistym za pomocą mikroskopii filmów poklatkowych. Można to osiągnąć za pomocą mikroskopii z kontrastem fazowym w świetle białym lub za pomocą obrazowania fluorescencyjnego. Jeśli ta druga technika miałaby być zastosowana, konieczne jest wprowadzenie etykiet fluorescencyjnych. Można to osiągnąć poprzez wprowadzenie barwników fluorescencyjnych, takich jak DiI lub DiO, poprzez znakowanie wsteczne z kończyny lub znakowanie następcze z komory, lub elektroporację in ovo konstruktów w celu napędzania białek fluorescencyjnych w podzbiorze neuronów.

Podczas normalnego rozwoju zarodka powstaje wiele różnych typów komórek, które muszą migrować z miejsca pochodzenia do miejsca, w którym ostatecznie będą funkcjonować w dojrzałym organizmie. W rozwijającym się rdzeniu kręgowym komórki progenitorowe znajdują się w strefie komorowej w linii środkowej i generują wiele podtypów neuronów postmitotycznych i komórek glejowych, które muszą migrować, aby zintegrować się z funkcjonalnymi obwodami neuronalnymi wymaganymi do przetwarzania sensorycznego i wyjść motorycznych1. Rdzeniowe neurony ruchowe, które kontrolują skurcze mięśni kończyn, zostały szeroko przebadane i wiele wiadomo o cząsteczkach i mechanizmach, które napędzają powstawanie ich różnych podklas. Jednak znacznie mniej wiadomo o mechanizmach, za pomocą których neurony ruchowe migrują, segregują się i odbierają sygnały synaptyczne.
	Tożsamość podtypu neuronu ruchowego jest nabywana podczas rozwoju w sposób hierarchiczny. Podtypy neuronów ruchowych można ogólnie podzielić na odrębne kolumny, podziały i pule, które są definiowane przez ich projekcje aksonów. Kolumny motoryczne wystają aksony na mięśnie osiowe, trzewne lub kończyn. Podziały motoryczne dzielą neurony ruchowe wystające kończynami bocznej kolumny ruchowej (LMC) na te wystające do mięśni brzusznych lub grzbietowych2. W obrębie podziałów skupiska neuronów ruchowych zwane pulami motorycznymi rzutują na poszczególne mięśnie kończyny2, 3. Neurony ruchowe wystające kończynami są definiowane przez ich ekspresję czynnika transkrypcyjnego Foxp14, 5, podczas gdy tożsamość dywizyjna charakteryzuje się ekspresją homeodomenowych czynników transkrypcyjnych Islet-1 (wystający brzusznie) lub Lhx-1 (wystający grzbietowo)6. Rzeczywiście, ekspresja Lhx-1 jest wymagana do odpowiednich projekcji grzbietowych neuronów ruchowych7. Każdy z tych podtypów zajmuje odrębne pozycje w rdzeniu kręgowym; Neurony ruchowe wystające brzusznie znajdują się w neuronach ruchowych wystających przyśrodkowo do grzbietowo. Powoduje to, że LMC jest podzielony na tzw. LMCmedial (LMCm) i LMClateral (LMCl). Organizacja dywizji i puli motorowej jest nabywana w dwóch fazach8. W pierwszej fazie segregacja dywizyjna odbywa się poprzez migrację neuronów ruchowych w charakterystyczny sposób przyśrodkowy do bocznego. Komórki LMCl są generowane po komórkach LMCm, a więc LMCl migruje przez LMCm, aby osiągnąć ostateczną pozycję osiadania. Druga faza obejmuje neurony ruchowe w obrębie podziału i grupuje je w pule neuronów ruchowych, prawdopodobnie poprzez grzbietowo-brzuszne sortowanie neuronów ruchowych. Wykazano, że członkowie klasycznej rodziny kadheryny zależnej od kateniny mają kluczowe znaczenie dla obu faz organizacji neuronów ruchowych8-10. Jednak sposób, w jaki funkcja kadheryny kontroluje ruch komórek, jest słabo poznany.
	Nabywanie tożsamości kolumnowych, działowych i pulowych wymaga zewnętrznych sygnałów, które wzorcują wewnętrzną ekspresję czynników transkrypcyjnych11. Ponadto około 50% wszystkich neuronów ruchowych umiera w wyniku apoptozy podczas normalnego rozwoju w procesie, który wymaga zewnętrznych sygnałów z kończyny, głównie poprzez neurotroficzne wsparcie przeżycia neuronów ruchowych. W związku z tym rozwój neuronów ruchowych wymaga utrzymania odpowiedniego środowiska przez stosunkowo długi okres czasu. Z tego powodu praktyczne aspekty generowania kultur warstwowych rdzenia kręgowego w celu utrzymania przeżycia neuronów ruchowych wymagają wyjaśnienia odpowiednich warunków hodowli. Poprzednie kultury wycinkowe zarodków zostały wykorzystane do śledzenia zachowania dodanych zewnętrznie oczyszczonych populacji neuronów12-14. Jednak, zgodnie z naszą wiedzą, warunki kulturowe, które ułatwiają przetrwanie i migrację neuronów ruchowych in situ w obrębie samego wycinka, nie zostały opublikowane. Zmodyfikowaliśmy standardowe warunki hodowli, które ułatwiają przetrwanie oczyszczonych, zdysocjowanych neuronów ruchowych czaszki, aby ułatwić rozwój neuronów ruchowych w systemie hodowli plastrów zarodka. Monitorowaliśmy również położenie ocalałych neuronów ruchowych i wykazaliśmy, że w okresie hodowli uzyskuje się w dużej mierze normalne pozycje podziałów neuronów ruchowych.

<table><tbody><tr><td>Jaja</td><td>Henry Stewart Farms, Wielka Brytania</td><td></td><td>Zapłodnione brązowe jaja kurze Bovan Gold (Henry Stewart Farms, Wielka Brytania), przechowywane w temperaturze 14 & deg; C do inkubacji</td></tr><tr><td>21 Igła do</td> pomiaru <td>BD-Microlance-3</td><td>304432</td><td></td></tr><tr><td>strzykawka 5 ml</td><td>BD Plastipak</td><td>302187</td><td></td></tr><tr><td>#5 Kleszcze Dumont</td><td>Roboz</td><td>RS 5045</td><td></td></tr><tr><td>Nożyczki do mikro preparacji</td><td>Roboz</td><td>RS 5910SC</td> <td>(3,5 cala prostego)</td></tr> <tr><td>Formy do osadzania zarodków: Odklejane formy</td><td>Agar Scientific</td><td>G3764</td><td>W kształcie piramidy 22 mm do 12 mm</td></tr><tr><td>Super klej</td><td></td><td></td><td>Power Flex, Loctite</td></tr><tr><td>Etanol</td><td>SIGMA</td><td>32221</td><td></td></tr><tr><td>Diwodorofosforan sodu, monohydrat</td><td>BDH</td><td>102454R</td><td></td></tr><tr><td>Di Monowodorofosforan sodu</td><td>VWR/ BDH</td><td>102494C</td><td></td></tr><tr><td>Chlorek sodu</td><td>VWR/BDH</td><td>27810.295</td><td></td></tr><tr><td>Agaroza o niskiej temperaturze topnienia</td><td>Invitrogen</td><td>16520</td><td></td></tr><tr><td>Surowica bydlęca</td> płodu <td>Gibco</td><td>10500-064</td><td></td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>SIGMA</td><td>T8787</td><td></td></tr><tr><td>Wodorotlenek sodu</td><td>FLUKA</td><td>71689</td><td></td></tr><tr><td>Paraformaldehyd</td><td>VWR/BDH</td><td>28794.295</td><td></td></tr><tr><td>Plastikowe jednorazowe pipety pasteura</td><td>ElKay Precyzyjne materiały laboratoryjne</td><td>127-P503-000</td><td>Likier o pojemności 3 ml</td></tr><tr><td>Hanks Zrównoważony roztwór soli (HBSS)</td><td>Gibco</td><td>14170</td><td></td></tr><tr><td>Sacharoza</td><td>SIGMA</td><td>S0389</td><td></td></tr><tr><td>Wodorowęglan sodu</td><td>SIGMA</td><td>S5761</td><td></td></tr><tr><td>Ekstrakt z zarodków kurczaka</td><td>Seralabs</td><td>CE650-J</td><td></td></tr><tr><td>Roztwór penicyliny/streptomycyny</td><td>Gibco</td><td>15070</td><td></td></tr><tr><td>Roztwór L-glutaminy</td><td>Gibco</td><td>25030</td><td></td></tr><tr><td>2-mercapt&#8211; tanol</td><td>Gibco</td><td>21985</td><td></td></tr><tr><td>Surowica końska</td><td>Southern Group Labs</td><td>9028B</td><td></td></tr><tr><td>B27 suplement</td><td>Invitrogen</td><td>17504-044</td><td></td></tr><tr><td>Podłoże neuropodstawowe</td><td>Gibco</td><td>Cat ~ 2103</td><td></td></tr><tr><td>Czynnik neurotroficzny Cilliary (CNTF)</td> <td>Systemy R i D</td><td>557-NT-010</td><td></td></tr><tr><td>Surowica piskląt</td><td>SIGMA</td><td>C5405</td><td></td></tr><tr>Przeciwciała <td></td><td></td><td>pierwszorzędowe</td><td>zakupiono w Developmental Studies Hybridoma Bank, z wyjątkiem przeciwciał anty-foxP1, które były miłym prezentem od Bennetta Novitcha z UCLA. Pierwszorzędowe rozcieńczenia przeciwciał to królik anty-FoxP1 (1/32000), mysie anty-Lhx1/2 (4F2) (1/50), świnka morska anty-FoxP1 (1/1000). Wszystkie przeciwciała przechowywano w temperaturze 4 stopni Celsjusza.</td></tr><tr>Przeciwciała <td></td><td></td><td>drugorzędowe</td><td>Osioł anty-Świnka morska (cy3) (1:1000) zakupiony w Jackson Immunoreseach Laboratories Inc. Osioł anty-mysz (Alexa Fluor 488) (1:1000), osioł anty-Królik (Alexa Fluor 594) (1:1000) zakupiony od Invitrogen Wszystkie przeciwciała przechowywano w temperaturze 4 stopni Celsjusza.</td></tr><tr><td>Płytka 24-dołkowa</td><td>Corning COSTAR</td><td>3473</td><td>ultraniska płytka 24-dołkowa</td></tr><tr><td>O.C.T.</td><td>Tissue Tek, Sakura</td><td>4583</td><td>Optymalna temperatura cięcia</td></tr><tr><td>Vectashield</td><td>Vector Labs</td><td>H1000</td><td>Vectashield fluorescencyjne medium montażowe</td></tr><tr><td>Prowadnice</td><td>Thermo Scientific</td><td></td><td>Superfrost-Plus z dodatnim ładunkiem, 25 x 75 x 1,0 mm</td></tr><tr><td>Szkło osłonowe</td><td>VWR International</td><td>631-0167</td><td>25x60 mm</td></tr><tr><td>Inkubator z wymuszonym ciągiem: </td><td>Lyon Electric Company</td><td></td><td>utrzymywane w stanie wilgotnym poprzez zapewnienie zawsze wystarczającego poziomu wody, utrzymywanego na poziomie 38 stopni; C</td></tr><tr><td>Cryostat</td><td>Brite, Huntingdon, Wielka Brytania-36</td><td></td> <td>& C</td></tr><tr><td>Inkubator do hodowli tkankowych</td><td>DH Autoflow</td><td></td><td>Nuaire 38 &deg; C, 5% CO2</td></tr><tr><td>Vibratome</td><td>Leica</td><td></td><td>Leica VT1000-S</td></tr><tr><td>Mikroskop</td> fluorescencyjny <td>Nikon</td><td></td><td>Nikon Eclipse E80i</td></tr><tr><td>Aparat cyfrowy</td><td>Nikon</td><td></td><td>Nikon DS5M i Hamammatsu ORCA ER</td></tr></tbody></table>

protokół hodowli plastrów rdzenia kręgowego zarodków kurczaka

Chicken Embryo Spinal Cord Slice Culture Protocol

Kultury Slice mogą ułatwiać manipulowanie rozwojem zarodka, zarówno farmakologicznie, jak i poprzez manipulacje genami. W tym zredukowanym systemie można przezwyciężyć potencjalne śmiertelne skutki uboczne spowodowane ogólnoustrojowym stosowaniem leków. Jednak warunki hodowli muszą zapewniać, że normalny rozwój przebiega w ograniczonym środowisku wycinka. Skupiliśmy się na rozwoju rdzenia kręgowego, a w szczególności neuronów ruchowych rdzenia. Systematycznie zmienialiśmy warunki hodowli wycinków zarodków kurzych od momentu, w którym urodziła się większość rdzeniowych neuronów ruchowych. Oznaczyliśmy liczbę i typ neuronów ruchowych, które przetrwały w okresie hodowli oraz położenie tych neuronów ruchowych w porównaniu z in vivo. Odkryliśmy, że typ surowicy i czynniki neurotroficzne były wymagane w okresie hodowli i były w stanie utrzymać neurony ruchowe przy życiu przez co najmniej 24 godziny i umożliwić tym neuronom ruchowym migrację do odpowiednich pozycji w rdzeniu kręgowym. Przedstawiono te warunki hodowli oraz metodykę przygotowania kultur zarodków w plastrach z wykorzystaniem wypatroszonych zarodków kurzych zatopionych w agarozie i pokrojonych za pomocą wibratomu.

Wykorzystanie hodowli skrawków do śledzenia rozwoju interneuronów i neuronów projekcyjnych miało istotny wpływ na postęp w rozumieniu generowania organizacji w obrębie kory mózgowej16. W rdzeniu kręgowym rozwój neuronów ruchowych śledzono, wykorzystując hodowle całych embrionów danio pręgowanego17. Jednakże organizacja neuronów ruchowych rdzenia u danio pręgowanego jest stosunkowo prosta (ze względu na brak dużych mięśni kończyn u ryb). Mechanizmy molekularne sterujące hierarchią organizacji neuronów ruchowych rdzenia podczas rozwoju wyższych kręgowców są obecnie słabo poznane. W związku z tym niezbędne są warunki hodowli ułatwiające przeżycie neuronów i migrację ciał komórkowych w hodowlach skrawków embrionów wyższych kręgowców. Obecnie hodowle skrawków rdzenia kręgowego wyższych kręgowców były wykorzystywane do wysiewania dysocjowanych neuronów na powierzchni skrawków12-14, badania fluorescencyjnie znakowanych aksonów na obrzeżach skrawka18 lub zachowania komórek progenitorowych we wczesnym rozwoju rdzenia kręgowego19. Obecnie brakuje warunków hodowli skrawków dla późniejszych etapów rozwoju rdzenia kręgowego, w szczególności takich, które utrzymują rozwój neuronów ruchowych.
Aby podjąć próbę śledzenia rozwoju neuronów rdzeniowych, w szczególności motoneuronów rdzeniowych, zbadaliśmy różne warunki hodowli, które mogłyby promować przeżywalność motoneuronów oraz nabycie początkowej organizacji motorycznej poprzez migrację boczna neuronów. Wstępne próby z wykorzystaniem skrawków rdzenia kręgowego embrionów kurczęt w stadiach od 18 do 20 okazały się bezowocne; nie udało nam się utrzymać motoneuronów przy życiu dłużej niż przez kilka godzin i nie byliśmy w stanie wykazać generowania znaczącej liczby komórek LMCl w okresie hodowli (dane nie przedstawiono). Zbadaliśmy zatem hodowle skrawków embrionów w stadium 24, czyli w punkcie czasowym, w którym większość neuronów LMCl i LMCm została już wygenerowana, ale migracja neuronów LMCl jest wciąż w początkowej fazie (Rycina 1a-c). Ta migracja boczna neuronów LMCl jest w dużej mierze zakończona do stadium 27, około 24 do 36 h później (Rycina 1 d-f). Nasz test mógł zatem zostać uproszczony do zapewnienia przeżywalności neuronów i ułatwienia ich migracji bocznej do rogu przedniego. Eksperymenty rozpoczęliśmy od stosunkowo prostych warunków hodowli, zawierających jedynie zrównoważony roztwór soli Hanksa z dodatkiem lub bez dodatku surowicy kurzej lub ekstraktu z embrionu kurczęt. W każdym przypadku, mimo że udało nam się utrzymać neurony LMC w skrawku, stwierdzono niewielkie dowody na utrzymanie neuronów LMCl (przynajmniej w oparciu o ekspresję Lhx-1). Ponadto zaobserwowaliśmy nieprawidłową ekspresję genów takich jak HB9 w grzbietowej części rdzenia kręgowego, co jest sytuacją, która nigdy nie występuje in vivo (dane nie przedstawiono). Zatem te proste warunki hodowli nie są odpowiednie do badania procesu nabywania organizacji motoneuronów.
Poszukiwaliśmy zatem bardziej złożonych warunków i jako bazę wykorzystaliśmy sformułowaną w publikacjach mieszankę, która ma ułatwiać przeżycie dysocjowanych embrionalnych neuronów ruchowych czaszki kurczaka. Warunki te20 (1% ekstraktu z zarodka kurczaka, 1% Pen Strep, 0,35% L-glutaminy, 0,1% 2-merkaptoetanolu, 2% surowicy konia, 2% suplementu B27 oraz 50 ng/ml czynnika wzrostu neurotroficznego rzęskowego (CNTF) w podłożu neurobasalnym (zwanym tutaj podłożem Guthrie)) pozwoliły na przeżycie większej liczby neuronów ruchowych niż prostsze pożywki. Dodatkowo nie doprowadziło to do błędnej ekspresji czynników transkrypcyjnych w grzbietowej części rdzenia kręgowego. Jednak przeżywalność neuronów LMCl była słaba (Rysunek 1 g-i, p). Zmienialiśmy zatem czynniki, które uznaliśmy za kluczowe w podłożu Guthrie, a mianowicie gatunek zwierzęcia, z którego pochodziła surowica, stężenie surowicy oraz stężenie CNTF w podłożu. Stwierdziliśmy, że zmiana surowicy konia na surowicę kurczaka oraz zwiększenie stężenia CNTF z 50 ng/ml do 100 ng/ml znacząco zwiększyło przeżywalność komórek LMCl i LMCm, a także umożliwiło ich migrację do rogu przedniego w ciągu 24 h hodowli (Rysunek 1 j-l, p). Całkowita liczba neuronów ruchowych, stosunek LMCm do LMCl, a także migracja komórek LMCl do rogu przedniego wydawały się bardzo podobne do przekrojów embrionów, których pozwolono rozwijać się in ovo, a nie w hodowli plastrów (Rysunek 1 k-o, p). Uważamy zatem, że opierając się na ekspresji czynników transkrypcyjnych, liczbie komórek i pozycji neuronów ruchowych, nasze warunki hodowli plastrów odwzorowują prawidłowy rozwój neuronów ruchowych rdzenia kręgowego, przynajmniej w okresie 24 h.
<img alt="Białka Lhx-1 i FoxP1 w embrionie kurczaka; immunohistochemia, hodowla plastrów, analiza ekspresji." fo:content-width="2in" fo:src="/files/ftp_upload/50295/50295fig1highres.jpg" src="/files/ftp_upload/50295/50295fig1.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Rysunek 1"> 
Rysunek 1. a-c. Status generowania LMC (barwienie Foxp1 w b) i LMCl (barwienie Lhx-1 w a) w stadium 24. Panel c przedstawia nałożenie obu kanałów. Linia środkowa jest zaznaczona linią przerywaną w a i D, V wskazuje orientację osi grzbietowo-brzusznej (D, V) rdzenia kręgowego. d-f. Status organizacji LMC (barwienie Foxp1 w d) i LMCl (barwienie Lhx-1 w e) w stadium 27. Panel f przedstawia nałożenie obu kanałów. g-i. Ekspresja Lhx-1 (g) i Foxp1 (h) w przekrojach plastra hodowanego w medium wspierającym przeżycie komórek czuciowych neuronów ruchowych czaszkowych (medium Guthrie, nasze „medium początkowe”, patrz odniesienie 20). Lhx-1 nie jest już eksprimowany w neuronach ruchowych, choć obserwuje się przeżycie niektórych komórek LMC, co potwierdza ekspresja Foxp1. D, V w (g) wskazuje orientację osi grzbietowo-brzusznej (D, V) rdzenia kręgowego. M-L wskazuje orientację osi przyśrodkowo-bocznej (M, L) rdzenia kręgowego. j-l. Komórki LMCl (Lhx-1 w rogu przednim w j) oraz LMC ogólnie (Foxp1 w k) można zaobserwować w plastrach hodowanych w medium zawierającym 4% surowicy kurzej i 100 ng/ml CNTF. Należy zauważyć, że niektóre komórki LMCl znajdują się w pozycji bocznej w rogu przednim. Strzałka w (j) wskazuje boczną pozycję niektórych komórek LMCl. Panel (l) przedstawia nałożenie obu kanałów. m-o. Status ekspresji Lhx-1 (m) i Foxp1 (n) w przekrojach embrionu utrzymywanego in ovo podczas hodowli plastrów embrionu pokazanego w j-l. Panel (o) przedstawia nałożenie obu kanałów. p. Ilościowe oznaczenie procentowego udziału komórek LMCl (Foxp1+ve/ Lhx1+ve) w stosunku do komórek LMC (Foxp1+ve/Lhx1-ve) znalezionych w hodowlach plastrów w różnych warunkach w porównaniu do embrionów kontrolnych utrzymywanych in ovo (które reprezentują 100%). Test t Studenta *** oznacza p&lt;0.01. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/50295/50295fig1large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększony rysunek</a>.

Kultury Slice ułatwiają manipulowanie rozwojem zarodka za pomocą zaburzeń genowych i farmakologicznych. Jednakże warunki hodowli muszą zapewniać, że normalny rozwój może przebiegać w ograniczonym środowisku wycinka. Ilustrujemy protokół, który ułatwia prawidłowy rozwój rdzenia kręgowego, aby przebiegał przez co najmniej 24 godziny.

Protokół hodowli plastrów rdzenia kręgowego zarodków kurczaka

Slice cultures can facilitate the manipulation of  embryo development both pharmacologically and through gene manipulations. In  this reduced system, ...

Ogólnym celem niniejszej procedury jest hodowla skrawków zarodka kurczaka w celu utrzymania prawidłowego rozwoju neuronów, w szczególności neuronów ruchowych rdzenia kręgowego. Osiąga się to najpierw poprzez wypreparowanie zarodka kurczaka w celu usunięcia narządów trzewnych. Drugim krokiem jest przygotowanie i pocięcie zarodka osadzonego w bloku agarowym.Następnie plaster zarodka jest ostrożnie usuwany z agarozy. Ostatnim krokiem jest przeniesienie plastra zarodka do medium hodowlanego, które inkubuje się przez 24 godziny w temperaturze 37 °C. Ostatecznie, w celu wykazania obecności i lokalizacji motoneuronów rdzeniowych po okresie hodowli, stosuje się mikroskopię immunofluorescencyjną na cienkich przekrojach plastra zarodka.W związku z tym metoda ta może pomóc w odpowiedzi na kluczowe pytania z zakresu neurobiologii rozwoju, na przykład dotyczące mechanizmów i cząsteczek zaangażowanych w migrację motoneuronów rdzeniowych. Zazwyczaj osoby rozpoczynające pracę z tą metodą mogą napotkać trudności, ponieważ etapy preparowania tkanek w ramach protokołu wymagają szczególnej staranności.Umieść 10 zapłodnionych jaj z najdłuższym bokiem ułożonym poziomo w inkubatorze z wymuszonym obiegiem powietrza w temperaturze 38 °C, aż osiągną stadium hamburgera i stadium Hamiltona 24. Zwykle wymaga to około czterech dni inkubacji. Drugiego dnia inkubacji wysterylizuj skorupkę jaja, przecierając ją papierową chusteczką nasączoną 70% Ethanolem, a następnie ostrożnie przebij płaski koniec skorupki, używając igły 21 G przymocowanej do strzykawki o pojemności 5 ml, i odessij 5 ml albuminy.Obniża to zarodek względem skorupki, aby nie został on uszkodzony podczas jej otwierania. Przenieś jaja z powrotem do inkubatora i inkubuj je przez kolejne dwa dni. Po upływie dwóch dni użyj stępionych.Następnie, w punkcie piątym, użyć pęsety, aby ostrożnie przebić górną środkową część skorupy i usunąć fragment skorupy o powierzchni około 9 cm². Przeciąć obszar wokół embrionu, ostrożnie go wyjęt i umieścić w HBSS.Do sekcji. Wszystkie wykorzystane zarodki powinny znajdować się blisko stadium 24. Wszelkie zarodki wykazujące jakiekolwiek oznaki nieprawidłowości należy odrzucić.Umieścić naczynie z embrionem pod mikroskopem stereoskopowym. Za pomocą dwóch pęset nr 5 usunąć błonę amnionową, błonę pozarodkową, allantois oraz wegetację głowy. Następnie przeprowadzić ewiscerację embrionu w celu usunięcia wszystkich narządów wewnętrznych, używając mikronożyczek do nacięcia linii pośrodkowej strony brzusznej embrionu.Następnie przytrzymaj zarodek w okolicy przedniej części tułowia jedną parą pęsety. Chwyć przednią część przewodu pokarmowego oraz serce i delikatnie pociągnij. Somity zarodka powinny być teraz wyraźnie widoczne.Następnie przytnij ścianę klatki piersiowej, używając nożyczek do mikrodysekcji. Potem przetnij embrion w poprzek na pół, pomiędzy pąkami kończyn górnych i dolnych. Ostrożnie usuń lędźwiową połowę rozsektowanego embrionu, używając dwóch pincet do podtrzymania embrionu i wyjęcia go z roztworu do dysekcji, a następnie umieść go w suchej szalce Petriego za pomocą jednorazowej pipety Pasteura o długości około pięciu centymetrów.Odcinając od dołu, odessaj około dwóch mililitrów stopionego 4% w/v aros w PBS. Pipetą nanieś około 0,5 mililitra aros na wierzch embrionu, a następnie wciągnij fragment embrionu do pipety. Przenieś embrion wraz z aros do plastikowej formy z odrywaną folią, unikając wprowadzania pęcherzyków powietrza do aros.Ostrożnie opuść embrion na dno otworu w plastikowej formie, tak aby sekcja klatki piersiowej była skierowana w dół, i użyj igły o rozmiarze 25 G, aby upewnić się, że embrion jest ułożony prosto. Otwór będzie zawierał również część rozwijającej się kończyny, dlatego ważne jest, aby embriony były ustawione pionowo w otworze; w tym celu umieść plastikową formę na lodzie na około dwie minuty. Podczas utrwalania w otworze należy zadbać o to, aby embrion nie zmienił orientacji w tym czasie.Przygotuj urządzenie typu VT 1000 S w analogiczny sposób, tak aby komora była wypełniona roztworem HBSS i otoczona lodem z zimną wodą. Użyj kleju super glue, aby przymocować blok agarowy do platformy Vibram, a następnie przytnij blok żyletką, pozostawiając wokół fragmentu z embrionem od 1 do 3 mm agaru.Uruchom wibratom i rozpocznij krojenie zarodka. Wybierz plastry zawierające sekcje pączka kończyn z wyraźną grzebienią ektodermalną dystalną, a następnie przenieś je do naczynia z HBSS. Zazwyczaj w jednym zarodku uzyskuje się tylko jeden lub dwa odpowiednie plastry.Delikatnie usuń agarozę wokół skrawków tkanki, używając dwóch igieł. Niezbędne jest, aby czynność ta została wykonana dokładnie i ostrożnie. Dodaj 500 µL roztworu hodowlanego do odpowiedniej liczby studzienek 24-dołkowej płytki do hodowli tkanek o ultra niskiej adhezji.Ostrożnie przenieś skrawki z roztworu HBSS do dołków, umieszczając po dwa lub trzy skrawki w każdym dołku, a następnie umieść płytkę 24-dołkową w inkubatorze do hodowli tkanek w temperaturze 37 °C przy 5% CO2 na 24 godziny. Po okresie hodowli dodaj 500 µL niebuforowanego utrwalacza do każdego dołka ze skrawkami embrionów i pozostaw na lodzie przez 20 minut. Następnie ostrożnie odessij cały roztwór i przemyj trzy razy w PBS w odstępach pięciominutowych. Następnie dodaj do dołków 30% sacharozy w PBS i pozostaw płytkę w temperaturze 4 °C przez około sześć godzin lub dłużej, aż skrawki opadną na dno.Po opadnięciu skrawków przenieś je do czystej szalki Petriego o średnicy 10 centymetrów i odsącz nadmiar roztworu sacharozy. Następnie dodaj jeden mililitr OCT i pozostaw skrawki do wyrównania na pięć minut w temperaturze 20 stopni Celsjusza. Zamocuj każdy skrawek płasko w formie z odrywanym plastikiem wypełnionej OCT, a po zamocowaniu usuń plastik.Umieść formy pionowo na suchym lodzie, aby utwardzić bloki OCT, a następnie zamocuj je w kriotomie i doprowadź do wyrównania temperatury bloków do -24 °C przez około 20 minut. Następnie przetnij każdy blok na sekcje o grubości 15 µm i nanieś je na szkiełka SuperFrost Plus. Szkiełka można przechowywać w temperaturze -80 °C do momentu ich wykorzystania do barwienia immunofluorescencyjnego, zgodnie z opisem w części tekstowej protokołu; niniejszy obraz przedstawia stan rozwoju bocznej kolumny ruchowej w stadium 24 według Hamburgera i Hamiltona.Podział boczny bocznej kolumny motorycznej jest uwidoczniony za pomocą barwienia LH X one na lewym panelu. Boczna kolumna motoryczna jest uwidoczniona poprzez barwienie Fox P one na panelu środkowym, a prawy panel stanowi nałożenie obu kanałów. Linia środkowa jest zaznaczona linią przerywaną, a DV oznacza tutaj oś grzbietowo-brzuszną.Status bocznego podziału bocznej kolumny ruchowej jest ponownie przedstawiony za pomocą barwienia LHX1 na lewym panelu oraz bocznej kolumny ruchowej za pomocą barwienia FoxP1 na panelu środkowym, z obrazem scalonym po prawej stronie. Obrazy te przedstawiają rozwój w stadium 27. Zdjęcia te pokazują ekspresję LHX1 po lewej stronie oraz ekspresję FoxP1 na panelu środkowym w przekrojach plastra hodowanego w medium wspierającym przeżywalność dysocjowanych komórek czaszkowych neuronów ruchowych.LHX1 nie jest już eksprymowany w neuronach ruchowych, choć pewne przeżycie komórek LMC jest potwierdzone ekspresją FoxP1. DV reprezentuje orientację osi grzbietowo-brzusznej rdzenia kręgowego, a ML reprezentuje orientację osi przyśrodkowo-bocznej bocznej kolumny neuronów ruchowych rdzenia kręgowego. Komórki dywizji bocznej, ponownie zabarwione na LHX1 w rogu przednim na lewym panelu oraz LMC ogólnie zabarwione na FoxP1 na panelu środkowym, można zaobserwować w plastrach hodowanych w medium zawierającym 4% surowicy z kurczaka oraz 100 ng/mL CNTF.Należy zauważyć, że niektóre komórki bocznego działu bocznej kolumny motorycznej znajdują się w położeniu bocznym w rogu przednim, co wskazuje strzałka na lewym panelu. Obraz ten przedstawia stan ekspresji LHX1 i FoxP1 w przekrojach zarodka utrzymywanego w OVO podczas hodowli plastrów zarodka pokazanego wcześniej. Ten histogram przedstawia wyniki ilościowego oznaczenia procentowego udziału komórek bocznego działu bocznej kolumny motorycznej, wykazujących pozytywne barwienie na FoxP1 i LHX1, w stosunku do komórek bocznej kolumny motorycznej, wykazujących pozytywne barwienie na FoxP1 i LHX1.Dane negatywne przedstawiono dla komórek znalezionych w kulturach skrawkowych w różnych warunkach w porównaniu do embrionów kontrolnych utrzymywanych in ovo, które reprezentują 100%. Dane analizowano za pomocą testu t Studentowi. Potrójna gwiazdka oznacza poziom istotności mniejszy niż 0,01. Podczas wykonywania tego protokołu należy zachować szczególną ostrożność podczas preparowania embrionu oraz usuwania agros ze skrawków, ponieważ kluczowe jest zachowanie integralności aksonów ruchowych w pąku kończyny.

chicken-embryo-spinal-cord-slice-culture-protocol

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Neuronauka

Protokół hodowli plastów rdzenia kręgowego z zarodków kurczaka

W tym filmie zaprezentowano New culture – metodę, dzięki której zarodki kurcząt są hodowane poza jajem przez maksymalnie 24 hr. Metoda ta umożliwia badanie wczesnego rozwoju (od pręgi pierwotnej do 14 som.), co odpowiada okresowi E7-9 u myszy. Zastosowania tej techniki obejmują elektroporację, hybrydyzację in situ oraz immunohistochemię.

Metoda hodowli wczesnych zarodków kurczaka ex vivo (nowa hodowla)

W niniejszej pracy przedstawiamy metodę transplantacji ludzkich komórek macierzystych do różnych obszarów ośrodkowego układu nerwowego zarodka kurczaka. Stanowi to model in vivo do oceny proliferacji i różnicowania różnych typów ludzkich komórek macierzystych w środowisku tkanki embrionalnej.

Ksenotransplantacja ludzkich komórek macierzystych do zarodka kurczaka

Przedstawiamy metodę przygotowania organotypowych skrawków embrionów myszy w połowie okresu gestacji do hodowli i obrazowania time-lapse wzrostu nerwów obwodowych.

Organotypowa hodowla skrawków embrionów myszy wykazujących ekspresję GFP do obrazowania w czasie rzeczywistym wzrostu nerwów obwodowych

Słuchowy pień mózgu kurczaka składa się z jąder odpowiedzialnych za binauralne przetwarzanie dźwięku. Pojedyncza preparacja w przekroju wieńcowym zachowuje cały układ obwodów, podczas gdy podejście z wykorzystaniem kultur komórkowych zapewnia unikalną możliwość badania rozwoju struktury neuronalnej i funkcji słuchowej na poziomach molekularnym, komórkowym i sieciowym.

Przygotowanie i hodowla skrawków pnia mózgu słuchowego kurczaka

Obrazowanie tkanki zarodkowej w czasie rzeczywistym przez długie okresy stanowi duże wyzwanie. Przedstawiamy tutaj metodę monitorowania zmian komórkowych i podkomórkowych w rdzeniu kręgowym kurczaka przez dłuższy czas z wysoką rozdzielczością przestrzenną i czasową. Technikę tę można zaadaptować do innych obszarów układu nerwowego oraz rozwijającego się zarodka.

Obrazowanie na żywo w wysokiej rozdzielczości zachowania komórek w rozwijającym się neuroepitelium

Opisano metodę, która pozwala na specyficzne dla typu komórek i możliwe do śledzenia obniżenie ekspresji genów w rurce nerwowej. Wykazujemy, w jaki sposób elektroporacja in ovo plazmidów opartych na mikroRNA, które wywołują kontrolowaną przestrzennie i czasowo interferencję RNA, może być wykorzystana do badania prowadzenia aksonów komisuralnych w rozwijającej się rurce nerwowej.

In ovo elektroporacja plazmidów opartych na miRNA w rozwijającej się rurze neuronalnej i ocena fenotypów poprzez wstrzykiwanie DiI w preparatach typu open-book

Film demonstruje funkcjonalną regenerację połączeń propriordzeniowych za pomocą testu opartego na matrycy wieloelektrodowej (MEA). Wycinki rdzenia kręgowego umieszcza się na MEA i pozostawia się do połączenia. Połączone plastry są mechanicznie oddzielane poprzez tworzenie zmiany, indukując neurony propriordzeniowe do wzrostu nad zmianą i łączenia plasterków. Aktywność elektryczna warstw jest oceniana w celu identyfikacji regeneracji połączeń funkcjonalnych.

Badanie regeneracji funkcjonalnych połączeń między wycinkami rdzenia kręgowego przy użyciu układu wieloelektrodowego

Modele hodowli komórkowych zapewniają szczegółową kontrolę nad warunkami środowiskowymi, a tym samym stanowią potężną platformę do wyjaśnienia wielu aspektów biologii komórek neuronalnych. Opisujemy szybką, niedrogą i niezawodną metodę izolacji, dysocjacji i hodowli neuronów czuciowych z zarodków piskląt. Podano również szczegółowe informacje na temat przygotowania podłoża i immunocytochemii.

Izolacja i hodowla zdysocjowanych neuronów czuciowych z zarodków piskląt

Tutaj prezentujemy protokół, który opiera się na wycinkach rdzenia kręgowego hodowanych na układach wieloelektrodowych w celu zbadania funkcjonalnej regeneracji połączeń propriordzeniowych in vitro.

Badanie regeneracji funkcjonalnej w organotypowych kokulturach rdzenia kręgowego hodowanych na matrycach wieloelektrodowych

Tutaj prezentujemy protokół hodowli organotypowej do hodowli embrionalnych organów kurczaka in vitro. Za pomocą tej metody można badać rozwój zarodkowej tkanki kurczaka, przy zachowaniu wysokiego stopnia kontroli nad środowiskiem hodowli.

Metoda hodowli organotypowej do badania rozwoju zarodkowych tkanek kurczaka

Tutaj prezentujemy protokół uzyskiwania niekoronalnych warstw słuchowych pnia mózgu zarodka kurczaka w celu zbadania właściwości tonotopowych i trajektorii rozwojowych w obrębie jednego wycinka pnia mózgu. Przekroje te obejmują przekroje strzałkowe, poziome i poziome/poprzeczne obejmujące większe obszary tonotopowe w pojedynczej płaszczyźnie przekroju niż tradycyjne sekcje koronalne.

Krojenie embrionalnego słuchowego pnia mózgu kurczaka w celu oceny gradientów tonotopowych i mikroobwodów

Poznaj metodę hodowli plastrów zarodków kurczaka w celu badania rozwoju neuronów ruchowych rdzenia kręgowego. Protokół umożliwia utrzymanie prawidłowego rozwoju komórek nerwowych przez 24 godziny w kontrolowanych warunkach.

Protokół hodowli plastrów rdzenia kręgowego zarodków kurczaka

Przeglądaj więcej filmów