Protokół hodowli plastrów rdzenia kręgowego zarodków kurczaka

Ogólnym celem niniejszej procedury jest hodowla skrawków zarodka kurczaka w celu utrzymania prawidłowego rozwoju neuronów, w szczególności neuronów ruchowych rdzenia kręgowego. Osiąga się to najpierw poprzez wypreparowanie zarodka kurczaka w celu usunięcia narządów trzewnych. Drugim krokiem jest przygotowanie i pocięcie zarodka osadzonego w bloku agarowym.

Następnie plaster zarodka jest ostrożnie usuwany z agarozy. Ostatnim krokiem jest przeniesienie plastra zarodka do medium hodowlanego, które inkubuje się przez 24 godziny w temperaturze 37 °C. Ostatecznie, w celu wykazania obecności i lokalizacji motoneuronów rdzeniowych po okresie hodowli, stosuje się mikroskopię immunofluorescencyjną na cienkich przekrojach plastra zarodka.

W związku z tym metoda ta może pomóc w odpowiedzi na kluczowe pytania z zakresu neurobiologii rozwoju, na przykład dotyczące mechanizmów i cząsteczek zaangażowanych w migrację motoneuronów rdzeniowych. Zazwyczaj osoby rozpoczynające pracę z tą metodą mogą napotkać trudności, ponieważ etapy preparowania tkanek w ramach protokołu wymagają szczególnej staranności.

Umieść 10 zapłodnionych jaj z najdłuższym bokiem ułożonym poziomo w inkubatorze z wymuszonym obiegiem powietrza w temperaturze 38 °C, aż osiągną stadium hamburgera i stadium Hamiltona 24. Zwykle wymaga to około czterech dni inkubacji. Drugiego dnia inkubacji wysterylizuj skorupkę jaja, przecierając ją papierową chusteczką nasączoną 70% Ethanolem, a następnie ostrożnie przebij płaski koniec skorupki, używając igły 21 G przymocowanej do strzykawki o pojemności 5 ml, i odessij 5 ml albuminy.

Obniża to zarodek względem skorupki, aby nie został on uszkodzony podczas jej otwierania. Przenieś jaja z powrotem do inkubatora i inkubuj je przez kolejne dwa dni. Po upływie dwóch dni użyj stępionych.

Następnie, w punkcie piątym, użyć pęsety, aby ostrożnie przebić górną środkową część skorupy i usunąć fragment skorupy o powierzchni około 9 cm². Przeciąć obszar wokół embrionu, ostrożnie go wyjęt i umieścić w HBSS.

Do sekcji. Wszystkie wykorzystane zarodki powinny znajdować się blisko stadium 24. Wszelkie zarodki wykazujące jakiekolwiek oznaki nieprawidłowości należy odrzucić.

Umieścić naczynie z embrionem pod mikroskopem stereoskopowym. Za pomocą dwóch pęset nr 5 usunąć błonę amnionową, błonę pozarodkową, allantois oraz wegetację głowy. Następnie przeprowadzić ewiscerację embrionu w celu usunięcia wszystkich narządów wewnętrznych, używając mikronożyczek do nacięcia linii pośrodkowej strony brzusznej embrionu.

Następnie przytrzymaj zarodek w okolicy przedniej części tułowia jedną parą pęsety. Chwyć przednią część przewodu pokarmowego oraz serce i delikatnie pociągnij. Somity zarodka powinny być teraz wyraźnie widoczne.

Następnie przytnij ścianę klatki piersiowej, używając nożyczek do mikrodysekcji. Potem przetnij embrion w poprzek na pół, pomiędzy pąkami kończyn górnych i dolnych. Ostrożnie usuń lędźwiową połowę rozsektowanego embrionu, używając dwóch pincet do podtrzymania embrionu i wyjęcia go z roztworu do dysekcji, a następnie umieść go w suchej szalce Petriego za pomocą jednorazowej pipety Pasteura o długości około pięciu centymetrów.

Odcinając od dołu, odessaj około dwóch mililitrów stopionego 4% w/v aros w PBS. Pipetą nanieś około 0,5 mililitra aros na wierzch embrionu, a następnie wciągnij fragment embrionu do pipety. Przenieś embrion wraz z aros do plastikowej formy z odrywaną folią, unikając wprowadzania pęcherzyków powietrza do aros.

Ostrożnie opuść embrion na dno otworu w plastikowej formie, tak aby sekcja klatki piersiowej była skierowana w dół, i użyj igły o rozmiarze 25 G, aby upewnić się, że embrion jest ułożony prosto. Otwór będzie zawierał również część rozwijającej się kończyny, dlatego ważne jest, aby embriony były ustawione pionowo w otworze; w tym celu umieść plastikową formę na lodzie na około dwie minuty. Podczas utrwalania w otworze należy zadbać o to, aby embrion nie zmienił orientacji w tym czasie.

Przygotuj urządzenie typu VT 1000 S w analogiczny sposób, tak aby komora była wypełniona roztworem HBSS i otoczona lodem z zimną wodą. Użyj kleju super glue, aby przymocować blok agarowy do platformy Vibram, a następnie przytnij blok żyletką, pozostawiając wokół fragmentu z embrionem od 1 do 3 mm agaru.

Uruchom wibratom i rozpocznij krojenie zarodka. Wybierz plastry zawierające sekcje pączka kończyn z wyraźną grzebienią ektodermalną dystalną, a następnie przenieś je do naczynia z HBSS. Zazwyczaj w jednym zarodku uzyskuje się tylko jeden lub dwa odpowiednie plastry.

Delikatnie usuń agarozę wokół skrawków tkanki, używając dwóch igieł. Niezbędne jest, aby czynność ta została wykonana dokładnie i ostrożnie. Dodaj 500 µL roztworu hodowlanego do odpowiedniej liczby studzienek 24-dołkowej płytki do hodowli tkanek o ultra niskiej adhezji.

Ostrożnie przenieś skrawki z roztworu HBSS do dołków, umieszczając po dwa lub trzy skrawki w każdym dołku, a następnie umieść płytkę 24-dołkową w inkubatorze do hodowli tkanek w temperaturze 37 °C przy 5% CO2 na 24 godziny. Po okresie hodowli dodaj 500 µL niebuforowanego utrwalacza do każdego dołka ze skrawkami embrionów i pozostaw na lodzie przez 20 minut. Następnie ostrożnie odessij cały roztwór i przemyj trzy razy w PBS w odstępach pięciominutowych. Następnie dodaj do dołków 30% sacharozy w PBS i pozostaw płytkę w temperaturze 4 °C przez około sześć godzin lub dłużej, aż skrawki opadną na dno.

Po opadnięciu skrawków przenieś je do czystej szalki Petriego o średnicy 10 centymetrów i odsącz nadmiar roztworu sacharozy. Następnie dodaj jeden mililitr OCT i pozostaw skrawki do wyrównania na pięć minut w temperaturze 20 stopni Celsjusza. Zamocuj każdy skrawek płasko w formie z odrywanym plastikiem wypełnionej OCT, a po zamocowaniu usuń plastik.

Umieść formy pionowo na suchym lodzie, aby utwardzić bloki OCT, a następnie zamocuj je w kriotomie i doprowadź do wyrównania temperatury bloków do -24 °C przez około 20 minut. Następnie przetnij każdy blok na sekcje o grubości 15 µm i nanieś je na szkiełka SuperFrost Plus. Szkiełka można przechowywać w temperaturze -80 °C do momentu ich wykorzystania do barwienia immunofluorescencyjnego, zgodnie z opisem w części tekstowej protokołu; niniejszy obraz przedstawia stan rozwoju bocznej kolumny ruchowej w stadium 24 według Hamburgera i Hamiltona.

Podział boczny bocznej kolumny motorycznej jest uwidoczniony za pomocą barwienia LH X one na lewym panelu. Boczna kolumna motoryczna jest uwidoczniona poprzez barwienie Fox P one na panelu środkowym, a prawy panel stanowi nałożenie obu kanałów. Linia środkowa jest zaznaczona linią przerywaną, a DV oznacza tutaj oś grzbietowo-brzuszną.

Status bocznego podziału bocznej kolumny ruchowej jest ponownie przedstawiony za pomocą barwienia LHX1 na lewym panelu oraz bocznej kolumny ruchowej za pomocą barwienia FoxP1 na panelu środkowym, z obrazem scalonym po prawej stronie. Obrazy te przedstawiają rozwój w stadium 27. Zdjęcia te pokazują ekspresję LHX1 po lewej stronie oraz ekspresję FoxP1 na panelu środkowym w przekrojach plastra hodowanego w medium wspierającym przeżywalność dysocjowanych komórek czaszkowych neuronów ruchowych.

LHX1 nie jest już eksprymowany w neuronach ruchowych, choć pewne przeżycie komórek LMC jest potwierdzone ekspresją FoxP1. DV reprezentuje orientację osi grzbietowo-brzusznej rdzenia kręgowego, a ML reprezentuje orientację osi przyśrodkowo-bocznej bocznej kolumny neuronów ruchowych rdzenia kręgowego. Komórki dywizji bocznej, ponownie zabarwione na LHX1 w rogu przednim na lewym panelu oraz LMC ogólnie zabarwione na FoxP1 na panelu środkowym, można zaobserwować w plastrach hodowanych w medium zawierającym 4% surowicy z kurczaka oraz 100 ng/mL CNTF.

Należy zauważyć, że niektóre komórki bocznego działu bocznej kolumny motorycznej znajdują się w położeniu bocznym w rogu przednim, co wskazuje strzałka na lewym panelu. Obraz ten przedstawia stan ekspresji LHX1 i FoxP1 w przekrojach zarodka utrzymywanego w OVO podczas hodowli plastrów zarodka pokazanego wcześniej. Ten histogram przedstawia wyniki ilościowego oznaczenia procentowego udziału komórek bocznego działu bocznej kolumny motorycznej, wykazujących pozytywne barwienie na FoxP1 i LHX1, w stosunku do komórek bocznej kolumny motorycznej, wykazujących pozytywne barwienie na FoxP1 i LHX1.

Dane negatywne przedstawiono dla komórek znalezionych w kulturach skrawkowych w różnych warunkach w porównaniu do embrionów kontrolnych utrzymywanych in ovo, które reprezentują 100%. Dane analizowano za pomocą testu t Studentowi. Potrójna gwiazdka oznacza poziom istotności mniejszy niż 0,01. Podczas wykonywania tego protokołu należy zachować szczególną ostrożność podczas preparowania embrionu oraz usuwania agros ze skrawków, ponieważ kluczowe jest zachowanie integralności aksonów ruchowych w pąku kończyny.