Protokół hodowli plastrów rdzenia kręgowego zarodków kurczaka

Ogólnym celem tej procedury jest hodowla wycinków zarodków kurzych w celu utrzymania prawidłowego rozwoju neuronów, szczególnie neuronów ruchowych rdzenia. Osiąga się to poprzez najpierw wypreparowanie zarodka kurczaka w celu usunięcia narządów trzewnych. Drugim krokiem jest przygotowanie i pokrojenie zarodka osadzonego w bloku agarro.

Następnie plasterek zarodka jest ostrożnie usuwany z agarro. Ostatnim krokiem jest przeniesienie wycinka zarodka do pożywki hodowlanej, którą inkubuje się przez 24 godziny w temperaturze 37 stopni Celsjusza. Ostatecznie mikroskopia immunofluorescencyjna na cienkich odcinkach wycinka zarodka służy do wykazania obecności i lokalizacji neuronów ruchowych rdzenia kręgowego po okresie hodowli.

Tak więc ta metoda może pomóc odpowiedzieć na kluczowe pytania w dziedzinie neurobiologii rozwojowej. Na przykład mechanizmy i cząsteczki biorące udział w migracji neuronów ruchowych rdzenia. Ogólnie rzecz biorąc, osoby początkujące w tej metodzie będą miały trudności, ponieważ podczas etapów sekcji protokołu potrzebna jest duża ostrożność.

Umieść zapłodnione 10 jaj najdłuższym bokiem poziomo w inkubatorze z wymuszonym ciągiem w temperaturze 38 stopni Celsjusza, aż rozwiną się do etapu hamburgera i Hamiltona 24. Zwykle wymaga to około czterech dni inkubacji. W drugim dniu inkubacji wysterylizuj skorupkę jaja, wycierając ją bibułą nasączoną 70% etanolem, ostrożnie przekłuj płaski koniec skorupki jajka za pomocą igły o rozmiarze 21 przymocowanej do pięciomililitrowej strzykawki i usuń pięć mililitrów albuminy.

Powoduje to obniżenie zarodka z dala od skorupy, dzięki czemu zarodek nie ulega uszkodzeniu po otwarciu skorupy. Umieść jaja z powrotem w inkubatorze i wysiaduj je przez kolejne dwa dni. Po upływie dwóch dni użyj stępionego.

Rób więcej. Numer pięć, kleszcze, aby ostrożnie przebić górną środkową część skorupy i usunąć około dziewięciu centymetrów kwadratowych skorupy. Przeciąć wokół zarodka i ostrożnie wyjąć zarodek i umieścić w HBSS.

Do sekcji. Wszystkie użyte zarodki powinny być w stadium zbliżonym do 24. Wszelkie zarodki, które wykazują jakiekolwiek oznaki nieprawidłowości, należy wyrzucić.

Umieść naczynie zawierające zarodek pod mikroskopem preparacyjnym. Użyj dwóch kleszczy numer pięć, aby usunąć błonę owodniową. Chorio Alan do błony, Alan Tous i głowa następnie patroszą zarodek, aby usunąć wszystkie narządy wewnętrzne za pomocą mikronożyczek preparujących, aby otworzyć brzuszną linię środkową zarodka.

Następnie przytrzymaj zarodek wokół okolicy tułowia rostralnego za pomocą jednej pary kleszczy. Chwyć rostralną część jelita i serca i pociągnij. Kwartalnik. Powinieneś być w stanie wyraźnie zobaczyć zarodki somitów.

Teraz przytnij ścianę klatki piersiowej za pomocą nożyczek do mikrodysekcji. Następnie przetnij zarodek na pół poprzecznie między zawiązkami kończyn górnych i dolnych. Delikatnie usuń lędźwiową połowę wypreparowanego zarodka za pomocą dwóch kleszczy, aby wyciągnąć zarodek z roztworu preparacyjnego i umieścić na suchej szalce Petriego za pomocą jednorazowej pipety do makaronu o długości około pięciu centymetrów.

Wyciąć od dołu, odessać około dwóch mililitrów stopionego 4% masy na objętość. Aros w PBS odpipetować około 0,5 mililitra aros na wierzchu zarodka, a następnie zassać kawałek zarodka do pipety. Przenieś zarodek i aros do odklejanej plastikowej formy bez wprowadzania pęcherzyków do aros.

Delikatnie opuść zarodek na dno aros w plastikowej formie z częścią piersiową skierowaną w dół i użyj igły o rozmiarze 25, aby upewnić się, że zarodek jest prosty. Agros będzie również zawierał część rozwijającej się kończyny i ważne jest, aby zarodki były ustawione pionowo w arosie, aby umożliwić umieszczenie plastikowej formy na lodzie przez około dwie minuty. Aby ustawić aros, należy uważać, aby zarodek nie zmienił orientacji w tym okresie.

Ustaw podobnie jak VT 1000 S foma, aby komora była wypełniona HBSS i otoczona lodem. Zimna woda. Użyj super kleju, aby przymocować blok aros do platformy Vibram, a następnie przytnij blok żyletką, aby pozostawić kawałek zarodka z otaczającym go jednym do trzech milimetrów aros.

Rozpocznij vibrato i zacznij kroić zarodek. Plastry, które zawierają sekcje pąków kończyn z przezroczystym wierzchołkowym grzbietem elektrodermalnym, są wybierane, a następnie przenoszone do naczynia HBSS. Ogólnie rzecz biorąc, na zarodek przypada tylko jeden do dwóch odpowiednich plasterków.

Delikatnie usuń agarozę wokół plasterków tkanki za pomocą dwóch igieł. Ważne jest, aby zrobić to dokładnie i ostrożnie. Dodać 500 mikrolitrów roztworu hodowlanego do wymaganej liczby dołków 24-dołkowej kultury tkankowej o bardzo niskim przyłączeniu.

Ostrożnie przenieść plastry z roztworu HBSS do studzienki, umieszczając dwie lub trzy cząstki w każdym dołku, następnie umieścić 24-dołkową płytkę w inkubatorze do hodowli tkankowych w temperaturze 37 stopni Celsjusza z 5% dwutlenkiem węgla na 24 godziny po okresie hodowli w 500 mikrolitrach niebuforowanego roztworu do każdej studzienki z wycinkami zarodków i pozostawić na lodzie na 20 minut. Następnie ostrożnie odessać cały roztwór i przemyć go trzykrotnie w PBS w odstępach pięciominutowych. Następnie dodaj 30% sacharozy z PBS do dołków i umieść talerz w temperaturze czterech stopni Celsjusza na około sześć godzin lub dłużej, aż plastry opadną.

Po opadnięciu plastrów przenieś je na czystą 10-centymetrową szalkę Petriego i zetrzyj dodatkowy roztwór sacharozy. Następnie dodaj jeden mililitr OCT i pozwól plasterkom zrównoważyć się przez pięć minut w temperaturze 20 stopni Celsjusza. Zamontuj każdy plasterek płasko w wypełnionym OCT, po zamontowaniu zdejmij plastikową formę.

Umieść formy pionowo na suchym lodzie w celu zestalenia, zamontuj bloki OCT na kriosacie i wyrównaj bloki w temperaturze minus 24 stopni Celsjusza przez około 20 minut. Następnie pokrój każdy plasterek na odcinki o grubości 15 mikronów i zamontuj na super frostach i szkiełkach. Preparaty mogą być przechowywane w temperaturze minus 80 stopni Celsjusza, dopóki nie będą potrzebne do barwienia immunofluorescencyjnego, jak opisano w części tekstowej protokołu, ten obraz pokazuje stan generowania bocznej kolumny motorycznej na hamburgerze i etapie Hamiltona 24.

Boczny podział bocznej kolumny silnikowej jest wizualizowany przez barwienie LH X one w lewym panelu. Boczna kolumna silnika jest wizualizowana przez barwienie Fox P, jeden w środkowym panelu, a prawy panel jest połączeniem dwóch kanałów. Linia środkowa jest pokazana jako linia przerywana, a DV oznacza tutaj grzbietową oś brzuszną.

Stan bocznego podziału bocznej kolumny silnika jest ponownie pokazany przez LH X jedno barwienie w lewym panelu i boczne zabarwienie kolumny silnika przez Fox P jedno barwienie w środkowym panelu ze scalonym obrazem po prawej stronie. Zdjęcia te pokazują rozwój na etapie 27. Obrazy te pokazują LH X jedną ekspresję po lewej stronie i jedną ekspresję Fox P w środkowym panelu w sekcjach wycinka hodowanego w pożywce, która wspiera przeżycie zdysocjowanych komórek neuronu ruchowego czaszki.

LH X one nie ulega już ekspresji w neuronach ruchowych, chociaż istnieje pewna przeżywalność komórek LMC, o czym świadczy ekspresja Fox P one. DV reprezentuje orientację grzbietowo-brzusznej osi rdzenia kręgowego, a ML reprezentuje orientację bocznej osi środkowej bocznej kolumny motorycznej rdzenia kręgowego. Komórki podziału bocznego, ponownie wybarwione dla LH X, jeden w rogu brzusznym w lewym panelu i LMC ogólnie wybarwiony dla Fox P, jeden w panelu środkowym, można zaobserwować w plasterkach, hodowanych w pożywce zawierającej 4% surowicy piskląt i 100 nanogramów na mililitr CNTF.

Zauważ, że niektóre komórki podziału bocznego kolumny motorycznej znajdują się w pozycji bocznej w rogu brzusznym, jak wskazuje strzałka w lewym panelu. Obraz ten pokazuje stan ekspresji LH X one i Fox P one w skrawkach zarodka trzymanego w OVO podczas hodowli plastrowej zarodka wcześniej pokazanej. Ten histogram przedstawia wyniki ilościowego oznaczania procentu komórek podziału bocznego kolumny motorycznej, które barwią FOX P jedną dodatnią i LHX jedną dodatnią w porównaniu z bocznymi komórkami kolumny motorycznej, które barwią FOX P jeden dodatni, a LHX jeden.

Ujemne dane przedstawiono dla komórek znalezionych w kulturach plastrowych w innych warunkach w porównaniu z zarodkami kontrolnymi trzymanymi w owcu, które stanowią 100% danych, które zostały przeanalizowane za pomocą testu T studentów. Potrójna gwiazdka reprezentuje poziom istotności mniejszy niż 0,01 Podczas próby tego protokołu. Ważne jest, aby zachować ostrożność podczas preparowania zarodka i podczas usuwania agros z plastrów, ponieważ ważne jest, aby zachować integralność aksonów motorycznych w zawiązku kończyny.