Laserowe wychwytywanie mikrodysekcji wzbogaconych populacji neuronów lub pojedynczych neuronów do analizy ekspresji genów po urazowym uszkodzeniu mózgu

Ogólnym celem tej procedury jest pokazanie, w jaki sposób uzyskać wzbogacone populacje neuronów hipokampa i pojedynczych neuronów z zamrożonych skrawków tkanek za pomocą mikrodysekcji laserowej do późniejszej analizy ekspresji genów. Osiąga się to poprzez pierwsze znieczulenie, szczura w komorze anestezjologicznej. Szczur jest następnie intubowany, wentylowany mechanicznie i umieszczany w stereotaktycznym uchwycie głowy, aby przygotować szczura Do płynnego uszkodzenia mózgu wykonuje się kraniotomię.

Drugim krokiem jest podanie płynnego uszkodzenia mózgu spowodowanego uderzeniem. Następnie wycinki koronalne mózgu są wycinane na kriostacie i barwione fluro aid, markerem degenerujących się neuronów, lub rzeczywistym fioletem, barwnikiem pociskowym. Ostatnim krokiem jest wykonanie mikropreparacji laserowej i pobranie pojedynczych neuronów lub pul neuronów.

Ostatecznie całkowite RNA jest izolowane z wychwyconych komórek, analizowane pod kątem jakości i oznaczane ilościowo za pomocą bioanalizatora Agilent i wykorzystywane w dalszych zastosowaniach, takich jak ilościowy PCR w czasie rzeczywistym i analiza mikromacierzy skoncentrowana na szlaku lub obejmująca cały genom. Główną zaletą tej techniki w porównaniu z istniejącymi metodami, takimi jak ręczna mikropreparacja, jest to, że możemy uzyskać wzbogacone populacje neuronów lub innych typów komórek mózgowych, takich jak komórki glejowe lub immunomodulujące, lub pojedyncze neurony z wycinków tkanek. Pozwala nam to na przeprowadzenie analizy ekspresji genów w odrębnych zidentyfikowanych typach komórek w mózgu oraz w innych heterogenicznych tkankach złożonych z wielu typów komórek, Wykazanie tej procedury zostanie pominięte.

Debbie Boone, starszy pracownik naukowy w naszym laboratorium. Najpierw odzyskaj tkankę mózgową uzyskaną od szczurów z płynną opukiwaniem, urazowym uszkodzeniem mózgu lub pozorowanym urazem z zamrażarki o temperaturze minus 80 stopni Celsjusza i przenieś do minus 22 stopni Celsjusza. Kriostat przez 10 minut, aby doprowadzić mózg do temperatury podziału, podczas gdy mózg się rozmraża.

Przetrzyj kriostat zapem RNA zawierającym etanol i wyczyść szczotki etanolem. Po upływie 10 minut wyjmij mózg z rurki i umieść go brzuszną stroną do góry na kawałku gazy na etapie kriostatu, użyj świeżej żyletki i pokrój mózg, aby usunąć tylną część mózgu. Tylko rostralnie do móżdżku i przedniej części na skrzyżowaniu wzrokowym.

Napełnij formę kriogeniczną podłożem montażowym OCT i umieść mózg w formie przednią stroną do dołu. Pozwól tkance mózgowej zamrozić się w podłożu montażowym, aż zmieni kolor na biały. Powinno to zająć około 10 minut.

Teraz zamroź krążek próbki na mózgu za pomocą OCT. Następnie usuń formę. Włóż krążek z zamocowanym mózgiem do głowicy próbki i dokręć.

Włóż jednorazowe niskoprofilowe ostrze do uchwytu noża i dokręć dźwignię. Rozpocznij krojenie mózgu na 20 mikronów, aby usunąć zewnętrzną warstwę OCT. Po osiągnięciu obszaru hipokampa ustaw pokrętło mikronowe na 10.

Zbierz koronalne sekcje szeregowe, umieszczając szklane szkiełko lub plus szkło. Wsuń na sekcję tkanki. Umieść szkiełka w stojaku do barwienia bez RNA w temperaturze minus 20 stopni Celsjusza, aż do zakończenia cięcia.

Przed przystąpieniem do barwienia skrawków wytrzyj wszystkie pojemniki do barwienia i cylindry z podziałką ese i spłucz w wodzie mili Q. Upewnij się, że wszystkie roztwory zostały przygotowane z wodą wolną od RNA i że fiolet wyrostka zębodylnego i barwnik z jadeitu fluorowego przeszły wcześniej przez filtr 0,2 mikrona. Użyj skrawków mózgu Thora w temperaturze pokojowej przez 30 sekund i utrwal w 75% etanolu na jedną minutę.

Następnie przejdź do odpowiedniego barwnika przeciw dla LCM albo pasm neuronów, albo pojedynczych neuronów dla LCM połaci neuronów po utrwaleniu, przepłucz szkiełka w wodzie wolnej od RNA przez jedną minutę, barwić 1% fioletem grzebieniastym przez jedną minutę. Płukać w wodzie wolnej od RNA trzy razy przez jedną minutę, za każdym razem odwodnić 95% etanolem dwa razy po 30 sekund. Następnie 100% etanol dwa razy przez 30 sekund i ksylen dwa razy po trzy minuty.

Po zabarwieniu powietrzem wysusz wszystkie sekcje w dygestoriach przez 15 minut, a następnie przejdź do LCM.Tutaj. Wykonywany jest LCM. Używając mikroskopu P cell two E z laserem diodowym na podczerwień, najpierw ustaw środkowy joystick w pozycji pionowej.

Następnie obróć i zablokuj cel Forex w odpowiedniej pozycji. Umieść szkiełko z poplamionymi sekcjami hipokampa na środku stolika mikroskopu i ręcznie wyreguluj, aż obszar hipokampa będzie widoczny. Skorzystaj z kursu i znajdź korekty ostrości.

Aby ustawić ostrość sekcji, aktywuj uchwyt podciśnieniowy, naciskając przycisk podciśnienia na sterowniku. Następnie obróć i zablokuj obiektyw 10 x na swoim miejscu. Ponownie ustaw ostrość za pomocą kursu i precyzyjnych korekt.

Załaduj nasadki nasadek makra LCM do zaślepek, modułu kasety i umieść nasadkę w pozycji linii ładowania. Obróć ramię umieszczające nasadkę i ustaw wokół nasadki. Następnie podnieś ramię umieszczające nasadkę, aby zdjąć zaślepki z modułu kasety.

Obróć ramię umieszczające nasadkę nad suwakiem, a następnie opuść je w dół nad suwakiem, aby umieścić nasadkę na suwaku. Dostosuj precyzyjną ostrość i przesuń joystick, aby sprawdzić, czy komórki znajdują się w czarnym kółku na nasadce. Wszystkie komórki, które mają zostać przechwycone, powinny znajdować się w tym czarnym kółku.

Teraz ustaw parametry lasera. Najpierw naciśnij przycisk włączania lasera na kontrolerze. Plamka celu laserowego będzie widoczna jako różowa.

w polu view na monitorze komputera. Ustaw rozmiar plamki lasera na mały, aby ustawić ostrość lasera i dostosuj moc i czas trwania do 65 do 75 miliwatów przez jedną do dwóch milisekund w razie potrzeby w celu optymalnego wychwytywania komórek. Aby przetestować laser, użyj joysticka, aby przesunąć plamkę lasera do obszaru, w którym nie ma komórek do podniesienia.

Odpal laser za pomocą przełącznika kciukowego. Następnie użyj joysticka, aby odsunąć plamkę lasera od plamki stopionego polimeru i sprawdź, czy widoczny jest ciemny pierścień otaczający czysty obszar, w którym laser został wystrzelony. Aby przechwycić komórki, użyj joysticka, aby przesunąć plamkę lasera nad obszarem komórek, aby przechwycić i wystrzelić laser.

Za pomocą przełącznika kciukowego poruszaj joystickiem podczas wystrzeliwania lasera, aby uchwycić duży obszar komórek. Po wystrzeleniu wszystkich interesujących komórek podnieś ramię umieszczające nasadkę. Uchwycone komórki oddzielą się od sekcji tkanki i przylgną do czapeczki.

Twoja czapka, pozostała tkanka i brakujące komórki będą widoczne w polu widzenia. Komórki na nasadce można również wyświetlić, umieszczając nasadkę na pustej części szkiełka. Podnieś ramię do umieszczania nasadki i obróć je do stacji rozładunku nasadek.

Opuść nasadkę do stacji i obróć ramię umieszczające nasadkę z powrotem do poprzedniej pozycji. Przesuń nasadkę narzędzia do wkładania wzdłuż platformy i na nasadkę. Podnieś narzędzie z zatyczką przymocowaną z platformy.

Delikatnie przyłóż nakrętkę do samoprzylepnej części karteczki samoprzylepnej, aby usunąć niechcianą tkankę. Umieść nasadkę w probówce o pojemności 0,5 mililitra wolnej od RNA, wypełnionej 100 mikrolitrami buforu do lizy uzyskanego z wodnego zestawu do mikroizolacji RN. Natychmiast obracaj nakrętkę przez 30 sekund, aby leżała.

Komórki inkubują próbki w temperaturze 42 stopni Celsjusza przez 30 minut i zamrażają w temperaturze minus 80 stopni Celsjusza do momentu izolacji RNA. Procedura barwienia LCM pojedynczych uszkodzonych neuronów po utrwaleniu jest podobna do procedury dla połaci neuronów. Jednak niektóre czasy inkubacji różnią się, a sekcje utrzymywane z fluorem przez cztery minuty przed płukaniem i odwodnieniem, szczegółowe informacje po barwieniu znajdują się w części tekstowej protokołu.

Ponownie wysusz wszystkie sekcje na powietrzu w dygestoriach przez 15 minut. Przed przystąpieniem do LCM w celu przechwycenia pojedynczego ogniwa załaduj nasadki HS LCM do nasadki lub modułu kasety, stosując tę samą procedurę, co w przypadku nasadki makra LCM. Ponownie ustaw rozmiar plamki lasera na mały, aby ustawić ostrość lasera, ale tym razem dostosuj moc i czas trwania lasera do 65 do 75 miliwatów przez 0,45 do 0,5 milisekundy, aby uzyskać optymalne wychwytywanie pojedynczych komórek.

Obróć ramię umieszczające nasadkę nad suwakiem i opuść ramię w dół w kierunku suwaka. Aby umieścić nasadkę na szkiełku, powierzchnia nasadki wychwytującej HS znajduje się wyżej od próbki. Podczas LCM użyj joysticka, aby przesunąć laser nad pojedynczymi dodatnimi ogniwami fluoru.

Wszystkie przechwytywane komórki muszą znajdować się wewnątrz małego czarnego pierścienia na nasadce, wystrzelić laser za pomocą przełącznika kciukowego. Gdy wszystkie komórki w obszarze czarnego koła zostaną wystrzelone za pomocą podnośnika laserowego, ramienia umieszczającego nasadkę, przechwycone komórki oddzielą się od sekcji tkanki i przylgną do wychwytującej nasadki hs. Teraz umieść kolejny szkiełko na stoliku mikroskopu i zbieraj dodatnie komórki fluro-aid, aż nasadka HS będzie pełna.

Następnie umieść nasadkę w probówce wolnej od 0,5 mililitra RNA wypełnionej 40 do 50 mikrolitrami lizy, buforu i wiru oraz inkubatorów, zanim ponownie zamrozić w temperaturze minus 80 stopni Celsjusza. Jeśli nie natychmiast, wykonaj izolację RNA zgodnie z instrukcjami w części tekstowej protokołu. Poniższe obrazy pokazują mikrodysekcję laserową połaci określonych populacji komórek z mózgu szczura zamrożonych 10-mikronowych odcinków koronalnych mózgu szczura.

Zostały przygotowane zgodnie z tym protokołem i zabarwione fioletem wyrostka zębodołowego i plamą pocisku. Ten obraz pokazuje neurony parametaliczne od ca jednego do około trzech podpól hipokampa szczura. W tym miejscu wychwycono komórki ziarniste w zakręcie zębatym hipokampa.

Na koniec pokazujemy połacie neuronów wychwyconych z obustronnych jąder nadchiasmy znajdujących się po obu stronach trzeciej komory i powyżej skrzyżowania wzrokowego. SCN zawiera główny zegar okołodobowy, który kontroluje rytm okołodobowy w całym ciele. Poniższe zdjęcia pokazują mikrodysekcję pojedynczych neuronów z hipokampa szczura za pomocą przechwytywania laserowego.

Pokazane tutaj są degenerujące się fluorkowo-dodatnie hipokampy ca trzy neurony, tutaj przeżywają fluro aid, ujemne około trzy neurony przed i po LCM, które są pokazane, przechwycone komórki są wizualizowane na czapce LCM. Poniższe obrazy przedstawiały analizę ekspresji genów całkowitego RNA, wyizolowanego z neuronów wychwyconych laserowo. Ten obraz przedstawia ilościowe dane PCR w czasie rzeczywistym dotyczące ekspresji genów zegara okołodobowego w SCN.

Ta mapa cieplna ekspresji genów w umierających i ocalałych neuronach hipokampa pokazuje profilowanie ekspresji genów związanych z apoptozą przy użyciu zogniskowanych macierzy PCR. Na koniec pokazujemy przykład mapy cieplnej wygenerowanej na podstawie analizy całego genomu mikromacierzy laryngologicznej ekspresji genów w około jednym do około trzech neuronach od szczurów, które otrzymały pozorowane urazy TBI lub TBI oraz leżącego wirusa siRNA związanego z adeno, zaprojektowanego w celu obniżenia ekspresji neuronalnego tlenku azotu, syntazy lub peroksydazy glutationowej, oba są genami indukowanymi przez uszkodzenie mózgu po jego rozwoju. Techniki te utorowały drogę naukowcom z wielu dziedzin badań, w tym z zakresu urazów mózgu i raka, którzy wykorzystują modele zwierzęce tych zaburzeń do przeprowadzania genomicznego profilowania proteomicznego i metabolicznego określonych populacji komórek.

Na przykład, obecnie używamy tych technik do laserowego wychwytywania określonych populacji komórek z kory przedczołowej i jądra półleżącego obszarów mózgu, o których wiadomo, że są zaangażowane w uzależnienie.