Name: Laserowe wychwytywanie mikrodysekcji wzbogaconych populacji neuronów lub pojedynczych neuronów do analizy ekspresji genów po urazowym uszkodzeniu mózgu (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-04-10T12:00:00.000+00:00
Duration: 13 min 32 s
Description: Poznaj metodę laserowego wychwytywania mikrodysekcji do izolacji neuronów hipokampu z mózgu szczura po urazie. Technika umożliwia analizę ekspresji genów w określonych populacjach komórkowych.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Ta praca jest finansowana przez R01 NS052532 (do HLH), Fundację Moody'ego i Dział Anestezjologii. Dziękujemy Laurie Bolding, Christine Courteau Butler i Christy Perry za ich pomoc redakcyjną oraz Christy Perry za układ i doskonałą produkcję wszystkich rysunków, tabel i grafiki.

1. Zabiegi chirurgiczne i płynowa stymulacja TBI
<ol>
 <li>Wszystkie eksperymenty na zwierzętach są najpierw zatwierdzane przez Instytucjonalny Komitet ds. Opieki nad Zwierzętami i Wykorzystania Oddziału Medycznego Uniwersytetu Teksańskiego w Galveston w Teksasie oraz przez Przewodnik Narodowego Instytutu Zdrowia dotyczący opieki i wykorzystania zwierząt laboratoryjnych (wydanie 8, Krajowa Rada ds. Badań Naukowych).</li>
 <li>Szczury (dorosłe samce szczurów Sprague-Dawley, 400-500 g uzyskane od sprzedawcy Charlesa Riversa, Portland, Maine) są trzymane po dwa w klatce i dostarczane są pożywienie i wodę ad libitum w wiwarium w następujących stałych warunkach: cykl światła (600 godzin do 1800 godzin), temperatura (21 °C do 23 °C) i wilgotność (40% do 50%) na tydzień przed użyciem.</li>
 <li>Znieczulić szczury 4% izofluranem, zaintubować i mechanicznie przewietrzyć (NEMI Scientific; New England Medical Instruments, Medway, MA) szczury z 1,5-2,0% izofluranem w tlenie: powietrze (70:30) i przygotowują je do przystrzałkowego urazu płynowo-uderzeniowego, jak opisano wcześniej. 8,10</li>
 <li>Składanie ofiar ze szczurów w odpowiednim momencie po zranieniu, w zależności od projektu eksperymentalnego. Szybko wyjmij mózgi, natychmiast zamroź na suchym lodzie i przechowuj w temperaturze -80 °C w probówce o pojemności 50 ml lub natychmiast przystąp do zatopienia w OCT w celu zamrożonego podziału.</li>
</ol>
2. Podział i barwienie mózgu szczura
<ol>
 <li>Tkanka mózgowa, która nie jest natychmiast wykorzystywana, może być przechowywana w temperaturze -80 °C przez okres do jednego miesiąca, jeśli jest przechowywana w stałej temperaturze. Mózgi, które są zamrażane w temperaturze -80 °C, następnie rozmrażane do -20 °C w celu podziału, a następnie ponownie zamrażane, nie dają wysokiej jakości RNA po drugim rozmrożeniu. Po rozmrożeniu mózgu, zamontowaniu w OCT i pocięciu na sekcje, szkiełka należy wybarwić w ciągu 24 godzin i użyć do LCM w ciągu 30 minut do jednej godziny od barwienia. Zapewni to dobrą jakość RNA. Po LCM wychwycone komórki na czapeczkach LCM mogą być przechowywane w buforze do lizy w temperaturze -80 °C przez okres do jednego tygodnia, ale RNA powinno być izolowane w odpowiednim czasie, aby zapewnić najwyższą jakość.</li>
 <li>Przed sekcją mózgu przetrzyj kriostat RNase-Zap i wyczyść szczoteczki ETOH (wymień jednorazowe ostrze między każdym mózgiem).</li>
 <li>Pobrać mózg z probówki o pojemności 50 ml z zamrażarki o temperaturze -80 °C; umieścić go w kriostacie w temperaturze -22 °C i rozmrażać w probówce przez około 10 minut. Usunąć mózg z probówki i umieścić na scenie, na gazie, brzuszną stroną do góry.</li>
 <li>Za pomocą żyletki pokrój mózg, aby usunąć tylną część mózgu tylko rostralną do móżdżku i przednią część na skrzyżowaniu wzrokowym. Napełnij kriomold podłożem montażowym OCT (Tissue Tek) i umieść mózg w formie przednią stroną do dołu. Pozwól tkance mózgowej zamrozić się w podłożu mocującym, aż zmieni kolor na biały (około 10 min).</li>
 <li>Zamroź krążek próbki (Tissue Tek) na mózgu za pomocą OCT. Usuń mózg z formy. Włóż mózg do głowicy próbki i dokręć.</li>
 <li>Włóż jednorazowe, niskoprofilowe ostrze (Fisher Scientific) do uchwytu noża i dokręć dźwignię.</li>
 <li>Rozpocznij krojenie mózgu na 20 μm, aby usunąć zewnętrzną warstwę OCT. Po osiągnięciu obszaru hipokampa ustaw pokrętło mikronowe na 10. Zbierz koronalne odcinki szeregowe, umieszczając szkiełko podstawowe lub szkiełko z plusem na przekroju tkanki (Fisher Scientific). Szkiełka są przechowywane w temperaturze -20 °C w stojaku do barwienia bez RNaz do czasu zakończenia cięcia.</li>
 <li>Aby usunąć wszystkie RNazy ze szkła, w którym przetwarzane są skrawki tkanki, przetrzyj wszystkie pojemniki do barwienia i cylindry z podziałką Eliminase (Fisher Scientific) i spłucz w wodzie Milli Q. Przygotuj wszystkie roztwory wodą wolną od RNaz i przefiltruj plamę fioletu krezylowego (Sigma-Aldrich) i fluorojadeitu (Histo-chem) za pomocą filtra 0,2 μm przed użyciem.</li>
 <li>Rozmrażaj skrawki mózgu w RT przez 30 sekund i utrwalaj w 75% ETOH (1 min).</li>
 <li>W przypadku LCM pojedynczych uszkodzonych neuronów po fiksacji spłukać szkiełka w wodzie wolnej od RNaz (1 min), przeciwbarwieć 1% fioletem krezylowym (15-20 sek), spłukać w wodzie wolnej od RNaz (2 × 30 sek.), zabarwić Fluoro-Jade (4 min), spłukać w wodzie wolnej od RNaz (3 × 1 min), odwodnić 95% ETOH wykonanym z wody wolnej od RNaz (30 sek.), 100% ETOH (30 sek.), i ksylenu (2 × 3 min).</li>
 <li>W przypadku LCM połaci neuronów po utrwaleniu spłucz szkiełka w wodzie wolnej od RNaz (1 min), zabarwij 1% fioletem krezylowym (1 min), spłucz wodą wolną od RNaz przez (3 × 1 min), odwodnij 95% ETOH (2 × 30 s), 100% ETOH (2 × 30 s) i ksylenem (2 × 3 min).</li>
 <li>Wysuszyć wszystkie sekcje na powietrzu w dygestorium przez 15 minut przed LCM. Szkiełka można przechowywać sekcjami do góry, w pudełku na slajdy wyłożonym środkiem osuszającym, jeśli zachodzi potrzeba przenoszenia z pokoju do pokoju. Jednak optymalne wyniki uzyskuje się, jeśli LCM wykonuje się natychmiast po wyschnięciu sekcji. LCM powinien być ograniczony od 30 minut do 1 godziny. W następnej sekcji opiszemy najpierw, jak uchwycić ciągłe połacie komórek, co jest najłatwiejsze do opanowania dla tych, którzy uczą się tej techniki. Następnie opisujemy, jak precyzyjnie uchwycić pojedyncze neurony. W naszej procedurze identyfikujemy umierające neurony na podstawie ich powinowactwa do Fluoro-Jade-markera degeneracji neuronów. Zakłada się, że komórki fluoro-jadeitowo-ujemne są neuronami, które przeżyły.</li>
</ol>
3. Mikrodysekcja laserowa (LCM)
LCM połaci wzbogaconych populacji neuronów hipokampa
<ol>
 <li>LCM wykonywany jest przy użyciu mikroskopu PixCell IIe z laserem diodowym na podczerwień (Life Technologies).</li>
 <li>Ustaw środkowy joystick w pozycji pionowej. Obróć i zablokuj obiektyw 4X na swoim miejscu.</li>
 <li>Umieść szkiełko na środku stolika mikroskopu i ręcznie wyreguluj, aż obszar hipokampa będzie widoczny. Użyj zgrubnej i precyzyjnej regulacji ostrości, aby ustawić ostrość obrazu.</li>
 <li>Aktywuj uchwyt podciśnieniowy, naciskając przycisk podciśnienia na sterowniku. Obróć i zablokuj obiektyw 10X na miejscu. Ponownie ustaw ostrość za pomocą zgrubnych i precyzyjnych regulacji.</li>
 <li>Załaduj nasadki CapSure Macro LCM (Life Technologies) do modułu kasety CapSure i umieść nasadkę w pozycji linii ładowania. Obróć ramię do umieszczania nasadki i ustaw wokół nasadki. Podnieś ramię do umieszczania nasadki, aby zdjąć nasadkę CapSure z modułu kasety.</li>
 <li>Obróć ramię do umieszczania nasadki nad suwakiem i opuść ramię w dół nad suwakiem; spowoduje to umieszczenie nasadki na suwaku. Dostosuj precyzyjną ostrość i przesuń joystick, aby sprawdzić, czy komórki znajdują się w czarnym kółku na nasadce. Wszystkie przechwycone komórki powinny znajdować się w tym czarnym okręgu.</li>
 <li>Ustaw parametry lasera. Najpierw naciśnij przycisk włączania lasera na kontrolerze. Plamka celu laserowego będzie widoczna jako różowa kropka w polu view na monitorze komputera.</li>
 <li>Ustaw rozmiar plamki lasera na mały (7,5 μm), aby ustawić ostrość lasera i dostosuj moc i czas trwania do 65 - 75 mW, przez 1,0-2,0 ms w razie potrzeby dla optymalnego wychwytywania komórek.</li>
 <li>Aby przetestować laser, użyj joysticka, aby przesunąć plamkę lasera do obszaru, w którym nie ma komórek do podniesienia. Odpal laser za pomocą przełącznika kciukowego. Użyj joysticka, aby odsunąć plamkę lasera od plamki stopionego polimeru i sprawdź, czy widoczny ciemny pierścień otacza czysty obszar, w którym laser został wystrzelony.</li>
 <li>Aby przechwycić komórki, użyj joysticka, aby przesunąć plamkę lasera nad obszarem komórek, które chcesz przechwycić. Odpal laser za pomocą przełącznika kciukowego. Poruszaj joystickiem podczas odpalania lasera, aby uchwycić duży obszar komórek. Po wystrzeleniu laser topi termoplastyczną folię polimerową na nasadce na powierzchni komórek docelowych. Polimer pochłania promieniowanie laserowe, nie zmieniając w ten sposób RNA, DNA ani białka, zapewniając integralność próbki do przyszłych zastosowań molekularnych.</li>
 <li>Po wystrzeleniu wszystkich interesujących komórek podnieś ramię umieszczania nasadki. Uchwycone komórki oddzielą się od części tkanki i przylgną do nasadki CapSure. Pozostała tkanka i brakujące komórki będą widoczne w polu widzenia. Komórki na nasadce można również wyświetlić, umieszczając nasadkę na pustej części szkiełka.</li>
 <li>Podnieś ramię do umieszczania nasadki i obróć je do stacji rozładunku nasadki. Opuść nasadkę do stacji i obróć ramię do umieszczania nasadki z powrotem do poprzedniej pozycji.</li>
 <li>Przesuń narzędzie do wkładania CapSure wzdłuż platformy i na nasadkę. Podnieś narzędzie z platformy. Nasadka pozostanie przymocowana. Delikatnie przyłóż nasadkę do wkładki CapSure clean, aby usunąć niechcianą tkankę.</li>
 <li>Umieść nakrętkę w 0,5 ml probówce wolnej od RNaz wypełnionej 100 μl buforu do lizy uzyskanego z zestawu do mikroizolacji RNAqueous. Natychmiast wiruj nasadkę przez 30 sekund, aby zlizować komórki. Próbki inkubować w temperaturze 42 °C przez 30 minut i zamrażać w temperaturze -80 °C do czasu izolacji RNA.</li>
</ol>
LCM pojedynczych neuronów FJ+ w hipokampie
<ol start="15">
 <li>Aby przechwycić pojedyncze ogniwa, załaduj nasadki CapSure HS LCM do modułu kasety CapSure i umieść nasadkę w pozycji linii ładowania. Obróć ramię do umieszczania nasadki i umieść je wokół nasadki. Podnieś ramię do umieszczania nasadki, aby zdjąć nasadkę CapSure z modułu kasety.</li>
 <li>Ustaw rozmiar plamki lasera na mały (7,5 μm), aby ustawić ostrość lasera i dostosuj moc i czas trwania lasera do 65 -75 mW przez 0,45 do 0,50 ms, aby uzyskać optymalne wychwytywanie pojedynczych komórek.</li>
 <li>Obróć ramię do umieszczania nasadki nad suwakiem i opuść ramię w dół w kierunku suwaka. Spowoduje to umieszczenie nasadki na szkiełku. Powierzchnia nasadki Capsure HS znajduje się uniesiona w stosunku do próbki podczas LCM.</li>
 <li>Użyj joysticka, aby przesunąć laser nad pojedynczymi ogniwami FJ+. Wszystkie przechwytywane komórki muszą znajdować się wewnątrz małego czarnego pierścienia na nasadce. Odpal laser za pomocą przełącznika kciukowego.</li>
 <li>Gdy wszystkie komórki w obszarze czarnego koła zostaną wystrzelone laserem, podnieś ramię umieszczania nasadki. Uchwycone komórki oddzielą się od części tkanki i przylgną do nasadki CapSure HS.</li>
 <li>Umieść kolejny szkiełko na stoliku mikroskopu i zbieraj komórki FJ+, aż nasadka HS będzie pełna. Umieść nakrętkę w 0,5 ml probówce wolnej od RNaz wypełnionej 40-50 μl buforu do lizy. Natychmiast wiruj nasadkę przez 30 sekund, aby zlizować komórki. Próbki inkubować w temperaturze 42 °C przez 30 minut i zamrażać w temperaturze -80 °C do czasu izolacji RNA.</li>
</ol>
4. Całkowita izolacja RNA z próbek LCM (Ta sekcja zostanie opisana w prezentacji wideo)
<ol>
 <li>Całkowite RNA z komórek izoluje się za pomocą zestawu RNAqueous-Micro Kit (Ambion) zgodnie z protokołami producenta. Wszystkie odczynniki i roztwory myjące znajdują się w tym zestawie. Wstępnie zwilż zespół wkładu mikrofiltra, dodając do filtra 30 μl buforu roztworu do lizy. Po 5 minutach odwirować filtr przez 30 sekund przy 10 000 × g.</li>
 <li>Dodać 3 μl dodatku LCM do lizatu próbki, odpipetować do wymieszania i odwirować.</li>
 <li>Dodać 52 μl 100% ETOH (1/2 objętości) do lizatu próbki; odpipetować do wymieszania i przenieść lizat do kolumny filtrującej.</li>
 <li>Odwirować kolumnę filtrującą o stężeniu 10 000 × g przez 1 minutę, aby związać RNA z kolumną. Jeżeli na jedną próbkę przypada wiele nasadek, należy oddzielnie przepuścić każdy lizat przez tę samą kolumnę.</li>
 <li>Wykonaj procedurę izolacji RNA zgodnie z opisem w zestawie RNAqueous Micro.</li>
 <li>Przeprowadzić obróbkę DNazą i inaktywację DNazy próbek RNA LCM zgodnie z opisem w zestawie, przenieść RNA do probówki wolnej od RNaz i przechowywać w temperaturze -80 °C.</li>
</ol>
5. Kwantyfikacja RNA i dalsze zastosowania
Ocena jakości RNA i kwantyfikacji jest przeprowadzana za pomocą Bioanalizatora Agilent przy użyciu odczynników z zestawu Pico (Agilent Technologies, Santa Clara, CA) zgodnie z protokołem producenta.
<ol>
 <li>Całkowite RNA jest analizowane na bioanalizatorze Agilent Bioanalyzer 2100 (Agilent Technologies). Oprogramowanie ocenia stężenie i integralność próbki RNA, przypisując każdej próbce numer integralności RNA (RIN) w zakresie od 1 do 10. 1-5 oznacza zdegradowany RNA, a 7-10 oznacza RNA dobrej jakości.</li>
 <li>Niezdegradowany, nienaruszony RNA zostanie wykorzystany do Real-Time PCR; indywidualnych testów Taqmana lub matryc profilujących RT2 przy użyciu chemii Sybr-green. RNA może być również używany do analizy mikromacierzy mRNA i analizy mikromacierzy mikroRNA.</li>
</ol>

<ol><li>Squire, L. R., Stark, C. E., Clark, R. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+medial+temporal+lobe%5BTitle%5D)+AND+%22Annual+Review+of+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">The medial temporal lobe.</a> Annual Review of Neuroscience. 27, 279-306 (2004).</li>
<li>Bast, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Toward+an+integrative+perspective+on+hippocampal+function%3A+from+the+rapid+encoding+of+experience+to+adaptive+behavior%5BTitle%5D)+AND+%22Rev.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Toward an integrative perspective on hippocampal function: from the rapid encoding of experience to adaptive behavior.</a> Rev. Neurosci. 18 (3-4), 253-281 (2007).</li>
<li>Emmert-Buck, M. R., Bonner, R. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Laser+capture+microdissection%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Laser capture microdissection.</a> Science. 274 (5289), 998-1001 (1996).</li>
<li>Bota, M., Dong, H. W., Swanson, L. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((From+gene+networks+to+brain+networks%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">From gene networks to brain networks.</a> Nat. Neurosci. 6 (8), 795-799 (2003).</li>
<li>Schouten, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neuroprotection+in+traumatic+brain+injury%3A+a+complex+struggle+against+the+biology+of+nature%5BTitle%5D)+AND+%22Curr.+Opin.+Crit.+Care%22%5BJournal%5D)">Neuroprotection in traumatic brain injury: a complex struggle against the biology of nature.</a> Curr. Opin. Crit. Care. 13 (2), 134-142 (2007).</li>
<li>Schmued, L. C., Albertson, C., Slikker, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fluoro-Jade%3A+a+novel+fluorochrome+for+the+sensitive+and+reliable+histochemical+localization+of+neuronal+degeneration%5BTitle%5D)+AND+%22Brain+Research%22%5BJournal%5D)">Fluoro-Jade: a novel fluorochrome for the sensitive and reliable histochemical localization of neuronal degeneration.</a> Brain Research. 751 (1), 37-46 (1997).</li>
<li>Ye, X., Carp, R. I., Schmued, L. C., Scallet, A. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fluoro-Jade+and+silver+methods%3A+application+to+the+neuropathology+of+scrapie%2C+a+transmissible+spongiform+encephalopathy%5BTitle%5D)+AND+%22Brain+Res.+Brain+Res.+Protoc%22%5BJournal%5D)">Fluoro-Jade and silver methods: application to the neuropathology of scrapie, a transmissible spongiform encephalopathy.</a> Brain Res. Brain Res. Protoc. 8 (2), 104-112 (2001).</li>
<li>Shimamura, M., Garcia, J. M., Prough, D. S., Hellmich, H. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Laser+capture+microdissection+and+analysis+of+amplified+antisense+RNA+from+distinct+cell+populations+of+the+young+and+aged+rat+brain%3A+effect+of+traumatic+brain+injury+on+hippocampal+gene+expression%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Brain+Res%22%5BJournal%5D)">Laser capture microdissection and analysis of amplified antisense RNA from distinct cell populations of the young and aged rat brain: effect of traumatic brain injury on hippocampal gene expression.</a> Mol. Brain Res. 17 (1), 47-61 (2004).</li>
<li>Alder, J., Fujioka, W., Lifshitz, J., Crockett, D. P., Thakker-Varia, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lateral+Fluid+Percussion%3A+Model+of+Traumatic+Brain+Injury+in+Mice%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis.+Exp%22%5BJournal%5D)">Lateral Fluid Percussion: Model of Traumatic Brain Injury in Mice.</a> J. Vis. Exp. (54), e3063(2011).</li>
<li>Shimamura, M., Garcia, J. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analysis+of+long-term+gene+expression+in+neurons+of+the+hippocampal+subfields+following+traumatic+brain+injury+in+rats%5BTitle%5D)+AND+%22Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Analysis of long-term gene expression in neurons of the hippocampal subfields following traumatic brain injury in rats.</a> Neuroscience. 131 (1), 87-97 (2005).</li>
<li>Shah, S. A., Prough, D. S., Garcia, J. M., DeWitt, D. S., Hellmich, H. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+correlates+of+age-specific+responses+to+traumatic+brain+injury+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Exp.+Gerontol%22%5BJournal%5D)">Molecular correlates of age-specific responses to traumatic brain injury in mice.</a> Exp. Gerontol. 41 (11), 1201-125 (2006).</li>
<li>Hellmich, H. L., Garcia, J. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Traumatic+brain+injury+and+hemorrhagic+hypotension+suppress+neuroprotective+gene+expression+in+injured+hippocampal+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22Anesthesiology%22%5BJournal%5D)">Traumatic brain injury and hemorrhagic hypotension suppress neuroprotective gene expression in injured hippocampal neurons.</a> Anesthesiology. 102 (4), 806-814 (2005).</li>
<li>Rojo, D. R., Prough, D. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Influence+of+stochastic+gene+expression+on+the+cell+survival+rheostat+after+traumatic+brain+injury%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Influence of stochastic gene expression on the cell survival rheostat after traumatic brain injury.</a> PLoS One. 6 (8), e2311(2011).</li>
<li>Elstner, M., Morris, C. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Expression+analysis+of+dopaminergic+neurons+in+Parkinson%27s+disease+and+aging+links+transcriptional+dysregulation+of+energy+metabolism+to+cell+death%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Neuropathol%22%5BJournal%5D)">Expression analysis of dopaminergic neurons in Parkinson's disease and aging links transcriptional dysregulation of energy metabolism to cell death.</a> Acta Neuropathol. 122 (1), 75-86 (2011).</li>
<li>Chen, H., Liu, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genome-Wide+Gene+Expression+Profiling+of+Nucleus+Accumbens+Neurons+Projecting+to+Ventral+Pallidum+Using+both+Microarray+and+Transcriptome+Sequencing%5BTitle%5D)+AND+%22Front.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Genome-Wide Gene Expression Profiling of Nucleus Accumbens Neurons Projecting to Ventral Pallidum Using both Microarray and Transcriptome Sequencing.</a> Front. Neurosci. 5, 98(2011).</li>
<li>Lein, E. S., Hawrylycz, M. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genome-wide+atlas+of+gene+expression+in+the+adult+mouse+brain%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Genome-wide atlas of gene expression in the adult mouse brain.</a> Nature. 445 (7124), 168-176 (2007).</li>
<li>Amaral, D. G., Ishizuka, N., Claiborne, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neurons%2C+numbers+and+the+hippocampal+network%5BTitle%5D)+AND+%22Prog.+Brain+Res%22%5BJournal%5D)">Neurons, numbers and the hippocampal network.</a> Prog. Brain Res. 83, 1-11 (1990).</li>
<li>Zeng, Y. C., Bongrani, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effect+of+long-term+treatment+with+L-deprenyl+on+the+age-dependent+microanatomical+changes+in+the+rat+hippocampus%5BTitle%5D)+AND+%22Mech.+Ageing+Dev%22%5BJournal%5D)">Effect of long-term treatment with L-deprenyl on the age-dependent microanatomical changes in the rat hippocampus.</a> Mech. Ageing Dev. 79 (2-3), 169-185 (1995).</li>
<li>Schmued, L. C., Hopkins, K. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fluoro-Jade%3A+novel+fluorochromes+for+detecting+toxicant-induced+neuronal+degeneration%5BTitle%5D)+AND+%22Toxicol.+Pathol%22%5BJournal%5D)">Fluoro-Jade: novel fluorochromes for detecting toxicant-induced neuronal degeneration.</a> Toxicol. Pathol. 28 (1), 91-99 (2000).</li>
<li>Banks, R. E., Dunn, M. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+potential+use+of+laser+capture+microdissection+to+selectively+obtain+distinct+populations+of+cells+for+proteomic+analysis--+preliminary+findings%5BTitle%5D)+AND+%22Electrophoresis%22%5BJournal%5D)">The potential use of laser capture microdissection to selectively obtain distinct populations of cells for proteomic analysis-- preliminary findings.</a> Electrophoresis. 20 (4-5), 689-700 (1999).</li>
<li>Fend, F., Emmert-Buck, M. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Immuno-LCM%3A+laser+capture+microdissection+of+immunostained+frozen+sections+for+mRNA+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Am.+J.+Pathol%22%5BJournal%5D)">Immuno-LCM: laser capture microdissection of immunostained frozen sections for mRNA analysis.</a> Am. J. Pathol. 154 (1), 61-66 (1999).</li>
</ol>

Autorzy oświadczają, że nie pozostają w konflikcie interesów.

Ta technika LCM umożliwiła nam poczynienie znacznych postępów w zrozumieniu mechanizmów molekularnych TBI. 8,10,11,12,13 Byliśmy pierwszymi badaczami, którzy wykorzystali tę technikę do wykazania, że różne podregiony hipokampa szczura mają profile ekspresji genów, które korelują z ich selektywną podatnością na uszkodzenia. Nasze badania wykazały, że możemy określić ilościowo ekspresję genów za pomocą qPCR z zaledwie 10 komórek wychwyconych laserowo i że możemy przeprowadzić analizę mikromacierzy całego genomu z zaledwie 600 przechwyconych komórek. LCM byłby cennym narzędziem w podobnych badaniach innych regionów mózgu, o których wiadomo, że są zaangażowane w różne zaburzenia neurologiczne i neuropsychiatryczne. Na przykład, badania z użyciem LCM rzuciły światło na patogenezę choroby Parkinsona w neuronach dopaminowych istoty czarnej i pomogły w badaniach profilowania całego genomu jądra półleżącego, które jest zaangażowane w obwody nagrody związane z zaburzeniami związanymi z nadużywaniem substancji. 15
Heterogeniczność neuronów znajduje odzwierciedlenie na poziomie genomu16 i może przyczyniać się do braku powodzenia eksperymentalnych metod leczenia TBI w badaniach klinicznych. Dlatego naszym celem jest wykorzystanie tej techniki do zbadania krytycznych elementów wpływających na przeżycie neuronów po TBI. Nasze niedawne badanie profilowania całego genomu umierających i sąsiednich neuronów hipokampa, które przeżyły po TBI, sugerowało, że reostat komórkowy, który odzwierciedla stosunek poziomów ekspresji genów przeżycia komórki do śmierci komórki, reguluje los komórki po TBI. Trwające badania przyczynią się do zaprojektowania i opracowania strategii farmakoterapeutycznych, które mogą pozytywnie wpłynąć na reostat przeżywalności komórek. Co więcej, obecnie używamy LCM do śledzenia i monitorowania efektów potencjalnych terapii lekowych w neuronach hipokampa po TBI. W związku z tym nasze badania pokazują, że przy ostrożnych technikach obchodzenia się z RNazami i pewnych modyfikacjach istniejących protokołów, możliwe jest uzyskanie wysokiej jakości próbek RNA z LCM w celu dokładnej ilościowej analizy ekspresji genów.
Istnieje jednak kilka pułapek związanych z technikami LCM. Na przykład pobranie tylko komórek neuronalnych bez zanieczyszczenia mikroglejem może być prawie niemożliwe. Szacuje się, że w piramidalnej warstwie komórkowej hipokampa 95% komórek to neurony, przy czym 90% tej populacji to komórki piramidalne, a 10% to interneurony, pozostawiając niewielki odsetek komórek glejowych i innych typów komórek. 8,17,18 W naszych badaniach używamy fluoro-jadeitu, barwnika fluorescencyjnego, który specyficznie znakuje tylko uszkodzone neurony w tkance mózgowej. Do barwienia mikrogleju potrzebna byłaby inna plama, która jest markerem GFAP. 19 Zbieranie tylko pojedynczych ciał neuronalnych barwionych fluoro-jadeitem zapewnia bardziej jednorodną populację neuronów. Innym częstym problemem, który może wymagać rozwiązania problemu, jest to, że okrąg nie jest zdefiniowany podczas wystrzeliwania lasera. W takim przypadku należy sprawdzić ustawienia lasera i w razie potrzeby dostosować moc i czas trwania. Ważne jest również, aby upewnić się, że nasadka jest umieszczona płasko na tkance i prawidłowo osadzona w ramieniu. Czasami konieczne będzie zapoznanie się z instrukcją techniczną LCM lub skontaktowanie się z pomocą techniczną. Po izolacji LCM i RNA jakość RNA powinna być zawsze oceniana za pomocą bioanalizatora przed jakąkolwiek analizą ekspresji genów.
Obecnie na rynku dostępnych jest kilka rodzajów przyrządów do przechwytywania laserowego, w tym instrumenty do cięcia laserowego (Life Technologies, Leica Microsystems) i katapultowania laserowego (Zeiss). Nasz system LCM dobrze sprawdza się w przypadku przechwytywania niewielkiej liczby komórek. Inne wysokowydajne i bardziej zautomatyzowane systemy mogą być bardziej odpowiednie do uzyskiwania większej liczby komórek do analizy genomicznej, a zwłaszcza proteomicznej. Rzeczywiście, LCM wykorzystujący te zautomatyzowane systemy ma ogromny potencjał w zakresie analizy ekspresji białek w zidentyfikowanych komórkach lub wzbogaconych populacjach komórek. Co więcej, LCM może ułatwić analizę ekspresji genów w komórkach znakowanych immunologicznie,21 co pozwala nam badać ekspresję genów w zdefiniowanych typach komórek, niezależnie od złożoności w najbardziej heterogenicznych tkankach. Tym samym LCM jest doskonałym narzędziem do najnowocześniejszych badań molekularnych pojedynczych lub wzbogaconych populacji komórek.

Analiza ekspresji genów w heterogenicznych tkankach zawsze była problematyczna; jest to szczególnie prawdziwe w mózgu ssaków, który ma około 5 000 różnych typów komórek. 4 Przed opracowaniem techniki mikrodysekcji wychwytu laserowego (LCM) badania genomiczne skutków TBI in vivo opierały się na analizie ekspresji genów w mieszanej populacji komórek mózgowych składającej się nie tylko z różnych typów komórek neuronalnych, ale także z komórek podtrzymujących glejowo i immunomodulujących. Uzyskane w ten sposób złożone profile ekspresji genów uzyskane z tych heterogenicznych tkanek oraz często sprzeczne wzorce sygnałów komórkowych wywołanych urazem mogą być jednym z wyjaśnień niepowodzenia w badaniach klinicznych na ludziach strategii terapeutycznych, które okazały się skuteczne w badaniach przedklinicznych TBI. 5
Aby uzyskać jasne zrozumienie ekspresji genów wywołanych urazami w wrażliwych populacjach neuronów z hipokampa szczura, zastosowaliśmy technikę LCM, po raz pierwszy opisaną przez Emmert-Buck i wsp. 3 Następnie zmodyfikowaliśmy i zoptymalizowaliśmy tę technikę mikrodysekcji w celu skutecznego wychwytywania wzbogaconych populacji neuronów i pojedynczych neuronów do profilowania mRNA za pomocą ilościowej reakcji PCR w czasie rzeczywistym i analizy mikromacierzy. Aby zachować integralność mRNA w zamrożonych odcinkach tkanki mózgowej do analizy genomicznej, zmodyfikowaliśmy istniejące protokoły utrwalania, barwienia i szybkiego wychwytywania neuronów z zamrożonych odcinków mózgu szczura. W celu identyfikacji i izolacji uszkodzonych i umierających neuronów hipokampa zoptymalizowaliśmy również technikę barwienia fluoro-jadeitowego dla LCM. Jadeit fluorowy nie rozróżnia apoptozy i martwiczej śmierci komórek. W ten sposób wszystkie typy degenerujących się neuronów mogą być wykryte przez to barwienie. 6,7
Tutaj opisujemy protokół używany w naszym laboratorium do uzyskiwania pul pojedynczych umierających lub ocalałych neuronów, a także połaci wzbogaconych populacji różnych typów komórek neuronalnych (np. neuronów CA1-CA3 do analizy ekspresji genów po TBI). Procedura uszkodzenia mózgu spowodowanego płynną udarem płuc wykonywana w naszym laboratorium jest szczegółowo opisana w Shimamura i wsp.8 i jest bardzo podobna do protokołu bocznego uszkodzenia płynu i wsp. dla myszy opublikowanego w JoVE przez Aldera i wsp. 9 Ponieważ wykazano, że technika LCM ma minimalny lub żaden wpływ na integralność DNA, RNA i białka w tkankach, jest to doskonałe narzędzie do analizy molekularnej i białkowej określonych typów komórek.

Mikroskop laserowy <table><tbody><tr><td>PixCell IIe</td><td>Life Technologies (Arcturus)</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Bioanalizator Agilent 2100</td><td>Agilent Technologies</td><td></td><td></td></tr><tr><td>RNAqueous Micro- Kit</td><td>Life Technologies (Ambion)</td><td>AM1931</td><td></td></tr><tr><td>Zestaw Agilent 6000 Pico</td><td>Agilent Technologies</td><td>5067-1513</td><td></td></tr><tr><td>Capsure LCM</td><td>Applied Biosystems</td><td>LCM0211/LCM0214</td><td></td></tr><tr><td>Fluoro-Jade</td><td>Histo-chem Inc.</td><td></td><td></td>#1FJ</tr><tr><td>Octan fioletu krezylowego</td><td>Sigma-aldrich</td><td>C5042-10G</td><td></td></tr><tr><td>Ksylen (klasa histologiczna)</td><td>Fisher Scientific</td><td>X3P-1GAL</td><td></td></tr><tr><td>Etanol 200 proof (klasa histologiczna)</td><td>UTMB apteka</td><td></td><td></td>UTMB</tr><tr><td>Barierowe końcówki do pipet bez RNaz</td><td>Fisher Scientific</td><td>2123635, 212364, 212361, 21-236-2A</td><td></td></tr><tr><td colspan="4"><a href="http://tools.invitrogen.com/content/sfs/brochures/cms_086283.pdf" target="_blank">System mikrodysekcji laserowej Arcturus (Life Technologies)</a> <a href="http://microscopy.zeiss.com/microscopy/en_de/downloads/brochure-downloads.html?catalog=laser_microdissection" target="_blank">Mikrodysekcja laserowa Zeiss Rodzina PALM </a> <a href="http:// www.leica-microsystems.com/fileadmin/downloads/Leica%20DM6000%20B/Brochures/Leica_DM4000-6000_B-Brochure_en.pdf" target="_blank">Leica Microsystems</a></td></tr></tbody></table>

laserowe wychwytywanie mikrodysekcji wzbogaconych populacji neuronów lub pojedynczych neuronów do analizy ekspresji genów po urazowym uszkodzeniu mózgu

Laser Capture Microdissection of Enriched Populations of Neurons or Single Neurons for Gene Expression Analysis After Traumatic Brain Injury

Długotrwała niepełnosprawność poznawcza po TBI jest związana z wywołaną urazem neurodegeneracją w hipokampie - regionie w przyśrodkowym płacie skroniowym, który jest krytyczny dla uczenia się, pamięci i funkcji wykonawczych. 1,2 Dlatego nasze badania koncentrują się na analizie ekspresji genów w określonych populacjach neuronów w różnych podregionach hipokampa. Technika mikrodysekcji wychwytu laserowego (LCM), wprowadzona w 1996 roku przez Emmert-Buck i wsp.3, pozwoliła na znaczny postęp w analizie ekspresji genów pojedynczych komórek i wzbogaceniu populacji komórek z heterogenicznych tkanek, takich jak mózg ssaków, który zawiera tysiące funkcjonalnych typów komórek. 4 Używamy LCM i dobrze znanego szczurzego modelu urazowego uszkodzenia mózgu (TBI) do zbadania mechanizmów molekularnych, które leżą u podstaw patogenezy TBI. Po TBI z płynną interakcją mózgi są usuwane w określonym czasie po urazie, natychmiast zamrażane na suchym lodzie i przygotowywane do sekcji w kriostacie. Mózgi szczurów mogą być osadzone w OCT i natychmiast podzielone na sekcje lub przechowywane przez kilka miesięcy w temperaturze -80 °C przed sekcją w celu wychwytywania laserowego mikrodysekcji. Dodatkowo używamy LCM do badania wpływu TBI na rytmy okołodobowe. W tym celu wychwytujemy neurony z jąder nadskrzyżowaniowych, które zawierają główny zegar mózgu ssaków. Tutaj demonstrujemy zastosowanie LCM do uzyskania pojedynczych zidentyfikowanych neuronów (uszkodzonych i degenerujących, fluoro-jadeitowo-dodatnich lub nieuszkodzonych, fluoro-jadeitowych) oraz wzbogaconych populacji neuronów hipokampa do późniejszej analizy ekspresji genów za pomocą PCR w czasie rzeczywistym i / lub mikromacierzy całego genomu. Te badania z wykorzystaniem LCM ujawniły, że selektywna podatność anatomicznie odrębnych regionów hipokampa szczura znajduje odzwierciedlenie w różnych profilach ekspresji genów różnych populacji neuronów uzyskanych przez LCM z tych odrębnych regionów. Wyniki naszych badań na pojedynczych komórkach, w których porównujemy profile transkrypcyjne umierających i sąsiednich neuronów hipokampa, które przeżyły, sugerują istnienie reostatu przeżycia komórki, który reguluje śmierć i przeżycie komórki po TBI.

W naszym pierwszym badaniu z wykorzystaniem LCM udało nam się wykazać, że funkcjonalnie odrębne podregiony (CA1 i CA3) hipokampa szczura posiadają profile ekspresji genów odzwierciedlające ich podatność na TBI.8 Rycina 1A-1C przedstawia mikrodysekcję laserową neuronów piramidowych hipokampa (CA1-CA3), neuronów zakrętu zębatego oraz neuronów SCN przed i po LCM. Czyste przechwyty neuronów piramidowych, ziarnistych lub SCN są widoczne odpowiednio na nakładkach makroskopowych. Rycina 2A-2B ilustruje obumierające, pozytywne pod względem Fluoro-Jade neurony piramidowe oraz przeżywalne, negatywne pod względem Fluoro-Jade neurony piramidowe przed i po LCM. Czysty przechwyt neuronów obumierających lub przeżywalnych jest widoczny podczas oglądania przechwyconych komórek na nakładkach LCM.
Po LCM całkowite RNA można wykorzystać do szerokiego zakresu badań molekularnych, w tym do ilościowej analizy ekspresji genów metodą real-time PCR z wykorzystaniem chemii TaqMan lub SYBR green (Rysunek 3A), niewielkich ukierunkowanych tablic PCR z sondami SYBR green (Rysunek 3B) lub badań całego genomu za pomocą mikromacierzy (Rysunek 3C).
<img alt="Hipokamp, przechwytywanie komórek zakrętu zębatego, schemat obrazowania jąder; proces ekstrakcji komórek histologicznych." fo:content-width="3in" fo:src="/files/ftp_upload/50308/50308fig1large.jpg" src="/files/ftp_upload/50308/50308fig1.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Rysunek 1"> 
Rysunek 1. Laserowa mikrodysekcja przechwytywania pasm określonych populacji komórek z mózgu szczura. Zamrożone koronalne skrawki mózgu szczura o grubości 10 μm są utrwalone w etanolu, barwione metodą Nissla (fiolet krezylu) i przygotowane do LCM. Przedstawiono zdjęcia hipokampa i jądra nadskrzyżowaniowego szczura przed i po LCM oraz przechwycone komórki zwizualizowane na nakładkach makroskopowych. A. Neurony piramidowe z pól CA1-CA3 hipokampa szczura. B. Komórki ziarniste w zakręcie zębatem hipokampa. C. Obustronne jądra nadskrzyżowaniowe położone po obu stronach trzeciej komory i powyżej skrzyżowania wzrokowego. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/50308/50308fig1large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększony rysunek</a>.
<img alt="Cell separation experiment; before and after micrographs; captured cells analysis; microscopy." fo:content-width="3in" fo:src="/files/ftp_upload/50308/50308fig2large.jpg" src="/files/ftp_upload/50308/50308fig2.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Figure 2"> 
Rycina 2. Mikrodysekcja wspomagana laserem pojedynczych neuronów z hipokampa szczura. Przedstawiono A. degenerujące, fluoro-jade-dodatnie (obarwione) neurony obszaru CA3 hipokampa i B. Przeżyjące, Fluoro-Jade-ujemne (niebarwione) neurony obszaru CA3 przed i po mikrodissekcji laserowej (LCM). Zobrazowano wyizolowane komórki. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/50308/50308fig2large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększony schemat</a>.
<img alt="Analiza ekspresji genów; cykle fluorescencji qPCR, klastrowanie na mapie ciepła, poziomy ekspresji." fo:content-width="6.5in" fo:src="/files/ftp_upload/50308/50308fig3large.jpg" src="/files/ftp_upload/50308/50308fig3.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Rysunek 3"> 
Rysunek 3. Analiza ekspresji genów w całkowitym RNA wyizolowanym z neuronów pobranych metodą laserowej mikrodysekcji. A. Dane ilościowej PCR w czasie rzeczywistym dla ekspresji genów zegara okołodobowego w SCN. B. Mapa ciepła ekspresji genów w obumierających i przeżywających neuronach hipokampa, wykazująca ekspresję genów związanych z apoptozą z wykorzystaniem ukierunkowanych macierzy PCR. C. Analiza ekspresji genów za pomocą mikromacierzy całego genomu Agilent w neuronach obszarów CA1-CA3 hipokampa szczurów, które poddano zabiegowi pozorowanemu, TBI lub TBI wraz z rekombinowanym wirusem adeno-asocjowanym siRNA zaprojektowanym do wyciszenia ekspresji genów indukowanych urazem mózgu (syntazy tlenku azotu neuronalnej oraz peroksydazy glutationowej-1). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/50308/50308fig3large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby zobaczyć powiększony rysunek</a>.

Opisujemy, jak korzystać z mikrodysekcji laserowej (LCM) w celu uzyskania wzbogaconych populacji neuronów hipokampa lub pojedynczych neuronów z zamrożonych fragmentów uszkodzonego mózgu szczura do późniejszej analizy ekspresji genów przy użyciu ilościowego PCR w czasie rzeczywistym i/lub mikromacierzy całego genomu.

Laserowe wychwytywanie mikrodysekcji wzbogaconych populacji neuronów lub pojedynczych neuronów do analizy ekspresji genów po urazowym uszkodzeniu mózgu

Long-term cognitive disability after TBI is associated with injury-induced neurodegeneration in the hippocampus-a region in the medial temporal lobe that ...

Ogólnym celem tej procedury jest pokazanie, w jaki sposób uzyskać wzbogacone populacje neuronów hipokampa i pojedynczych neuronów z zamrożonych skrawków tkanek za pomocą mikrodysekcji laserowej do późniejszej analizy ekspresji genów. Osiąga się to poprzez pierwsze znieczulenie, szczura w komorze anestezjologicznej. Szczur jest następnie intubowany, wentylowany mechanicznie i umieszczany w stereotaktycznym uchwycie głowy, aby przygotować szczura Do płynnego uszkodzenia mózgu wykonuje się kraniotomię.Drugim krokiem jest podanie płynnego uszkodzenia mózgu spowodowanego uderzeniem. Następnie wycinki koronalne mózgu są wycinane na kriostacie i barwione fluro aid, markerem degenerujących się neuronów, lub rzeczywistym fioletem, barwnikiem pociskowym. Ostatnim krokiem jest wykonanie mikropreparacji laserowej i pobranie pojedynczych neuronów lub pul neuronów.Ostatecznie całkowite RNA jest izolowane z wychwyconych komórek, analizowane pod kątem jakości i oznaczane ilościowo za pomocą bioanalizatora Agilent i wykorzystywane w dalszych zastosowaniach, takich jak ilościowy PCR w czasie rzeczywistym i analiza mikromacierzy skoncentrowana na szlaku lub obejmująca cały genom. Główną zaletą tej techniki w porównaniu z istniejącymi metodami, takimi jak ręczna mikropreparacja, jest to, że możemy uzyskać wzbogacone populacje neuronów lub innych typów komórek mózgowych, takich jak komórki glejowe lub immunomodulujące, lub pojedyncze neurony z wycinków tkanek. Pozwala nam to na przeprowadzenie analizy ekspresji genów w odrębnych zidentyfikowanych typach komórek w mózgu oraz w innych heterogenicznych tkankach złożonych z wielu typów komórek, Wykazanie tej procedury zostanie pominięte.Debbie Boone, starszy pracownik naukowy w naszym laboratorium. Najpierw odzyskaj tkankę mózgową uzyskaną od szczurów z płynną opukiwaniem, urazowym uszkodzeniem mózgu lub pozorowanym urazem z zamrażarki o temperaturze minus 80 stopni Celsjusza i przenieś do minus 22 stopni Celsjusza. Kriostat przez 10 minut, aby doprowadzić mózg do temperatury podziału, podczas gdy mózg się rozmraża.Przetrzyj kriostat zapem RNA zawierającym etanol i wyczyść szczotki etanolem. Po upływie 10 minut wyjmij mózg z rurki i umieść go brzuszną stroną do góry na kawałku gazy na etapie kriostatu, użyj świeżej żyletki i pokrój mózg, aby usunąć tylną część mózgu. Tylko rostralnie do móżdżku i przedniej części na skrzyżowaniu wzrokowym.Napełnij formę kriogeniczną podłożem montażowym OCT i umieść mózg w formie przednią stroną do dołu. Pozwól tkance mózgowej zamrozić się w podłożu montażowym, aż zmieni kolor na biały. Powinno to zająć około 10 minut.Teraz zamroź krążek próbki na mózgu za pomocą OCT. Następnie usuń formę. Włóż krążek z zamocowanym mózgiem do głowicy próbki i dokręć.Włóż jednorazowe niskoprofilowe ostrze do uchwytu noża i dokręć dźwignię. Rozpocznij krojenie mózgu na 20 mikronów, aby usunąć zewnętrzną warstwę OCT. Po osiągnięciu obszaru hipokampa ustaw pokrętło mikronowe na 10.Zbierz koronalne sekcje szeregowe, umieszczając szklane szkiełko lub plus szkło. Wsuń na sekcję tkanki. Umieść szkiełka w stojaku do barwienia bez RNA w temperaturze minus 20 stopni Celsjusza, aż do zakończenia cięcia.Przed przystąpieniem do barwienia skrawków wytrzyj wszystkie pojemniki do barwienia i cylindry z podziałką ese i spłucz w wodzie mili Q. Upewnij się, że wszystkie roztwory zostały przygotowane z wodą wolną od RNA i że fiolet wyrostka zębodylnego i barwnik z jadeitu fluorowego przeszły wcześniej przez filtr 0,2 mikrona. Użyj skrawków mózgu Thora w temperaturze pokojowej przez 30 sekund i utrwal w 75% etanolu na jedną minutę.Następnie przejdź do odpowiedniego barwnika przeciw dla LCM albo pasm neuronów, albo pojedynczych neuronów dla LCM połaci neuronów po utrwaleniu, przepłucz szkiełka w wodzie wolnej od RNA przez jedną minutę, barwić 1% fioletem grzebieniastym przez jedną minutę. Płukać w wodzie wolnej od RNA trzy razy przez jedną minutę, za każdym razem odwodnić 95% etanolem dwa razy po 30 sekund. Następnie 100% etanol dwa razy przez 30 sekund i ksylen dwa razy po trzy minuty.Po zabarwieniu powietrzem wysusz wszystkie sekcje w dygestoriach przez 15 minut, a następnie przejdź do LCM.Tutaj. Wykonywany jest LCM. Używając mikroskopu P cell two E z laserem diodowym na podczerwień, najpierw ustaw środkowy joystick w pozycji pionowej.Następnie obróć i zablokuj cel Forex w odpowiedniej pozycji. Umieść szkiełko z poplamionymi sekcjami hipokampa na środku stolika mikroskopu i ręcznie wyreguluj, aż obszar hipokampa będzie widoczny. Skorzystaj z kursu i znajdź korekty ostrości.Aby ustawić ostrość sekcji, aktywuj uchwyt podciśnieniowy, naciskając przycisk podciśnienia na sterowniku. Następnie obróć i zablokuj obiektyw 10 x na swoim miejscu. Ponownie ustaw ostrość za pomocą kursu i precyzyjnych korekt.Załaduj nasadki nasadek makra LCM do zaślepek, modułu kasety i umieść nasadkę w pozycji linii ładowania. Obróć ramię umieszczające nasadkę i ustaw wokół nasadki. Następnie podnieś ramię umieszczające nasadkę, aby zdjąć zaślepki z modułu kasety.Obróć ramię umieszczające nasadkę nad suwakiem, a następnie opuść je w dół nad suwakiem, aby umieścić nasadkę na suwaku. Dostosuj precyzyjną ostrość i przesuń joystick, aby sprawdzić, czy komórki znajdują się w czarnym kółku na nasadce. Wszystkie komórki, które mają zostać przechwycone, powinny znajdować się w tym czarnym kółku.Teraz ustaw parametry lasera. Najpierw naciśnij przycisk włączania lasera na kontrolerze. Plamka celu laserowego będzie widoczna jako różowa.w polu view na monitorze komputera. Ustaw rozmiar plamki lasera na mały, aby ustawić ostrość lasera i dostosuj moc i czas trwania do 65 do 75 miliwatów przez jedną do dwóch milisekund w razie potrzeby w celu optymalnego wychwytywania komórek. Aby przetestować laser, użyj joysticka, aby przesunąć plamkę lasera do obszaru, w którym nie ma komórek do podniesienia.Odpal laser za pomocą przełącznika kciukowego. Następnie użyj joysticka, aby odsunąć plamkę lasera od plamki stopionego polimeru i sprawdź, czy widoczny jest ciemny pierścień otaczający czysty obszar, w którym laser został wystrzelony. Aby przechwycić komórki, użyj joysticka, aby przesunąć plamkę lasera nad obszarem komórek, aby przechwycić i wystrzelić laser.Za pomocą przełącznika kciukowego poruszaj joystickiem podczas wystrzeliwania lasera, aby uchwycić duży obszar komórek. Po wystrzeleniu wszystkich interesujących komórek podnieś ramię umieszczające nasadkę. Uchwycone komórki oddzielą się od sekcji tkanki i przylgną do czapeczki.Twoja czapka, pozostała tkanka i brakujące komórki będą widoczne w polu widzenia. Komórki na nasadce można również wyświetlić, umieszczając nasadkę na pustej części szkiełka. Podnieś ramię do umieszczania nasadki i obróć je do stacji rozładunku nasadek.Opuść nasadkę do stacji i obróć ramię umieszczające nasadkę z powrotem do poprzedniej pozycji. Przesuń nasadkę narzędzia do wkładania wzdłuż platformy i na nasadkę. Podnieś narzędzie z zatyczką przymocowaną z platformy.Delikatnie przyłóż nakrętkę do samoprzylepnej części karteczki samoprzylepnej, aby usunąć niechcianą tkankę. Umieść nasadkę w probówce o pojemności 0,5 mililitra wolnej od RNA, wypełnionej 100 mikrolitrami buforu do lizy uzyskanego z wodnego zestawu do mikroizolacji RN. Natychmiast obracaj nakrętkę przez 30 sekund, aby leżała.Komórki inkubują próbki w temperaturze 42 stopni Celsjusza przez 30 minut i zamrażają w temperaturze minus 80 stopni Celsjusza do momentu izolacji RNA. Procedura barwienia LCM pojedynczych uszkodzonych neuronów po utrwaleniu jest podobna do procedury dla połaci neuronów. Jednak niektóre czasy inkubacji różnią się, a sekcje utrzymywane z fluorem przez cztery minuty przed płukaniem i odwodnieniem, szczegółowe informacje po barwieniu znajdują się w części tekstowej protokołu.Ponownie wysusz wszystkie sekcje na powietrzu w dygestoriach przez 15 minut. Przed przystąpieniem do LCM w celu przechwycenia pojedynczego ogniwa załaduj nasadki HS LCM do nasadki lub modułu kasety, stosując tę samą procedurę, co w przypadku nasadki makra LCM. Ponownie ustaw rozmiar plamki lasera na mały, aby ustawić ostrość lasera, ale tym razem dostosuj moc i czas trwania lasera do 65 do 75 miliwatów przez 0,45 do 0,5 milisekundy, aby uzyskać optymalne wychwytywanie pojedynczych komórek.Obróć ramię umieszczające nasadkę nad suwakiem i opuść ramię w dół w kierunku suwaka. Aby umieścić nasadkę na szkiełku, powierzchnia nasadki wychwytującej HS znajduje się wyżej od próbki. Podczas LCM użyj joysticka, aby przesunąć laser nad pojedynczymi dodatnimi ogniwami fluoru.Wszystkie przechwytywane komórki muszą znajdować się wewnątrz małego czarnego pierścienia na nasadce, wystrzelić laser za pomocą przełącznika kciukowego. Gdy wszystkie komórki w obszarze czarnego koła zostaną wystrzelone za pomocą podnośnika laserowego, ramienia umieszczającego nasadkę, przechwycone komórki oddzielą się od sekcji tkanki i przylgną do wychwytującej nasadki hs. Teraz umieść kolejny szkiełko na stoliku mikroskopu i zbieraj dodatnie komórki fluro-aid, aż nasadka HS będzie pełna.Następnie umieść nasadkę w probówce wolnej od 0,5 mililitra RNA wypełnionej 40 do 50 mikrolitrami lizy, buforu i wiru oraz inkubatorów, zanim ponownie zamrozić w temperaturze minus 80 stopni Celsjusza. Jeśli nie natychmiast, wykonaj izolację RNA zgodnie z instrukcjami w części tekstowej protokołu. Poniższe obrazy pokazują mikrodysekcję laserową połaci określonych populacji komórek z mózgu szczura zamrożonych 10-mikronowych odcinków koronalnych mózgu szczura.Zostały przygotowane zgodnie z tym protokołem i zabarwione fioletem wyrostka zębodołowego i plamą pocisku. Ten obraz pokazuje neurony parametaliczne od ca jednego do około trzech podpól hipokampa szczura. W tym miejscu wychwycono komórki ziarniste w zakręcie zębatym hipokampa.Na koniec pokazujemy połacie neuronów wychwyconych z obustronnych jąder nadchiasmy znajdujących się po obu stronach trzeciej komory i powyżej skrzyżowania wzrokowego. SCN zawiera główny zegar okołodobowy, który kontroluje rytm okołodobowy w całym ciele. Poniższe zdjęcia pokazują mikrodysekcję pojedynczych neuronów z hipokampa szczura za pomocą przechwytywania laserowego.Pokazane tutaj są degenerujące się fluorkowo-dodatnie hipokampy ca trzy neurony, tutaj przeżywają fluro aid, ujemne około trzy neurony przed i po LCM, które są pokazane, przechwycone komórki są wizualizowane na czapce LCM. Poniższe obrazy przedstawiały analizę ekspresji genów całkowitego RNA, wyizolowanego z neuronów wychwyconych laserowo. Ten obraz przedstawia ilościowe dane PCR w czasie rzeczywistym dotyczące ekspresji genów zegara okołodobowego w SCN.Ta mapa cieplna ekspresji genów w umierających i ocalałych neuronach hipokampa pokazuje profilowanie ekspresji genów związanych z apoptozą przy użyciu zogniskowanych macierzy PCR. Na koniec pokazujemy przykład mapy cieplnej wygenerowanej na podstawie analizy całego genomu mikromacierzy laryngologicznej ekspresji genów w około jednym do około trzech neuronach od szczurów, które otrzymały pozorowane urazy TBI lub TBI oraz leżącego wirusa siRNA związanego z adeno, zaprojektowanego w celu obniżenia ekspresji neuronalnego tlenku azotu, syntazy lub peroksydazy glutationowej, oba są genami indukowanymi przez uszkodzenie mózgu po jego rozwoju. Techniki te utorowały drogę naukowcom z wielu dziedzin badań, w tym z zakresu urazów mózgu i raka, którzy wykorzystują modele zwierzęce tych zaburzeń do przeprowadzania genomicznego profilowania proteomicznego i metabolicznego określonych populacji komórek.Na przykład, obecnie używamy tych technik do laserowego wychwytywania określonych populacji komórek z kory przedczołowej i jądra półleżącego obszarów mózgu, o których wiadomo, że są zaangażowane w uzależnienie.

laser-capture-microdissection-enriched-populations-neurons-or-single

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Neuronauka

Laserowa mikrosekcja pojedynczych neuronów lub wzbogaconej populacji neuronów w celu analizy ekspresji genów po urazie mózgu

W niniejszym artykule wideo przedstawiamy metodę izolacji pojedynczych lub wielu neuronów dopaminergicznych (da) Drosophila z larw trzeciego stadium za pomocą mikrodysekcji laserowej (LCM) w klasie przechwytywania podczerwienią (IR). RNA uzyskane z wyizolowanych neuronów może być łatwo wykorzystane w dalszych zastosowaniach, w tym w analizach qRT-PCR lub mikromacierzach.

Mikrodysekcja laserowa neuronów obwodowych Drosophila

Profilowanie ekspresji RNA w oddzielnych regionach mózgu myszy wymaga precyzyjnej i powtarzalnej strategii pobierania tkanek. W niniejszym opracowaniu opisano protokół wykorzystujący zarówno sekcjonowanie mózgu w płaszczyźnie czołowej, jak i mikrodysekcję wspomaganą wycinakiem do tkanek. Wydajność i jakość całkowitego RNA uzyskanego z otrzymanych próbek potwierdzają użyteczność przedstawionej metody.

Metoda mikroskopii bez użycia laserowej mikrodysekcji do mikrodysekcji dyskretnych obszarów mózgu myszy w celu izolacji całkowitego RNA oraz późniejszego sekwencjonowania następnej generacji i profilowania ekspresji genów

Ludzkie komórki neuroprogenitorowe (NPC) były rozwijane w warunkach proliferacji. NPC różnicowano w kultury bogate w neurony w obecności kombinacji neurotrofin. Markery neuronalne wykryto za pomocą barwienia immunofluorescencyjnego. Aby wyizolować czystą populację neuronów, NPC różnicowano na szkiełkach membranowych PEN i przeprowadzono mikrodysekcję wychwytywania laserowego.

Laserowe wychwytywanie mikrodysekcji neuronów ze zróżnicowanych ludzkich komórek neuroprogenitorowych w hodowli

Izolacja pojedynczych neuronów dopaminowych lub brzusznego obszaru nakrywki za pomocą bezpośredniej lub pośredniej immunohistochemii jest demonstrowana za pomocą mikrodysekcji laserowej. Omówiono parametry izolacji tkanki ze szkiełka podstawowego za pomocą lasera na podczerwień oraz od szkiełek membranowych z wykorzystaniem kombinacji lasera podczerwonego i ultrafioletowego.

Mikrodysekcja laserowa - demonstracja izolacji pojedynczych neuronów dopaminowych i całego brzusznego obszaru nakrywki

Analiza ekspresji genów w podzbiorze komórek w określonej tkance stanowi duże wyzwanie. W tym artykule opisano, jak wyizolować wysokiej jakości całkowite RNA z określonej populacji komórek, łącząc metodę szybkiego znakowania immunologicznego z mikrodysekcją wychwytu laserowego.

Izolacja RNA z subpopulacji specyficznych dla komórek za pomocą mikrodysekcji laserowej w połączeniu z szybkim znakowaniem immunologicznym

Opisujemy użycie mikrodysekcji laserowej do uzyskania próbek różnych populacji komórek z różnych regionów mózgu do analizy genów i mikroRNA. Technika ta pozwala na badanie zróżnicowanych skutków urazowego uszkodzenia mózgu w określonych obszarach mózgu szczura.

Stereotaktyczne przechwytywanie laserowe pod kontrolą atlasu Mikrodysekcja obszarów mózgu dotkniętych urazem urazowym

Tutaj opisujemy protokół powtarzalnej mikrodysekcji laserowej (LCM) do izolowania siatki beleczkowej (TM) do dalszej analizy RNA. Możliwość analizowania zmian w ekspresji genów w TM pomoże w zrozumieniu mechanizmów molekularnych leżących u podstaw chorób oczu związanych z TM.

Laserowe wychwytywanie mikrodysekcji siatki beleczkowej o wysokiej czystości z oczu myszy do analizy ekspresji genów

Ten protokół wyjaśnia, jak zbierać pojedyncze neurony, mikroglej i astrocyty z centralnego jądra ciała migdałowatego z dużą dokładnością i anatomiczną specyficznością za pomocą mikrodysekcji laserowej. Dodatkowo wyjaśniamy nasze zastosowanie mikroprzepływowego RT-qPCR do pomiaru podzbioru transkryptomu tych komórek.

Połączenie mikrodysekcji wychwytu laserowego i mikroprzepływowego qPCR w celu analizy profili transkrypcyjnych pojedynczych komórek: podejście biologii systemowej do uzależnienia od opioidów

Mikrodysekcja laserowa (LMD) jest czułą i wysoce powtarzalną techniką, która może być wykorzystana do odkrycia ścieżek pośredniczących w heterogeniczności i inwazji glejaka. W tym miejscu opisujemy zoptymalizowany protokół izolacji dyskretnych obszarów z tkanki glejaka za pomocą laserowego LMD, a następnie analizy transkryptomicznej.

Mikrodysekcja podregionów glejaka do wychwytywania laserowego w celu przestrzennej i molekularnej charakterystyki heterogeniczności wewnątrznowotworowej, onkostrumieni i inwazji

Opisujemy tutaj metodę pobierania biopsji błony śluzowej węchowej z jam nosowych szczura i człowieka. Biopsje te mogą być wykorzystane do identyfikacji anomalii molekularnych w chorobach mózgu lub do izolacji wielopotencjalnych dorosłych komórek macierzystych, które mogą zostać użyte do transplantacji komórkowej w zwierzęcych modelach urazów i chorób mózgu.

Izolowanie komórek macierzystych węchowych z nosa gryzoni lub ludzi

Poznaj metodę laserowego wychwytywania mikrodysekcji do izolacji neuronów hipokampu z mózgu szczura po urazie. Technika umożliwia analizę ekspresji genów w określonych populacjach komórkowych.

Laserowe wychwytywanie mikrodysekcji wzbogaconych populacji neuronów lub pojedynczych neuronów do analizy ekspresji genów po urazowym uszkodzeniu mózgu (Wideo) | JoVE Journal

Laserowe wychwytywanie mikrodysekcji wzbogaconych populacji neuronów lub pojedynczych neuronów do analizy ekspresji genów po urazowym uszkodzeniu mózgu

Przeglądaj więcej filmów