Tworzenie adhezyjnych i rozpuszczalnych gradientów do obrazowania migracji komórek za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej

Ogólnym celem tej procedury jest stworzenie adhezyjnych i rozpuszczalnych gradientów w celu zbadania migracji komórek. Osiąga się to poprzez pierwszą pasywację, powierzchnię zapobiegającą niespecyficznej adhezji komórek. Drugim krokiem jest wyprodukowanie stempli metodą druku mikrokontaktowego.

Następnie powierzchnia jest wzorzysta z paciorkowymi liniami za pomocą druku mikrokontaktowego. Straped din może być również drukowany jako kropki za pomocą litografii piórem zanurzeniowym przymocowanym do spodu urządzenia mikroprzepływowego. Zmodyfikowana powierzchnia będzie stanowić podstawę dla gradientu adhezyjnego biotyny RGD.

Ostatnim krokiem jest załadowanie komórek na powierzchnię za pomocą adhezyjnej wskazówki w obecności rozpuszczalnego gradientu atraktantu chemio. Ostatecznie mikroskopia żywych komórek służy do pokazania migracji komórek w odpowiedzi zarówno na adhezyjne, jak i rozpuszczalne sygnały. Główną przewagą tej techniki nad istniejącymi metodami, takimi jak test transwell lub test pustej komory i konwencjonalna konfiguracja mikroprzepływowa, jest to, że zdezintegrowany układ wzoru powierzchni Urządzenie mikroprzepływowe umożliwia obserwację reakcji komórek na przestrzennie kontrolowane sygnały adhezyjne oraz gradient kleju i gradient rozpuszczalny w tym samym czasie.

Cóż, ta metoda może pomóc odpowiedzieć na kluczowe pytania w dziedzinie migracji komórek, takie jak znaczenie adhezji komórek i powodować udar między receptorami chemiotekańskimi, takimi jak receptory sprzężone z białkiem G kinazy i receptory adhezyjne, takie jak RIN Do jedzenia szklanych szkiełek nakrywkowych. Najpierw wyczyść szkiełka nakrywkowe, zanurzając je w stojaku w 100% etanolu i umieszczając stojak w kąpieli wodnej dla synów łyżwiarskich na 30 minut. Wysuszyć szklaną pokrywę w powietrzu.

Następnie sonikować szklaną pokrywę przez 30 minut w jednym molowym wodorotlenku sodu. Następnie spłucz szklane powierzchnie, ostrożnie przechylając ruszt w zlewce wypełnionej półtora litra wody w mili kostce. Powtórz proces płukania trzy razy, za każdym razem używając świeżej wody z mili kostki.

Po trzecim płukaniu wysuszyć szklaną pokrywę wsuwa się do piekarnika w temperaturze 60 stopni Celsjusza na około pół godziny. Umieść połowę czystych szkiełek pokrywowych pojedynczo w wilgotnej komorze wykonanej z 24-dołkowej płytki, częściowo wypełnionej wodą. Studnie są napełniane wodą, a szklane szkiełka nakrywkowe są układane na wierzchu studni w celu acji, Stosuje się kopolimer polilizyny i glikolu polietylenowego, w którym 20% cząsteczek peg jest szczepionych biotynie.

W skrócie biotyna PLL Peg upuść 15 mikrolitrów biotyny PLL Peg w PBS na każde szklane szkiełko nakrywkowe. Weź drugą połowę pozostałych czystych szkiełek nakrywkowych i ostrożnie ułóż roztwór PEG. Pozostaw szkiełka nakrywkowe na godzinę w wilgotnej komorze.

Po godzinnym ślizganiu się warstwowa osłona delikatnie odsuwa się od siebie, nie ocierając się o powierzchnię pokrytą PEG i spłukuje je wodą UE. Woda powinna łatwo zsuwać się po stronie pokrytej kołkami. W razie potrzeby.

Wysuszyć na powietrzu szklaną pokrywę ślizga się na ręczniku papierowym z obrabianą powierzchnią skierowaną do góry do przechowywania. Szklana pokrywa wsuwa się w próżnię, wysusza do dalszego użycia. Wzorzec krzemowy wymagany do tej procedury jest wytwarzany za pomocą fotolitografii w celu odlania stempla A-P-D-M-S dla elastomeru PDMS na Silicon Master wewnątrz szalki Petriego na wysokość około jednego centymetra i utwardzenia mieszaniny wzorca i PDMS w piecu w temperaturze 70 stopni Celsjusza przez jedną godzinę.

Następnie stempel PDMS jest usuwany z wzorca krzemowego i przycinany na wymiar w celu wydrukowania wzorów białkowych przy użyciu techniki druku mikrokontaktowego, najpierw oczyszczenia i nadania stemplom PDMS bardziej hydrofilowego charakteru poprzez obróbkę strony wzoru środkiem czyszczącym UV i ozonem przez półtorej godziny bezpośrednio po miejscu obróbki ozonem. I rozprowadź 10 mikrolitrów paskowanego adinu na znaczkach PDMS. Jeśli ślady powinny być widoczne pod mikroskopem fluorescencyjnym, użyj prążkowanego Adenu, który jest sprzężony z fluorową czwórką, taką jak stripted avid i LOR three 50.

Pozostaw na godzinę w wilgotnej komorze. Usuń nadmiar paciorkowca ze stempla za pomocą bibuły, papieru i powietrza. Suszyć stempel przez około minutę.

Lekko dociśnij stempel do szkiełka nakrywkowego PLL peg ze szkła pokrytego biotyną. Jeśli użyto fluorescencyjnego strep din, zbadaj wzór pod mikroskopem epi fluorescencyjnym. Wzory białek można również drukować za pomocą litografii piórkiem zanurzeniowym.

Najpierw wymieszaj jedną część jednego miligrama na mililitr, spinkę do pasków lub pozbawione avidan elif Fluor three 50 z 10 częściami glicerolu i załaduj pięć mikrolitrów mieszaniny na wspornik. Dostosuj prędkość drukowania. Czas kontaktu wspornika z powierzchnią lub pionowa odległość wspornika od powierzchni w celu zmniejszenia rozmiaru plamki.

Około pięciu mikrometrów rozpoczyna proces drukowania zgodnie z opisem w instrukcji obsługi sklepu z przyrządami do litografii piórami zanurzeniowymi. Wszystkie zadrukowane powierzchnie w osuszaniu. Do tworzenia gradientów powierzchni wykorzystywane jest dostępne na rynku urządzenie mikroprzepływowe.

Przyklej tę pokrytą trytyną lub wzorzystą szklaną pokrywę wsuwaną na lepką stronę urządzenia, aby upewnić się, że nie ma wycieków przez kilka godzin. Uszczelnij krawędzie urządzenia cienką warstwą podgrzanej wazeliny i drugą warstwą mieszaniny jednej części wazeliny i jednej części wosku parafinowego. Wypełnij kanał urządzenia sześcioma mikrolitrami PBS, aby utworzyć dwa przeciwległe gradienty.

Napełnij dwa zbiorniki, jeden 70 mikrolitrami biotyny, czterema fluoresceiną, a drugi 70 mikrolitrami biotyny sprzężonej z biotynylowanym peptydem argininy, glicyną, kwasem spartowym lub RGD, inkubuj próbki w temperaturze pokojowej w ciemności przez jedną godzinę. Płukanie biotyny, RGD i biotyny z urządzenia mikroprzepływowego jest najtrudniejszym aspektem tej procedury, ponieważ istnieje ryzyko uwięzienia pęcherzyków powietrza i zakłócenia wydrukowanych ścieżek mikrokontaktowych. Aby zapewnić sukces, biotyna i PBS muszą być usuwane ostrożnie i powoli.

Usuń roztwory biotyny i ostrożnie spłucz powierzchnię dwukrotnie PBS, będąc nadal podłączonym do urządzenia mikroprzepływowego. Zaznacz kierunek gradientu kleju przed załadowaniem fluorescencyjnie znakowanych komórek do urządzenia mikroprzepływowego. Policz komórki i podziel je na dwie probówki o równej liczbie komórek.

Umyj i zregeneruj. Zawieś jedną probówkę komórek z pożywką zawierającą atraktant chemioterapii, taką jak DMEM o niskiej stężeniu glukozy z 10% płukaniem FBS, a drugą probówkę komórek w pożywce. Bez atraktantu chemioterapii, takiego jak DMEM z 0% FBS, końcowe stężenie komórek w każdej probówce powinno wynosić pięć razy 10 piątych komórek na mililitr.

Usuń wszystkie roztwory z urządzenia mikroprzepływowego i umieść je na wstępnie rozgrzanym mikroskopie. Załaduj na scenie 70 mikrolitrów komórek zawieszonych w 0% F-B-S-D-M-E-M do jednego zbiornika. Załaduj 70 mikrolitrów komórek zawieszonych w 10% F-B-S-D-M-E-M do innego zbiornika.

Luźno umieszczona taśma na zbiornikach, aby uniknąć parowania. Upewnij się, że kanał urządzenia mikroprzepływowego znajduje się w polu viewa a komórki są ostre. Wybierz parametry akwizycji obrazu, takie jak czasy naświetlania i filtry fluorescencyjne.

Sekwencja obrazu jasnego pola i fluorescencji, które komórki i ścieżki, a także punkty czasowe i długość zapisu uruchamiają program akwizycji obrazu. Ten film przedstawia metodę obrazowania żywych komórek komórek, które migrują w środowisku o konkurencyjnych gradientach adhezyjnych i rozpuszczalnych. Ścieżki samoprzylepne, które zawierają fluorescencyjną spinkę i biotynylowany RGD, zostały stworzone za pomocą druku mikrokontaktowego lub litografii długopisem.

O udanym drukowaniu mikrokontaktowym świadczy profil linii intensywności fluorescencji na ścieżkach, na których wyraźnie można odróżnić ścieżki adhezyjne i obszary przeciwporostowe. Kropki wydrukowane za pomocą litografii piórem zanurzeniowym wydają się zaokrąglone, a nie w kształcie łzy, co wskazuje na udany proces drukowania. W tym przykładzie kropki zostały wydrukowane w linii z separacją wierszy i kolumn ustawioną na 10 do 15 mikrometrów.

Odległość ta jest wystarczająca, aby zapobiec łączeniu się punktów ze sobą, ale umożliwia wyświetlanie wielu punktów w jednym polu widzenia. W przypadku większości ustawień mikroskopu, za pomocą prostego urządzenia mikrofluidycznego utworzono grady samoprzylepnych wskazówek na wydrukowanej ścieżce. Poprzez załadowanie biotyny czterech, fluoresceiny i biotyny RGD po przeciwnych stronach panelu komory mikroprzepływowej.

Pokaz 60 mozaikowych zdjęć wykonanych o łącznej długości 3072 mikrometrów. W panelu B zmierzono intensywność fluorescencji na całej długości mozaiki. Liniowe linie trendu zostały dopasowane do intensywności fluorescencji, aby wskazać gradient RGD w kanale.

Po usunięciu biotyny, roztworu biotyny RGD, w tej samej komorze można wprowadzić rozpuszczalny gradient. Panel A pokazuje natężenie fluorescencji barwnika fluoresceinowego w pobliżu zbiorników wypełnionych PBS i fluoresceiną oraz w poprzek kanału przy T równym zero. Panel B pokazuje intensywność fluorescencji rozpuszczalnych wskazówek.

Po 16-godzinnej inkubacji porównywalne wyniki wskazują, że gradient był stabilny przez co najmniej 16 godzin. He, migracja komórek w komorze mikroprzepływowej o przeciwstawnych gradientach została zaobserwowana przy użyciu tej metody, a reprezentatywny film jest pokazany tutaj. Gradient kleju został unieruchomiony RGD na ścieżkach paciorkowca avidana a gradient rozpuszczalny wynosił od zera do 10% FBS.

Zdjęcia były wykonywane co 15 minut przez łącznie 20 godzin. Pokazane przejście obrazu to osiem klatek na sekundę. Ten drugi film przedstawia pojedynczą komórkę heli migrującą w kierunku źródła FBS.

Pokazane przejście obrazu to osiem klatek na sekundę. Niebieska linia reprezentująca trajektorię komórki została uzyskana za pomocą oprogramowania do śledzenia komórek. Ta ostatnia grafika przedstawia trajektorie komórek na podstawie obrazów z pierwszego filmu.

Trajektorie komórek, które migrowały w kierunku wyższego stężenia rozpuszczalnego FPS, są pokazane w trajektoriach krwinek czerwonych, które migrowały w kierunku wyższych stężeń przylegającego RGD, są pokazane na czarno. Trajektorie te wykazały, że więcej komórek hela migrowało w kierunku źródła atraktantu chemioterapii niż w kierunku wyższych stężeń przylegającego RGD. Podczas próby wykonania tej procedury należy pamiętać, aby uniknąć odparowania PBS lub pożywki w urządzeniu mikroprzepływowym podczas przygotowywania gradientu kleju i obrazowania stylu życia, w razie potrzeby użyj taśmy klejącej, aby zakryć wszystkie wloty urządzenia mikroprzepływowego Postępując zgodnie z tą procedurą.

Inne metody, takie jak transfekcja i mikroskopia roztworów hybrydowych, mogą być wykonane w celu uzyskania odpowiedzi na dodatkowe pytania, takie jak biomechanika cytoszkieletu działającego przez białko, ogniskowe białka adhezyjne i receptory podczas migracji komórek.