Name: Tworzenie adhezyjnych i rozpuszczalnych gradientów do obrazowania migracji komórek za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-04-04T13:00:00.000+00:00
Duration: 13 min 10 s
Description: Poznaj metodę tworzenia adhezyjnych i rozpuszczalnych gradientów do badania migracji komórek przy użyciu mikroskopii fluorescencyjnej. Technika umożliwia obserwację odpowiedzi komórek na sygnały przestrzenne.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Autorzy dziękują za finansowanie ze strony Australijskiej Rady ds. Badań Naukowych oraz Narodowej Rady Zdrowia i Badań Medycznych Australii, a także dziękują Australian National Fabrication Facility za mistrza SU-8 za druk mikrokontaktowy. SHN jest wspierany przez Ministerstwo Szkolnictwa Wyższego Malezji i Universiti Sains Malaysia.

1. Pasywacja szkiełek nakrywkowych za pomocą PLL-PEG-biotyny
Ten krok ma na celu pasywację powierzchni, tak aby komórki przylegały i migrowały do określonych obszarów na szkiełku nakrywkowym, które są tworzone za pomocą druku mikrokontraktowego (Krok 2-3a) lub litografii piórkiem (Krok 3b). Do pasywacji stosuje się kopolimer poli-L-lizyny (PLL) i glikolu polietylenowego (PEG), w którym 20% cząsteczek PEG jest szczepionych biotyną (PLL-PEG-biotyna).
<ol>
 <li>Aby wyczyścić szkiełka nakrywkowe (18 mm x 18 mm), zanurz je w stojaku w 100% etanolu i umieść ruszt w kąpieli dźwiękowej na 30 minut. Wysusz szklane szkiełka nakrywkowe na powietrzu lub pod strumieniem azotu.</li>
 <li>Następnie sonikować szklane szkiełka nakrywkowe przez 30 minut w 1 M NaOH. Następnie spłucz szklane powierzchnie, ostrożnie zanurzając ruszt w zlewce wypełnionej 1,5 L Milli-Q H2O. Powtórz proces płukania trzy razy, używając za każdym razem świeżego Milli-Q H2O. Szkiełka nakrywkowe wysuszyć w suszarce w temperaturze 60 °C.</li>
 <li>Umieść połowę czystych szklanych szkiełek nakrywkowych pojedynczo w wilgotnej komorze, która jest wykonana z 24-dołkowej płytki częściowo wypełnionejH2O. Na każde szklane szkiełko nakrywkowe wrzuć 15 μl PLL-PEG-biotyny (1 mg/ml) w PBS. Weź drugą połowę pozostałych czystych szklanych szkiełek nakrywkowych i ostrożnie ułóż warstwę z roztworem PEG. Pozostaw szkiełka nakrywkowe na 1 godzinę w wilgotnej komorze. Delikatnie odsuń szkiełka nakrywkowe od siebie, nie zdrapując powierzchni pokrytej PEG, a następnie spłucz je środkiem Milli-Q H2O. Woda powinna łatwo zsuwać się po stronie pokrytej PEG. W razie potrzeby wysusz szklane szkiełka nakrywkowe na ręczniku papierowym tak, aby obrabiana powierzchnia była skierowana do góry. Szkiełka nakrywkowe należy przechowywać w eksykatorze próżniowym do czasu dalszego użycia.</li>
</ol>
2. Produkcja stempli do druku mikrokontaktowego
Opisujemy dwa procesy wzorowania ścieżek streptawidyny na pasywowanych szklanych szkiełkach nakrywkowych. Pierwsza, druk mikrokontaktowy, zazwyczaj wymaga wytworzenia wzorca krzemowego, z którego odlewany jest stempel PDMS. W naszym przypadku wzór na stemplu PDMS to linie o szerokości 100 μm, które są rozmieszczone w odstępach 290 μm od środka do środka z wysokością elementu 25 μm. Poniżej opisujemy pokrótce, jak wytworzyć odpowiedni master krzemowy (Krok 2.1-2.3) i stempel PDMS (Krok 2.4). Istnieje jednak wiele protokołów drukowania mikrokontaktowego opisanych w literaturze19-23, które są odpowiednie do drukowania wzorów białkowych na szklanych szkiełkach nakrywkowych. Mistrzowie mogą być również wykonywani na zamówienie i kupowani ze źródeł komercyjnych.
<ol>
 <li>Najpierw oczyść płytkę krzemową (o średnicy 4 cali), inkubując ją w roztworze piranii (3:1 v:v kwasu siarkowego i 30% nadtlenku wodoru) przez 20 minut. Dokładnie opłucz wafel 10 razy za pomocą MilliQ H2O. Wysusz wafel w piekarniku w temperaturze 150 °C O/N.</li>
 <li>Opłucz czystą i wysuszoną płytkę silikonową 100% acetonem, a następnie 100% alkoholem izopropylowym. Następnie nałóż 2 ml fotorezystu GM1070 SU-8 (Gersteltec Sarl) na płytkę z prędkością 3 100 obr./min przez 40 sekund, aby utworzyć warstwę o grubości 25 μm. Próbkę piecze się następnie na płycie grzejnej w temperaturze 65 °C przez 5 minut, a następnie przez kolejne 5 minut w temperaturze 95 °C.</li>
 <li>Wystawić fotorezystor SU-8 na działanie promieniowania UV przez 60 sekund pod fotomaską z pożądanym wzorem (na przykład za pomocą nakładki do maski Quintel Q6000) i powtórzyć proces pieczenia opisany w ppkt 2.2. Następnie próbka jest wywoływana poprzez zanurzenie płytki w wywoływaczu SU-8 (Gersteltec Sarl) na 4 minuty, płukanie w 100% alkoholu izopropylowym i suszenie pod przepływem azotu. Obszar fotorezystu SU-8, który nie był wystawiony na działanie światła UV, jest w ten sposób usuwany, tworząc odwrotny wzór stempla PDMS.</li>
 <li>Następnym krokiem jest odlanie stempla PDMS z wzorca krzemowego. Najpierw dokładnie wymieszaj 1 część (w/w) utwardzacza z 10 częściami prepolimeru elastomerowego (Sylgard 184). Aby usunąć pęcherzyki powietrza, należy odgazować mieszaninę w eksykatorze podłączonym do przewodu próżniowego na 1 godzinę. Następnie wylać elastomer PDMS na wzorzec silikonowy wewnątrz szalki Petriego na wysokość około 1 cm i utwardzić mieszaninę wzorca i PDMS w piecu w temperaturze 70 °C przez 1 godzinę. Na koniec stempel PDMS jest usuwany z wzorca krzemowego i przycinany do odpowiedniego rozmiaru.</li>
</ol>
3. Wzorowanie streptawidyny lub adhezyjnych wskazówek na pasywowanych szkiełkach nakrywkowych
Po pasywacji szklanych szkiełek nakrywkowych, wzory białek są drukowane za pomocą druku mikrokontaktowego (Krok 3a) lub litografii metodą dip-pen (Krok 3b). W naszym przypadku streptawidyna jest drukowana jako linie, które stanowią podstawę gradientów RGD (krok 4). Ta sama procedura może być również stosowana do drukowania białek macierzy w celu tworzenia wzorów adhezyjnych.
Alternatywną metodą dla druku mikrokontaktowego do modelowania biomolekuł na powierzchniach jest litografia piórem zanurzeniowym. W litografii zanurzeniowej wspornik służy do przenoszenia niewielkiej objętości roztworu na powierzchnię. Wielkość wsporników, lepkość roztworu, czas kontaktu wspornika z powierzchnią, hydrofobowość powierzchni i wilgotność w komorze drukowania decydują o wielkości drukowanych elementów. Zaletą tej metody jest to, że dla każdego eksperymentu można wydrukować różne wzory, ponieważ nie ma potrzeby wytwarzania wzorców i stempli. Wadą jest to, że wydrukowanie danego wzoru zajmuje więcej czasu, a litografia zanurzeniowa wymaga specjalistycznego instrumentu, który może nie być dostępny w wielu laboratoriach. Przyrząd do litografii piórem, którego użyliśmy, to NanoeNabler firmy Bioforce Nanoscience. Tutaj wydrukowaliśmy małe kropki o średnicy <10 μm, do których użyliśmy wsporników SPT10.
3a. Technika druku mikrokontaktowego (μCP)
<ol>
 <li>Aby wyczyścić stempel PDMS i uczynić go bardziej hydrofilowym, należy poddać wzorzystą stronę stempli PDMS działaniu promieniowania UV i ozonu (na przykład UV Ozone Procleaner firmy Bioforce Nanoscience) przez 1,5 godziny. Alternatywnie, użyj środka do czyszczenia plazmowego przez krótszy czas w tym samym celu. W procesie tym powstaje utleniona powierzchnia PDMS24, która usprawnia proces drukowania.</li>
 <li>Natychmiast po poddaniu działaniu ozonu lub osocza należy umieścić i rozprowadzić 10 μl streptawidyny (1 mg/ml w PBS) na stemplach PDMS i pozostawić na 1 godzinę w wilgotnej komorze (takiej jak częściowo wypełniona płytka 6-dołkowa, patrz krok 1.3). Jeśli ślady powinny być widoczne pod mikroskopem fluorescencyjnym, należy użyć streptawidyny, która jest sprzężona z fluoroforem, takim jak streptawidyna-AlexaFluor350.</li>
 <li>Usuń nadmiar streptawidyny ze stempla za pomocą bibuły i wysusz stempel na powietrzu przez około 1 minutę. Lekko dociśnij stempel do szkiełka nakrywkowego pokrytego PLL-PEG-biotyną.</li>
 <li>Jeśli w kroku 3.a2 użyto fluorescencyjnej streptawidyny, zbadaj wzór pod mikroskopem epifluorescencyjnym. Przechowuj zadrukowane powierzchnie w eksykatorze.</li>
</ol>
3b. Litografia metodą zanurzania pióra
<ol>
 <li>Najpierw zmieszać 1 część 1 mg/ml streptawidyny lub streptawidyny-AlexaFluor350 z 10 częściami glicerolu (v/v) i załadować 5 μl mieszaniny na wspornik. Następnie rozpocznij proces drukowania zgodnie z opisem w instrukcji obsługi przyrządu do litografii z użyciem pióra zanurzeniowego. Aby zmniejszyć rozmiar plamki do około 5 μm, dostosuj prędkość drukowania, czas kontaktu wspornika z powierzchnią lub pionową odległość wspornika od powierzchni. W przykładzie pokazanym na rysunku 2c kropki zostały wydrukowane w linii z separacją rzędów i kolumn ustawioną na 10-15 μm. Odległość ta jest wystarczająca, aby zapobiec łączeniu się punktów ze sobą, ale umożliwia oglądanie wielu punktów w jednym polu widzenia przy większości ustawień mikroskopu.</li>
 <li>Przechowuj zadrukowane powierzchnie w eksykatorze.</li>
</ol>
4. Tworzenie gradientów adhezyjnych na powierzchniach ze wzorem streptawidyny
Tworzymy gradienty kleju biotyny-RGD na szklanych szkiełkach nakrywkowych, które są pokryte streptawidyną (Rysunek 3) lub zawierają wzory streptawidyny na pasywowanych szkiełkach nakrywkowych (Rysunek 5). Aby stworzyć gradient powierzchni, użyliśmy dostępnego na rynku urządzenia mikroprzepływowego (o nazwie sticky-Slide Chemotaxis 3D firmy Ibidi), które tworzy stabilny gradient roztworu poprzez dyfuzję pasywną. Aby konkurować o miejsca wiązania streptawidyny, zastosowaliśmy dwa przeciwstawne gradienty biotyny-RGD i biotyny, która nie była sprzężona z RGD (patrz ryc. 1).
<ol>
 <li>Przyklej szkiełka nakrywkowe pokryte streptawidyną lub wzorzyste szkiełka nakrywkowe do lepkiej strony urządzenia Sticky-Slide Chemotaxis 3D. Aby zapewnić, że nie ma wycieku przez kilka godzin, krawędzie urządzenia uszczelnia się cienką warstwą podgrzanej wazeliny oraz drugą warstwą mieszaniny 1 części wazeliny na 1 część wosku parafinowego (w/w).</li>
 <li>Napełnij kanał urządzenia 6 μl PBS w kanale. Następnie napełnij oba zbiorniki odpowiednio 70 μl 0,03 μg/μl biotyny-4-fluoresceiny w PBS i 70 μl 0,03 μg/μl biotyny-RGD w PBS. Próbki należy inkubować w temperaturze pokojowej w ciemności przez 1 godzinę.</li>
 <li>Usuń roztwory biotyny i ostrożnie spłucz powierzchnię, będąc nadal podłączoną do urządzenia mikroprzepływowego, dwukrotnie za pomocą PBS. Zaznacz kierunek gradientu kleju i w razie potrzeby przechowuj urządzenie napełnione PBS w temperaturze 4 °C, ale upewnij się, że urządzenie nie wyschnie. W razie potrzeby przeanalizować gradient kleju za pomocą mikroskopu fluorescencyjnego.</li>
</ol>
5. Znakowanie komórek za pomocą fluoroforów do obrazowania żywych komórek
Komórki są oznaczone barwnikami fluorescencyjnymi, które pomagają śledzić komórki pod mikroskopem fluorescencyjnym. Typowymi sondami są fluorescencyjne markery organelli, takie jak Syto 64 Red, które oznaczają jądro komórkowe. W tym celu komórki są najpierw trzykrotnie przemywane PBS, następnie inkubowane z 1 μM Syto 64 Red w pożywkach hodowlanych przez 45 minut, a na koniec przemywane kolejne trzy razy PBS. Należy pamiętać, że komórki nie powinny być przechowywane w PBS przez długi czas.
Alternatywnymi barwnikami do śledzenia komórek są serie CellTracker, które barwią cytoplazmę i są zatrzymywane podczas migracji i podziału komórek. Transfekcja komórek za pomocą fluorescencyjnego białka fuzyjnego jest szczególnie przydatna do rejestrowania subkomórkowej dystrybucji białka będącego przedmiotem zainteresowania podczas migracji. Jednak białka fluorescencyjne zazwyczaj wybielają się szybciej niż barwniki organiczne, więc długoterminowe obserwacje mogą nie być możliwe.
6. Wczytywanie komórek z rozpuszczalnym gradientem do urządzenia mikroprzepływowego
<ol>
 <li>Policz fluorescencyjnie znakowane komórki i podziel na dwie probówki o równej liczbie komórek. Umyj i ponownie zamieszaj jedną probówkę komórek z pożywką zawierającą chemoatraktant, taką jak Modified Eagle Medium (DMEM) firmy Dulbecco o niskim poziomie glukozy z 10% płodową surowicą bydlęcą (FBS). Umyj i ponownie wymieszaj drugą probówkę komórek w pożywce bez chemoatraktantu, tj. DMEM z 0% FBS. Końcowe stężenie komórek w każdej probówce powinno wynosić 5 x 105 komórek/ml.</li>
 <li>Usuń wszystkie roztwory z urządzenia mikroprzepływowego (z kroku 4.3) i umieść je na stoliku mikroskopu (patrz krok 7). Załaduj 70 μl komórek (5 x 105 komórek/ml w 0% FBS DMEM) do jednego zbiornika i 70 μl komórek HeLa (5 x 105 komórek/ml w 10% FBS DMEM) do drugiego. Luźno umieść taśmę na zbiornikach, aby uniknąć parowania. Jeśli komórki na powierzchni są wstępnie inkubowane przed obrazowaniem, zaleca się, aby komórki zostały załadowane do urządzenia w pożywce wzrostowej bez gradientu. Urządzenie jest następnie umieszczane na stoliku mikroskopowym, a media zastępowane są mediami gradientowymi, tj. DMEM bez FBS w jednym zbiorniku i DMEM z 10% FBS w drugim.</li>
</ol>
7. Obrazowanie komórek na żywo i analiza danych
<ol>
 <li>Włącz mikroskop (Nikon Ti-E) i rozgrzej stage co najmniej 1 godzinę przed rozpoczęciem eksperymentu.</li>
 <li>Upewnij się, że kanał urządzenia mikroprzepływowego znajduje się w polu viewa a komórki są ostre. Wybierz parametry akwizycji obrazu, takie jak czasy naświetlania i filtry fluorescencyjne, sekwencja obrazu jasnego pola i fluorescencja, która rejestruje komórki i ścieżki, a także punkty czasowe i długość nagrania (np. co 15 minut przez 16 godzin).</li>
 <li>Analizuj dane za pomocą odpowiedniego oprogramowania, takiego jak ImageJ Manual Tracking lub Ibidi Chemotaxis and Migration Tool.</li>
</ol>

<ol><li>Pulsipher, A., Yousaf, M. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Surface+Chemistry+and+Cell+Biological+Tools+for+the+Analysis+of+Cell+Adhesion+and+Migration%5BTitle%5D)+AND+%22Chem.+BioChem%22%5BJournal%5D)">Surface Chemistry and Cell Biological Tools for the Analysis of Cell Adhesion and Migration.</a> Chem. BioChem. 11, 745-753 (2010).</li>
<li>Hall, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+cytoskeleton+and+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Metastasis+Reviews%22%5BJournal%5D)">The cytoskeleton and cancer.</a> Cancer Metastasis Reviews. 28, 5-14 (2009).</li>
<li>Parsons, J. T., Horwitz, A. R., Schwartz, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell+adhesion%3A+integrating+cytoskeletal+dynamics+and+cellular+tension%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Rev.+Mol.+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Cell adhesion: integrating cytoskeletal dynamics and cellular tension.</a> Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 11, 633-643 (2010).</li>
<li>Geiger, B., Spatz, J. P., Bershadsky, A. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Environmental+sensing+through+focal+adhesions%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Rev.+Mol.+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Environmental sensing through focal adhesions.</a> Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 10, 21-33 (2009).</li>
<li>Roussos, E. T., Condeelis, J. S., Patsialou, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chemotaxis+in+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Cancer%22%5BJournal%5D)">Chemotaxis in cancer.</a> Nature Reviews Cancer. 11, 573-587 (2011).</li>
<li>Petrie, R. J., Doyle, A. D., Yamada, K. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Random+versus+directionally+persistent+cell+migration%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Rev.+Mol.+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Random versus directionally persistent cell migration.</a> Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 10, 538-549 (2009).</li>
<li>Geiger, B., Yamada, K. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+architecture+and+function+of+matrix+adhesions%5BTitle%5D)+AND+%22Cold+Spring+Harbor+Perspectives+in+Biology%22%5BJournal%5D)">Molecular architecture and function of matrix adhesions.</a> Cold Spring Harbor Perspectives in Biology. 3, (2011).</li>
<li>Ngalim, S. H., Magenau, A., Saux, G. L. e, Gooding, J. J., Gaus, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((How+do+cells+make+decisions%3A+engineering+micro-+and+nanoenvironments+for+cell+migration%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Oncology%22%5BJournal%5D)">How do cells make decisions: engineering micro- and nanoenvironments for cell migration.</a> Journal of Oncology. 2010, 363106(2010).</li>
<li>Roy, D. C., Wilke-Mounts, S. J., Hocking, D. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chimeric+fibronectin+matrix+mimetic+as+a+functional+growth-+and+migration-promoting+adhesive+substrate%5BTitle%5D)+AND+%22Biomaterials%22%5BJournal%5D)">Chimeric fibronectin matrix mimetic as a functional growth- and migration-promoting adhesive substrate.</a> Biomaterials. 32, 2077-2087 (2011).</li>
<li>Jin, T., Xu, X., Hereld, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chemotaxis%2C+chemokine+receptors+and+human+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Cytokine%22%5BJournal%5D)">Chemotaxis, chemokine receptors and human disease.</a> Cytokine. 44, 1-8 (2008).</li>
<li>Xu, X., Jin, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Imaging+G-protein+Coupled+Receptor+%28GPCR%29-mediated+Signaling+Events+that+Control+Chemotaxis+of+Dictyostelium+Discoideum%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis.+Exp%22%5BJournal%5D)">Imaging G-protein Coupled Receptor (GPCR)-mediated Signaling Events that Control Chemotaxis of Dictyostelium Discoideum.</a> J. Vis. Exp. (55), e3128(2011).</li>
<li>Chung, B. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Gradient-generating+Microfluidic+Device+for+Cell+Biology%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis.+Exp%22%5BJournal%5D)">A Gradient-generating Microfluidic Device for Cell Biology.</a> J. Vis. Exp. (7), e271(2007).</li>
<li>Rhoads, D. S., Guan, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analysis+of+directional+cell+migration+on+defined+FN+gradients%3A+role+of+intracellular+signaling+molecules%5BTitle%5D)+AND+%22Exp.+Cell+Res%22%5BJournal%5D)">Analysis of directional cell migration on defined FN gradients: role of intracellular signaling molecules.</a> Exp. Cell Res. 313, 3859-3867 (2007).</li>
<li>Park, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Simple+haptotactic+gradient+generation+within+a+triangular+microfluidic+channel%5BTitle%5D)+AND+%22Lab+on+a+Chip%22%5BJournal%5D)">Simple haptotactic gradient generation within a triangular microfluidic channel.</a> Lab on a Chip. 10, 2130-2138 (2010).</li>
<li>Li Jeon, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neutrophil+chemotaxis+in+linear+and+complex+gradients+of+interleukin-8+formed+in+a+microfabricated+device%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Biotech%22%5BJournal%5D)">Neutrophil chemotaxis in linear and complex gradients of interleukin-8 formed in a microfabricated device.</a> Nat. Biotech. 20, 826-830 (2002).</li>
<li>Joanne Wang, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+microfluidics-based+turning+assay+reveals+complex+growth+cone+responses+to+integrated+gradients+of+substrate-bound+ECM+molecules+and+diffusible+guidance+cues%5BTitle%5D)+AND+%22Lab+on+a+Chip%22%5BJournal%5D)">A microfluidics-based turning assay reveals complex growth cone responses to integrated gradients of substrate-bound ECM molecules and diffusible guidance cues.</a> Lab on a Chip. 8, 227-237 (2008).</li>
<li>Frequently Asked Questions (FAQ) :: ibidi [Internet]. , ibidi GmbH. Available from:
		
	 <a target="_blank" href="http://www.ibidi.com/service/faq.html">http://www.ibidi.com/service/faq.html</a> (2010).</li>
<li>Pujic, Z., Mortimer, D., Feldner, J., Goodhill, G. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Assays+for+eukaryotic+cell+chemotaxis%5BTitle%5D)+AND+%22Combinatorial+Chemistry+%26+High+Throughput+Screening%22%5BJournal%5D)">Assays for eukaryotic cell chemotaxis.</a> Combinatorial Chemistry & High Throughput Screening. 12, 580-588 (2009).</li>
<li>Thery, M., Piel, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Adhesive+micropatterns+for+cells%3A+a+microcontact+printing+protocol%5BTitle%5D)+AND+%22Cold+Spring+Harbor+protocols%22%5BJournal%5D)">Adhesive micropatterns for cells: a microcontact printing protocol.</a> Cold Spring Harbor protocols. 2009, pdb prot5255(2009).</li>
<li>Shen, K., Qi, J., Kam, L. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microcontact+Printing+of+Proteins+for+Cell+Biology%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis.+Exp%22%5BJournal%5D)">Microcontact Printing of Proteins for Cell Biology.</a> J. Vis. Exp. (22), e1065(2008).</li>
<li>Shin, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microfluidic+assay+for+simultaneous+culture+of+multiple+cell+types+on+surfaces+or+within+hydrogels%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Protocols%22%5BJournal%5D)">Microfluidic assay for simultaneous culture of multiple cell types on surfaces or within hydrogels.</a> Nat. Protocols. 7, 1247-1259 (2012).</li>
<li>Qin, D., Xia, Y., Whitesides, G. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Soft+lithography+for+micro-+and+nanoscale+patterning%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Protocols%22%5BJournal%5D)">Soft lithography for micro- and nanoscale patterning.</a> Nat. Protocols. 5, 491-502 (2010).</li>
<li>Huang, Y., Agrawal, B., Sun, D., Kuo, J. S., Williams, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microfluidics-based+devices%3A+New+tools+for+studying+cancer+and+cancer+stem+cell+migration%5BTitle%5D)+AND+%22Biomicrofluidics%22%5BJournal%5D)">Microfluidics-based devices: New tools for studying cancer and cancer stem cell migration.</a> Biomicrofluidics. 5, 13412(2011).</li>
<li>Hillborg, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Crosslinked+polydimethylsiloxane+exposed+to+oxygen+plasma+studied+by+neutron+reflectometry+and+other+surface+specific+techniques%5BTitle%5D)+AND+%22Polymer%22%5BJournal%5D)">Crosslinked polydimethylsiloxane exposed to oxygen plasma studied by neutron reflectometry and other surface specific techniques.</a> Polymer. 41 (00), 6851-6863 (2000).</li>
<li>Liu, L., Ratner, B. D., Sage, E. H., Jiang, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Endothelial+Cell+Migration+on+Surface-Density+Gradients+of+Fibronectin%2C+VEGF%2C+or+Both+Proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Langmuir%22%5BJournal%5D)">Endothelial Cell Migration on Surface-Density Gradients of Fibronectin, VEGF, or Both Proteins.</a> Langmuir. 23, 11168-11173 (2007).</li>
<li>Friedl, P., Wolf, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Plasticity+of+cell+migration%3A+a+multiscale+tuning+model%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Plasticity of cell migration: a multiscale tuning model.</a> The Journal of Cell Biology. 188, 11-19 (2010).</li>
<li>Moazzam, F., DeLano, F. A., Zweifach, B. W., Schmid-Schönbein, G. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+leukocyte+response+to+fluid%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences%22%5BJournal%5D)">The leukocyte response to fluid.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 94, 5338-5343 (1997).</li>
<li>Walker, G. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effects+of+flow+and+diffusion+on+chemotaxis+studies+in+a+microfabricated+gradient+generator%5BTitle%5D)+AND+%22Lab+on+a+Chip%22%5BJournal%5D)">Effects of flow and diffusion on chemotaxis studies in a microfabricated gradient generator.</a> Lab on a Chip. 5, 611-618 (2005).</li>
<li>Perl, A., Reinhoudt, D. N., Huskens, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microcontact+Printing%3A+Limitations+and+Achievements%5BTitle%5D)+AND+%22Adv.+Mater%22%5BJournal%5D)">Microcontact Printing: Limitations and Achievements.</a> Adv. Mater. 21, 2257-2268 (2009).</li>
<li>Salaita, K., Wang, Y., Mirkin, C. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Applications+of+dip-pen+nanolithography%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Nano%22%5BJournal%5D)">Applications of dip-pen nanolithography.</a> Nat. Nano. 2, 145-155 (2007).</li>
<li>Wouters, D., Schubert, U. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nanolithography+and+nanochemistry%3A+probe-related+patterning+techniques+and+chemical+modification+for+nanometer-sized+devices%5BTitle%5D)+AND+%22Angewandte+Chemie+%28International+ed.+in+English%29%22%5BJournal%5D)">Nanolithography and nanochemistry: probe-related patterning techniques and chemical modification for nanometer-sized devices.</a> Angewandte Chemie (International ed. in English). 43, 2480-2495 (2004).</li>
<li>Xia, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Directional+control+of+cell+motility+through+focal+adhesion+positioning+and+spatial+control+of+Rac+activation%5BTitle%5D)+AND+%22FASEB+J%22%5BJournal%5D)">Directional control of cell motility through focal adhesion positioning and spatial control of Rac activation.</a> FASEB J. 22, 1649-1659 (2008).</li>
<li>Oakes, P. W., Beckham, Y., Stricker, J., Gardel, M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tension+is+required+but+not+sufficient+for+focal+adhesion+maturation+without+a+stress+fiber+template%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Tension is required but not sufficient for focal adhesion maturation without a stress fiber template.</a> The Journal of Cell Biology. 196, 363-374 (2012).</li>
</ol>

Nie mamy żadnych interesów komercyjnych do ujawnienia.

W tym protokole użyliśmy dostępnego na rynku urządzenia mikroprzepływowego (sticky-Slide Chemotaxis 3D firmy Ibidi) do zbadania wpływu chemicznie modyfikowanych powierzchni i gradientów chemoatraktantu na migrację komórek. Ten układ mikroprzepływowy nie wymaga przepływu, ponieważ gradient jest ustalany przez dyfuzję wzdłuż kanału. Jest to ważne, ponieważ przepływ może w różny sposób wpływać na wolno migrujące komórki, takie jak fibroblasty, które tworzą stabilne zrosty ogniskowe, i szybko migrujące komórki, ta...

Ukierunkowana migracja komórek jest podstawową właściwością wielu komórek i jest kluczowym aspektem wielu normalnych procesów fizjologicznych, w tym rozwoju embrionalnego, obrony przed infekcją i gojenia się ran. Ponadto migracja komórek odgrywa również znaczącą rolę w wielu chorobach, takich jak choroby naczyniowe, przerzuty do komórek nowotworowych i przewlekłe stany zapalne1,2. Podczas gdy klasyczne stany migracji komórek - polaryzacja, wydłużenie wypukłości, tworzenie adhezji, generowanie siły i wycofanie tylne - są ogólnie akceptowane3,4 , wyjaśnienie mechanizmów czasoprzestrzennych, za pomocą których koordynowana jest integracja sygnału, było trudniejsze.
Macierz zewnątrzkomórkowa (ECM) służy jako substrat do adhezji komórek, a dzięki wrodzonej różnorodności chemicznej5 i fizycznej6, dostarcza wskazówek kierunkowych dla nawigacji komórkowej7,8. Oprócz tych adhezyjnychwskazówek 9, rozpuszczalne czynniki10-12, takie jak chemokiny i czynniki wzrostu, mogą indukować ukierunkowaną migrację komórek przez receptory chemoatraktantu i ich dalszą sygnalizację motogenną. Obecnie nie wiadomo, czy zaangażowanie i sygnalizacja poprzez receptory adhezyjne (tj. integryny) czy receptory chemoatraktantowe, takie jak receptorowa kinaza tyrozynowa (RTK), są dominujące. Nie wiadomo też, czy hierarchie systemów receptorowych są specyficzne dla typu komórki.
Mikroskopia żywych komórek dostarcza bogactwa informacji, które nie są dostępne w masowych testach i mogą być łączone z urządzeniami mikroprzepływowymi w celu generowania gradientów unieruchomionych 13,14 i rozpuszczalnych wskazówek15 16. Opisana tutaj metoda wykorzystuje szereg prostych i uznanych kroków modyfikacji powierzchni w połączeniu z dostępną na rynku komorą mikroprzepływową w celu stworzenia testu obrazowania migracji komórek, który można łatwo wdrożyć w laboratorium biologii komórki (ryc. 1). Zmontowane urządzenie mikroprzepływowe ma właściwości optyczne porównywalne ze szkłem17, a gradienty dyfuzyjnych cząsteczek są stabilne przez co najmniej 16 godzin. System może być stosowany do epifluorescencji i zaawansowanych technik mikroskopowych. W przeciwieństwie do innych konfiguracji chemotaksji18, ten system nadaje się do nagrywania wolno migrujących, przylegających komórek. Co ważne, system jest modułowy i w łatwy sposób pozwala na wprowadzenie alternatywnych adhezyjnych lub rozpuszczalnych sygnałów migracji oraz badanie różnych typów komórek.

<table><tbody><tr><td>Zestawy do barwienia szkła nakrywkowego</td><td>Thomas Scientific</td><td>8542 E40</td><td>Stojak na szkiełka nakrywkowe</td></tr><tr><td>Spoiwo do piekarnika</td><td>Seria</td><td></td><td>ED 53</td></tr><tr><td>Wafel krzemowy</td><td>Silicon Quest</td><td>708-007</td><td>Domieszkowany borem < 100> Wafel, średnica 4", 500 &mu; m, jednostronnie polerowany</td></tr><tr><td>GM1070 SU-8 fotorezystor</td><td>Gersteltec Sarl</td><td></td><td></td></tr><tr><td>SU-8 wywoływacz</td><td>Gersteltec Sarl</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Sylgard 184 utwardzacz</td><td>Dow Corning</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Sylgard 184 elastomer prepolimer</td><td>Dow Corning</td><td></td><td></td></tr><tr><td>PLL-PEG-biotyna (20%)</td><td>SuSos AG</td><td>PLL(20)-g[3.5]-PEG(2)/PEG(3.4)-Biotyna (20%)</td><td>1 mg/ ml w PBS</td></tr><tr><td>Fluorescein</td><td>Sigma</td><td>46955</td><td>1 mM w PBS</td></tr><tr><td>Streptavidin-AlexaFluor350</td><td>Invitrogen</td><td>S-11249</td><td>1 mg/ml w PBS</td></tr><tr><td>Biotyna-4-fluoresceina</td><td>Invitrogen</td><td>B-1370</td><td>0,03 &mu; g/&mu; l w PBS</td></tr><tr><td>Biotin-RGD</td><td>GenScript</td><td>SC1208</td><td>0,03 mg/ml w PBS</td></tr><tr><td>Syto 64 Red</td><td>Invitrogen</td><td>S-11346</td><td>1 &mu; M w PBS</td></tr><tr><td>Lepkie szkiełko chemotaksja 3D</td><td>Ibidi</td><td>80328</td><td></td></tr><tr><td>200 &mu; l Greiner żółta fazowana końcówka</td><td>Greiner Bio-One</td><td>739261</td><td></td></tr><tr><td>Wazelina</td><td>Sigma</td><td>16415</td><td></td></tr><tr><td>Wosk parafinowy, mp 55-57 &deg; C</td><td>Sigma</td><td>327204</td><td></td></tr><tr><td>Nano eNabler 10 &mu; m cantilever </td><td>BioForce</td><td>SPT-S-C-10s</td><td></td></tr><tr><td>Image J oprogramowanie</td><td>National Institute of Health</td><td></td><td><a href="http://rsbweb.nih.gov/ij/download.html" target="_blank">rsbweb.nih.gov/ij/download.html</a></td></tr><tr><td>Wtyczka do śledzenia ręcznego</td><td>Fabrice Cordeli&#232; res</td><td></td><td><a href="http://rsb.info.nih.gov/ij/plugins/track/track.html" target="_blank">rsb.info.nih.gov/ij/plugins/track/track.html</a></td></tr><tr><td>Chemotaxis and Migration Tool</td><td>Ibidi GmbH</td><td></td><td><a href="http://www.ibidi.com/applications/ap_chemotaxis.html" target="_blank">www.ibidi.com/applications/ap_chemotaxis.html</a></td></tr></tbody></table>

tworzenie adhezyjnych i rozpuszczalnych gradientów do obrazowania migracji komórek za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej

Creating Adhesive and Soluble Gradients for Imaging Cell Migration with Fluorescence Microscopy

Komórki mogą wyczuwać i migrować w kierunku wyższych stężeń adhezyjnych sygnałów, takich jak glikoproteiny macierzy zewnątrzkomórkowej i rozpuszczalnych sygnałów, takich jak czynniki wzrostu. W tym miejscu przedstawiamy metodę tworzenia przeciwstawnych gradientów adhezyjnych i rozpuszczalnych wskazówek w komorze mikroprzepływowej, która jest kompatybilna z obrazowaniem żywych komórek. Kopolimer poli-L-lizyny i glikolu polietylenowego (PLL-PEG) jest stosowany do pasywacji szklanych szkiełek nakrywkowych i zapobiegania niespecyficznej adsorpcji biomolekuł i komórek. Następnie druk mikrokontaktowy lub litografia zanurzeniowa są wykorzystywane do tworzenia śladów streptawidyny na pasywowanych powierzchniach, które służą jako punkty zakotwiczenia dla biotynylowanego peptydu kwasu argininowo-glicynowo-asparaginowego (RGD) jako wskazówki adhezyjnej. Urządzenie mikroprzepływowe umieszcza się na zmodyfikowanej powierzchni i wykorzystuje do tworzenia gradientu wskazówek adhezyjnych (100% RGD do 0% RGD) na ścieżkach streptawidyny. Wreszcie, to samo urządzenie mikroprzepływowe jest używane do tworzenia gradientu chemoatraktantu, takiego jak płodowa surowica bydlęca (FBS), jako rozpuszczalna wskazówka w przeciwnym kierunku niż gradient adhezyjnych wskazówek.

Aby zrozumieć, w jaki sposób komórki integrują sygnały migracyjne25, opracowaliśmy metodę obrazowania komórek za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej, które migrują w środowisku z konkurującymi gradientami adhezyjnymi i rozpuszczalnymi (Rysunek 1). Ścieżki adhezyjne zawierające fluorescencyjną streptawidynę i biotinylowany peptyd RGD zostały utworzone za pomocą mikrodruku kontaktowego oraz litografii piórem dip-pen (Rysunek 2). O poprawnym mikrodruku kontaktowym świadczy profil...

Opisano metodę montażu adhezyjnych i rozpuszczalnych gradientów w komorze mikroskopowej do badań migracji żywych komórek. Zaprojektowane środowisko łączy powierzchnie przeciwporostowe i ścieżki adhezyjne z gradientami roztworu, a tym samym pozwala określić względne znaczenie wskazówek naprowadzających.

Tworzenie adhezyjnych i rozpuszczalnych gradientów do obrazowania migracji komórek za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej

Cells can sense and migrate towards higher concentrations of adhesive cues such as the glycoproteins of the extracellular matrix and soluble cues such as ...

Ogólnym celem tej procedury jest stworzenie gradientów adhezyjnych i rozpuszczalnych do badania migracji komórek. Osiąga się to poprzez uprzednią pasywację powierzchni w celu zapobiegania nieswoistej adhezji komórek. Drugim krokiem jest wykonanie stempli metodą mikrokontaktowego druku.Następnie na powierzchni naniesiono wzór z linii streptawidyny za pomocą mikrodoświetlania kontaktowego. Streptawidynę można również nanieść w formie kropek, wykorzystując litografię dip-pen na dnie urządzenia mikroprzepływowego. Zmodyfikowana powierzchnia będzie stanowiła podstawę dla gradientu adhezyjnego biotyny RGD.Ostatnim krokiem jest naniesienie komórek na powierzchnię z sygnałem adhezyjnym w obecności gradientu rozpuszczalnego chemoatraktanta. W końcowej fazie wykorzystuje się mikroskopię komórek żywych, aby wykazać migrację komórek w odpowiedzi na sygnały adhezyjne i rozpuszczalne. Główną zaletą tej techniki w porównaniu z istniejącymi metodami, takimi jak testy transwell, testy w komorach próżniowych czy konwencjonalne układy mikroprzepływowe, jest to, że zintegrowany system mikroprzepływowego urządzenia z wzorcowaniem powierzchni umożliwia jednoczesną obserwację odpowiedzi komórek na przestrzennie kontrolowane sygnały adhezyjne, gradient adhezyjny oraz gradient rozpuszczalny.Ta metoda może pomóc w odpowiedzi na kluczowe pytania w dziedzinie migracji komórek, takie jak znaczenie adhezji komórkowej oraz crosstalk pomiędzy chemotaktycznymi receptorami, np. kinazą receptorową G, receptorami sprzężonymi z białkiem G i receptorami adhezyjnymi. Aby przygotować szkiełka przedmiotowe, najpierw należy je wyczyścić, zanurzając je w statywie w 100% etanolu, a następnie umieszczając statyw w sonikacyjnej kąpieli wodnej na 30 minut. Szkiełka przedmiotowe należy wysuszyć na powietrzu.Następnie poddaj szkiełka nakrywkowe sonikacji przez 30 minut w 1 M wodorotlenku sodu. Po tym czasie opłucz szklane powierzchnie, ostrożnie przechylając statyw w zlewce wypełnionej 1,5 l wody Milli-Q. Powtórz proces płukania trzy razy, za każdym razem używając świeżej wody Milli-Q.Po trzecim płukaniu wysusz szkiełka podstawowe w piekarniku w temperaturze 60 °C przez około pół godziny. Połowę czystych szkiełek podstawowych umieść pojedynczo w komorze wilgotnościowej wykonanej z płytki 24-dołkowej, częściowo wypełnionej wodą. Dołki wypełnia się wodą, a szkiełka podstawowe kładzie się na ich wierzchu w celu nawilżenia. Stosowany jest kopolimer polilizyny i glikolu polietylenowego, w którym 20% cząsteczek PEG jest szczepionych biotyną.W skrócie jako PLL Peg biotin. Nanieś kroplę 15 µL PLL Peg biotin w PBS na każde szkiełko nakrywki. Weź drugą połowę pozostałych czystych szkiełek nakrywek i ostrożnie przykryj nimi roztwór PEG, tworząc kanapkę. Pozostaw szkiełka na jedną godzinę w komorze wilgotnościowej.Po godzinie delikatnie rozsunij szkiełka nakrywki, tak aby nie uszkodzić powierzchni pokrytej PEG, a następnie wypłucz je wodą UE. Woda powinna łatwo spływać ze strony potraktowanej PEG. W razie potrzeby.Osusz szkiełka podstawowe na ręczniku papierowym, kierując przetworzoną powierzchnię ku górze. Przechowuj szkiełka podstawowe w eksykatorze próżniowym do czasu dalszego użycia. Matryca krzemowa wymagana do tej procedury jest wytwarzana metodą fotolitografii w celu odlewu stempla PDMS. Należy wylać elastomer PDMS na matrycę krzemową w szalce Petriego do wysokości około 1 cm, a następnie utwardzić matrycę i mieszaninę PDMS w piekarniku w temperaturze 70 °C przez jedną godzinę.Następnie stempel z PDMS jest zdejmowany z formy krzemowej i docięty do odpowiedniego rozmiaru w celu wydrukowania wzorów białkowych przy użyciu techniki mikro-druku kontaktowego. Najpierw należy oczyścić stempel oraz zwiększyć jego hydrofilowość, poddając stronę z wzorem działaniu czyszczarki UV-ozonowej przez półtorej godziny. Natychmiast po obróbce ozonowej należy nanieść i rozprowadzić 10 µL oczyszczonej streptawidyny na stempel z PDMS. Jeśli ścieżki mają być widoczne pod mikroskopem fluorescencyjnym, należy użyć oczyszczonej streptawidyny sprzężonej z fluoroforem, np. streptawidyny koniugowanej z Rhodamine 350.Pozostawić na jedną godzinę w komorze wilgotnościowej. Usunąć nadmiar strep din ze stempla za pomocą chusteczki, papieru oraz powietrza. Osuszyć stempel przez około jedną minutę.Lekko dociśnij stempel do szkiełka nakrywkowego pokrytego biotyną na podłożu PLL. W przypadku użycia fluorescencyjnej streptawidyny, sprawdź wzór pod mikroskopem fluorescencyjnym epifluorescencyjnym. Wzory białkowe można również nanosić za pomocą litografii dip-pen.W pierwszej kolejności wymieszaj jedną część stężenia 1 mg/ml Avidain ELIF Fluor 350 (w formie strippingowej lub po strippingu) z 10 częściami glicerolu, a następnie nanieś 5 µL mieszaniny na wspornik. Dostosuj prędkość drukowania. Reguluj czas kontaktu wspornika z powierzchnią lub pionową odległość wspornika od powierzchni, aby zmniejszyć rozmiar plamki.Proces drukowania rozpoczyna się przy wykorzystaniu około pięciu mikrometrów, zgodnie z opisem w instrukcji obsługi urządzenia do litografii dip-pen. Wszystkie wydrukowane powierzchnie przechowywane są w deskrykatorze. Do tworzenia gradientów powierzchniowych wykorzystywane jest dostępne komercyjnie urządzenie mikroprzepływowe.Przyklej pokrywki szklane powlekane tritonem lub wzorowane tritonem do lepkiej strony urządzenia, aby zapobiec wyciekom przez kilka godzin. Uszczelnij krawędzie urządzenia cienką warstwą podgrzanej wazeliny, a następnie drugą warstwą mieszaniny jednej części wazeliny i jednej części wosku parafinowego. Wypełnij kanał urządzenia 6 µL PBS, aby stworzyć dwa przeciwstawne gradienty.Napełnij dwa zbiorniki: jeden 70 µL biotyny z czterema fluoresceinamidami, a drugi 70 µL biotyny sprzężonej z biotynylowanym peptydem arginina-glicyna-kwas asparaginowy (RGD); inkubuj próbki w temperaturze pokojowej w ciemności przez jedną godzinę. Płukanie biotyny, RGD oraz biotyny w urządzeniu mikrofluidycznym jest najtrudniejszym etapem tej procedury ze względu na ryzyko uwięzienia pęcherzyków powietrza i naruszenia ścieżek naniesionych metodą mikrodościsku (micro contact printing). Aby zapewnić powodzenie operacji, biotynę i PBS należy usuwać ostrożnie i powoli.Usunąć roztwory biotyny i ostrożnie przepłukać powierzchnię dwukrotnie przy użyciu PBS, gdy wciąż jest ona przymocowana do urządzenia mikroprzepływowego. Przed załadowaniem komórek znakowanych fluorescencyjnie do urządzenia mikroprzepływowego należy zaznaczyć kierunek gradientu adhezyjnego. Policzyć komórki i podzielić je na dwie probówki zawierające taką samą liczbę komórek.Przemyć i resuspendować. Jedną probówkę z komórkami zawiesić w medium zawierającym chemoatraktant, takim jak DMEM o niskiej zawartości glukozy z 10% FBS, a drugą probówkę z komórkami w medium bez chemoatraktanta, takim jak DMEM z 0% FBS; końcowe stężenie komórek w każdej probówce powinno wynosić 5 × 10⁵ komórek na mililitr.Usuń wszystkie roztwory z urządzenia mikroprzepływowego i umieść je na wstępnie podgrzanym mikroskopie. Nałóż 70 µL komórek resuspendowanych w 0% FBS-DMEM do jednego zbiornika. Nałóż 70 µL komórek resuspendowanych w 10% FBS-DMEM do drugiego zbiornika.Luźno zaklejone zbiorniki taśmą, aby zapobiec odparowaniu. Należy upewnić się, że kanał urządzenia mikroprzepływowego znajduje się w polu widzenia, a komórki są w ostrości. Wybrać parametry akwizycji obrazu, takie jak czasy ekspozycji i filtry fluorescencyjne.Sekwencja obrazów w polu jasnym i fluorescencji, w której komórki i ścieżki, a także punkty czasowe i długość nagrania uruchamiają program akwizycji obrazu. Ten film demonstruje metodę obrazowania żywych komórek migrujących w środowisku z konkurującymi gradientami adhezyjnymi i rozpuszczalnymi. Ścieżki adhezyjne zawierające fluorescencyjną streptawidynę i biotynilowany RGD zostały utworzone za pomocą mikrodo druku kontaktowego lub litografii dip-pen.O sukcesie mikrodruku kontaktowego świadczy profil linii intensywności fluorescencji w poprzek ścieżek, na którym można wyraźnie rozróżnić ścieżki adhezyjne oraz obszary przeciwzakotwiczające. Kropki naniesione metodą litografii dip-pen mają zaokrąglony kształt, a nie kształt łzy, co wskazuje na prawidłowy przebieg procesu drukowania. W tym przykładzie kropki zostały naniesione w linii, przy odstępach między rzędami i kolumnami wynoszących od 10 do 15 micrometers.Odległość ta jest wystarczająca, aby zapobiec zlewaniu się kropek, a jednocześnie umożliwia obserwację wielu kropek w jednym polu widzenia. Przy większości ustawień mikroskopu, za pomocą prostego urządzenia mikroprzepływowego utworzono gradient sygnałów adhezyjnych na wydrukowanym ścieżce. Odbyło się to poprzez wprowadzenie biotyny-fluoresceiny 4 oraz biotyny-RGD po przeciwnych stronach panelu komory mikroprzepływowej.Rycina A przedstawia 60 obrazów mozaikowych wykonanych przy całkowitej długości obrazu wynoszącej 3072 micrometers. Na panelu B zmierzono intensywność fluorescencji wzdłuż całej długości mozaiki. Do intensywności fluorescencji dopasowano linie trendu liniowego, aby wskazać gradient RGD w kanale.Po usunięciu roztworu biotyny RGD, ta sama komora może zostać wykorzystana do wprowadzenia gradientu rozpuszczalnego. Panel A przedstawia intensywność fluorescencji barwnika fluoresceinowego w pobliżu zbiorników wypełnionych PBS i fluoresceiną oraz w poprzek kanału w czasie T równym zero. Panel B przedstawia intensywność fluorescencji rozpuszczalnych czynników sygnałowych.Po 16-godzinnej inkubacji porównawcze wyniki wskazały, że gradient był stabilny przez co najmniej 16 godzin. Przy użyciu tej metody zaobserwowano migrację komórek w komorze mikroprzepływowej z przeciwstawnymi gradientami, a reprezentatywny film przedstawiono tutaj. Gradient adhezyjny stanowił unieruchomiony RGD na ścieżkach streptawidyny, a gradient rozpuszczalny wynosił od 0 do 10% FBS.Zdjęcia wykonywano co 15 minut przez łącznie 20 godzin. Pokazane przejście obrazów odbywa się w tempie ośmiu klatek na sekundę. Ten drugi film przedstawia pojedynczą komórkę heli migrującą w kierunku źródła FBS.Przejście obrazu jest wyświetlane w tempie ośmiu klatek na sekundę. Niebieska linia reprezentująca trajektorię komórki została uzyskana za pomocą oprogramowania do śledzenia komórek. Ostatnia grafika przedstawia trajektorie komórek z obrazów w pierwszym filmie.Trajektorie komórek, które migrowały w stronę wyższego stężenia rozpuszczalnego FPS, przedstawiono na czerwono, natomiast trajektorie komórek migrujących w stronę wyższego stężenia adherentnego RGD przedstawiono na czarno. Trajektorie te wykazały, że więcej komórek HeLa migrowało w stronę źródła chemoatraktanta niż w stronę wyższych stężeń adherentnego RGD. Podczas wykonywania tej procedury należy pamiętać o unikaniu odparowania PBS lub pożywki w urządzeniu mikrofluidycznym podczas przygotowywania gradientu adhezyjnego i obrazowania timelapse; w razie potrzeby należy użyć taśmy klejącej, aby zakryć wszystkie wloty urządzenia mikrofluidycznego po zakończeniu tej procedury.W celu odpowiedzi na dodatkowe pytania, takie jak biomechanika cytoszkieletu zależna od białek, rola białek adhezji ogniskowej i receptorów podczas migracji komórek, można zastosować inne metody, takie jak transfekcja i mikroskopia roztworów hybrydowych.

creating-adhesive-soluble-gradients-for-imaging-cell-migration-with

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Bioinżynieria

Tworzenie gradientów adhezji i rozpuszczalnych do obrazowania migracji komórek za pomocą mikroskopu fluorescencyjnego

Opisujemy protokół mikrofabrykacji mikroprzepływowego urządzenia do generowania gradientów, które umożliwia tworzenie przestrzennych i czasowych gradientów w ściśle określonym mikrośrodowisku. W tym podejściu mikroprzepływowe urządzenie do generowania gradientów może być wykorzystane do badania kierunkowej migracji komórek, embriogenezy, gojenia ran oraz przerzutów nowotworowych.

Mikroprzepływowe urządzenie do generowania gradientów w biologii komórki

Procesy komórkowe, takie jak migracja komórek, były tradycyjnie badane na dwuwymiarowych, sztywnych powierzchniach plastikowych. Niniejszy raport opisuje technikę bezpośredniej wizualizacji lokalizacji białek oraz analizy dynamiki białek w komórkach migrujących w bardziej fizjologicznie istotnej macierzy trójwymiarowej.

Obrazowanie żywych komórek migrujących, wykazujących ekspresję białek z fluorescencyjnym znacznikiem, w macierzy trójwymiarowej

Łącząc transplantację komórek, znakowanie cytoszkieletu i podejście do utraty/wzmocnienia funkcji, ten protokół opisuje, w jaki sposób migrująca prospektywna płytka przedstrunowa danio pręgowanego może być wykorzystana do analizy funkcji genu kandydującego w migracji komórek in vivo.

Analiza migracji komórek in vivo przy użyciu przeszczepów komórek i obrazowania poklatkowego w zarodkach danio pręgowanego

Wizualne testy chemotaksji są niezbędne do lepszego zrozumienia, w jaki sposób komórki eukariotyczne kontrolują kierunkową migrację komórek za pośrednictwem chemoatraktantu. W tym miejscu opisujemy szczegółowe metody dla: 1) monitorowania w czasie rzeczywistym w wysokiej rozdzielczości wielu testów chemotaksji oraz 2) jednoczesnej wizualizacji gradientu chemoatraktantu i czasoprzestrzennej dynamiki zdarzeń sygnalizacyjnych w neutrofilopodobnych komórkach HL60.

Obrazowanie chemotaksji sprzężonej z białkiem G i jej zdarzeń sygnalizacyjnych w neutrofilowych komórkach HL60

Ten protokół szczegółowo opisuje konfigurowalną metodę pomiaru migracji komórek w odpowiedzi na chemoatraktanty, które mogą być również użyte do określenia szybkości dyfuzji leku z matrycy polimerowej.

Konfigurowalna komora do pomiaru migracji komórek

Kontrola gradientów chemicznych i tlenu jest niezbędna dla hodowli komórkowych. W artykule opisano urządzenie mikroprzepływowe z polidimetylosiloksanu i poliwęglanu (PDMS-PC) zdolne do niezawodnego generowania kombinacji gradientów chemicznych i tlenowych do badań migracji komórek, które można praktycznie wykorzystać w laboratoriach biologicznych bez wyrafinowanego oprzyrządowania.

Urządzenia mikroprzepływowe z polidimetylosiloksanu i poliwęglanu do badań migracji komórek w prostopadłych gradientach chemicznych i tlenu

Zbiorowa migracja komórek w procesie rozwoju, gojenia ran i przerzutów nowotworowych jest często kierowana przez gradienty czynników wzrostu lub cząsteczek sygnałowych. Opisano tutaj eksperymentalny system łączący mikroskopię trakcyjną z układem mikroprzepływowym oraz demonstrację sposobu ilościowego określania mechaniki migracji zbiorowej w warunkach gradientu biochemicznego.

Mikroskopia trakcyjna zintegrowana z mikrofluidyką do chemotaktycznej migracji zbiorowej

Tutaj opisujemy metody wykorzystujące mikroskopię poklatkową z kontrastem fazowym do obrazowania makrofagów otrzewnowych rezydujących myszy w chemotaktycznym gradiencie dopełniacza C5a. Protokoły można rozszerzyć na inne komórki odpornościowe.

Obrazowanie poklatkowe chemotaksji makrofagów myszy

Ten protokół przedstawia eksperymentalne procedury przeprowadzania testu śladu adhezyjnego w celu zobrazowania zdarzeń adhezji podczas szybkiej adhezji toczenia komórek.

Obrazowanie adhezji molekularnej w walcowaniu komórek za pomocą testu śladu adhezyjnego

Protokół do ilościowej oceny migracji komórek 3D w obrębie i do interfejsu granulowanych hydrożeli jest przedstawiony tutaj.

Kwantyfikacja trójwymiarowej migracji komórek w obrębie i do granulowanych biomateriałów hydrożelowych

Poznaj metodę tworzenia adhezyjnych i rozpuszczalnych gradientów do badania migracji komórek przy użyciu mikroskopii fluorescencyjnej. Technika umożliwia obserwację odpowiedzi komórek na sygnały przestrzenne.

Tworzenie adhezyjnych i rozpuszczalnych gradientów do obrazowania migracji komórek za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej

Przeglądaj więcej filmów