Analizy populacji komórek podczas kancerogenezy skóry

Ogólnym celem tej procedury jest przeprowadzenie analiz populacji komórek w mysim modelu raka podstawnokomórkowego raka skóry. Osiąga się to poprzez najpierw indukcję ekspresji genów docelowych u myszy. W drugim etapie naskórek jest izolowany od skóry myszy.

Po wytworzeniu zawiesiny pojedynczej komórki, komórki naskórka są znakowane określonymi markerami usług komórkowych. Ostatecznie zmiany populacji komórek podczas rozwoju guza w skórze można monitorować za pomocą analizy cytometrii przepływowej. Rozwój raka to proces obejmujący wiele typów komórek.

Celem tej procedury jest pomoc naukowcom w zbadaniach, w jaki sposób różne komórki przyczyniają się do rozwoju raka skóry. Metoda ta może zapewnić wgląd w interakcje komórkowe podczas rozwoju raka skóry, ale może być również stosowana do innych systemów, takich jak rak trzustki. Wizualna demonstracja tej metody ma kluczowe znaczenie, ponieważ trudno jest określić, kiedy eksperyment powinien zostać zakończony bez oceny wizualnej.

Na początek ma keratynę 14 myszy Cree ER określane jako myszy K 14 z myszami Rosa 26 zawierającymi znakowany YFP zmutowany wygładzony gen SMU M dwa określany jako SMU. Myszy. Następnie zanurz 0,5-centymetrowe próbki ogonowe zebrane od podwójnie dodatnich myszy w wieku od trzech do sześciu tygodni w roztworze do lizy ogona PCR z jednym miligramem na mililitr proteinazy K. Następnie inkubuj próbki przez noc w temperaturze 55 stopni Celsjusza z potrząsaniem. Następnego dnia obróć tkankę z maksymalną prędkością w mikrowirówce, aby usunąć zanieczyszczenia.

Następnie, aby genotypować każde zwierzę, użyj jednego mikrolitra SNAT z każdej próbki w indywidualnych reakcjach PCR ze starterami i warunkami zgodnie z zaleceniami sprzedawcy. Za pomocą zakrzywionej igły do karmienia o rozmiarze 20 należy podawać tamoksyfen zwierzętom. Podwójnie dodatni dla K 14 C er i ROSA 26 przez zgłębnik doustny przez pięć kolejnych dni w celu wywołania ekspresji OO M dwa w keratynocytach.

Ogólnie rzecz biorąc, fenotypy są bardziej dotkliwe dla ucha i ogona myszy oznaczonych GFP K 14 OO w celu pobrania skóry do analizy komórek. Najpierw użyj drżenia, aby usunąć sierść z uśpionego zwierzęcia. Następnie usuń skórę myszy i zanurz tkankę w roztworze disbe o temperaturze 37 stopni Celsjusza na jedną do dwóch godzin.

Po zabiegu dispa użyj kleszczy, aby oddzielić naskórek od skóry właściwej. Teraz użyj nożyczek, aby zmielić naskórek. Następnie zanurz tkankę w roztworze kolagenazy czwartej na jedną do dwóch godzin w temperaturze 37 stopni Celsjusza w 50-mililitrowej probówce.

Delikatnie obracaj rurkę co 20 minut, aby oddzielić komórki. Użyj mikroskopu, aby potwierdzić dysocjację komórek, gdy pojedyncze komórki można wykryć w pożywce kolagenazy. Inkubuj próbkę przez dodatkowe 30 minut, aby zwiększyć wydajność komórek.

Następnie przefiltruj mieszaninę tkanek przez sitko do komórek o wielkości 70 mikronów i myj komórki przez 10 minut w temperaturze 500 razy G i temperaturze pokojowej, aby oznaczyć komórki, zacznij od resus, zawieszając właśnie umyte osady w PBS uzupełnionym 10% FBS w ilości 2,5 razy 10 z sześciu komórek na mililitr. Następnie umieść roztwór komórkowy na lodzie na 30 minut, aby zablokować wszelkie niespecyficzne wiązanie. Następnie przenieś podwielokrotności komórek do mikroprobówek o pojemności 1,5 mililitra w celu znakowania specyficznych przeciwciał.

Dodanie przeciwciał do każdej probówki w końcowym stężeniu dwóch mikrogramów na mililitr. Delikatnie wiruj probówki przez kilka sekund, aby wymieszać przeciwciała z komórkami, a następnie umieść probówki z powrotem na lodzie na kolejne 30 minut. Po umyciu probówek w jednym mililitrze PBS, ponownie zawieś granulki w PBS, a następnie dodaj DPI w końcowym stężeniu jednego miligrama na mililitr.

Podczas analizowania danych najpierw wybierz pojedyncze komórki na podstawie wykresu punktowego do przodu i bocznego wykresu punktowego, z wyłączeniem dodatnich martwych komórek DABI. Myszy nie rozwijają raka podstawnokomórkowego, z wyjątkiem sytuacji, gdy aktywowana jest sygnalizacja hedgehog, jak widać na tych obrazach. Indukowana tamoksyfenem ekspresja onkogennego, wygładzonego gładkiego M 2 YFP skutkuje fenotypem skóry, który jest widoczny nawet na poziomie anatomicznym wzrostu w próbkach barwionych skórą h i e od tych zwierząt.

Guzy skóry można zaobserwować u myszy K 14 SMU. Bez indukcji SMU M 2 YFP skóra zwierzęcia nie wykazywała nieprawidłowej morfologii o wartości h i e. Barwienie tych wykresów kropkowych pokazuje reprezentatywną analizę komórek szpikowych u myszy normalnych i z nowotworem.

Komórki CD 11 B dodatnie GR one pochodzą z komórek szpikowych, z których niektóre są komórkami supresorowymi pochodzenia szpikowego u normalnych i niesmu M dwóch myszy indukowanych YFP. CD 11 B dodatnia GR jedna dodatnia populacja komórek jest ledwo wykrywalna, ale zwiększa się w odpowiedzi na stan zapalny lub rozwój guza. W K 14 myszy SMU.

Indukowana ekspresja smu, M, dwóch, YFP i keratynocytów w skórze powoduje wzrost populacji komórek CD 11 B dodatnich GR one. Technika ta pozwoli naukowcom zajmującym się biologią skóry na przeprowadzenie analizy molekularnej raka komórek B u myszy.