Name: Analizy populacji komórek podczas kancerogenezy skóry (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-08-21T12:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 53 s
Description: Poznaj analizę populacji komórek podczas kancerogenezy skóry w modelu mysim. Ta metoda umożliwia badanie interakcji między komórkami nowotworowymi a ich mikrośrodowiskiem za pomocą cytometrii przepływowej.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

To badanie było wspierane przez NCI (R01-94160 i R01-155086), IU Simon Cancer Center i Wells Center for Pediatric Research.

To badanie zostało zatwierdzone przez Komitet IACUC w Indiana University School of Medicine.
1. Generuj myszy z prawidłowymi genotypami
<ol>
	<li>Ustal mysi model BCC. Połącz myszy K14-CreER (numer zapasów laboratorium Jacksona 005107) z myszami R26-SmoM2YFP (numer zapasów laboratorium Jackson 005130) (18) w celu wygenerowania myszy K14-creER+ i R26-SmoM2YFP+.</li>
	<li>Wykonaj genotypowanie. Zanurzyć próbki ogonów (o długości 0,5 cm) w roztworze do lizy ogona metodą directPCR z 1 mg/ml proteinazy K w temperaturze 55 °C przez noc z wytrząsaniem. Następnego dnia usuń resztki tkanek przez odwirowanie z maksymalną prędkością w mikrowirówce (aby zachować supernatant do genotypowania). Użyć 1 μl supernatantu do każdej reakcji PCR ze starterami i warunkami zalecanymi przez dostawcę. Wybierz myszy z odpowiednimi genotypami (w wieku 3-6 tygodni buprenorfina w dawce 0,05-0,1 mg/kg będzie podawana przez SQ co 8-12 godzin przez 2-3 dni po wycięciu ogona) dla kroku 2.</li>
</ol>
2. Indukuj ekspresję SmoM2 w keratynocytach skóry
Indukuj ekspresję SmoM2 w keratynocytach poprzez doustne podawanie tamoksyfenu (5 μg/kg masy ciała w 50 ml oleju roślinnego w każdym karmieniu) przez 5 kolejnych dni przez doustny zgłębnik z igłą do karmienia (zakrzywiona 20 gauge).
3. Przygotowanie próbek skóry
Ogólnie, fenotypy są bardziej dotkliwe dla ucha i ogona u myszy K14creER/R26SmoM2GFP. Aby przygotować się do analiz komórkowych, najpierw pobieramy skórę myszy po uśmierceniu zwierzęcia za pomocą zatwierdzonej przez instytucję procedury (CO2 plus zwichnięcie szyjki macicy).
4. Izolacja naskórka
<ol>
	<li>Po uśmierceniu myszy za pomocą zatwierdzonej procedury (patrz krok 3), usuń sierść za pomocą trymera. Zanurzyć próbki skóry w roztworze dyspazy (5 mg/ml w DMEM z 10% FBS) w temperaturze 37 °C przez 1-2 godziny (1 godzina dla myszy w wieku poniżej 8 tygodni i 2 godziny dla myszy w wieku poniżej 8 tygodni).</li>
	<li>Po leczeniu dispazy należy oddzielić naskórek od skóry właściwej za pomocą kleszczy.</li>
</ol>
5. Generuj pojedyncze komórki
<ol>
	<li>Aby uzyskać populację pojedynczych komórek, zmiel naskórek nożyczkami, a następnie zanurz w roztworze kolagenazy dożylnej (1 mg / ml w DMEM z 10% FBS) na 1-2 godziny w temperaturze 37 °C w probówce o pojemności 50 ml. Staraj się delikatnie obracać rurki co 20 minut, aby pomóc w dysocjacji komórek.</li>
	<li>Sprawdź dysocjację komórek pod mikroskopem. Gdy pojedyncze komórki można wykryć w pożywce kolagenazy, należy inkubować próbkę przez dodatkowe 30 minut, aby zwiększyć wydajność komórek. Ogólnie rzecz biorąc, naskórek jednej myszy może dać do 107 komórek.</li>
	<li>Przefiltrować mieszaninę tkanek przez sitko komórkowe (wielkość porów 70 μm), odwirować komórki z prędkością 1,500 obr./min za pomocą wirowania na stole i przemyć raz PBS.</li>
</ol>
6. Oznaczanie komórek i wykonywanie analiz cytometrii przepływowej
<ol>
	<li>Ponownie zawiesić komórki w 10% FBS w PBS przy 2,5 x 106 komórek/ml, aby zablokować niespecyficzne wiązanie (na lodzie przez 30 min)</li>
	<li>Pobrać porcję komórek do każdej z mikroprobówek o pojemności 1,5 ml w celu znakowania przeciwciał. Dodać różne przeciwciała do każdej probówki w końcowym stężeniu 2 μg/ml. Mieszać przeciwciała z komórkami przez delikatny wierzchołek przez kilka sekund i pozostawić je na lodzie na 30 minut, a następnie przemyć 1 ml PBS. W przypadku próbek BCC użyliśmy przeciwciał dla następujących biomarkerów: CD11b-PE plus Gr1-APC (komórki szpikowe lub komórki supresorowe pochodzenia mieloidalnego); wimentyna-FITC (fibroblast) (szczegółowe informacje można znaleźć w odczynnikach).</li>
	<li>Do barwienia wewnątrzkomórkowego używamy zestawu i postępujemy zgodnie z instrukcją dostawcy (szczegółowe informacje można znaleźć w sekcji Odczynniki). Używamy świeżych komórek do analizy markerów powierzchniowych komórek. Po wybarwieniu markerem powierzchniowym umyj komórki i ponownie zawieś je w PBS. Dodać DAPI do mieszaniny komórek w końcowym stężeniu 1 μg/ml. DAPI wybarwi martwe komórki, które zostaną wykluczone z dalszych analiz.</li>
	<li>Analizuj dane za pomocą specjalnego oprogramowania. Najpierw wybieramy pojedyncze komórki na podstawie wykresu FSC vs. SSC i używamy ujemnej populacji DAPI (żywych komórek) do dalszej analizy.</li>
</ol>

<ol><li>Rogers, H. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Incidence+estimate+of+nonmelanoma+skin+cancer+in+the+United+States%5BTitle%5D)+AND+%22Arch.+Dermatol%22%5BJournal%5D)">Incidence estimate of nonmelanoma skin cancer in the United States.</a> Arch. Dermatol. 146, 283-287 (2006).</li>
<li>Epstein, E. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Basal+cell+carcinomas%3A+attack+of+the+hedgehog%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Rev.+Cancer%22%5BJournal%5D)">Basal cell carcinomas: attack of the hedgehog.</a> Nat. Rev. Cancer. 8, 743-754 (2008).</li>
<li>Yang, L., Xie, G., Fan, Q., Xie, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Activation+of+the+hedgehog-signaling+pathway+in+human+cancer+and+the+clinical+implications%5BTitle%5D)+AND+%22Oncogene%22%5BJournal%5D)">Activation of the hedgehog-signaling pathway in human cancer and the clinical implications.</a> Oncogene. 29, 469-481 (2010).</li>
<li>Johnson, R. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+homolog+of+patched%2C+a+candidate+gene+for+the+basal+cell+nevus+syndrome%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Human homolog of patched, a candidate gene for the basal cell nevus syndrome.</a> Science. 272, 1668-1671 (1996).</li>
<li>Hahn, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+mammalian+patched+homolog+is+expressed+in+target+tissues+of+sonic+hedgehog+and+maps+to+a+region+associated+with+developmental+abnormalities%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biol.+Chem%22%5BJournal%5D)">A mammalian patched homolog is expressed in target tissues of sonic hedgehog and maps to a region associated with developmental abnormalities.</a> J. Biol. Chem. 271, 12125-12128 (1996).</li>
<li>Hahn, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mutations+of+the+human+homolog+of+Drosophila+patched+in+the+nevoid+basal+cell+carcinoma+syndrome%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Mutations of the human homolog of Drosophila patched in the nevoid basal cell carcinoma syndrome.</a> Cell. 85, 841-851 (1996).</li>
<li>Xie, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Activating+Smoothened+mutations+in+sporadic+basal-cell+carcinoma%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Activating Smoothened mutations in sporadic basal-cell carcinoma.</a> Nature. 391, 90-92 (1998).</li>
<li>Reifenberger, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Missense+mutations+in+SMOH+in+sporadic+basal+cell+carcinomas+of+the+skin+and+primitive+neuroectodermal+tumors+of+the+central+nervous+system%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Res%22%5BJournal%5D)">Missense mutations in SMOH in sporadic basal cell carcinomas of the skin and primitive neuroectodermal tumors of the central nervous system.</a> Cancer Res. 58, 1798-1803 (1998).</li>
<li>Lam, C. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+frequent+activated+smoothened+mutation+in+sporadic+basal+cell+carcinomas%5BTitle%5D)+AND+%22Oncogene%22%5BJournal%5D)">A frequent activated smoothened mutation in sporadic basal cell carcinomas.</a> Oncogene. 18, 833-836 (1999).</li>
<li>Nilsson, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Induction+of+basal+cell+carcinomas+and+trichoepitheliomas+in+mice+overexpressing+GLI-1%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Induction of basal cell carcinomas and trichoepitheliomas in mice overexpressing GLI-1.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 97, 3438-3443 (2000).</li>
<li>Sheng, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dissecting+the+oncogenic+potential+of+Gli2%3A+deletion+of+an+NH%282%29-terminal+fragment+alters+skin+tumor+phenotype%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Res%22%5BJournal%5D)">Dissecting the oncogenic potential of Gli2: deletion of an NH(2)-terminal fragment alters skin tumor phenotype.</a> Cancer Res. 62 (2), 5308-5316 (2002).</li>
<li>Reifenberger, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Somatic+mutations+in+the+PTCH%2C+SMOH%2C+SUFUH+and+TP53+genes+in+sporadic+basal+cell+carcinomas%5BTitle%5D)+AND+%22Br.+J.+Dermatol%22%5BJournal%5D)">Somatic mutations in the PTCH, SMOH, SUFUH and TP53 genes in sporadic basal cell carcinomas.</a> Br. J. Dermatol. 152, 43-51 (2005).</li>
<li>Guha, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hedgehog+inhibitor+gets+landmark+skin+cancer+approval%2C+but+questions+remain+for+wider+potential%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Rev.+Drug+Discov%22%5BJournal%5D)">Hedgehog inhibitor gets landmark skin cancer approval, but questions remain for wider potential.</a> Nat. Rev. Drug Discov. 11, 257-258 (2012).</li>
<li>Sekulic, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Efficacy+and+safety+of+vismodegib+in+advanced+basal-cell+carcinoma%5BTitle%5D)+AND+%22N.+Engl.+J.+Med%22%5BJournal%5D)">Efficacy and safety of vismodegib in advanced basal-cell carcinoma.</a> N. Engl. J. Med. 366, 2171-2179 (2012).</li>
<li>Tang, J. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inhibiting+the+hedgehog+pathway+in+patients+with+the+basal-cell+nevus+syndrome%5BTitle%5D)+AND+%22N.+Engl.+J.+Med%22%5BJournal%5D)">Inhibiting the hedgehog pathway in patients with the basal-cell nevus syndrome.</a> N. Engl. J. Med. 366, 2180-2188 (2012).</li>
<li>Aszterbaum, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ultraviolet+and+ionizing+radiation+enhance+the+growth+of+BCCs+and+trichoblastomas+in+patched+heterozygous+knockout+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Med%22%5BJournal%5D)">Ultraviolet and ionizing radiation enhance the growth of BCCs and trichoblastomas in patched heterozygous knockout mice.</a> Nat. Med. 5, 1285-1291 (1999).</li>
<li>Pazzaglia, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Modulation+of+patched-associated+susceptibility+to+radiation+induced+tumorigenesis+by+genetic+background%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Res%22%5BJournal%5D)">Modulation of patched-associated susceptibility to radiation induced tumorigenesis by genetic background.</a> Cancer Res. 64, 3798-3806 (2004).</li>
<li>Athar, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inhibition+of+smoothened+signaling+prevents+ultraviolet+B-induced+basal+cell+carcinomas+through+regulation+of+Fas+expression+and+apoptosis%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Res%22%5BJournal%5D)">Inhibition of smoothened signaling prevents ultraviolet B-induced basal cell carcinomas through regulation of Fas expression and apoptosis.</a> Cancer Res. 64, 7545-7552 (2004).</li>
<li>Mancuso, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Basal+cell+carcinoma+and+its+development%3A+insights+from+radiation-induced+tumors+in+Ptch1-deficient+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Res%22%5BJournal%5D)">Basal cell carcinoma and its development: insights from radiation-induced tumors in Ptch1-deficient mice.</a> Cancer Res. 64, 934-941 (2004).</li>
<li>Ellis, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Patched+1+conditional+null+allele+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Genesis%22%5BJournal%5D)">Patched 1 conditional null allele in mice.</a> Genesis. 36, 158-161 (2003).</li>
<li>Mao, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+novel+somatic+mouse+model+to+survey+tumorigenic+potential+applied+to+the+Hedgehog+pathway%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Res%22%5BJournal%5D)">A novel somatic mouse model to survey tumorigenic potential applied to the Hedgehog pathway.</a> Cancer Res. 66, 10171-10178 (2006).</li>
<li>Wang, G. Y., Wang, J., Mancianti, M. L., Epstein, E. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Basal+cell+carcinomas+arise+from+hair+follicle+stem+cells+in+Ptch1%28%2B%2F-%29+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Cell%22%5BJournal%5D)">Basal cell carcinomas arise from hair follicle stem cells in Ptch1(+/-) mice.</a> Cancer Cell. 19, 114-124 (2011).</li>
<li>Grachtchouk, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Basal+cell+carcinomas+in+mice+arise+from+hair+follicle+stem+cells+and+multiple+epithelial+progenitor+populations%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Clin.+Invest%22%5BJournal%5D)">Basal cell carcinomas in mice arise from hair follicle stem cells and multiple epithelial progenitor populations.</a> J. Clin. Invest. 121, 1768-1781 (2011).</li>
<li>Kasper, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Wounding+enhances+epidermal+tumorigenesis+by+recruiting+hair+follicle+keratinocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Wounding enhances epidermal tumorigenesis by recruiting hair follicle keratinocytes.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 108, 4099-4104 (2011).</li>
<li>Youssef, K. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+the+cell+lineage+at+the+origin+of+basal+cell+carcinoma%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Identification of the cell lineage at the origin of basal cell carcinoma.</a> Nat Cell Biol. 12, 299-305 (2010).</li>
<li>Yauch, R. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Smoothened+mutation+confers+resistance+to+a+Hedgehog+pathway+inhibitor+in+medulloblastoma%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Smoothened mutation confers resistance to a Hedgehog pathway inhibitor in medulloblastoma.</a> Science. 326, 572-574 (2009).</li>
<li>Buonamici, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Interfering+with+resistance+to+smoothened+antagonists+by+inhibition+of+the+PI3K+pathway+in+medulloblastoma%5BTitle%5D)+AND+%22Sci.+Transl.+Med%22%5BJournal%5D)">Interfering with resistance to smoothened antagonists by inhibition of the PI3K pathway in medulloblastoma.</a> Sci. Transl. Med. 2, 51ra70(2010).</li>
<li>Dijkgraaf, G. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Small+molecule+inhibition+of+GDC-0449+refractory+smoothened+mutants+and+downstream+mechanisms+of+drug+resistance%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Res%22%5BJournal%5D)">Small molecule inhibition of GDC-0449 refractory smoothened mutants and downstream mechanisms of drug resistance.</a> Cancer Res. 71, 435-444 (2011).</li>
<li>Guo, Z., Draheim, K., Lyle, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+and+culture+of+adult+epithelial+stem+cells+from+human+skin%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis.+Exp%22%5BJournal%5D)">Isolation and culture of adult epithelial stem cells from human skin.</a> J. Vis. Exp. (49), e2561(2011).</li>
<li>Li, L., Fukunaga-Kalabis, M., Herlyn, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+three-dimensional+human+skin+reconstruct+model%3A+a+tool+to+study+normal+skin+and+melanoma+progression%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis.+Exp%22%5BJournal%5D)">The three-dimensional human skin reconstruct model: a tool to study normal skin and melanoma progression.</a> J. Vis. Exp. (54), e2937(2011).</li>
<li>Anacker, D., Moody, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generation+of+organotypic+raft+cultures+from+primary+human+keratinocytes%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis.+Exp%22%5BJournal%5D)">Generation of organotypic raft cultures from primary human keratinocytes.</a> J. Vis. Exp. (60), e3668(2012).</li>
</ol>

Autorzy oświadczają, że nie mają konkurencyjnych interesów finansowych.

Opisaliśmy metodę analizy populacji komórek w BCC. Tkanki nowotworowe są spójne dla wielu typów komórek, a każdy typ komórek zachowuje się inaczej w danym momencie kancerogenezy, co jest bardzo trudne do odtworzenia nawet w najlepszych warunkach in vitro . Korzystając z tego protokołu, wykazaliśmy, że rozwojowi raka podstawnokomórkowego towarzyszy ekspansja komórek macierzystych naskórka, a także rekrutacja komórek szpikowych. W porównaniu z analizami immunohistochemicznymi lub immunofluorescencyjnymi, analizy populacji komórek dają bardziej ilościową ocenę zmian populacji komórek, ponieważ obecnie dostępne są specyficzne przeciwciała przeciwko różnym typom komórek.
W przypadku tego protokołu potrzeba 10 tygodni na ukończenie badania, ponieważ zmiana fenotypowa spowodowana indukcją genów wymaga czasu. Dlatego ważne jest, aby zaplanować eksperyment z wyprzedzeniem. Do izolacji komórek i analiz mogą być potrzebne całe dwa dni. Ponieważ do analiz używa się żywych komórek, ważne jest, aby zarezerwować FACSCalibur z wyprzedzeniem. Wymieniliśmy również typowe problemy podczas pracy z tym protokołem (patrz poniżej).
Z naszego doświadczenia wynika, że poniżej znajdują się typowe problemy, które napotkaliśmy:
<ol>
	<li>Słabe oddzielanie się naskórka: Może to być spowodowane niepełnym leczeniem dypazą (należy wydłużyć czas leczenia diapazą) lub niewystarczającą ilością roztworu dypazy (skóra musi być całkowicie zanurzona w roztworze dypazy). Na jedną mysz używamy co najmniej 5 ml roztworu dispazy. Objętość może się różnić w zależności od wielkości skóry.</li>
	<li>Niska wydajność liczby komórek: Może to być spowodowane niepełnym trawieniem kolagenazą IV. Najpierw sprawdź stężenie kolagenazy lub datę ważności. Może to być również spowodowane niewystarczającą ilością użytego naskórka. Ponadto trawienie enzymatyczne powinno odbywać się w temperaturze do 37 °C z wytrząsaniem (przed przystąpieniem do mineralizacji należy dostosować temperaturę).</li>
	<li>Zbrylenia komórek: Jest to bardzo powszechne w przypadku komórek skóry (pipeta komórek kilka razy po przejściu przez sitko (przed wirowaniem) lub obecność Mg2+ i Ca2+ w roztworze (należy użyć PBS wolnego od Mg2+ i Ca2+ do płukania komórek).</li>
	<li>Zbyt wiele martwych komórek: Może to być wynikiem degradacji tkanek (należy używać świeżych tkanek) lub nadmiernego trawienia (unikać długotrwałej inkubacji z dypazą i kolagenazą IV).</li>
</ol>
Protokół ten można połączyć z przeszczepem szpiku kostnego lub przeszczepem tkanek w celu zbadania pochodzenia komórek. Na przykład przeszczepienie komórek szpiku kostnego wykazujących ekspresję GFP śmiertelnie napromieniowanym myszom pozwoli nam zbadać udział komórek szpiku kostnego w fibroblastach i komórkach szpikowych związanych z nowotworem. Podobnie, guzy skóry można przeszczepić do nowego gospodarza myszy w celu zbadania interakcji guz-gospodarz.
Oprócz badania zmian populacji komórek podczas kancerogenezy, protokół ten pozwoli również naukowcom na zbadanie wpływu leczenia farmakologicznego na komórki w środowisku guza. Chociaż protokół ten jest przeznaczony do wykorzystania do analiz populacji komórek podczas kancerogenezy skóry, w przypadku innych typów raka można wprowadzić niewielkie modyfikacje.
Podsumowując, analizy populacji komórek w mysich modelach raka skóry mogą dostarczyć nam informacji na temat dynamicznych zmian komórkowych podczas kancerogenezy, prowadząc do lepszego zrozumienia biologii komórki w transformacji nowotworowej i różnych zdarzeń komórkowych w procesie transformacji.

Jako najczęstszy rodzaj ludzkiego nowotworu, rak podstawnokomórkowy (BCC) dotyka około 2 milionów Amerykanów rocznie 1. Coraz więcej dowodów wskazuje na to, że nieprawidłowa aktywacja sygnalizacji hedgehog (Hh) jest siłą napędową leżącą u podstaw rozwoju BCC (przegląd w 2,3). Zmiany sygnalizacji Hh w BCC obejmują inaktywujące mutacje PTCH1 4-6, mutacje wzmocnienia funkcji SMO 7-9 i nieprawidłową ekspresję czynników transkrypcyjnych szlaku Hh GLI1 10 i GLI2 11 lub rzadkie inaktywowane mutacje negatywnego regulatora Su (Fu) 12. Dzięki tym wszystkim i innym badaniom Federalna Agencja ds. Leków (FDA) zatwierdziła niedawno stosowanie inhibitora sygnalizacji Hh Wismodegibu w leczeniu przerzutowych i miejscowo zaawansowanych BCC13-15.
Pomimo tych wszystkich osiągnięć 16, nadal nie rozumiemy molekularnych i komórkowych mechanizmów, za pomocą których sygnalizacja Hh napędza kancerogenezę. Tworzenie modeli zwierzęcych przy użyciu specyficznej tkankowo aktywacji sygnalizacji Hh jest nadal ważne dla tych badań i dla naszego zrozumienia oporności na leki. U myszy typu dzikiego nie rozwijają BCC, nawet pod wpływem dużych dawek czynników rakotwórczych, promieniowania UV lub jonizującego. Natomiast myszy Ptch1 +/- są podatne na rozwój BCC 17,18. Penetracja rozwoju BCC u myszy Ptch1 +/- wynosi ponad 50% 18,19, chociaż myszy Ptch1 + / - rzadko rozwijają w pełni rozwinięte BCC, jeśli są trzymane w normalnych warunkach. Ze względu na śmiertelność embrionalną Ptch1-/-, w badaniu zwykle stosuje się specyficzny tkankowo nokaut PTCH1 20. Ponadto, warunkowa, specyficzna dla skóry ekspresja onkogennego SmoM2YFP (Krt14-creER:R26-SmoM2YFP lub Krt14-cre:R26-SmoM2YFP) prowadzi do powstawania wielu mikroskopijnych BCC w bardzo młodym wieku, zapewniając łatwy test genetyczny na sygnalizację Hh za SMO 21.
Są trzy główne problemy w naszej wiedzy na temat biologii BCC. Po pierwsze, komórkowe pochodzenie BCC nie jest do końca jasne. Podczas gdy niektóre badania potwierdzają pączek mieszków włosowych jako miejsce komórek macierzystych 22-24, Youssef i in. 25 zlokalizowali mysią komórkę pochodzenia nowotworów skórnych wywołanych przez Hh w obszarze naskórka między mieszkami włosowymi, a nie w mieszku włosowym, używając specyficznego dla komórki Cre do aktywacji ekspresji transgenicznego mutanta SMO napędzanego przez ROSA26. Po drugie, interakcje komórkowe podczas rozwoju raka podstawnokomórkowego nie są dobrze poznane. Wiadomo, że keratynocyty z aktywowaną sygnalizacją Hh mogą prowadzić do powstawania BCC, ale inne zmiany komórkowe nie są dobrze poznane. Ponadto leczenie antagonistami Smo u myszy może prowadzić do oporności na leki 26-28. W związku z tym bardzo potrzebne są nowe cele dla BCC. Zrozumienie tych trzech zagadnień wymaga analizy zmian komórkowych u myszy podczas kancerogenezy. Chociaż opublikowano kilka metod hodowli keratynocytów, cytometrii przepływowej i izolacji komórek macierzystych skóry 29-31, obecnie nie ma kompleksowych procedur analizy komórek w mysich BCC. Łącząc metody mysiego modelu BCC, separacji naskórka, generowania pojedynczych komórek z tkanek i analiz komórkowych, dostarczymy czytelnikom zestaw procedur do badania sygnalizacji komórkowej, interakcji komórkowych i molekularnych podczas rozwoju BCC. Wierzymy, że ten protokół pozwoli czytelnikom zobaczyć, jak przebiega każda procedura. Ponadto przedstawiliśmy kilka danych, aby zilustrować, jak powinny wyglądać wyniki, oraz rozwiązywanie problemów, aby pomóc czytelnikom przezwyciężyć trudności podczas wykonywania tych procedur.

<table><tbody><tr><td>odczynnik do lizy directPCR (ogon) </td><td>Viagen Biotech</td><td>102-T</td><td>store @ 4 &deg; Białkowa C</td></tr><tr><td>K </td><td>Sigma</td><td>P2308</td><td>sklep @ -20 &deg; C</td></tr><tr><td>ApliTag 360 taq polimeraza </td><td>Zastosowane biosystemy</td><td>N8080155</td><td> sklep @ -20 &deg; C</td></tr><tr><td>Tamoxifen </td><td>Sigma</td><td>T5648</td><td> sklep @ 4 &deg; C</td></tr><tr><td>Igła do karmienia (rozmiar 20) </td><td>Fisher scientific</td><td>01-290-9B</td><td></td></tr><tr><td>Dispase </td><td>Roche Diagnostic</td><td>04942078001</td><td>sklep @ 4 & deg; C</td></tr><tr><td>Collagenase IV </td><td>Worthington</td><td>LS004189</td><td>sklep @ -20 &deg; C</td></tr><tr><td>Sitko do komórek </td><td>Fisher scientific</td><td>08-771-2</td><td></td></tr><tr><td>Anty-CD11b-PE </td><td>eBioscience</td><td>12-0112-81</td><td>sklep @ 4 & deg; C</td></tr><tr><td>Anty-Gr1-APC </td><td>eBioscience</td><td>17-5931-81</td><td>sklep @ 4 & deg; C</td></tr><tr><td>Anti-vimentin-FITC </td><td>eBioscience</td><td>11-9897-80</td><td>sklep @ 4 &deg; Z</td></tr></tbody></table>

analizy populacji komórek podczas kancerogenezy skóry

Cell Population Analyses During Skin Carcinogenesis

Rozwój raka to wieloetapowy proces obejmujący wiele typów komórek, w tym komórki prekursorowe raka, komórki odpornościowe, fibroblasty i komórki śródbłonka. Każdy typ komórek ulega zmianom sygnalizacyjnym i funkcjonalnym podczas kancerogenezy. Obecnym wyzwaniem dla wielu badaczy nowotworów jest przeanalizowanie tych zmian w każdym typie komórek podczas wieloetapowego procesu in vivo. W ciągu ostatnich kilku lat autorzy opracowali zestaw procedur izolowania różnych populacji komórek podczas rozwoju raka skóry przy użyciu myszy K14creER/R26-SmoM2YFP. Procedura podzielona jest na 6 części: 1) wygenerowanie odpowiednich myszy do badania (myszy K14creER+ i R26-SmoM2YFP+ w tym protokole); 2) indukowanie ekspresji SmoM2YFP w skórze myszy; 3) przygotowanie biopsji skóry myszy; 4) izolowanie naskórka od skóry; 5) przygotowanie pojedynczych komórek z naskórka; 6) znakowanie pojedynczych populacji komórek do analizy cytometrii przepływowej. Wygenerowanie wystarczającej liczby myszy o odpowiednim genotypie jest krokiem granicznym w tym protokole, który może potrwać do dwóch miesięcy. Reszta kroków trwa od kilku godzin do kilku dni. W tym protokole znajduje się również sekcja dotycząca rozwiązywania problemów. Chociaż skupiamy się na raku skóry, protokół ten może zostać zmodyfikowany tak, aby miał zastosowanie do innych zwierzęcych modeli chorób ludzkich.

Wiadomo, że u myszy nie rozwijają się raki podstawnokomórkowe, chyba że nastąpi aktywacja sygnalizacji Hh. Rycina 1 przedstawia fenotyp skóry po indukowanej ekspresji onkogennego białka smoothened, SmoM2YFP. Rycina 2 przedstawia analizę komórek mieloidalnych u myszy zdrowych oraz z nowotworami. Komórki CD11b+ Gr1+ pochodzą z komórek mieloidalnych, a część z nich to mieloidalne komórki supresorowe. W warunkach prawidłowych populacja komórek CD11b+Gr1+ jest prawie niewykrywalna, jednak zwiększa się w odpowiedzi na stan zapalny lub rozwój nowotworu. Wykazaliśmy, że indukowana ekspresja SmoM2YFP w skórze prowadzi do wzrostu liczby komórek CD11b+Gr1+. Obecnie mechanizmy molekularne leżące u podstaw tej zmiany w BCC nie są jasne.
<img alt="Eksperyment genetyczny R26-SmoM2^YFP x K14-CreER; barwienie H&amp;E; analiza fenotypu myszy; indukcja guza." src="/files/ftp_upload/50311/50311fig1.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Rysunek 1"> 
Rysunek 1. Zmiany morfologiczne po indukcji SmoM2YFP w skórze myszy. Górna część przedstawia schemat genotypów myszy. Panel środkowy: mysz K14creER+ i R26-SmoM2YFP+ traktowana tamoksyfenem wykazała widoczne makroskopowo nieprawidłowości w skórze (prawa strona) oraz guzy skóry w przekroju barwionym H&amp;E (lewa strona). Panel dolny: mysz bez indukcji SmoM2YFP wykazała skórę o normalnym wyglądzie (prawa strona) i brak nieprawidłowości morfologicznych w przekroju H&amp;E (lewa strona).
<img alt="Wykresy kropkowe cytometrii przepływowej przedstawiające ekspresję CD11b vs Gr1; efekt tamoksyfenu w modelu K14-CreER/R26-SmoM2YFP." src="/files/ftp_upload/50311/50311fig2.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Rysunek 2"> 
Rysunek 2. Analiza przepływowa komórek CD11b+Gr1+. Aby zbadać zmianę liczby komórek CD11b+Gr1+ podczas rozwoju raka skóry, wyizolowano pojedyncze komórki i zabarwiono je przeciwciałami fluorescencyjnymi przeciwko CD11b oraz Gr1. Po analizie programem FlowJo zaobserwowano wzrost tej populacji komórek w tkankach skóry myszy traktowanych tamoksyfenem.

Karcynogeneza to proces obejmujący interakcje między komórkami nowotworowymi a mikrośrodowiskiem nowotworu. Aby przeanalizować zdarzenia molekularne, należy wyizolować różne populacje komórek na różnych etapach rozwoju raka. Korzystając z mysiego modelu raka podstawnokomórkowego, opisujemy protokół analizy komórek podczas kancerogenezy.

Analizy populacji komórek podczas kancerogenezy skóry

Cancer development is  a multiple-step process involving many cell types including cancer precursor  cells, immune cells, fibroblasts and endothelial ...

Ogólnym celem niniejszej procedury jest przeprowadzenie analiz populacji komórek w mysim modelu raka podstawnokomórkowego skóry. Jest to realizowane poprzez wstępną indukcję ekspresji genu docelowego u myszy, a w drugim kroku poprzez izolację naskórka ze skóry mysiej.Po przygotowaniu jednokomórkowej zawiesiny, komórki naskórka znakuje się specyficznymi markerami powierzchniowymi. Ostatecznie, zmiany w populacjach komórek podczas rozwoju nowotworu w skórze mogą być monitorowane za pomocą analizy cytometrycznej. Rozwój raka jest procesem angażującym wiele typów komórek.Celem niniejszej procedury jest pomoc badaczom w analizie wpływu różnych komórek na rozwój raka skóry. Metoda ta może dostarczyć informacji na temat oddziaływań komórkowych podczas rozwoju raka skóry, ale może być również zastosowana w innych układach, takich jak rak trzustki. Wizualna prezentacja tej metody jest kluczowa, ponieważ bez oceny wizualnej trudno jest określić moment zakończenia eksperymentu.W celu rozpoczęcia, skrzyżowano myszy K14 (ma keratin 14 Cree ER) z myszami Rosa 26 zawierającymi zmutowany gen smoothened z tagiem YFP (SMU M two), określanymi jako myszy SMU. Następnie próbki ogonów o długości 0,5 cm, pobrane od myszy podwójnie pozytywnych w wieku od trzech do sześciu tygodni, zanurzono w roztworze do lizy ogonów do bezpośredniej PCR z dodatkiem 1 mg/mL proteinazy K. Następnie próbki inkubowano przez noc w temperaturze 55 °C przy ciągłym mieszaniu. Następnego dnia tkankę wirowano z maksymalną prędkością w mikrowirowarce w celu usunięcia zanieczyszczeń.Następnie, aby przeprowadzić genotypowanie każdego zwierzęcia, należy użyć 1 µL SNAT z każdego preparatu w oddzielnych reakcjach PCR, stosując startery i warunki zalecane przez dostawcę. Do podawania tamoksyfenu zwierzętom należy użyć zakrzywionej igły do karmienia o rozmiarze 20 G. Zwierzęta podwójnie pozytywne dla K 14 C er oraz ROSA 26 należy poddać gavage'owi doustnemu przez pięć kolejnych dni, aby zindukować ekspresję OO M two w keratynocytach.Zazwyczaj fenotypy są bardziej nasilone na małżowinie usznej i ogonie myszy K 14 OO z markerem GFP; w celu pobrania skóry do analizy komórkowej należy postępować w następujący sposób. Najpierw, używając trymera, usuń futro z uśpionego zwierzęcia. Następnie usuń skórę myszy i zanurz tkankę w roztworze disbe w temperaturze 37 °C na jedną do dwóch godzin.Po obróbce w preparacie Dispa, należy oddzielić naskórek od skóry właściwej za pomocą pęsety. Następnie należy posiekać naskórek nożyczkami. Po tym czasie tkankę należy zanurzyć w roztworze kolagenazy IV na jedną do dwóch godzin w temperaturze 37 °C w probówce o pojemności 50 ml.Należy delikatnie mieszać zawartość probówki co 20 minut w celu dysocjacji komórek. Za pomocą mikroskopu należy potwierdzić dysocjację komórek, gdy w medium z kolagenazą będą widoczne pojedyncze komórki. Próbkę należy inkubować przez dodatkowe 30 minut, aby zwiększyć wydajność uzyskiwania komórek.Następnie przefiltruj mieszaninę tkankową przez sitko komórkowe o rozmiarze oczek 70 µm i wypłucz komórki przez 10 minut przy 500 ×g w temperaturze pokojowej. Aby oznakować komórki, rozpocznij od resuspensji świeżo wypłukanego osadu w PBS uzupełnionym o 10% FBS do stężenia 2,5 × 10⁶ komórek/ml. Następnie umieść zawiesinę komórkową na lodzie na 30 minut, aby zablokować nieswoiste wiązania. W kolejnym kroku przenieś alikwoty komórek do probótek mikrotubowych o pojemności 1,5 ml w celu specyficznego znakowania przeciwciałami.Należy dodać przeciwciała do każdej probówki do stężenia końcowego 2 µg/mL. Probówki należy delikatnie wymieszać na wirówce typu vortex przez kilka sekund, aby wymieszać przeciwciała z komórkami, a następnie ponownie umieścić je w lodzie na kolejne 30 minut. Po przemyciu zawartości probówek 1 mL PBS, osady należy resuspendować w PBS, a następnie dodać DPI do stężenia końcowego 1 mg/mL.Podczas analizy danych w pierwszej kolejności należy wyselekcjonować pojedyncze komórki na podstawie wykresu rozproszenia przedniego względem rozproszenia bocznego, wykluczając martwe komórki wykazujące pozytywny wynik barwienia DABI. Myszy nie rozwijają raków podstawnokomórkowych, chyba że zostanie aktywowany szlak sygnałowy hedgehog, co widać na tych obrazach. Ekspresja onkogennego białka smoothened smooth M two YFP indukowana tamoksyfenem prowadzi do fenotypu skóry, który jest widoczny nawet na poziomie anatomicznego wzrostu w preparatach skóry barwionych H&amp;E pobranych od tych zwierząt.Guzy skóry można zaobserwować u myszy K 14 SMU. Bez indukcji YFP w SMU M two skóra zwierząt nie wykazywała nieprawidłowej morfologii w barwieniu H&amp;E. Te wykresy kropkowe przedstawiają reprezentatywną analizę komórek mieloidalnych u myszy zdrowych i z guzami.Komórki CD 11 B pozytywne GR one pozytywne pochodzą z komórek mieloidalnych, z których niektóre są mieloidalnymi komórkami supresorowymi u myszy z indukowanym M two YFP w warunkach normalnych oraz bez SMU. Populacja komórek CD 11 B pozytywnych GR one pozytywnych jest ledwo wykrywalna, lecz zwiększa się w odpowiedzi na stan zapalny lub rozwój nowotworu u myszy K 14 SMU.Indukowana ekspresja smu M two YFP w keratynocytach skóry prowadzi do zwiększenia populacji komórek CD 11 B pozytywnych i GR one pozytywnych. Technika ta umożliwi badaczom w dziedzinie biologii skóry przeprowadzenie analizy molekularnej raka komórkowego B u myszy.

cell-population-analyses-during-skin-carcinogenesis

Research

JoVE Journal

Medicine

Medycyna

Analizy populacji komórkowych podczas rakotwórczego rozwoju skóry

Ten artykuł opisuje przygotowanie świeżo uzyskanej tkanki czerniaka do pierwotnych hodowli komórkowych oraz sposób usuwania zanieczyszczeń erytrocytów i fibroblastów z komórek nowotworowych. Na koniec opisujemy, w jaki sposób domniemane komórki macierzyste czerniaka CD133 + są sortowane od masy CD133 za pomocą sortowania komórek aktywowanych magnetycznie (MACS).

Hodowla komórkowa pochodząca od pacjenta i izolacja domniemanych komórek macierzystych raka CD133+ z czerniaka

Opisujemy protokół skutecznego izolowania limfocytów T rezydujących w skórze z biopsji ludzkiej skóry. Protokół ten zapewnia wystarczającą liczbę żywotnych limfocytów rezydentnych w ludzkiej skórze do analizy cytometrii przepływowej i hodowli ex vivo.

Izolacja limfocytów z ludzkiej skóry w celu analizy fenotypowej i hodowli komórkowej ex vivo

Idealnym modelem do badania biologii dorosłych komórek macierzystych jest mieszek włosowy myszy. W tym miejscu przedstawiamy protokół izolacji różnych populacji mieszków włosowych, komórek macierzystych i keratynocytów naskórka, wykorzystujący trawienie enzymatyczne skóry grzbietowej myszy, a następnie analizę FACS.

Izolowanie komórek macierzystych mieszków włosowych i keratynocytów naskórka z grzbietowej skóry myszy

Ten raport opisuje protokół CUBIC do wyjaśniania pełnej grubości biopsji skóry myszy i wizualizacji wzorców ekspresji białek, proliferujących komórek i sebocytów w rozdzielczości pojedynczej komórki w 3D. Metoda ta umożliwia dokładną ocenę anatomii i patologii skóry oraz nieprawidłowych fenotypów naskórka w genetycznie zmodyfikowanych liniach myszy.

Protokół CUBIC wizualizuje ekspresję białek w rozdzielczości pojedynczej komórki w preparatach skórnych z całego montażu

Celem tego protokołu jest wyizolowanie keratynocytów naskórka z grzbietowej skóry dorosłych myszy do różnych dalszych zastosowań, takich jak biologia molekularna, biochemia, sortowanie komórek aktywowane fluorescencją i podstawowe zastosowania in vitro (np. keratynocyty klonogenne).

Izolacja keratynocytów naskórka myszy i ich klonogenna hodowla in vitro

Ten protokół opisuje, jak izolować keratynocyty skóry od modeli mysich, barwić przeciwciałami znakowanymi metalem oraz analizować barwione komórki za pomocą cytometrii masowej w celu profilowania wzorca ekspresji interesujących białek w różnych fazach cyklu komórkowego.

Izolacja i barwienie keratynocytów skóry myszy do specyficznej dla cyklu komórkowego analizy ekspresji białek komórkowych za pomocą cytometrii masowej

Poniższa procedura opisuje metodę przestrzennej i czasowej kontroli inicjacji guza melanocytowego w skórze grzbietowej myszy, przy użyciu genetycznie zmodyfikowanego modelu myszy. Protokół ten opisuje makroskopową i mikroskopową inicjację czerniaka skóry.

Przestrzenna i czasowa kontrola inicjacji czerniaka myszy ze zmutowanych komórek macierzystych melanocytów

Dwuetapowa kancerogeneza skóry jest indukowana przez dwie miejscowo stosowane substancje chemiczne. Mutagen 7,12-dimetylobenzantracen) powoduje mutacje w komórkach naskórka, a ciągłe stosowanie ogólnego stymulatora wzrostu octanu 12-O-tetradekanoiloforbol-13 przyspiesza powstawanie brodawczaków skóry.

Model kancerogenezy skóry indukowanej chemicznie z wykorzystaniem dimetylobenz[a]antracenu i octanu 12-O-tetradekanoilu forbolu-13 (DMBA-TPA)

Połączenie iteracyjnego wybielania-rozszerzającego multipleksję (IBEX) oraz komercyjnego testu znakowania nukleotydów (Click-iT EdU) umożliwia wykrywanie i kategoryzację dzielących się typów komórek w wysoce dynamicznych procesach w stałych zamarzniętych przekrojach tkanek myszy. Ponadto nowatorski otwarty pipeline przetwarzania obrazów zapewnia wysokoprzepustowe pozyskiwanie i analizę obrazów.

Wysokoprzepustowy workflow obrazowania i analizy do oceny fenotypów komórek skóry i stanów proliferacji w próbkach tkanek

Przedstawiamy tutaj metodę analizy obrazowania żywych komórek, którą można wykorzystać do ręcznego śledzenia linii keratynocytów przejścia 0 oraz umożliwia zbieranie metryk proliferacji, w tym losów podziału komórkowego i czasu trwania cyklu komórkowego.

Obrazowanie żywych komórek z użyciem fotografii poklatkowej do badania kinetyki proliferacji keratynocytów naskórka

Przedstawiamy tutaj półautomatyczny protokół identyfikacji i ilościowej identyfikacji i ilościowej identyfikacji komórek odpornościowych i nieimmunologicznych w przekrojach skóry za pomocą SCAnED, darmowego makro opartego na ImageJ do segmentacji skóry.

SCAnED – otwartoźródłowe makro do segmentacji skóry do półautomatycznego wykrywania komórek i jąder w przegrodach skóry naskórnej i skórnej

Poznaj analizę populacji komórek podczas kancerogenezy skóry w modelu mysim. Ta metoda umożliwia badanie interakcji między komórkami nowotworowymi a ich mikrośrodowiskiem za pomocą cytometrii przepływowej.

Analizy populacji komórek podczas kancerogenezy skóry

Przeglądaj więcej filmów