Rejestrowanie aktywności elektrycznej ze zidentyfikowanych neuronów w nienaruszonym mózgu ryb transgenicznych

Ogólnym celem niniejszej procedury jest rejestracja aktywności elektrycznej neuronów w preparacie nienaruszonego mózgu ryby. Cel ten osiąga się poprzez wprowadzenie w stan znieczulenia transgenicznej ryby meca w wieku od czterech do sześciu miesięcy w roztworze MS 2 22, a następnie wypreparowanie jej mózgu. Następnie jeden z wybranych neuronów znakowanych GFP zostaje skontaktowany z elektrodą rejestrującą, a jego aktywność elektryczna jest rejestrowana za pomocą elektrofizjologii metodą loose patch lub whole cell patch clamp.

Ostatecznie wyniki mogą wykazać zmiany w częstotliwości wyładowań potencjałów czynnościowych lub zmiany potencjału błonowego w odpowiedzi na różne zabiegi w nienaruszonym mózgu. Główną zaletą tej techniki w porównaniu z istniejącymi metodami, takimi jak elektrofizjologia pojedynczych komórek, hodowli komórkowych czy preparatów skrawków mózgu, jest możliwość charakterystyki właściwości elektrycznych neuronów w preparacie całego mózgu z nienaruszonymi obwodami neuronalnymi. Choć pomiary te dostarczają wglądu w neuroendokrynologię rozrodczą, mogą one zostać zastosowane również w innych układach nerwowych przy użyciu ryb o zdolności do regeneracji, na przykład w badaniu neuronów kontrolujących motywację i zachowania afektywne.

W tej demonstracji wykorzystano transgeniczne ryby medaka, w których neurony GnRH3 są genetycznie znakowane białkiem GFP. Aby rozpocząć, znieczul dorosłą rybę medaka, zanurzając ją w 5 ml MS-222. Kilka minut po ustaniu ruchów skrzeli przenieś rybę do 60 mm szalki Petriego z solą fizjologiczną dla ryb. Następnie za pomocą nożyczek odetnij głowę ryby w tylnej części łba.

Przenieś głowę do szalki Petriego o średnicy 35 mm, wypełnionej do połowy solą fizjologiczną dla ryb i wyłożonej wkładką ochronną. Szalka musi posiadać centralne wgłębienie, w którym należy umieścić i przymocować głowę stroną grzbietową do góry za pomocą szpilek entomologicznych i precyzyjnych nożyczek. Ostrożnie przetnij grzbietową część czaszki wzdłuż jej obwodu.

Następnie delikatnie usuń czaszkę za pomocą pincety, odsłaniając grzbietową część mózgu, w tym przednią część rdzenia kręgowego. Teraz ostrożnie unieś rdzeń kręgowy pincetą z cienką końcówką, a następnie przetnij obustronne nerwy łączące, używając nożyczek z cienkimi końcami. Obejmuje to przecięcie nerwów czaszkowych, nerwów rdzeniowych, brzusznej strony nerwów wzrokowych oraz przednich nerwów węchowych.

Umieść w pełni wypreparowany mózg w nowej szalce Petriego wypełnionej świeżym roztworem soli fizjologicznej dla ryb pod mikroskopem. Upewnij się, że cały mózg oraz przysadka są nienaruszone i nie zostały przecięte ani nakłute. Odrzuć wszelkie uszkodzone mózgi i powtórz procedurę, używając igły.

Nanieś małą kroplę kleju szybkoschnącego, takiego jak cyjanoakrylan, na środek komory rejestracyjnej. Rozprowadź kroplę kleju na powierzchni jednego centymetra kwadratowego. Następnie szybko przenieś mózg na klej.

Zabeziecz go stroną brzuszną do góry. Następnie napełnij komorę rejestracyjną około 1 ml soli fizjologicznej dla ryb, aby pokryć mózg. Używając pęsety z cienkimi końcami, ostrożnie usuń opony mózgowe z powierzchni obszaru rejestracji mózgu, kierując się do przodu.

Kontynuuj perfuzję mózgu napowietrzoną solą fizjologiczną dla ryb z prędkością co najmniej 200 µL na minutę. Wykonaj kilka szklanych mikroelektrod o rezystancji od 6 do 10 MΩ i wypełnij je do około połowy roztworem do rejestracji loose patch. Używając pionowego mikroskopu fluorescencyjnego z chłodzoną kamerą CCD, zlokalizuj neurony terminalne nerwu gn RH trzy wykazujące ekspresję GFP, zaczynając od obiektywu 10x.

Następnie należy przełączyć na obiektyw 40x i zlokalizować neurony znajdujące się na powierzchni brzusznej opoli węchowych lub w jej pobliżu, tuż przed cephalonem. Teraz należy przełączyć widok na monitor wideo, który wyświetla obrazy z mikroskopu w czasie rzeczywistym. Grupa neuronów zawiera od 8 do 10 neuronów GnRH.

Umieść mikroelektrodę w kąpieli komory rejestracyjnej tak, aby końcówka elektrody znajdowała się nad docelowym neuronem. Przyłóż stałe, lekkie dodatnie ciśnienie, aby zapobiec zapchaniu się mikroelektrody. Powoli zbliżaj końcówkę elektrody do docelowego neuronu, kontrolując i monitorując rezystancję elektrody za pomocą oprogramowania Axograph.

Podczas wykonywania testu szczelności w trybie clampowania napięcia, gdy końcówka elektrody znajduje się na powierzchni neuronu, oporność elektrody w tym punkcie ulega niewielkiej zmianie. Należy zwolnić ciśnienie dodatnie, aby uzyskać uszczelnienie o niskiej rezystancji, a w razie potrzeby zastosować lekkie ciśnienie ujemne. Najbardziej krytycznym krokiem dla uzyskania dobrego zapisu jest wybór czystego fragmentu wypustki neuronalnej, co ułatwia stworzenie idealnego uszczelnienia pomiędzy elektrodami a błoną komórkową.

Przełącz teraz urządzenie w tryb zacisku prądowego (current clamp). Otwórz program PowerLab i rozpocznij ciągły pomiar napięcia błony bez podawania prądu; w razie potrzeby dostosuj skalę napięcia oraz częstotliwość rejestracji. Przed zastosowaniem jakichkolwiek zabiegów rejestruj bazową aktywność elektryczną w normalnym soli fizjologicznej dla ryb przez około pięć minut. Perfuzja kąpieli z lekami, hormonami, peptydami itp. powinna być prowadzona do preparatu mózgu z przepływem 200 µL na minutę.

Następnie użyj zwykłej soli fizjologicznej dla ryb w celu przemycia układu; po zlokalizowaniu komórki sprawdź i monitoruj oporność elektrody w trybie clampa napięciowego (voltage clamp). Gdy końcówka elektrody znajdzie się na powierzchni neuronu, a oporność elektrody lekko ulegnie zmianie, zwolnij ciśnienie dodatnie i zastosuj niewielkie ciśnienie ujemne, aby uzyskać szczelną styk o wysokiej oporności (high resistance seal) na neuronie.

Zastosuj delikatne ssanie ustami. Przerwij uszczelnioną błonę komórkową. W momencie przerwania błony oporność natychmiast spadnie do około 120 do 250 mega ohms.

Następnie przełącz urządzenie w tryb zaciskania prądu (current clamp) i rejestruj stale napięcie błonowe za pomocą wykresu, nie przykładając żadnego prądu. Ponownie dostosuj skalę napięcia oraz szybkość rejestracji zgodnie z potrzebami. Po wykonaniu pomiaru bazowego aktywności elektrycznej w normalnym roztworze soli fizjologicznej dla ryb przez około pięć minut, zastosuj odpowiednie preparaty, a następnie przeprowadź okres wypłukiwania. Spontaniczna aktywność elektryczna neuronów GNRH3 w zakończeniu nerwu moca była rejestrowana w trybie zaciskania prądu.

Typowa częstotliwość wyładowań wynosi od 0,5 do 6 Hz. Potencjały czynnościowe występują zazwyczaj w wzorcu tonicznym lub rytmicznym z dość regularnym odstępem między impulsami, a średni potencjał błonowy między impulsami wynosi około -48 mV. To podejście eksperymentalne sprawdza się również w rejestracji sygnałów z neuronów GNRH znakowanych GFP, znajdujących się w przedmózgowiu dorosłych osobników transgenicznych.

Aktywność elektryczna neuronów rybki zebrafish w wyciętym, nienaruszonym mózgu osobników transgenicznych. Rejestrację aktywności rybek zebrafish przeprowadzono w sposób analogiczny do opisanego dla DACA, stosując metodę loose patch. Te same techniki zapewniły również możliwość rejestracji z całej komórki (whole cell recording).

W przeciwieństwie do neuronów GnRH nerwu końcowego u meca, wzorzec spontanicznych potencjałów czynnościowych neuronów GnRH u danio-pręgowanego w obszarze pre-op, brzusznej części cephalon i podwzgórzu jest często nieregularny. Po opanowaniu tej techniki, nagranie trwające 15 minut można zrealizować w ciągu godziny, jeśli procedura zostanie przeprowadzona prawidłowo. Powodzenia.