Name: Rejestrowanie aktywności elektrycznej ze zidentyfikowanych neuronów w nienaruszonym mózgu ryb transgenicznych (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-04-30T13:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 45 s
Description: Poznaj technikę rejestracji aktywności elektrycznej neuronów w nienaruszonym mózgu ryb transgenicznych. Metoda patch clamp pozwala analizować częstość wyładowań i potencjał błonowy neuronów GnRH w układach nerwowych.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Dziękujemy Dr. Meng-Chin Lin i Pani Yuan Dong za pomoc techniczną. Prace te zostały wsparte grantem z National Institutes of Health HD053767 (podwykonawstwo dla NLW) oraz ze środków z Wydziału Fizjologii i Biura Prorektora ds. Badań Uniwersytetu Kalifornijskiego w Los Angeles (NLW).

1. Sekcja mózgów dorosłego Medaka
<ol>
	<li>Znieczulić dorosłego mężczyznę lub kobietę (ryc. 1A) przez zanurzenie w 5 ml MS-222 (150 mg/l, pH 7,4); odczekaj kilka minut po ustaniu ruchów skrzeli przed dekapitacją. Wszystkie procedury zostały zatwierdzone przez Instytucjonalną Komisję ds. Opieki nad Zwierzętami i Użytkowania Uniwersytetu Kalifornijskiego w Los Angeles.</li>
	<li>Odciąć ryby w soli fizjologicznej na ogonowym końcu wieczka nożyczkami na szalce Petriego o średnicy 60 mm.</li>
	<li>Przenieś głowę ryby na szalkę Petriego o średnicy 35 mm, wypełnioną do połowy solą fizjologiczną dla ryb i wyłożoną Sylgardem, który ma w sobie wgłębienie, aby ustawić i zabezpieczyć głowę do sekcji mózgu. Ustaw i zabezpiecz głowę grzbietem do góry za pomocą szpilek przeciw owadom.</li>
	<li>Ostrożnie przeciąć grzbietową część czaszki na całym jej obwodzie drobnymi nożyczkami i delikatnie usunąć ją kleszczami, całkowicie odsłaniając grzbietową część mózgu, w tym przednią część rdzenia kręgowego.</li>
	<li>Delikatnie podnieś rdzeń kręgowy kleszczami z cienką końcówką i przetnij obustronne nerwy łączne nożyczkami z cienką końcówką: nerwy czaszkowe, nerwy rdzeniowe i nerwy wzrokowe po brzusznej stronie mózgu oraz nerwy węchowe w przedniej części mózgu.</li>
	<li>Umieść w pełni wypreparowany mózg na świeżej szalce Petriego wypełnionej solą fizjologiczną dla ryb i dokładnie sprawdź pod mikroskopem, aby upewnić się, że cały mózg jest nienaruszony (w tym przysadka mózgowa) bez żadnych nacięć lub nakłuć. Uszkodzone mózgi nie są używane do eksperymentów.</li>
</ol>
2. Montaż mózgu w komorze nagraniowej
<ol>
	<li>Umieść małą kroplę cyjanoakrylanu lub innego szybko działającego kleju za pomocą igły na środku komory nagraniowej i rozprowadź klej na około 1cm2.</li>
	<li>Szybko przenieś mózg i przyklej go w pozycji brzusznej do góry.</li>
	<li>Dodać 1 ml soli fizjologicznej z ryb, aby wypełniła komorę zapisu i przykryła mózg. Stale perfować mózg napowietrzoną solą fizjologiczną z ryb z szybkością co najmniej 200 μl/min.</li>
	<li>Za pomocą kleszczyków z cienką końcówką ostrożnie usuń opony mózgowe nad powierzchnią obszaru nagrywania mózgu.</li>
</ol>
3. Elektrofizjologia
<ol>
	<li>Luźny zapis łatek wyzwalania potencjału czynnościowego
	<ol>
		<li>Mikroelektrody szklane (6-10 MΩ) są zbudowane z pipet ze szkła borokrzemianowego (1B150F-4, World Precision Instruments) za pomocą ściągacza elektrod (np. Sutter P-87) i z powrotem wypełnione roztworem do zapisu luźnej łaty w połowie wysokości elektrody.</li>
		<li>Używając pionowego mikroskopu fluorescencyjnego z chłodzoną kamerą ze sprzężeniem ładunkowym (CCD), znajdź neurony TN-GnRH3 wyrażające GFP przez 10-krotne (ryc. 1B), a następnie 40-krotne zanurzenie w wodzie (ryc. 1C). Znajdują się na brzusznej powierzchni opuszki węchowej lub w jej pobliżu, tuż przed kresomózgowiem.</li>
		<li>Przełącz się na monitor wideo, który dostarcza obrazy z mikroskopu w czasie rzeczywistym, aby zlokalizować klaster neuronów TN-GnRH3 (ryc. 1C).</li>
		<li>Umieść mikroelektrodę w kąpieli tak, aby końcówka elektrody znajdowała się nad celem neuronu. Wywieraj stały, lekki dodatni nacisk na mikroelektrodę, aby nie została zatkana, i delikatnie zbliż się do docelowego neuronu końcówką elektrody.</li>
		<li>Sprawdzaj i monitoruj rezystancję elektrody w trybie cęgów napięciowych za pomocą oprogramowania AxoGraph i wzmacniacza Axoclamp 200B z oprogramowaniem Axograph (Axon Instruments). Kiedy widzisz na monitorze wideo, że końcówka elektrody znajduje się na powierzchni neuronu, a na wyświetlaczu AxoGraph, że rezystancja zmienia się nieznacznie, zwolnij nadciśnienie i w razie potrzeby zastosuj lekkie podciśnienie, aby uzyskać uszczelnienie o niskiej rezystancji na neuronie (<100 MΩ).</li>
		<li>Przełącz się w tryb cęgów prądowych i rejestruj napięcie membrany w sposób ciągły bez żadnego prądu, dostosowując skalę napięcia i szybkość nagrywania, jeśli to konieczne. Dane są gromadzone i analizowane przez oprogramowanie Powerlab (ADInstruments Inc.).</li>
		<li>Rejestruj wyjściową aktywność elektryczną w normalnym roztworze soli fizjologicznej dla ryb przez około 5 minut przed jakimkolwiek zabiegiem (ryc. 2A). Perfuzja leków, hormonów, peptydów itp. Dodawanie do soli rybnej jest kontynuowane w ilości 200 μl/min, po czym następuje okres wymywania w normalnym roztworze soli fizjologicznej 5, 6, 11.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Zapis potencjału błonowego całej komórki 
	Procedura elektrofizjologii całego patch clampu komórkowego jest taka sama, jak w przypadku procedury pozakomórkowego zapisu luźnych plam opisanej powyżej, z kroków 3.1.1 - 3.1.4. Następnie procedury różnią się odpowiednio:
	<ol>
		<li>Sprawdź i monitoruj rezystancję elektrody w trybie cęgów napięciowych. Kiedy widzisz na monitorze wideo, że końcówka elektrody znajduje się na powierzchni neuronu, a na oscyloskopie, że rezystancja zmienia się nieznacznie, zwolnij nadciśnienie i zastosuj niewielkie podciśnienie, aby uzyskać uszczelnienie o wysokiej rezystancji na neuronze (~ 3 Giga Ω). Zastosuj delikatne ssanie doustnie, aby rozerwać załataną membranę; zobaczysz nagły spadek rezystancji do około 120-250 MΩ.</li>
		<li>Przełącz się w tryb cęgów prądowych i rejestruj napięcie membrany w sposób ciągły bez żadnego prądu, dostosowując skalę napięcia i szybkość nagrywania, jeśli to konieczne.</li>
		<li>Zapisywać wyjściową aktywność elektryczną w normalnym roztworze soli fizjologicznej dla ryb przez około 5 minut przed jakimkolwiek zabiegiem, jak opisano powyżej w ppkt 3.1.7 (rysunek 2B).</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

<ol><li>Kah, O., Lethimonier, C., Lareyre, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gonadotrophin-releasing+hormone+%28GnRH%29+in+the+animal+kingdom%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Soc.+Biol%22%5BJournal%5D)">Gonadotrophin-releasing hormone (GnRH) in the animal kingdom.</a> J. Soc. Biol. 198 (1), 53-60 (2004).</li>
<li>Ramakrishnan, S., Wayne, N. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Social+cues+from+conspecifics+alter+electrical+activity+of+gonadotropin-releasing+hormone+neurons+in+the+terminal+nerve+via+visual+signals%5BTitle%5D)+AND+%22Am.+J.+Physiol.+Regul.+Integr.+Comp.+Physiol%22%5BJournal%5D)">Social cues from conspecifics alter electrical activity of gonadotropin-releasing hormone neurons in the terminal nerve via visual signals.</a> Am. J. Physiol. Regul. Integr. Comp. Physiol. 297 (1), R135-R141 (2009).</li>
<li>Abe, H., Oka, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanisms+of+neuromodulation+by+a+nonhypophysiotropic+GnRH+system+controlling+motivation+of+reproductive+behavior+in+the+teleost%5BTitle%5D)+AND+%22%22%5BJournal%5D)">Mechanisms of neuromodulation by a nonhypophysiotropic GnRH system controlling motivation of reproductive behavior in the teleost.</a> 57 (6), 665-674 (2011).</li>
<li>Oka, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tetrodotoxin-resistant+persistent+Na%2B+current+underlying+pacemaker+potentials+of+fish+gonadotrophin-releasing+hormone+neurones%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Physiol%22%5BJournal%5D)">Tetrodotoxin-resistant persistent Na+ current underlying pacemaker potentials of fish gonadotrophin-releasing hormone neurones.</a> J. Physiol. 482 (Pt. 1), 1-6 (1995).</li>
<li>Zhao, Y., Wayne, N. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effects+of+Kisspeptin1+on+Electrical+Activity+of+an+Extrahypothalamic+Population+of+Gonadotropin-Releasing+Hormone+Neurons+in+Medaka%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Effects of Kisspeptin1 on Electrical Activity of an Extrahypothalamic Population of Gonadotropin-Releasing Hormone Neurons in Medaka.</a> PLoS One. 7 (5), e37909(2012).</li>
<li>Wayne, N. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Whole-cell+electrophysiology+of+gonadotropin-releasing+hormone+neurons+that+express+green+fluorescent+protein+in+the+terminal+nerve+of+transgenic+medaka+%28Oryzias+latipes%29%5BTitle%5D)+AND+%22Biol.+Reprod%22%5BJournal%5D)">Whole-cell electrophysiology of gonadotropin-releasing hormone neurons that express green fluorescent protein in the terminal nerve of transgenic medaka (Oryzias latipes).</a> Biol. Reprod. 73 (6), 1228-1234 (2005).</li>
<li>Okubo, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Forebrain+gonadotropin-releasing+hormone+neuronal+development%3A+insights+from+transgenic+medaka+and+the+relevance+to+X-linked+Kallmann+syndrome%5BTitle%5D)+AND+%22Endocrinology%22%5BJournal%5D)">Forebrain gonadotropin-releasing hormone neuronal development: insights from transgenic medaka and the relevance to X-linked Kallmann syndrome.</a> Endocrinology. 147 (3), 1076-1084 (2006).</li>
<li>Okubo, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+novel+form+of+gonadotropin-releasing+hormone+in+the+medaka%2C+Oryzias+latipes%5BTitle%5D)+AND+%22Biochem.+Biophys.+Res.+Commun%22%5BJournal%5D)">A novel form of gonadotropin-releasing hormone in the medaka, Oryzias latipes.</a> Biochem. Biophys. Res. Commun. 276 (1), 298-303 (2000).</li>
<li>Ramakrishnan, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Acquisition+of+spontaneous+electrical+activity+during+embryonic+development+of+gonadotropin-releasing+hormone-3+neurons+located+in+the+terminal+nerve+of+transgenic+zebrafish+%28Danio+rerio%29%5BTitle%5D)+AND+%22Gen.+Comp.+Endocrinol%22%5BJournal%5D)">Acquisition of spontaneous electrical activity during embryonic development of gonadotropin-releasing hormone-3 neurons located in the terminal nerve of transgenic zebrafish (Danio rerio).</a> Gen. Comp. Endocrinol. 168 (3), 401-407 (2010).</li>
<li>Abraham, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Targeted+gonadotropin-releasing+hormone-3+neuron+ablation+in+zebrafish%3A+effects+on+neurogenesis%2C+neuronal+migration%2C+and+reproduction%5BTitle%5D)+AND+%22Endocrinology%22%5BJournal%5D)">Targeted gonadotropin-releasing hormone-3 neuron ablation in zebrafish: effects on neurogenesis, neuronal migration, and reproduction.</a> Endocrinology. 151 (1), 332-340 (2010).</li>
<li>Wayne, N. L., Kuwahara, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Beta-endorphin+alters+electrical+activity+of+gonadotropin+releasing+hormone+neurons+located+in+the+terminal+nerve+of+the+teleost+medaka+%28Oryzias+latipes%5BTitle%5D)+AND+%22Gen.+Comp.+Endocrinol%22%5BJournal%5D)">Beta-endorphin alters electrical activity of gonadotropin releasing hormone neurons located in the terminal nerve of the teleost medaka (Oryzias latipes.</a> Gen. Comp. Endocrinol. 150 (1), 41-47 (2007).</li>
<li>Oka, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Three+types+of+gonadotrophin-releasing+hormone+neurones+and+steroid-sensitive+sexually+dimorphic+kisspeptin+neurones+in+teleosts%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neuroendocrinol%22%5BJournal%5D)">Three types of gonadotrophin-releasing hormone neurones and steroid-sensitive sexually dimorphic kisspeptin neurones in teleosts.</a> J. Neuroendocrinol. 21 (4), 334-338 (2009).</li>
<li>Molleman, A. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aMolleman%2C+A+%22Patch+Clamping%3A+An+Introductory+Guide+To+Patch+Clamp+Electrophysiology%22">Patch Clamping: An Introductory Guide To Patch Clamp Electrophysiology</a>. , Wiley & Sons. England. (2003).</li>
</ol>

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Transgeniczne ryby GnRH3:GFP dostarczają unikalnych modeli do badania neurofizjologicznych mechanizmów leżących u podstaw integracji i regulacji neuronów w centralnej kontroli zachowań, które są zarówno bezpośrednio, jak i pośrednio zaangażowane w reprodukcję3, 8-10. Jedną z istotnych zalet tego systemu modelowego jest to, że wiele neuronów GnRH3 wyrażających GFP znajduje się blisko brzusznej powierzchni mózgu, co pozwala na stosunkowo łatwy dostęp do neuronów w celu zapisu elektrofizjologicznego bez ...

<table><tbody><tr><td>Mikroskop</td><td>Olympus</td><td></td><td>BX50W (Pionowy)</td></tr><tr><td>Wzmacniacz</td><td>Axon Instruments</td><td></td><td>Axoclamp 200B </td></tr><tr><td>Przetwornik A-D</td><td>Computer Interference Corp.</td><td></td><td>Digidata ITC-18 </td></tr><tr><td>Chłodzona kamera CCD</td><td>PCO Optyka komputerowa Lampa</td><td></td><td></td></tr><tr><td>ksenonowa</td><td>Sensicam Sutter Instruments Co.</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Zestaw filtrów GFP</td><td>Chroma Technologies</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Oprogramowanie do obrazowania</td> Innowacje w zakresie <td>inteligentnego obrazowania</td><td>Oprogramowanie do slajdów </td><td></td></tr><tr><td>Oprogramowanie do akwizycji danych elektrofizjologicznych</td><td>Oprogramowanie Axon Instruments</td><td></td><td>Oprogramowanie do aksografii </td></tr><tr><td>Oprogramowanie do akwizycji danych elektrofizjologicznych</td><td>AD Instruments Inc.</td><td></td><td>PowerLab </td></tr><tr><td>Headstage do elektrofizjologii</td><td>Axon Instruments</td><td></td><td>CV 203BU </td></tr><tr><td>Micromanipulator</td><td>Sutter Instrument Co</td><td>MP-285</td><td></td></tr><tr><td>Platforma komory nagraniowej</td><td>Warner Instrument Corp.</td><td></td><td> </td></tr><tr><td>P1 Komora nagraniowa</td><td>Warner Instrument Corp.</td><td></td><td>RC-26G </td></tr><tr><td>Ściągacz elektrod</td><td>Instrumenty</td><td></td><td>Sutter P87 </td></tr><tr><td>Filament do ściągacza elektrod</td><td>Sutter Instruments</td><td>FB330B</td><td>Żarnik korytkowy o szerokości 3,0</td></tr><tr><td>mm Kapilary szklane 1,5 mm</td><td>World Precision Instruments</td><td>1B150-4</td><td>Micr&#8211; lektroda do nagrywania</td></tr><tr><td>Strzykawka</td><td>Becton Dickinson</td><td>309586</td><td>3 ml</td></tr><tr><td>MS-222 </td><td>Sigma</td><td>E10521-10G</td><td>Sól metanosulfonianu 3-aminobenzoesanu etylu Sól fizjologiczna</td></tr><tr><td>ryb</td><td></td><td></td><td>mM: 134 NaCl; 2,9 KCl; 2,1 CaCl2; 1,2 MgCl2; 10 HEPES </td></tr><tr><td>Roztwór elektrody (luźna plama) </td><td></td><td></td><td>mM: 150 NaCl; 3,5 KCl; 2.5 CaCl2; 1,3 MgCl2; 10 HEPES; 10 </td></tr><tr><td>glukoza Roztwór elektrody (plaster na całe komórki) </td><td></td><td></td><td>mM: 112,5 K-glukonian; Zawartość NaCl; 17,5 KCl; 0,5 CaCl2; 1 MgCl2; 5 MgATP; 1 EGTA; 10 HEPES; 1 GTP; 0,1 leupeptyny; 10 foskreatyna </td></tr></tbody></table>

rejestrowanie aktywności elektrycznej ze zidentyfikowanych neuronów w nienaruszonym mózgu ryb transgenicznych

Recording Electrical Activity from Identified Neurons in the Intact Brain of Transgenic Fish

Zrozumienie fizjologii obwodów nerwowych regulujących złożone zachowania jest znacznie lepsze dzięki zastosowaniu systemów modelowych, w których ta praca może być wykonywana w nienaruszonym preparacie mózgu, gdzie obwody nerwowe OUN pozostają nienaruszone. Używamy transgenicznych ryb, u których neurony hormonu uwalniającego gonadotropiny (GnRH) są genetycznie znakowane zielonym białkiem fluorescencyjnym w celu identyfikacji w nienaruszonym mózgu. Ryby mają wiele populacji neuronów GnRH, a ich funkcje zależą od ich lokalizacji w mózgu i genu GnRH, który wyrażają1 . Skoncentrowaliśmy naszą demonstrację na neuronach GnRH3 zlokalizowanych w nerwach końcowych (TN) związanych z opuszkami węchowymi przy użyciu nienaruszonego mózgu transgenicznej ryby medaka (Figura 1B i C). Badania sugerują, że neurony medaka TN-GnRH3 są neuromodulujące, działając jako przekaźnik informacji ze środowiska zewnętrznego do ośrodkowego układu nerwowego; nie odgrywają bezpośredniej roli w regulacji funkcji przysadkowo-gonadalnych, tak jak dobrze znane neurony GnRH1 podwzgórza2, 3 . Toniczny, spontaniczny potencjał czynnościowy wystrzeliwania neuronów TN-GnRH3 jest właściwością wewnętrzną4-6, której częstotliwość jest modulowana przez sygnały wizualne od współplemieńców2 i neuropeptydu kisspeptyny 15. W tym filmie używamy stabilnej linii transgenicznej medaki, w której neurony TN-GnRH3 wyrażają transgen zawierający region promotorowy Gnrh3 połączony ze wzmocnionym białkiem zielonej fluorescencji7, aby pokazać, jak identyfikować neurony i monitorować ich aktywność elektryczną w całym preparacie mózgu6.

Przykład obustronnych skupisk neuronów TN-GnRH3 znakowanych GFP z wyekscydowanego mózgu ryby medaka przedstawiono na Rysunkach 1B i 1C. Każde skupisko zawiera około 8-10 neuronów GnRH. Spontaniczną aktywność neuronalną docelowych neuronów TN-GnRH3 rejestrowano w trybie clampingu prądowego (I=0), przy typowych częstotliwościach wyładowań od 0,5 do 6 Hz. Wzór generowania potencjałów czynnościowych ma zazwyczaj charakter toniczny lub rytmiczny (beating pattern), z dość regularnymi odstępami...

W tym filmie pokażemy, jak rejestrować aktywność elektryczną z zidentyfikowanych pojedynczych neuronów w całym preparacie mózgu, który zachowuje złożone obwody neuronowe. Używamy transgenicznych ryb, u których neurony hormonu uwalniającego gonadotropiny (GnRH) są genetycznie znakowane białkiem fluorescencyjnym w celu identyfikacji w nienaruszonym preparacie mózgu.

Rejestrowanie aktywności elektrycznej ze zidentyfikowanych neuronów w nienaruszonym mózgu ryb transgenicznych

Understanding the cell physiology of neural circuits that regulate complex behaviors is greatly enhanced by using model systems in which this work can be ...

Ogólnym celem niniejszej procedury jest rejestracja aktywności elektrycznej neuronów w preparacie nienaruszonego mózgu ryby. Cel ten osiąga się poprzez wprowadzenie w stan znieczulenia transgenicznej ryby meca w wieku od czterech do sześciu miesięcy w roztworze MS 2 22, a następnie wypreparowanie jej mózgu. Następnie jeden z wybranych neuronów znakowanych GFP zostaje skontaktowany z elektrodą rejestrującą, a jego aktywność elektryczna jest rejestrowana za pomocą elektrofizjologii metodą loose patch lub whole cell patch clamp.Ostatecznie wyniki mogą wykazać zmiany w częstotliwości wyładowań potencjałów czynnościowych lub zmiany potencjału błonowego w odpowiedzi na różne zabiegi w nienaruszonym mózgu. Główną zaletą tej techniki w porównaniu z istniejącymi metodami, takimi jak elektrofizjologia pojedynczych komórek, hodowli komórkowych czy preparatów skrawków mózgu, jest możliwość charakterystyki właściwości elektrycznych neuronów w preparacie całego mózgu z nienaruszonymi obwodami neuronalnymi. Choć pomiary te dostarczają wglądu w neuroendokrynologię rozrodczą, mogą one zostać zastosowane również w innych układach nerwowych przy użyciu ryb o zdolności do regeneracji, na przykład w badaniu neuronów kontrolujących motywację i zachowania afektywne.W tej demonstracji wykorzystano transgeniczne ryby medaka, w których neurony GnRH3 są genetycznie znakowane białkiem GFP. Aby rozpocząć, znieczul dorosłą rybę medaka, zanurzając ją w 5 ml MS-222. Kilka minut po ustaniu ruchów skrzeli przenieś rybę do 60 mm szalki Petriego z solą fizjologiczną dla ryb. Następnie za pomocą nożyczek odetnij głowę ryby w tylnej części łba.Przenieś głowę do szalki Petriego o średnicy 35 mm, wypełnionej do połowy solą fizjologiczną dla ryb i wyłożonej wkładką ochronną. Szalka musi posiadać centralne wgłębienie, w którym należy umieścić i przymocować głowę stroną grzbietową do góry za pomocą szpilek entomologicznych i precyzyjnych nożyczek. Ostrożnie przetnij grzbietową część czaszki wzdłuż jej obwodu.Następnie delikatnie usuń czaszkę za pomocą pincety, odsłaniając grzbietową część mózgu, w tym przednią część rdzenia kręgowego. Teraz ostrożnie unieś rdzeń kręgowy pincetą z cienką końcówką, a następnie przetnij obustronne nerwy łączące, używając nożyczek z cienkimi końcami. Obejmuje to przecięcie nerwów czaszkowych, nerwów rdzeniowych, brzusznej strony nerwów wzrokowych oraz przednich nerwów węchowych.Umieść w pełni wypreparowany mózg w nowej szalce Petriego wypełnionej świeżym roztworem soli fizjologicznej dla ryb pod mikroskopem. Upewnij się, że cały mózg oraz przysadka są nienaruszone i nie zostały przecięte ani nakłute. Odrzuć wszelkie uszkodzone mózgi i powtórz procedurę, używając igły.Nanieś małą kroplę kleju szybkoschnącego, takiego jak cyjanoakrylan, na środek komory rejestracyjnej. Rozprowadź kroplę kleju na powierzchni jednego centymetra kwadratowego. Następnie szybko przenieś mózg na klej.Zabeziecz go stroną brzuszną do góry. Następnie napełnij komorę rejestracyjną około 1 ml soli fizjologicznej dla ryb, aby pokryć mózg. Używając pęsety z cienkimi końcami, ostrożnie usuń opony mózgowe z powierzchni obszaru rejestracji mózgu, kierując się do przodu.Kontynuuj perfuzję mózgu napowietrzoną solą fizjologiczną dla ryb z prędkością co najmniej 200 µL na minutę. Wykonaj kilka szklanych mikroelektrod o rezystancji od 6 do 10 MΩ i wypełnij je do około połowy roztworem do rejestracji loose patch. Używając pionowego mikroskopu fluorescencyjnego z chłodzoną kamerą CCD, zlokalizuj neurony terminalne nerwu gn RH trzy wykazujące ekspresję GFP, zaczynając od obiektywu 10x.Następnie należy przełączyć na obiektyw 40x i zlokalizować neurony znajdujące się na powierzchni brzusznej opoli węchowych lub w jej pobliżu, tuż przed cephalonem. Teraz należy przełączyć widok na monitor wideo, który wyświetla obrazy z mikroskopu w czasie rzeczywistym. Grupa neuronów zawiera od 8 do 10 neuronów GnRH.Umieść mikroelektrodę w kąpieli komory rejestracyjnej tak, aby końcówka elektrody znajdowała się nad docelowym neuronem. Przyłóż stałe, lekkie dodatnie ciśnienie, aby zapobiec zapchaniu się mikroelektrody. Powoli zbliżaj końcówkę elektrody do docelowego neuronu, kontrolując i monitorując rezystancję elektrody za pomocą oprogramowania Axograph.Podczas wykonywania testu szczelności w trybie clampowania napięcia, gdy końcówka elektrody znajduje się na powierzchni neuronu, oporność elektrody w tym punkcie ulega niewielkiej zmianie. Należy zwolnić ciśnienie dodatnie, aby uzyskać uszczelnienie o niskiej rezystancji, a w razie potrzeby zastosować lekkie ciśnienie ujemne. Najbardziej krytycznym krokiem dla uzyskania dobrego zapisu jest wybór czystego fragmentu wypustki neuronalnej, co ułatwia stworzenie idealnego uszczelnienia pomiędzy elektrodami a błoną komórkową.Przełącz teraz urządzenie w tryb zacisku prądowego (current clamp). Otwórz program PowerLab i rozpocznij ciągły pomiar napięcia błony bez podawania prądu; w razie potrzeby dostosuj skalę napięcia oraz częstotliwość rejestracji. Przed zastosowaniem jakichkolwiek zabiegów rejestruj bazową aktywność elektryczną w normalnym soli fizjologicznej dla ryb przez około pięć minut. Perfuzja kąpieli z lekami, hormonami, peptydami itp. powinna być prowadzona do preparatu mózgu z przepływem 200 µL na minutę.Następnie użyj zwykłej soli fizjologicznej dla ryb w celu przemycia układu; po zlokalizowaniu komórki sprawdź i monitoruj oporność elektrody w trybie clampa napięciowego (voltage clamp). Gdy końcówka elektrody znajdzie się na powierzchni neuronu, a oporność elektrody lekko ulegnie zmianie, zwolnij ciśnienie dodatnie i zastosuj niewielkie ciśnienie ujemne, aby uzyskać szczelną styk o wysokiej oporności (high resistance seal) na neuronie.Zastosuj delikatne ssanie ustami. Przerwij uszczelnioną błonę komórkową. W momencie przerwania błony oporność natychmiast spadnie do około 120 do 250 mega ohms.Następnie przełącz urządzenie w tryb zaciskania prądu (current clamp) i rejestruj stale napięcie błonowe za pomocą wykresu, nie przykładając żadnego prądu. Ponownie dostosuj skalę napięcia oraz szybkość rejestracji zgodnie z potrzebami. Po wykonaniu pomiaru bazowego aktywności elektrycznej w normalnym roztworze soli fizjologicznej dla ryb przez około pięć minut, zastosuj odpowiednie preparaty, a następnie przeprowadź okres wypłukiwania. Spontaniczna aktywność elektryczna neuronów GNRH3 w zakończeniu nerwu moca była rejestrowana w trybie zaciskania prądu.Typowa częstotliwość wyładowań wynosi od 0,5 do 6 Hz. Potencjały czynnościowe występują zazwyczaj w wzorcu tonicznym lub rytmicznym z dość regularnym odstępem między impulsami, a średni potencjał błonowy między impulsami wynosi około -48 mV. To podejście eksperymentalne sprawdza się również w rejestracji sygnałów z neuronów GNRH znakowanych GFP, znajdujących się w przedmózgowiu dorosłych osobników transgenicznych.Aktywność elektryczna neuronów rybki zebrafish w wyciętym, nienaruszonym mózgu osobników transgenicznych. Rejestrację aktywności rybek zebrafish przeprowadzono w sposób analogiczny do opisanego dla DACA, stosując metodę loose patch. Te same techniki zapewniły również możliwość rejestracji z całej komórki (whole cell recording).W przeciwieństwie do neuronów GnRH nerwu końcowego u meca, wzorzec spontanicznych potencjałów czynnościowych neuronów GnRH u danio-pręgowanego w obszarze pre-op, brzusznej części cephalon i podwzgórzu jest często nieregularny. Po opanowaniu tej techniki, nagranie trwające 15 minut można zrealizować w ciągu godziny, jeśli procedura zostanie przeprowadzona prawidłowo. Powodzenia.

recording-electrical-activity-from-identified-neurons-intact-brain

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Neuronauka

Rejestrowanie aktywności elektrycznej z identyfikowanych neuronów w nietkniętym mózgu transgennych ryb

W tym filmie przedstawiono techniki wielokolorowego konfokalnego obrazowania time-lapse oraz celowanej ablacji komórek. Obrazowanie time-lapse jest wykorzystywane do monitorowania zachowania wielu wybranych typów komórek in vivo. Celowana ablacja komórek ułatwia badanie funkcji obwodów neuronalnych oraz paradygmatów regeneracji neuronów specyficznych dla danej grupy komórek.

Wielokolorowe obrazowanie poklatkowe transgenicznych rybek zebrafish: wizualizacja komórek macierzystych siatkówki aktywowanych przez ukierunkowaną ablację komórek neuronalnych

Transport retrogradny barwnika fluorescencyjnego pozwala na oznakowanie subpopulacji neuronów na podstawie projekcji anatomicznej. Oznakowane aksony mogą być celowane wizualnie in vivo, co umożliwia rejestrację pozakomórkową z zidentyfikowanych aksonów. Technika ta ułatwia rejestrację w przypadkach, gdy neurony nie mogą zostać oznakowane poprzez manipulacje genetyczne lub gdy ich izolacja za pomocą „ślepych” metod in vivo jest utrudniona.

Retrogradne znakowanie fluorescencyjne umożliwia ukierunkowaną zewnątrzkomórkową rejestrację pojedynczych jednostek z zidentyfikowanych neuronów in vivo

Protokół opisuje procedurę wykonywania elektrofizjologii u dorosłych ryb danio pręgowanych. Metodę tę można wykorzystać do pomiaru aktywności neuronalnej in vivo.

Elektrofizjologia dorosłego danio pręgowanego: metoda pomiaru zewnątrzkomórkowej aktywności elektrycznej neuronów in vivo

Ten film demonstruje rejestrację sygnałów elektrycznych z neuronów doprowadzających u sparaliżowanej larwy danio pręgowanego poprzez umieszczenie mikropipety w pobliżu zwoju linii bocznej i utworzenie luźnej uszczelki do przechwytywania sygnału. Roztwór zewnątrzkomórkowy utrzymuje żywotność neuronów podczas tego procesu.

Monitorowanie sygnałów elektrycznych z neuronów aferentnych w unieruchomionej larwie danio pręgowanego

Opisana jest prosta metoda rejestrowania potencjałów pola zewnątrzkomórkowego w przodomózgowiu larwy danio pręgowanego. Metoda ta zapewnia solidny odczyt in vivo aktywności podobnej do napadowej. Technika ta może być stosowana w przypadku genetycznie zmodyfikowanych larw danio pręgowanego będących nosicielami genów związanych z padaczką lub napadów wywołanych podawaniem leków przeciwdrgawkowych.

Zapis elektrofizjologiczny przodomózgowia u larw danio pręgowanego

Ten artykuł opisuje, jak dorosły danio pręgowany może zostać unieruchomiony, zaintubowany i wykorzystany do eksperymentów elektrofizjologicznych in vivo, aby umożliwić rejestrację i manipulację aktywnością neuronalną u nienaruszonego zwierzęcia.

Zapis elektrofizjologiczny w mózgu nienaruszonego dorosłego danio pręgowanego

Ten manuskrypt opisuje metody zapisów elektrofizjologicznych z neuronów rdzeniowych zarodków i larw danio pręgowanego. Preparat utrzymuje neurony in situ i często wiąże się z minimalnym rozwarstwieniem. Metody te pozwalają na badanie elektrofizjologiczne różnych neuronów rdzeniowych, od początkowego nabycia pobudliwości elektrycznej do wczesnych stadiów larwalnych.

Przygotowanie rdzenia kręgowego danio pręgowanego in situ do zapisów elektrofizjologicznych z rdzeniowych neuronów czuciowych i ruchowych

Prezentowana jest nowatorska technika bezprzewodowa do rejestrowania zewnątrzkomórkowych sygnałów nerwowych z mózgu swobodnie pływających złotych rybek. Urządzenie rejestrujące składa się z dwóch tetrod, mikronapędu, rejestratora danych neuronowych i wodoodpornej obudowy. Wszystkie części są wykonywane na zamówienie, z wyjątkiem rejestratora danych i jego złącza.

Bezprzewodowa elektrofizjologiczna rejestracja neuronów przez ruchome tetrody u swobodnie pływających ryb

Tutaj prezentujemy metodę obrazowania embrionalnego mózgu danio pręgowanego in vivo, aż do stadium larwalnego i młodocianego. Ta mikroinwazyjna procedura, zaadaptowana z podejść elektrofizjologicznych, zapewnia dostęp do szczegółów komórkowych i subkomórkowych dojrzałego neuronu i może być połączona z badaniami optogenetycznymi i neurofarmakologicznymi w celu scharakteryzowania funkcji mózgu i interwencji farmakologicznej.

Obrazowanie in vivo w pełni aktywnej tkanki mózgowej u wybudzonych larw i osobników młodocianych danio pręgowanego poprzez usunięcie czaszki i skóry

Tutaj prezentujemy szczegółowy protokół badania aktywności neuronalnej w obszarach mózgu transgenicznego danio pręgowanego, które wyrażają wskaźniki wapnia GCaMP za pomocą mikroskopii konfokalnej.

In vivo (in vivo) Konfokalne obrazowanie fluorescencyjne aktywności neuronalnej wywołanej stymulacją sensoryczną u częściowo unieruchomionych larw danio pręgowanego

Poznaj technikę rejestracji aktywności elektrycznej neuronów w nienaruszonym mózgu ryb transgenicznych. Metoda patch clamp pozwala analizować częstość wyładowań i potencjał błonowy neuronów GnRH w układach nerwowych.

Rejestrowanie aktywności elektrycznej ze zidentyfikowanych neuronów w nienaruszonym mózgu ryb transgenicznych

Przeglądaj więcej filmów