Name: Stereotaktyczne wstrzyknięcie wektora wirusowego w celu warunkowej manipulacji genami w rdzeniu kręgowym myszy (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-03-18T13:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 39 s
Description: Naucz się stereotaktycznego wstrzyknięcia wektora wirusowego w rdzeń kręgowy myszy, aby uzyskać przestrzennie ograniczoną ekspresję genów w neuronach róg grzbietowy.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Dziękujemy Bakhos A. Tannous, Ph.D., Dyrektorowi ds. Rozwoju i Produkcji Wektorów w Centrum Neuronauki Massachusetts General Hospital, Charlestown, Massachusetts, za dostarczenie nam wektora rAAV-eGfp, oraz Johnowi Whangowi za pomoc techniczną. Praca ta została wsparta grantem R01 NS050408 (dla J.S.) z National Institute of Neurological Disorders and Stroke.

Opisana procedura chirurgiczna została zatwierdzona przez Instytucjonalny Komitet ds. Opieki i Użytkowania Zwierząt (IACUC) Uniwersytetu Columbia.
1. Przygotowanie sprzętu i zawiesiny cząsteczek wirusa
<ol>
	<li>Wyczyść i zdezynfekuj sprzęt, wysterylizuj narzędzia chirurgiczne i kolce z wycięciem w kształcie litery V, które będą używane do mocowania kręgu L1.</li>
	<li>Wyciągaj i ukosuj szklane pipety. Używamy pipet o średnicy końcówki 40 μm i są fazowane pod kątem 20°. Wysterylizuj szklane pipety.</li>
	<li>Ustaw ramkę stereotaktyczną, zamontuj wtryskiwacz mikrostrzykawkowy na manipulatorze i podłącz wtryskiwacz do sterownika.</li>
	<li>Przymocować jedną ze szklanych pipet do mikrostrzykawki za pomocą zestawu złączek zaciskowych.</li>
	<li>Wyjąć tłok z mikrostrzykawki i napełnić strzykawkę olejem mineralnym. Do oleju mineralnego można dodać czerwony olej O (1-(2,5-dimetylo-4-(2,5-dimetylofenyloazo)fenyloazo)-2-naftolow) w celu zwiększenia jego widoczności. Ponownie włóż tłok i dociśnij go aż do końcówki. Ostrożnie unikaj tworzenia pęcherzyków powietrza.</li>
	<li>Przygotować zawiesinę cząstek wirusa w komorze bezpieczeństwa biologicznego. Zamrożony wirus należy rozmrozić na lodzie i tuż przed użyciem rozcieńczyć go sterylnym roztworem soli fizjologicznej buforowanym fosforanami do pożądanego stężenia cząstek.</li>
	<li>Włożyć mikrostrzykawkę do uchwytu na wtryskiwaczu.</li>
	<li>Odpipetować 5 μl zawiesiny wirusa na mały arkusz z tworzywa sztucznego, np. Parafilm. Zanurzyć szklaną końcówkę pipety w kropli i pociągnąć tłok, aby napełnić mikrostrzykawkę. Na końcówce pipety utworzy mały pęcherzyk powietrza, aby zapobiec jej zatkaniu.</li>
</ol>
2. Laminektomia
<ol>
	<li>Przygotuj obszar operacji, przecierając ławkę i poduszkę grzewczą środkiem dezynfekującym.</li>
	<li>Znieczulij mysz. Stosujemy znieczulenie wziewne z izofluranem (3% podczas indukcji, 2%-3% podczas podtrzymującej).</li>
	<li>Umieść lubrykant na każdym oku, aby chronić oczy przed wysuszeniem podczas operacji.</li>
	<li>Ogol sierść od dolnej części pleców do szyi myszy i zdezynfekuj skórę naprzemiennymi chusteczkami z miejscowym środkiem antyseptycznym, takim jak chlorheksydyna lub powidon-jod i 70% etanolu. Odizolować aseptyczne miejsce za pomocą serwety chirurgicznej i naciekać miejsce nacięcia bupiwakainą (0,25%, rozcieńczoną w stosunku 1:10 solą fizjologiczną).</li>
	<li>Naciąć skórę na ogonowym końcu klatki piersiowej wzdłuż linii środkowej (2-3 cm) i oddzielić powięź pokrywającą kręgosłup.</li>
	<li>Ponieważ rdzeń kręgowy przestaje rosnąć wcześniej w okresie poporodowym niż kręgosłup, odcinek kręgowy L4 leży pod pierwszym kręgiem lędźwiowym (L1). Kręg L1 znajduje się ogonowo do kręgu, który podtrzymuje ostatnią parę żeber. Zidentyfikuj i odsłoń kręg L1, usuwając małe mięśnie rdzeniowe i więzadła przyczepione do jego powierzchni grzbietowej.</li>
	<li>Lekko podnieś i przytrzymaj kręg L1 za pomocą kleszczy Adson. Użyj dedykowanych kleszczy do laminektomii, aby usunąć grzbietową część kręgu (kręgosłup i blaszkę) i odsłonić rdzeń kręgowy. Unikaj uszkodzenia rdzenia kręgowego.</li>
	<li>Przenieś mysz na płytę grzewczą w ramce stereotaktycznej. Monitoruj temperaturę myszy podczas kolejnej operacji.</li>
</ol>
3. Wtrysk
<ol>
	<li>Zamocuj kręg L1 za pomocą kolców z wycięciem w kształcie litery V. Kolce muszą stabilizować kręgosłup, aby kręg nie poruszał się podczas oddychania.</li>
	<li>Przysunąć mikrostrzykawkę bliżej tak, aby końcówka pipety znajdowała się powyżej miejsca laminektomii. Opuścić tłok do momentu, gdy zawiesina wirusa wydostaje się z pipety. Usuń kroplę za pomocą sterylnej bawełnianej końcówki.</li>
	<li>Umieść końcówkę pipety w najbardziej rostralnej części odsłoniętego rdzenia kręgowego. Wyśrodkuj pipetę powyżej tylnej bruzdy środkowej, a następnie przesuń końcówkę o 500 μm w bok. Opuść końcówkę na powierzchnię sznurka i nakłuj oponę twardą lub, jeśli pracujesz z nieskośną szklaną pipetą, użyj skośnej stalowej kaniuli do przebicia opony twardej. Opuść końcówkę szklanej pipety na 300 μm do rdzenia kręgowego.</li>
	<li>Wstrzyknąć 1 μl zawiesiny wirusa z szybkością 200 nl/min.</li>
	<li>Po zakończeniu wstrzyknięcia należy odczekać co najmniej 2 minuty przed powolnym wyjęciem pipety.</li>
	<li>Powtórz kroki od 3,3 do 3,5 w najbardziej ogonowej części odsłoniętego rdzenia kręgowego, aby uzyskać pełną dystrybucję wektora wirusowego w segmencie rdzenia L4. Dwa miejsca wstrzyknięcia znajdują się rostralnie i ogonowo segmentu L4, aby uniknąć uszkodzenia tkanki w obszarze docelowym.</li>
</ol>
4. Zamykanie ran
<ol>
	<li>Zwolnij kręg L1 z zacisków z wycięciem w kształcie litery V i wyjmij mysz z ramy stereotaktycznej.</li>
	<li>Zszyj powięź vicrylem 5.0. Zamknięta powięź zapewnia osłonę dla miejsca laminektomii.</li>
	<li>Zamknij skórę nylonowymi szwami lub zszywkami chirurgicznymi.</li>
</ol>
5. Opieka pooperacyjna
<ol>
	<li>Przenieś mysz do klatki regeneracyjnej z miękką, nieszczególną ściółką. Połóż go na boku, aby wygodnie oddychać. Monitoruj zwierzę, dopóki nie będzie w pełni przytomne, nie zacznie chodzić i nie zacznie pić.</li>
	<li>Zapewniamy analgezję pooperacyjną przez 72 godziny z codziennymi podskórnymi iniekcjami karprofenu (5,0 mg/kg).</li>
	<li>Monitoruj rekonwalescencję pooperacyjną poprzez codzienną inspekcję przez pierwsze 3 dni, a następnie co drugi dzień lub 3 dni w tygodniu, aż do zakończenia eksperymentu.</li>
	<li>Usuń szwy lub zszywki skórne 7 do 10 dni po operacji, gdy gojenie się rany jest zakończone.</li>
	<li>Poddaj zwierzę eutanazji po zakończeniu eksperymentu.</li>
</ol>

<ol><li>Lewandoski, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Conditional+control+of+gene+expression+in+the+mouse%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Genetics%22%5BJournal%5D)">Conditional control of gene expression in the mouse.</a> Nature Reviews Genetics. 2, 743-755 (2001).</li>
<li>Couto, L. B., High, K. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Viral+vector-mediated+RNA+interference%5BTitle%5D)+AND+%22Curr.+Opin.+Pharmacol%22%5BJournal%5D)">Viral vector-mediated RNA interference.</a> Curr. Opin. Pharmacol. 10, 534-542 (2010).</li>
<li>Luo, L., Callaway, E. M., Svoboda, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genetic+dissection+of+neural+circuits%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Genetic dissection of neural circuits.</a> Neuron. 57, 634-660 (2008).</li>
<li>Davidson, B. L., Breakefield, X. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Viral+vectors+for+gene+delivery+to+the+nervous+system%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Viral vectors for gene delivery to the nervous system.</a> Nature Reviews Neuroscience. 4, 353-364 (2003).</li>
<li>Todd, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neuronal+circuitry+for+pain+processing+in+the+dorsal+horn%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Neuronal circuitry for pain processing in the dorsal horn.</a> Nature Reviews Neuroscience. 11, 823-836 (2010).</li>
<li>Wall, N. R., Wickersham, I. R., Cetin, A., De La Parra, M., Callaway, E. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Monosynaptic+circuit+tracing+in+vivo+through+Cre-dependent+targeting+and+complementation+of+modified+rabies+virus%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Monosynaptic circuit tracing in vivo through Cre-dependent targeting and complementation of modified rabies virus.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 107, 21848-21853 (2010).</li>
<li>Lo, L., Anderson, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Cre-dependent%2C+anterograde+transsynaptic+viral+tracer+for+mapping+output+pathways+of+genetically+marked+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">A Cre-dependent, anterograde transsynaptic viral tracer for mapping output pathways of genetically marked neurons.</a> Neuron. 72, 938-950 (2011).</li>
<li>Zhao, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell+type-specific+channelrhodopsin-2+transgenic+mice+for+optogenetic+dissection+of+neural+circuitry+function%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">Cell type-specific channelrhodopsin-2 transgenic mice for optogenetic dissection of neural circuitry function.</a> Nature Methods. 8, 745-752 (2011).</li>
<li>Tang, X. Q., Heron, P., Mashburn, C., Smith, G. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Targeting+sensory+axon+regeneration+in+adult+spinal+cord%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Targeting sensory axon regeneration in adult spinal cord.</a> J. Neurosci. 27, 6068-6078 (2007).</li>
<li>Cameron, A. A., Smith, G. M., Randall, D. C., Brown, D. R., Rabchevsky, A. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genetic+manipulation+of+intraspinal+plasticity+after+spinal+cord+injury+alters+the+severity+of+autonomic+dysreflexia%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Genetic manipulation of intraspinal plasticity after spinal cord injury alters the severity of autonomic dysreflexia.</a> J. Neurosci. 26, 2923-2932 (2006).</li>
<li>Passini, M. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CNS-targeted+gene+therapy+improves+survival+and+motor+function+in+a+mouse+model+of+spinal+muscular+atrophy%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Clinical+Investigation%22%5BJournal%5D)">CNS-targeted gene therapy improves survival and motor function in a mouse model of spinal muscular atrophy.</a> The Journal of Clinical Investigation. 120, 1253-1264 (2010).</li>
<li>Lutz, C. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Postsymptomatic+restoration+of+SMN+rescues+the+disease+phenotype+in+a+mouse+model+of+severe+spinal+muscular+atrophy%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Clinical+Investigation%22%5BJournal%5D)">Postsymptomatic restoration of SMN rescues the disease phenotype in a mouse model of severe spinal muscular atrophy.</a> The Journal of Clinical Investigation. 121, 3029-3041 (2011).</li>
<li>Chen, S. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((dsAAV+type+2-mediated+gene+transfer+of+MORS196A-EGFP+into+spinal+cord+as+a+pain+management+paradigm%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">dsAAV type 2-mediated gene transfer of MORS196A-EGFP into spinal cord as a pain management paradigm.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 104, 20096-20101 (2007).</li>
<li>South, S. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+conditional+deletion+of+the+NR1+subunit+of+the+NMDA+receptor+in+adult+spinal+cord+dorsal+horn+reduces+NMDA+currents+and+injury-induced+pain%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">A conditional deletion of the NR1 subunit of the NMDA receptor in adult spinal cord dorsal horn reduces NMDA currents and injury-induced pain.</a> J. Neurosci. 23, 5031-5040 (2003).</li>
<li>Tappe, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Synaptic+scaffolding+protein+Homer1a+protects+against+chronic+inflammatory+pain%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Med%22%5BJournal%5D)">Synaptic scaffolding protein Homer1a protects against chronic inflammatory pain.</a> Nat. Med. 12, 677-681 (2006).</li>
<li>Colle, M. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Efficient+intracerebral+delivery+of+AAV5+vector+encoding+human+ARSA+in+non-human+primate%5BTitle%5D)+AND+%22Human+Molecular+Genetics%22%5BJournal%5D)">Efficient intracerebral delivery of AAV5 vector encoding human ARSA in non-human primate.</a> Human Molecular Genetics. 19, 147-158 (2010).</li>
<li>Carbajal, K. S., Weinger, J. G., Whitman, L. M., Schaumburg, C. S., Lane, T. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Surgical+Transplantation+of+Mouse+Neural+Stem+Cells+into+the+Spinal+Cords+of+Mice+Infected+with+Neurotropic+Mouse+Hepatitis+Virus%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis.+Exp%22%5BJournal%5D)">Surgical Transplantation of Mouse Neural Stem Cells into the Spinal Cords of Mice Infected with Neurotropic Mouse Hepatitis Virus.</a> J. Vis. Exp. (53), e2834(2011).</li>
<li>Snyder, B. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparison+of+adeno-associated+viral+vector+serotypes+for+spinal+cord+and+motor+neuron+gene+delivery%5BTitle%5D)+AND+%22Hum.+Gene+Ther%22%5BJournal%5D)">Comparison of adeno-associated viral vector serotypes for spinal cord and motor neuron gene delivery.</a> Hum. Gene Ther. 22, 1129-1135 (2011).</li>
<li>Towne, C., Pertin, M., Beggah, A. T., Aebischer, P., Decosterd, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Recombinant+adeno-associated+virus+serotype+6+%28rAAV2%2F6%29-mediated+gene+transfer+to+nociceptive+neurons+through+different+routes+of+delivery%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Pain%22%5BJournal%5D)">Recombinant adeno-associated virus serotype 6 (rAAV2/6)-mediated gene transfer to nociceptive neurons through different routes of delivery.</a> Mol. Pain. 5, 52(2009).</li>
<li>Kaplitt, M. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Long-term+gene+expression+and+phenotypic+correction+using+adeno-associated+virus+vectors+in+the+mammalian%5BTitle%5D)+AND+%22%22%5BJournal%5D)">Long-term gene expression and phenotypic correction using adeno-associated virus vectors in the mammalian.</a> 8, 148-154 (1994).</li>
</ol>

Autorzy oświadczają, że nie mają konkurencyjnych interesów finansowych.

Iniekcja wektora stereotaktycznego umożliwia celowanie w neurony rdzenia kręgowego do zastosowań takich jak mapowanie sieci neuronalnych w oparciu o transsynaptyczne rozprzestrzenianie wirusa 6,7 lub optogenetyczne rozwarstwienie 8, prowadzenie aksonów podczas regeneracji po urazie 9,10 lub terapia genowa w celu zapobiegania lub leczenia neurodegeneracji 11,12. Wektory wirusowe zostały wykorzystane do manipulacji genami w rdzeniu kręgowym w celu zbadania szlaków somatosensorycz...

Zaawansowane technologie warunkowej manipulacji genami u myszy umożliwiają wieloaspektowe podejście do eksploracji szlaków synaptycznych i funkcjonalnych połączeń w ośrodkowym układzie nerwowym. Transgeny mogą być regulowane przez małocząsteczkowe efektory, takie jak doksycyklina działająca na transaktywator kontrolowany przez tetracyklinę, który może być zaprojektowany do działania jako represor lub aktywator transkrypcji genu, lub tamoksyfen rozpoznający zmutowaną domenę wiążącą ligand receptora estrogenowego 1. Nieodwracalna modyfikacja transgenu jest powszechnie osiągana przez rekombinazy kwasu dezoksyrybonukleinowego (DNA). Cre (powoduje rekombinację) i Flp (enzym rekombinacji flippazy) katalizują wycinanie, inwersję lub translokację fragmentów DNA, które są otoczone odpowiednio przez miejsca loxP (locus of crossing x over, P1) lub Frt (cel rozpoznawania flippazy) 1. Zastosowania obejmują aktywację lub wyciszanie genów oraz interferencję indukowalnego kwasu rybonukleinowego (RNA) 2. Warunkowa ekspresja reporterów fluorescencyjnych lub enzymatycznych, takich jak β-galaktozydaza lub fosfataza alkaliczna, może być wykorzystana do znakowania neuronów i badania ich miejscowej organizacji i łączności 3. Zakrojone na szeroką skalę projekty mutagenezy w Ameryce Północnej (<a href="http://www.norcomm.org/index.htm" target="_blank">http://www.norcomm.org/index.htm</a>) i Europie (<a href="http://www.knockoutmouse.org/about/eucomm" target="_blank">http://www.knockoutmouse.org/about/eucomm</a>) produkują biblioteki klonów embrionalnych komórek macierzystych myszy z warunkowymi celami genowymi i pułapkami, które ostatecznie pokryją cały genom myszy. Myszy wygenerowane z tych klonów mogą być krzyżowane z rosnącą liczbą linii myszy, które wyrażają rekombinacje DNA pod promotorami lub loci specyficznymi dla określonej populacji neuronów do selektywnej manipulacji genami (<a href="http://nagy.mshri.on.ca/cre_new/index.php" target="_blank">http://nagy.mshri.on.ca/cre_new/index.php</a>).
Jednakże, ograniczenie manipulacji genami do odrębnych populacji neuronów lub poszczególnych regionów zainteresowania może nie być osiągnięte przez samo celowanie genetyczne, jeśli promotor specyficzny dla populacji neuronów będących przedmiotem zainteresowania nie jest znany lub nie jest wyrażany przez wszystkie neurony w obszarze zainteresowania. W rdzeniu kręgowym projekty eksperymentalne mogą wymagać przestrzennego ograniczenia manipulacji genami do jednego lub dwóch segmentów czaszkowo-ogonowych. Stereotaktyczne wstrzyknięcie wektora wirusowego, który ulega ekspresji Cre lub Flp, pozwala ograniczyć rekombinację genów do regionów w rdzeniu kręgowym myszy, w których fragmenty DNA są otoczone miejscami loxP lub Frant, tak zwanymi allelami floxowanymi lub flrowanymi. W przeciwieństwie do konstytutywnej rearanżacji DNA, która wynikałaby z krzyżowania zwierząt z myszami wykazującymi ekspresję rekombinazy, strategia ta zapewnia również czasową kontrolę nad aktywacją lub wyciszaniem genów. Wektory wirusowe kodujące floksowane lub flirtowane transgeny oferują odwrotną opcję manipulacji genami u myszy wykazujących ekspresję odpowiedniej rekombinazy poniżej promotora specyficznego dla neuronu. Dostępnych jest kilka wektorów rekombinowanych o powinowactwie do neuronów 4. Adenowirus o dużej pojemności (bez jelit), wirus związany z adenowirusem, wirus opryszczki pospolitej i lentiwirus są powszechnie stosowanymi wektorami neurotropowymi. Wybór odpowiedniego wirusa do pytania badawczego jest kluczową częścią projektu eksperymentalnego. Należy wziąć pod uwagę wielkość transgenu, drogę dostarczania, specyficzność infekcji dla neuronów w przeciwieństwie do komórek glejowych, skuteczność infekcji, zapalne i toksyczne skutki uboczne 4.
Tutaj opisujemy stereotaktyczne wstrzyknięcie wektora wirusowego do grzbietowego rogu rdzenia kręgowego, technikę, którą stosujemy do warunkowej regulacji genów w naszych badaniach nad neurobiologią bólu. Róg grzbietowy otrzymuje aferentne dane wejściowe z pierwotnych neuronów somatosensorycznych, w tym neuronów nocyceptywnych. Lokalne interneurony przetwarzają informację, zanim neurony projekcyjne przekażą ją z rogu grzbietowego do mózgu 5. Wykazujemy zakażenie neuronów rogu grzbietowego na poziomie segmentu rdzenia L4 neurotropowym rekombinowanym wirusem związanym z adenowirusem (rAAV), który wykazuje ekspresję wzmocnionego białka zielonej fluorescencji (eGfp) pod konstytutywnie aktywnym promotorem wirusa cytomegalii.

<table><tbody><tr><td>Podstawa kręgosłupa</td><td>David Kopf Instruments</td><td>912</td><td></td></tr><tr><td>Instrument stereotaktyczny dla małych zwierząt</td><td>David Kopf Instruments</td><td>900</td><td></td></tr><tr><td>Uchwyt na głowę do znieczulenia gazem dla myszy</td><td>David Kopf Instruments</td><td>923-B</td><td></td></tr><tr><td>Regulowane mocowania podstawy</td><td>David Kopf Instruments</td><td>982</td><td></td></tr><tr><td>V Kolce do wycinania</td><td>David Kopf Instruments</td><td>987</td><td></td></tr><tr><td>System kontroli temperatury małych zwierząt</td><td>David Kopf Instruments</td><td>TCAT-2LV</td><td></td></tr><tr><td>Kleszcze Adson</td><td>Fine Science Tools</td><td>11006-12</td><td></td></tr><tr><td>Kleszcze do laminektomii</td><td>Fine Science Tools</td><td>11223-20</td><td></td></tr><tr><td>UltraMicroPump (jeden) ze sterownikiem SYS-Micro4 World</td><td>Precision Instruments</td><td>UMP3-1</td><td></td></tr><tr><td>Mikrostrzykawka, 65RN</td><td>Hamilton</td><td>7633-01</td><td></td></tr><tr><td>RN złączka zaciskowa, 1 mm</td><td>Hamilton</td><td>55750-01</td><td></td></tr><tr><td>Kapilary ze szkła borokrzemianowego</td><td>World Precision Instruments</td><td>1B100F-4</td><td></td></tr><tr><td>Mikroszlifierka</td><td>Narishige</td><td>EG-44</td><td></td></tr></tbody></table>

stereotaktyczne wstrzyknięcie wektora wirusowego w celu warunkowej manipulacji genami w rdzeniu kręgowym myszy

Stereotaxic Injection of a Viral Vector for Conditional Gene Manipulation in the Mouse Spinal Cord

Intraparenchymalne wstrzyknięcie wektora wirusowego umożliwia warunkową manipulację genami w różnych populacjach neuronów lub poszczególnych regionach ośrodkowego układu nerwowego. Demonstrujemy technikę wstrzykiwania stereotaktycznego, która umożliwia ukierunkowaną ekspresję genów lub wyciszenie w rogu grzbietowym rdzenia kręgowego myszy. Zabieg chirurgiczny jest krótki. Wymaga laminektomii pojedynczego kręgu, co zapewnia szybki powrót zwierzęcia do zdrowia i niezaburzoną motorykę kręgosłupa. Kontrolowane wstrzyknięcie małej objętości zawiesiny wektorowej przy niskiej prędkości i użycie mikrostrzykawki ze skośną szklaną kaniulą minimalizuje uszkodzenie tkanki. Miejscowa odpowiedź immunologiczna na wektor zależy od swoistych właściwości zastosowanego wirusa; Z naszego doświadczenia wynika, że jest ona niewielka i krótkotrwała, gdy stosuje się rekombinowany wirus związany z adenowirusem. Gen reporterowy, taki jak wzmocnione białko zielonej fluorescencji, ułatwia monitorowanie przestrzennego rozmieszczenia wektora oraz skuteczności i swoistości komórkowej transfekcji.

Pomyślna transfekcja skutkuje silną ekspresją genu w neuronach wstrzykniętego rogu tylnego (Rysunek 1), z pominięciem rogu tylnego po stronie przeciwległej, rogu przedniego oraz zwojów korzeni grzbietowych.
<img src="/files/ftp_upload/50313/50313fig1.jpg" alt="Mikroskopia fluorescencyjna tkanki nerwowej, przedstawiająca czerwone i zielone markery na nałożonych obrazach do analizy." data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Rycina 1"> 
Rycina 1. Transfekcja neuronó...

Wektory wirusowe pozwalają na celową manipulację genami. Demonstrujemy metodę warunkowej ekspresji genów lub ablacji w rdzeniu kręgowym myszy, wykorzystując stereotaktyczne wstrzyknięcie wektora wirusowego do rogu grzbietowego, widocznego miejsca kontaktu synaptycznego między pierwotnymi aferentami somatosensorycznymi a neuronami ośrodkowego układu nerwowego.

Stereotaktyczne wstrzyknięcie wektora wirusowego w celu warunkowej manipulacji genami w rdzeniu kręgowym myszy

Intraparenchymal injection of a viral vector enables conditional gene manipulation in distinct populations of neurons or particular regions of the central ...

Ogólnym celem tej procedury jest uzyskanie przestrzennie ograniczonej ekspresji genów w rdzeniu kręgowym myszy poprzez stereotaktyczne wstrzyknięcie wektora wirusowego do tylnego rogu odcinka lędźwiowego. Pierwszym krokiem procedury jest zlokalizowanie i odsłonięcie kręgu lędźwiowego. Drugim krokiem jest usunięcie grzbietowej części kręgu w celu odsłonięcia rdzenia kręgowego.Procedura określana jako laminektomia. Następnie szklaną pipetę połączoną z mikropompą strzykawkową ustawia się nad rogiem tylnym i wprowadza do rdzenia kręgowego. Ostatnim krokiem jest powolne wstrzyknięcie zawiesiny wektora.Dwa tygodnie później transfekcja neuronów rogu tylnego jest wykazana poprzez ekspresję zielonego białka fluorescencyjnego, co pozwala na śledzenie dystrybucji wirusa. Metoda ta pomaga wyjaśnić funkcję neuronów w niektórych częściach szlaku sensorycznego. Wykorzystujemy ją w badaniach skoncentrowanych specjalnie na rozwoju bólu zapalnego lub neuropatycznego.Demonstracja wizualna jest kluczowa dla nauki prawidłowego pozycjonowania myszy w ramie stereotaktycznej. Aby procedura zakończyła się sukcesem, niezbędne jest właściwe unieruchomienie kręgosłupa, ponieważ laminektomia jest techniką niezwykle delikatną. Martin Mole, doktorant z mojego laboratorium, zaprezentuje przebieg tej procedury.John Wang, asystent badawczy, będzie mu pomagać. Jeden lub dwa dni przed zabiegiem należy wyciągnąć szklane pipety, aby uzyskać średnicę końcówki wynoszącą 40 micrometers, a w dniu operacji ściąć końcówkę pod kątem 20 degrees. Procedurę należy rozpocząć od dezynfekcji sprzętu chirurgicznego i przygotowania sterylnych narzędzi chirurgicznych w celu ustawienia zestawu stereotaktycznego.Zamontuj wstrzykiwacz z mikrostrzykawką na manipulatorze i podłącz urządzenie do zasilania. Przymocuj jedną z szklanych pipet do mikrostrzykawki, używając złączki śrubowej. Następnie wyjmij tłok z mikrostrzykawki.Napełnij strzykawkę olejem mineralnym, a następnie ponownie włóż tłok i dociśnij go całkowicie do końca. Należy uważać, aby nie powstały pęcherzyki powietrza. Następnie włóż mikrostrzykawkę do uchwytu w iniektorze.Następnie wyjmij wirusa z zamrażarki i przygotuj zawiesinę cząsteczek wirusa bezpośrednio przed użyciem, rozcieńczając ją sterylnym roztworem soli fizjologicznej z buforem fosforanowym do pożądanego stężenia cząsteczek. Nanieś pięć µL zawiesiny wirusa na mały kawałek param. Następnie zanurz końcówkę szklanej pipety w kropli i pociągnij tłok, aby napełnić mikrostrzykawkę.Na koniec w końcówce pipety należy utworzyć mały pęcherzyk powietrza, aby zapobiec jej zapchaniu. W tym kroku należy przygotować obszar operacyjny, przecierając blat na podgrzewaczu środkiem dezynfekującym.Następnie znieczul mysz poprzez inhalację izofluranem. Potem na każde oko nanieś lubrykant, aby zapobiec ich wysychaniu podczas zabiegu. Następnie wygol futro myszy od dolnego odcinka pleców aż do karku. Zdezynfekuj skórę, przecierając ją naprzemiennie miejscowym środkiem antyseptycznym, takim jak chlorheksydyna lub powidon jodowy, oraz 70% etanolem.Następnie miejsce nacięcia należy znieczulić miejscowo 0,25% bupiwakainą rozcieńczoną w stosunku jeden do 10 w soli fizjologicznej. Następnie wykonuje się nacięcie skóry na końcu klatki piersiowej, na dwa do trzech centymetrów wzdłuż linii środkowej i oddziela powięź pokrywającą kręgosłup. Należy zidentyfikować kręg L1, który znajduje się za kręgami podtrzymującymi ostatnią parę żeber, i odsłonić go poprzez usunięcie małych mięśni grzbietowych oraz więzadeł przyczepionych do jego powierzchni grzbietowej.Następnie delikatnie unieś i przytrzymaj kręg L1 za pomocą pęsety. Dalej, użyj specjalistycznej pęsety do laminektomii, aby usunąć część grzbietową kręgu, w tym wyrostek kolczasty oraz łuk kolca, w celu odsłonięcia rdzenia kręgowego. Należy unikać uszkodzenia opony twardej lub rdzenia kręgowego podczas tej procedury.Następnie przenieś mysz na płytę grzewczą w aparacie stereotaktycznym i monitoruj temperaturę zwierzęcia podczas kolejnego etapu zabiegu. Teraz użyj kolców z wycięciem w kształcie litery V, aby ustabilizować kręgosłup, tak aby kręgi nie przemieszczały się podczas oddychania. Następnie zbliż mikrosstrzykawkę tak, aby końcówka pipety znajdowała się nad miejscem laminektomii.Obniżaj tłok, aż zobaczysz wypływ zawiesiny wirusa z pipety. Usuń kroplę za pomocą sterylnej gazy. Następnie umieść końcówkę pipety w najbardziej rostralnej części odsłoniętego rdzenia kręgowego.Umieść pipetę centralnie nad bruzdą środkową tylną i przesuń końcówkę o 500 micrometers bocznie. Następnie opuść końcówkę na powierzchnię rdzenia i przebij oponę twardą. Po tym opuść końcówkę szklanej pipety o 300 micrometers do wnętrza rdzenia kręgowego.Wstrzyknij jeden µL zawiesiny wirusa z prędkością 200 nL na minutę. Po zakończeniu iniekcji odczekaj co najmniej dwie minuty przed powolnym wycofaniem pipety. Powtórz procedurę wstrzykiwania w najbardziej bocznych częściach odsłoniętego rdzenia kręgowego, aby zapewnić pełną dystrybucję wektora wirusowego w segmencie rdzenia L4.Dwa miejsca wstrzyknięcia znajdują się rostralnie i caudalnie względem segmentu L4. Aby uniknąć uszkodzenia tkanek w obszarze docelowym po zwolnieniu wstrzykiwania, zwolnij kręg L1 z zacisków wcięki V i wyjmij mysz z aparatu stereotaktycznego. Następnie zszyj powięź nicią Vicryl 5-0.Zamknięta powięź osłania miejsce laminektomii. Następnie zamknij skórę za pomocą szwów nylonowych lub zszywek chirurgicznych. Zapewnij przeciwbólową opiekę pooperacyjną przez 72 godziny, podając codzienne podskórne iniekcje karprofenu w dawce five milligrams per kilogram.Przenieś mysz do klatki rekonwalescencyjnej z miękką ściółką, która nie pyli. Umieść mysz na boku, aby zapewnić jej swobodny oddech. Następnie monitoruj zwierzę, aż całkowicie odzyska przytomność.Karetka i rozpoczęcie picia. Monitoruj rekonwalescencję pooperacyjną poprzez codzienną kontrolę przez pierwsze trzy dni. Następnie co drugi dzień lub trzy razy w tygodniu aż do zakończenia eksperymentu.Od siedmiu do 10 dni po operacji, gdy gojenie rany jest zakończone. Usunąć szwy skórne lub zszywki. Rysunek ten przedstawia ekspresję białka reporterowego EGFP (enhanced green fluorescent protein) w lewym rogu tylnym rdzenia kręgowego na poziomie L4.Dwa tygodnie po wstrzyknięciu stereotaksycznym R-A-A-V-E-G-F-P neurony poddano immunobarwieniu na białko jąder neuronalnych, widoczne na czerwono. Grot strzałki wskazuje rozproszone przetransfekowane komórki glejowe w kolumnie tylnej. Około 80% neuronów w przyśrodkowej części rogu tylnego zostało zainfekowanych wektorem.Procedurę można przeprowadzić w ciągu 30–40 minut; należy pamiętać o zachowaniu warunków sterylnych podczas jej wykonywania. Po obejrzeniu tego filmu powinni Państwo mieć dobrą wiedzę na temat tego, jak przeprowadzać wstrzyknięcia dopłonne do grzbietowego rogu rdzenia kręgowego myszy. W tym przypadku stosujemy tę technikę do manipulacji genetycznych, jednak można ją dostosować do innych celów, takich jak podawanie leków do rdzenia kręgowego.

stereotaxic-injection-viral-vector-for-conditional-gene-manipulation

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Neuronauka

Wstrzyknięcie stereotaktyczne wirusa wektorowego w celu uwarunkowania manipulacji genem w rdzeniu kręgowym myszy

Źródło: Porlan, E., et al. Stabilna i wydajna modyfikacja genetyczna komórek u dorosłej myszy V-SVZ do analizy autonomicznych i nieautonomicznych efektów neuronalnych komórek macierzystych. J. Vis. Exp. (2016)Ten film pokazuje stabilną modyfikację genetyczną nerwowych komórek macierzystych (NSC) w strefie komorowo-podkomorowej (V-SVZ) poprzez stereotaktyczne wstrzyknięcie genu terapeutycznego przenoszącego wirusa w modelu mysim. Wirus wnika do NSC, ulega odwrotnej transkrypcji, integruje się z...

Stereotaktyczne wstrzykiwanie wirusów w celu stabilnej modyfikacji genetycznej w modelu mysim

Źródło: Chen, S., et al., Stereotaktyka chirurgiczna w komórkach prążkowia noworodków w mózgach myszy noworodków. J. Vis. Exp. (2018)Ten film pokazuje stereotaktyczne wstrzyknięcie wektora wirusowego kodującego rekombinazę Cre i białko zielonej fluorescencji lub GFP do prążkowia genetycznie zmodyfikowanego szczeniaka myszy w celu uzyskania manipulacji genami poprzez wycięcie kasety STOP po bokach loxP, aktywując białko czerwonej fluorescencji lub RFP jako reportera.

Stereotaktyczne mikrowstrzyknięcie wektora wirusowego do manipulacji genami u prążkowia szczeniąt myszy

Źródło: Tadokoro, T., et al. Dostarczanie wektorów subpialnego wirusa Adeno-associated 9 (AAV9) u dorosłych myszy. J. Vis. Exp. (2017)Ten film przedstawia technikę iniekcji podskórnej w celu dostarczenia genu do rdzenia kręgowego u myszy. Procedura polega na odsłonięciu opony twardej, nakłuciu opony twardej i wstrzyknięciu rekombinowanego wirusa związanego z adenowirusem (rAAV) przenoszącego gen eksprymujący białko fluorescencyjne do przestrzeni subpialnej. Po wstrzyknięciu i rekonwalescencji...

Subpialne dostarczanie genów w rdzeniu kręgowym myszy w celu oceny ekspresji genów

Źródło: Pereira, M. et al., In Vivo Bezpośrednie przeprogramowanie rezydentnych komórek glejowych do interneuronów przez domózgowe wstrzyknięcie wektorów wirusowych. J. Vis. Exp. (2019 rok)Ten film demonstruje stereotaktyczne wstrzyknięcie wirusa związanego z adenowirusem do kory mózgowej transgenicznej myszy w celu dostarczenia zależnego od Cre przeprogramowania neuronów i fluorescencyjnych genów reporterowych do komórek glejowych.

Stereotaktyczne wstrzykiwanie wektorów wirusowych do przeprogramowania komórek glejowych w modelu mysim

Źródło: Fricano-Kugler, C. J., et al. Projektowanie, pakowanie i dostarczanie wysokomianowych CRISPR Retro i lentiwirusów poprzez iniekcję stereotaktyczną. J. Vis. Exp. (2016)Ten film demonstruje stereotaktyczne wstrzyknięcie wirusa w celu precyzyjnej edycji genów neuronalnych w mózgu myszy. Protokół zapewnia dokładne dostarczanie wirusa do zakrętu zębatego, umożliwiając znakowanie fluorescencyjne i nokaut genów za pośrednictwem CRISPR w celu badania obwodów neuronalnych, funkcji genów i...

Stereotaktyczne wstrzyknięcie wirusa do celowanej edycji genów neuronalnych w mózgu myszy

Źródło: Li, D., et al. Bezpośrednie wstrzyknięcie dooponowe rekombinowanych wirusów związanych z adenowirusami u dorosłych myszy. J. Vis. Exp. (2019 rok)Ten film przedstawia procedurę dokanałowego wstrzykiwania wirusów związanych z adenowirusem (AAV) do płynu mózgowo-rdzeniowego (CSF) obudzonej myszy, obejmującą przygotowanie strzykawki, wyrównanie kręgosłupa i precyzyjne wprowadzenie igły. Metoda ta weryfikuje celowane dostarczanie genów, potwierdzając jej potencjał w terapiach OUN.

Dokanałowe podawanie wirusów w modelu mysim w leczeniu chorób ośrodkowego układu nerwowego

System CRISPR/Cas9 oferuje potencjał, aby uczynić ukierunkowaną edycję genomu dostępną i przystępną cenowo dla społeczności naukowej. Protokół ten ma na celu zademonstrowanie, jak tworzyć wirusy, które znokautują interesujący nas gen za pomocą systemu CRISPR/Cas9, a następnie wstrzykną je stereotaktycznie do mózgu dorosłej myszy.

Projektowanie, pakowanie i dostarczanie wysokomianowych CRISPR Retro i lentiwirusów poprzez iniekcję stereotaktyczną

Wstrzyknięcie dordzeniowe rekombinowanego rekombinowanego wirusa związanego z adenowirusem (rAAV) może być użyte do manipulowania dowolnym genetycznie znakowanym typem komórki w rdzeniu kręgowym. Tutaj opisujemy, jak transdukować neurony w rogu grzbietowym lędźwiowego rdzenia kręgowego. Technika ta umożliwia funkcjonalne badanie zmanipulowanego podtypu neuronu.

Ekspresja transgenu za pośrednictwem wirusa związanego z adenowirusem w genetycznie zdefiniowanych neuronach rdzenia kręgowego

Ten protokół demonstruje wstrzyknięcie wstecznie transportowalnego wektora wirusowego do tkanki rdzenia kręgowego szczura. Wektor jest wychwytywany w synapsie i transportowany do ciała komórkowego docelowych neuronów. Model ten nadaje się do wstecznego śledzenia ważnych ścieżek rdzeniowych lub celowania w komórki do zastosowań w terapii genowej.

Bezpośrednie wstrzyknięcie wektora lentiwirusowego uwydatnia wiele ścieżek motorycznych w rdzeniu kręgowym szczura

Ten protokół demonstruje nowatorską metodę stosowania terapii genowych do subpopulacji komórek u noworodków szczurów w wieku postnatalnym 5-10 dni poprzez wstrzyknięcie następczego modyfikatora chemogenetycznego do kory somatomotorycznej i wstecznie transportowanej rekombinazy Cre do rdzenia kręgowego szyjnego.

Celowanie w korowo-rdzeniowy przewód moczowy u noworodków szczurów za pomocą podwójnego wektora wirusowego przy użyciu połączonej chirurgii mózgu i kręgosłupa

Wstrzyknięcie dooponowe lędźwiowe stanowi translacyjnie istotną drogę podania dla dostarczania terapii genowej do ośrodkowego układu nerwowego. Ten kompleksowy, ustandaryzowany protokół wstrzyknięć dooponowych w odcinek lędźwiowy u noworodków, młodych i dorosłych myszy i szczurów ma na celu pomóc naukowcom w przyjęciu tej techniki do przedklinicznych badań nad terapią genową.

Lędźwiowe wstrzyknięcie dooponowe wektorów terapii genowej do celowania w ośrodkowy układ nerwowy u myszy i szczurów

Naucz się stereotaktycznego wstrzyknięcia wektora wirusowego w rdzeń kręgowy myszy, aby uzyskać przestrzennie ograniczoną ekspresję genów w neuronach róg grzbietowy.

Stereotaktyczne wstrzyknięcie wektora wirusowego w celu warunkowej manipulacji genami w rdzeniu kręgowym myszy

Przeglądaj więcej filmów