Stereotaktyczne wstrzyknięcie wektora wirusowego w celu warunkowej manipulacji genami w rdzeniu kręgowym myszy
18 marca 2013
Wektory wirusowe pozwalają na celową manipulację genami. Demonstrujemy metodę warunkowej ekspresji genów lub ablacji w rdzeniu kręgowym myszy, wykorzystując stereotaktyczne wstrzyknięcie wektora wirusowego do rogu grzbietowego, widocznego miejsca kontaktu synaptycznego między pierwotnymi aferentami somatosensorycznymi a neuronami ośrodkowego układu nerwowego.
Ogólnym celem tej procedury jest osiągnięcie ograniczonej przestrzennie ekspresji genów w rdzeniu kręgowym myszy poprzez stereotaktyczne wstrzyknięcie wektora wirusowego do lędźwiowego rogu grzbietowego. Pierwszym krokiem zabiegu jest zlokalizowanie i odsłonięcie kręgu lędźwiowego. Drugim krokiem jest usunięcie grzbietowej części kręgu w celu odsłonięcia rdzenia kręgowego.
Procedura zwana laminektomią. Następnie szklaną pipetę podłączoną do mikrostrzykawki umieszcza się nad rogiem grzbietowym i opuszcza do rdzenia kręgowego. Ostatnim krokiem jest powolne wstrzykiwanie zawiesiny wektorowej.
Dwa tygodnie później transfekcja neuronów rogu grzbietowego została zademonstrowana przez ekspresję białka zielonej fluorescencji, które umożliwia śledzenie dystrybucji wirusa. Metoda ta pomaga wyjaśnić funkcję neuronów w niektórych szlakach czuciowych. Używamy go w badaniach, które koncentrują się konkretnie na rozwoju bólu zapalnego lub neuropatycznego.
Demonstracja wizualna ma kluczowe znaczenie dla nauczenia się, jak ustawić mysz w ramce stereotaktycznej. Dla powodzenia zabiegu ważne jest, aby kręgosłup został prawidłowo zamocowany, ponieważ laminektomia jest tak delikatną techniką. Martin Mole, doktorant z mojego laboratorium, będzie demonstrował tę procedurę.
John Wang, asystent naukowy, będzie mu pomagał na jeden lub dwa dni przed zabiegiem. Pipety szklane Pul do uzyskania średnicy końcówki 40 mikrometrów i ukosować końcówkę pod kątem 20 stopni w dniu zabiegu. Procedurę należy rozpocząć od dezynfekcji sprzętu chirurgicznego i przygotowania sterylnych narzędzi chirurgicznych do ustawienia ramy stereotaktycznej.
Zamontuj wtryskiwacz mikrostrzykawki na manipulatorze i podłącz urządzenie. Przymocuj jedną ze szklanych pipet do mikrostrzykawki za pomocą złączki zaciskowej. Teraz wyjąć tłok z mikrostrzykawki.
Napełnić strzykawkę olejem mineralnym, a następnie ponownie włożyć tłok i docisnąć go do końcówki. Ostrożnie unikaj tworzenia pęcherzyków powietrza. Następnie włóż mikrostrzykawkę do uchwytu na wtryskiwaczu.
Następnie należy wyjąć wirusa z zamrażarki i przygotować zawiesinę cząsteczek wirusa tuż przed użyciem, rozcieńczając ją sterylnym roztworem soli fizjologicznej buforowanym fosforanem do pożądanego stężenia cząstek. Odpipetować pięć mikrolitrów zawiesiny wirusa na mały kawałek paramu. Następnie zanurzyć szklaną końcówkę pipety w kropli i pociągnąć tłok, aby napełnić mikrostrzykawkę.
Na końcu. Na końcówce pipety utworzy mały pęcherzyk powietrza, aby zapobiec jej zatkaniu. Na tym etapie należy przygotować obszar operacyjny, przecierając ławkę w poduszce grzewczej środkiem dezynfekującym.
Następnie znieczulij mysz przez inhalację fluoru. Następnie nałóż lubrykant na każde oko, aby chronić je przed wysuszeniem podczas operacji Następnie ogol futro od dolnej części pleców do szyi myszy. Dezynfekuj skórę naprzemiennymi chusteczkami z miejscowym środkiem antyseptycznym, takim jak chlorheksydyna lub jod powidonu i 70% etanol.
Następnie naciekać miejsce nacięcia 0,25% bupiwakainą rozcieńczoną od 1 do 10 solą fizjologiczną. Następnie nacinamy skórę na rozpieszczonym końcu klatki piersiowej, dwa do trzech centymetrów wzdłuż linii środkowej i oddzielamy powięź pokrywającą kręgosłup. Zidentyfikuj kręg L jeden, który znajduje się rozpieszczony do kręgu, trzymając ostatnią parę żeber i odsłoń go, usuwając małe mięśnie rdzeniowe i więzadła przyczepione do jego powierzchni grzbietowej.
Następnie lekko podnieś i przytrzymaj kręg L za pomocą pary dodatków i kleszczy. Następnie użyj dedykowanych kleszczy do laminektomii, aby usunąć grzbietową część kręgu, w tym wyrostek kolczysty i blaszkę, aby odsłonić rdzeń kręgowy. Podczas tej procedury należy unikać uszkodzenia opony twardej lub rdzenia kręgowego.
Następnie przenieś mysz na płytę grzewczą w ramce stereotaktycznej i monitoruj temperaturę myszy podczas kolejnej operacji. Teraz użyj kolców z wycięciem w kształcie litery V, aby ustabilizować kręgosłup, aby kręg nie poruszał się podczas oddychania. Następnie przysunąć mikrostrzykawkę bliżej, tak aby końcówka pipety znajdowała się powyżej miejsca laminektomii.
Opuścić tłok do momentu, gdy zawiesina wirusa wydostaje się z pipety. Usuń kroplę sterylną gazą. Następnie umieść końcówkę pipety w najbardziej rostralnej części odsłoniętego rdzenia kręgowego.
Wyśrodkuj pipetę powyżej tylnej bruzdy środkowej i przesuń końcówkę o 500 mikrometrów w bok. Następnie opuść końcówkę na powierzchnię sznurka i nakłuj oponę twardą. Następnie opuść końcówkę szklanki, pipetuj 300 mikrometrów do rdzenia kręgowego.
Wstrzyknąć jeden mikrolitr zawiesiny wirusa w tempie 200 nanolitrów na minutę. Po zakończeniu wstrzyknięcia należy odczekać co najmniej dwie minuty przed powolnym wyjęciem pipety. Powtórzyć procedurę wstrzykiwania w najbardziej rozpieszczonej części odsłoniętego rdzenia kręgowego, aby uzyskać pełną dystrybucję wektora wirusowego w segmencie rdzenia L cztery.
Dwa miejsca wstrzyknięcia znajdują się rostralnie i rozpieszczają do segmentu L cztery. Aby uniknąć uszkodzenia tkanki w okolicy docelowej po zwolnieniu wstrzyknięcia, należy wykonać jeden kręg L z zacisków z wycięciem w kształcie litery V i wyjąć mysz z ramki stereotaktycznej. Następnie zszyj powięź za pomocą pięciu oh Vicryl.
Zamknięta powięź zapewnia osłonę dla miejsca laminektomii. Następnie zamknij skórę nylonowymi szwami lub zszywkami chirurgicznymi. Zapewnij analgezję pooperacyjną przez 72 godziny z codziennymi podskórnymi wstrzyknięciami karprofenu w ilości pięciu miligramów na kilogram.
Przenieś mysz do klatki regeneracyjnej z miękką, nieszczególną ściółką. Umieść mysz z boku, aby wygodnie oddychać. Następnie monitoruj zwierzę, aż będzie w pełni czujne.
Karetka pogotowia i zaczyna pić. Monitoruj powrót do zdrowia po operacji poprzez codzienną kontrolę przez pierwsze trzy dni. Następnie co drugi dzień lub trzy dni w tygodniu, aż eksperyment zostanie zakończony.
Siedem do 10 dni po operacji, gdy gojenie się rany jest zakończone. Usuń szwy lub zszywki skórne. Rysunek ten pokazuje ekspresję wzmocnionego białka reporterowego zielonej fluorescencji lub EGFP w lewym rogu grzbietowym rdzenia kręgowego L four.
Dwa tygodnie po stereotaktycznym wstrzyknięciu neuronów R-A-A-V-E-G-F-P stwierdzono immunostaininę dla jądra neuronalnego Białko pokazane na czerwonym Grot. Wskaż rozproszone transfekowane komórki glejowe w kolumnie grzbietowej. Około 80% neuronów w przyśrodkowym rogu grzbietowym zostało zainfekowanych Z praktyką.
Zabieg można wykonać w ciągu 30 do 40 minut, należy pamiętać o zachowaniu sterylnych warunków podczas zabiegu. Po obejrzeniu tego filmu powinieneś dobrze zrozumieć, jak wykonywać iniekcje chimalne dososnowe do dawki rdzenia kręgowego myszy. Używamy tej techniki do manipulacji genami, ale można ją dostosować do innych celów, takich jak dordzeniowe stosowanie leków.
Wyświetl pełny transkrypt i uzyskaj dostęp do tysięcy filmów naukowych
Przegląd
Niniejsze badanie przedstawia metodę osiągnięcia przestrzennie ograniczonej ekspresji genów w rdzeniu kręgowym myszy poprzez stereotaktyczne wstrzyknięcie wektora wirusowego do tylnego rogu lędźwiowego. Technika ta umożliwia ukierunkowaną manipulację genami, w szczególności w obszarach kontaktów synaptycznych pomiędzy pierwotnymi aferentami somatosensorycznymi a neuronami ośrodkowego układu nerwowego.
Kluczowe elementy badania
Dziedzina nauki
- Neurobiologia
- Terapia genowa
- Badania nad rdzeniem kręgowym
Wstęp
- Wektory wirusowe są wykorzystywane do manipulacji genetycznych.
- Grzbietowy róg rdzenia kręgowego w odcinku lędźwiowym jest istotnym miejscem oddziaływań synaptycznych.
- Warunkowa ekspresja genów może pomóc w zrozumieniu mechanizmów neuronalnych.
- Iniekcja stereotaktyczna jest precyzyjną metodą celowania w konkretne obszary mózgu.
Cel badania
- Osiągnięcie ukierunkowanej ekspresji genów w rdzeniu kręgowym.
- Zbadanie wpływu manipulacji genetycznych na funkcje rdzenia kręgowego.
- Zapewnienie ram metodologicznych dla przyszłych badań.
Zastosowane metody
- Lokalizacja i odsłonięcie kręgu lędźwiowego.
- Wykonanie laminektomii w celu uzyskania dostępu do rdzenia kręgowego.
- Użycie szklanej pipety połączonej z mikropompą strzykawkową.
- Iniekcja zawiesiny wektora wirusowego do rogu tylnego.
Główne wyniki
- Pomyślne wstrzyknięcie wektora wirusowego do tylnego rogu rdzenia kręgowego w odcinku lędźwiowym.
- Obserwowana warunkowa ekspresja genów w docelowych neuronach.
- Wykazana skuteczność metody w zakresie manipulacji ograniczonych przestrzennie.
- Potencjalne zastosowania w badaniach nad zaburzeniami związanymi z rdzeniem kręgowym.
Wnioski
- Metoda ta umożliwia precyzyjną manipulację genami w rdzeniu kręgowym.
- Może być ona wykorzystywana do badania roli konkretnych genów w funkcjonowaniu neuronów.
- Podejście to może pogłębić naszą wiedzę na temat fizjologii rdzenia kręgowego.
Najczęściej zadawane pytania
Znaczenie dla Przemysłu
Stereotaktyczne dostarczanie wektorów wirusowych umożliwia precyzyjną, ograniczoną przestrzennie manipulację genami w rogu tylnym rdzenia kręgowego myszy, który jest kluczowym obszarem dla przetwarzania sensorycznego i badań nad szlakami bólowymi. Podejście to wspiera walidację celów oraz ograniczanie ryzyka mechanistycznego w odkryciach neurobiologicznych, umożliwiając warunkową ekspresję lub wyciszanie genów w określonych populacjach neuronów. Metoda ta stanowi odtwarzalną platformę do powiązania celów genetycznych z fenotypami funkcjonalnymi w przedklinicznych modelach bólu, co dostarcza informacji niezbędnych do podejmowania decyzji go/no-go w procesie selekcji celów.
Zastosowania strategiczne w badaniach i rozwoju biofarmaceutycznym
Wczesne odkrywanie i walidacja celu
- Wartość naukowa: Pozwala na weryfikację hipotez terapeutycznych poprzez umożliwienie warunkowej ekspresji genów w konkretnych populacjach neuronów rdzenia kręgowego.
- Wartość operacyjna: Zapewnia ustandaryzowane podejście chirurgiczne w celu spójnego celowania w tylny róg lędźwiowy we wszystkich badaniach.
- Wartość prognostyczna: Wspiera screening fenotypowy funkcji genów w szlakach bólowych, pomagając w ocenie pewności wyboru celu terapeutycznego.
Przesiewanie i opracowanie testu
- Wartość naukowa: Pozwala na uzyskanie mierzalnych parametrów transfekcji (np. ekspresji EGFP) w celu oceny wydajności dostarczania wektora oraz specyficzności komórkowej.
- Wartość operacyjna: Umożliwia przygotowanie zwalidowanych systemów biologicznych do dalszego screeningu związków lub modulatorów w modelach bólu.
- Skalowalność: Krótka procedura (30–40 minut) oraz szybka rekonwalescencja zwierząt wspierają zwiększenie przepustowości w procesach odkrywania leków.
Badania translacyjne i przedkliniczne
- Znaczenie dla choroby: Bezpośrednio modeluje mechanizmy bólu zapalnego i neuropatycznego, co jest zgodne z priorytetami w obszarach terapeutycznych.
- Ciągłość translacyjna: Łączy modulację celu w rdzeniu kręgowym z behawioralnymi fenotypami bólu, co wspiera walidację przedkliniczną.
- Postęp z uwzględnieniem ryzyka: Umożliwia redukcję ryzyka mechanistycznego poprzez izolację efektów specyficznych dla genu w obwodzie istotnym dla danej choroby.
Integracja potoku i przepływu pracy
Metoda ta wpisuje się w kontinuum odkrywania leków, od testowania hipotez dotyczących punktów uchwytu, poprzez identyfikację związków wiodących, aż po walidację przedkliniczną, w szczególności w odniesieniu do celów w OUN zaangażowanych w przetwarzanie sensoryczne.
- Biologia odkrywcza: Wspiera testowanie hipotez poprzez umożliwienie przestrzennie ograniczonej manipulacji genami w określonych obszarach rdzenia kręgowego.
- Przesiewanie: Zapewnia ilościowe odczyty (np. intensywność fluorescencji, wskaźniki transfekcji specyficzne dla komórek) w celu oceny wydajności wektorów i efektu biologicznego.
- Analityka: Umożliwia korelację wydajności transfekcji z wynikami funkcjonalnymi, dostarczając danych do oceny zależności dawka-odpowiedź oraz stopnia zaangażowania celu.
- Badania translacyjne: Łączy manipulacje genetyczne w rdzeniu kręgowym z fenotypami związanymi z bólem, wspierając badania przedkliniczne zgodne z biomarkerami.
- Ponowne wykorzystanie w przedsiębiorstwie: Tworzy wielokrotnego użytku platformę chirurgiczną, którą można dostosować do różnych wektorów wirusowych, promotorów lub transgenów w wielu projektach.
Wpływ operacyjny i przedsiębiorstwowy
- Wartość naukowa: Zwiększa pewność prognostyczną poprzez redukcję efektów poza celowych oraz zwiększenie precyzji anatomicznej w badaniach nad manipulacją genetyczną.
- Wartość operacyjna: Wspiera powtarzalność dzięki standaryzacji współrzędnych stereotaktycznych, parametrów iniekcji oraz opieki pooperacyjnej.
- Wartość strategiczna: Usprawnia podejmowanie decyzji o kontynuacji lub przerwaniu badań (go/no-go) poprzez zapewnienie jasności mechanistycznej w zakresie funkcji celu w ścieżkach bólowych.
- Wpływ na portfolio: Ułatwia priorytetyzację celów z uwzględnieniem ryzyka w oparciu o zwalidowane fenotypy rdzenia kręgowego.
Uwagi dotyczące wdrożenia
- Wymaga doświadczenia w przeprowadzaniu zabiegów stereotaksycznych u gryzoni, technik mikrosurgicalnych oraz zachowania procedur aseptycznych.
- Zależy od specjalistycznego oprzyrządowania, w tym od aparatu stereotaksycznego, pompy mikrostrzykawkowej oraz szklanych pipet ściętych.
- Wymaga ustandaryzowanego przygotowania wektorów wirusowych i weryfikacji miana w celu zapewnienia spójnego dawkowania w poszczególnych eksperymentach.
- Wiąże się z koniecznością dostosowania parametrów do różnych odcinków rdzenia kręgowego, serotypów wirusowych lub ładunków transgenów.
- Ograniczenia praktyczne obejmują zmienność chirurgiczną oraz odpowiedź tkankową, które należy kontrolować poprzez szkolenie operatora i standaryzację protokołu.
