Długotrwałe wyciszanie intersectin-1 w płucach myszy poprzez wielokrotne dostarczanie specyficznego siRNA przez kationowe liposomy. Ocena efektów knockdown za pomocą mikroskopii elektronowej

Ogólnym celem następującego eksperymentu jest ocena wpływu długotrwałego wyciszenia ekspresji genu intersecting one s na strukturę i funkcję płuc myszy. Jest to realizowane poprzez przygotowanie specyficznych kompleksów liposomalnych duplex INA w celu ukierunkowania ich na naczynia krwionośne płuc myszy w drugim etapie. Kompleksy liposomalne INA są podawane drogą iniekcji zaocznej, a zabieg ten jest powtarzany co 72 godziny przez 24 kolejne dni, aby uzyskać wydajną inhibicję ekspresji intersecting one S'S.

Następnie pobiera się próbki tkanki płuc wstrzykniętych myszy do analiz biochemicznych oraz badań EM, aby ocenić poziom białka i mRNA intersectin 1 oraz przeprowadzić szczegółowe analizy morfologiczne płuc. Wyniki uzyskane metodą western blot lizatów płuc z zastosowaniem specyficznych przeciwciał przeciwko intersectin 1 oraz analizy Q-R-T-P-C-R wykazują specyficzny i efektywny knockdown intersectin 1 przez 24 kolejne dni. Główną zaletą tej techniki w porównaniu z istniejącymi metodologiami, takimi jak rymery czy lentiwirusy, jest fakt, że dostarczanie liposomów onic do płuc jest powtarzalne, bezpieczne, nietoksyczne i wysoce skuteczne w śródbłonku płuc.

Pomysł na tę metodę pojawił się, gdy postanowiliśmy ocenić w żywych organizmach efekty przecinania N down, a inne metody dostarczania SRNA okazały się nieskuteczne. Aby przygotować liposomy onic, do kolby okrągłogrzasnej należy dodać 315 µL roztworu zapasowego bromku dimetyldiodosalanu amonu, czyli DOAB, a następnie 200 µL roztworu zapasowego cholesterolu oraz 9,5 mL chloroformu, mieszając całość poprzez okrężne potrząsanie. Kolbę należy podłączyć do rotacyjnego odparowacza ustawionego na 37 °C i prędkość 100 lub więcej obrotów na minutę.

Całkowicie otwórz pierwszy zawór argonu, przekręcając go zgodnie z ruchem wskazówek zegara. Zawsze otwieraj i zamykaj ten zawór w pierwszej kolejności. Drugi zawór reguluje ciśnienie argonu wdmuchiwanego do kolby.

Otwórz go częściowo, aby zapewnić łagodne ciśnienie. Gdy suchy lód zacznie skapywać na rurkę łączącą zbiornik z gazem argonem z roto-waporyzatorem, opuść roto-waporyzator do łaźni wodnej, aż kolba dotknie wody, nie będąc całkowicie zanurzoną. Przekręć pokrętło prędkości do 100–120 RPM. Gdy cały chloroform w kolbie wyparuje, zatrzymaj urządzenie.

Ustaw pokrętło prędkości rotavapora na zero i zamknij zawory zbiornika z argonem. Wyjmij kolbę. Dodaj dwa mililitry 5% roztworu glukozy do kolby, aby resuspenderć lipidy.

Używając końcówki do pipety o pojemności 1 ml, dokładnie zeskrob dno kolby, aby rozpuścić wszystkie lipidy. Inkubuj otrzymany roztwór w łaźni wodnej o temperaturze 42 °C przez jedną godzinę, powoli mieszając kolbę na vortexie. Sonicuj roztwór przez co najmniej 20 do 30 minut, trzymając kolbę pionowo tak, aby jej dno zaledwie dotykało zimnej wody w kąpieli ultradźwiękowej.

Następnie podgrzewaj kolbę w łaźni wodnej rotacyjnego parownika przez 20 minut w temperaturze 42 °C przy prędkości obrotowej zero, z dnem kolby zanurzonym w wodzie. Przefiltruj liposomy przez filtr strzykawkowy 0,47 µm, a następnie przez filtr strzykawkowy 0,22 µm. Używając małego ekstrudera, przefiltruj liposomy przez membranę 50 nm, aby uzyskać homogeniczną populację jednowarstwowych pęcherzyków liposomowych.

Przenieść liposomy do probówki typu Eppendorf i umieścić na lodzie. Przygotować kompleksy liposomów z irna ITSN w stosunku ośmiu moli liposomów na dwa mikrogramy RNA. W tym przykładzie użyto 50 µL I-A-I-T-S-N.

Z roztworu zapasowego o stężeniu 50 µM dodaje się odpowiednią ilość do 100 µL świeżo przygotowanych liposomów, używając probówki EOR wolnej od RNA i DNA. Mieszaninę należy przechowywać w lodzie do momentu wstrzyknięcia myszom. Myszy wykorzystane w tym badaniu mają około od czterech do sześciu tygodni i ważą około 25 g.

Przed wstrzyknięciem należy potwierdzić za pomocą odruchu z uciśnięcia palca u stopy, że zwierzę jest całkowicie znieczulone. Do podania preparatu należy użyć jednofazowych strzykawek tuberkulinowych o pojemności 1 ml z przymocowaną igłą. Trzymając mysz za uszy, należy obrócić ją na bok, aby odsłonić wewnętrzny kącik oka.

Kieruj igłę przyśrodkowo w stosunku do półksiężycowatych fałdów PIKA, unikając dotknięcia gałki ocznej. Podejdź do kąta łzowego oka załadowaną strzykawką pod kątem 45 stopni we wszystkich trzech osiach. Powoli wstrzyknij mieszaninę, przenieś mysz z powrotem do klatki i pozwól jej dojść do siebie z wstrzykniętej strony.

Myszy podawano SIR NA skierowany przeciwko genowi ITSN1 co 72 godziny przez 24 dni. Aby rozpocząć tę procedurę, należy upewnić się, że mysz jest w pełni znieczulona, co potwierdza brak odruchu wycofania. Następnie należy wykonać laparotomię i wyciąć przeponę.

Następnie wykonaj torakotomię, aby odsłonić płuca i serce. Usuń grasicę, korzystając z mikroskopu StereoZoom w celu zapewnienia większej precyzji. Wprowadź cewnik do tętnicy płucnej.

Następnie wykonaj tracheotomię i zaintubuj mysz przez otwór w tchawicy. Ustaw respirator na częstotliwość 150 oddechów na minutę i objętość oddechową 150 µL. W celu odprowadzenia cieczy otwórz lewy przedsionek, stosując pompę perystaltyczną ustawioną na 1,5 mL/min oraz podgrzany do 37 °C roztwór Hanksa.

Przez pięć minut przepłucz naczynia krwionośne płuc myszy w celu usunięcia krwi, a następnie przez 10 minut wykonaj perfuzję z użyciem znacznika. Po wypłukaniu niezwiązanego znacznika przeprowadź utrwalanie płuc in situ poprzez 10-minutową perfuzję 4% formaldehydem, 2,5% aldehydem glutarowym i 1% kwasem taninowym. Pobierz płuca i usuń nadmiar tkanki.

Płuca należy pociąć na małe bloczki i przenieść je do oznakowanej fiolki scyntylacyjnej zawierającej dwa mililitry mieszaniny utrwalającej. Aby rozpocząć przygotowanie tkanki płucnej do mikroskopii elektronowej, w pierwszej kolejności bloczki płuc należy krótko przemyć trzy razy w 0,1 molarnym buforze cytrynianowym sodu.

Następnie utrwal preparaty w 4% aldehydzie i 2,5% glutaraldehydzie w 0,1 buforze Pipee przez jedną godzinę w temperaturze pokojowej, a następnie przeprowadź postutrwalanie 1% osmem Pilate przez jedną godzinę w dygestorium na lodzie w ciemności, po uprzednim jednokrotnym przepłukaniu buforem Callen burgera. Inkubuj preparaty w buforze Callen burgera przez dwie godziny lub przez noc w temperaturze pokojowej. Przepłucz jednokrotnie w 50% etanolu, a następnie odwodnij za pomocą serii rozcieńczeń etanolu.

70% etanol przez pięć minut, 95% etanol przez pięć minut, a następnie dwukrotnie w 100% etanolu po 15 minut każdorazowo. Następnie przejść do 100% tlenku propylenu na dwie 15-minutowe inkubacje.

Usunąć tlenek propylenu i dodać mieszaninę 50% tlenku propylenu i 50% eponu. Inkubować przez noc, obracając na wirówce w temperaturze pokojowej. Następnego ranka usunąć mieszaninę i dodać świeży epon. Pozostawić na co najmniej cztery do pięciu godzin na wirówce.

Wybrane preparaty umieść w podwójnych stożkowych formach wypełnionych do połowy świeżą żywicą 100% Epon 812. Rozmieść je przy krawędziach, przenieś formy do inkubatora ustawionego na 60°C i pozostaw do utwardzenia na 48 do 72 godzin. Przewlekła inhibicja ekspresji ITSN1 przez 21 kolejnych dni poprzez powtarzane podawanie kompleksów liposomalnych siRNA przeciwko ITSN1 prowadzi do znacząco niższego poziomu białka ITSN1 w płucach myszy, co pokazują te reprezentatywne wyniki; lizaty płuc od kontroli nieleczonej oraz od myszy leczonych poddano analizie Western blot z użyciem przeciwciał przeciwko ITSN1 i aktynie w kilku punktach czasowych po podaniu siRNA, zgodnie z oznaczeniami.

Analiza densytometryczna reprezentatywnych obrazów z testu Western blot błon CL oraz ilościowy RT-PCR mRNA I TSN one s dodatkowo potwierdzają, że traktowanie kompleksami liposomalnymi siRNA I TSN one s skutecznie obniża poziom białka I TSN one s w płucach myszy. Spadek poziomu intersect in one prowadzi do zaburzeń endocytozy i transportu śródbłonkowego, co skutkuje rozszczelnieniem bariery śródbłonkowej i obrzękiem płuc. Te reprezentatywne mikrografie elektronowe tkanki płucnej pokazują otwarte połączenia międzykomórkowe śródbłonka lub IJs, oznakowane na całej ich długości cząsteczkami albuminy znakowanymi złotem o rozmiarze 8 nm.

Panel A1 stanowi powiększenie panelu A; groty strzałek wskazują na trzy do czterech cząsteczek złotej albuminy zlokalizowanych blisko siebie w tej samej płaszczyźnie, co świadczy o szerokim otwarciu IEJ. Cząsteczki złota są również powiązane z abluminalnym wyjściem IJ, wskazanym strzałkami na panelach A1 i B. Należy również zwrócić uwagę na ograniczoną liczbę CVE A oraz rozszerzenie przestrzeni okołokapilarnej oznaczone gwiazdką w panelu A; gwałtowna downregulation ekspresji intersectin 1 spowodowała upregulację alternatywnych szlaków transportu w celu zrekompensowania deficytowej endocytozy.

Te obrazy EM przedstawiają pierścienie błonowe na panelach A i A, pleomorficzne cewki na panelu B oraz powiększone endosomy zlane z typowymi cve LA na panelu C, aktywnie zaangażowane w wychwyt i transport albuminy znakowanej złotem. Zaobserwowano również silne rozszerzenie przestrzeni okołonaczyniowej oraz obrzęk białkowy. Przedłużona inhibicja intersect w jednej ekspresji przez 24 dni zmniejsza obrzęk płuc u myszy poprzez częściowe przywrócenie integralności bariery śródbłonkowej.

Badania morfologiczne z wykorzystaniem mikroskopii elektronowej (EM) wykazały, że marker albuminy znakowany złotem o rozmiarze 8 nm nie był w tym punkcie czasowym w stanie przeniknąć przez połączenia międzykomórkowe (IEJ), lecz zamiast tego tworzył pozostałości filtracyjne w świetle wejścia do połączenia wskazanego grotem strzałki. Jednakże przestrzenie okołynaczyniowe (PVS) wykazywały pewne rozszerzenie i lekki obrzęk, co sugeruje, że połączenia są nieprzepuszczalne dla cząsteczek tej wielkości, ale wciąż nieszczelne ciała wielopęcherzykowe (MVB) w bezpośrednim sąsiedztwie błony plazmatycznej mają część swoich wewnętrznych małych pęcherzyków znakowanych cząsteczkami albuminy ze złotem 8 nm. Niniejsza tabela przedstawia liczbę endocytowych struktur transcytotycznych w śródbłonku płuc myszy kontrolnych i deficientnych.

Istotnym odkryciem jest spadek liczby kawieoli w śródbłonku płuc myszy z niedoborem ITSN1. Przewlekłe hamowanie ekspresji ITSN1 spowodowało aktywację alternatywnych szlaków endocytozy i częściowo zmniejszyło liczbę kawieoli, czyli liczebność membranowych pierścieni lub cewek znakowanych cząsteczkami albuminy z goldem. W śródbłonku płuc myszy z przewlekłym niedoborem ITSN1 odnotowano również 14-krotny wzrost w porównaniu z grupą kontrolną.

Po przeprowadzeniu tej procedury można zastosować inne metody, takie jak test ELISA z użyciem lizatów płuc myszy, w celu ilościowej oceny transportu transendotelialnego różnych znaczników hnic. Po obejrzeniu tego filmu powinni Państwo posiadać gruntowną wiedzę na temat tego, jak specyficznie dostarczyć kompleksy liposomów onic i SRNA do endotelium płuc myszy, aby wyciszyć ekspresję interesującego białka i ocenić jego funkcję.