Name: Długotrwałe wyciszanie intersectin-1 w płucach myszy poprzez wielokrotne dostarczanie specyficznego siRNA przez kationowe liposomy. Ocena efektów knockdown za pomocą mikroskopii elektronowej (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-06-21T13:00:00.000+00:00
Duration: 15 min 55 s
Description: Poznaj metodę długotrwałego wyciszania intersectin-1 w płucach myszy przy użyciu kationowych liposomów z siRNA. Technika obejmuje wielokrotne wstrzyknięcia retroorbitalne co 72 godziny przez 24 dni, co skutkuje redukcją poziomów mRNA i białka ITSN-1s o 75%.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Ta praca była wspierana przez Granty Narodowego Instytutu Zdrowia R01HL089462 dla SP.

1. Przygotowanie liposomów kationowych
<ol>
 <li>Autoklawować czystą kolbę okrągłodenną, która ma być używana do przygotowania lipososmów.</li>
 <li>Przygotować roztwory podstawowe:
 <ol class="lalpha">
 <li>- Rozpuścić 200 mg bromku dimetylodioctadecyloamoniowego (DOAB) w 10 ml chloroformu za pomocą małej szklanej butelki.</li>
 <li>- Rozpuść 200 mg cholesterolu w 10 ml chloroformu za pomocą małej szklanej butelki.</li>
 <li>- Przygotowanie i autoklaw w celu sterylizacji 5% glukozy w 100 ml wody destylowanej wolnej od RNA/DNA-azy.</li>
 </ol>
 </li>
 <li>Przepłukać kolbę okrągłodenną chloroformem. Dodać 5-10 ml do kolby, zamieszać i odstawić na kilka minut. Kolbę należy zawsze przykryć folią aluminiową. Opróżnić chloroform z kolby.</li>
 <li>Przygotowanie liposomów:
 <ol class="lalpha">
 <li>- Dodać 315 μl roztworu podstawowego DOAB do kolby okrągłodennej.</li>
 <li>- Dodać 200 μl podstawowego roztworu cholesterolu do kolby.</li>
 <li>- Dodać 9,5 ml chloroformu do kolby i wymieszać przez zawirowanie.</li>
 </ol>
 </li>
 <li>Ustawić rotavapor na 37 °C, 100 obrotów na minutę (rpm) lub więcej (100-120 rpm). Wyparka rotaparowa powinna być podłączona do regulatora podciśnienia pompy wodnej z prawidłowo podłączoną rurą ssącą.</li>
 <li>Podłącz zbiornik argonu i rotavapor.</li>
 <li>Przymocować kolbę do rotavapor i wyregulować optymalne ustawienia przed opuszczeniem jej do łaźni wodnej. Całkowicie otwórz pierwszy zawór argonu, obracając go w kierunku przeciwnym do ruchu wskazówek zegara. Zawsze najpierw otwieraj i zamykaj ten zawór. Drugi zawór steruje ciśnieniem argonu wdmuchiwanego do kolby. Nacisk powinien być zawsze delikatny.</li>
 <li>Obniż rotavapor w łaźni wodnej na tyle, aby kolba dotknęła wody bez całkowitego zanurzenia i włącz prędkość.</li>
 <li>Poczekaj, aż cały chloroform odparuje, około 10 minut. Następnie zatrzymaj maszynę.</li>
 <li>Wyłącz prędkość obrotową pary i zawory zbiornika argonu. Teraz kolbę należy wyjąć.</li>
 <li>Dodać 2 ml 5% glukozy do kolby w celu rozpuszczenia lipidów.</li>
 <li>Dokładnie zdrapać dno kolby za pomocą końcówki pipety o pojemności 1 ml w celu rozpuszczenia wszystkich lipidów. Po zeskrobaniu, usunąć resztki lipidów z końcówki o pojemności 1 ml do kolby, jeśli to konieczne, za pomocą drugiej końcówki.</li>
 <li>Otrzymany roztwór inkubować w łaźni wodnej o temperaturze 42 °C, powoli wirując (15 obr./min) kolbę.</li>
 <li>Napełnij sonikatora zimną wodą. Sonikować roztwór przez co najmniej 20-30 minut z kolbą podniesioną do góry, a dno ledwo dotyka wody.</li>
 <li>Podgrzewać kolbę w łaźni wodnej rotoparownicy przez 20 minut w temperaturze 42 °C, przy zerowej prędkości, tym razem z okrągłym dnem zanurzonym w wodzie.</li>
 <li>Przefiltruj liposomy przez filtry strzykawkowe o wielkości 0,47 mikrona, a następnie o średnicy 0,22 mikrona.</li>
 <li>Za pomocą małej wytłaczarki przefiltruj liposomy przez membranę 50 nm, aby wygenerować jednorodną populację jednowarstwowych pęcherzyków liposomowych.</li>
 <li>Przenieś liposomy do probówki Eppendorfa i umieść ją na lodzie.</li>
</ol>
2. Przygotuj liposomy: kompleksy siRNA-ITSN-1
<ol>
 <li>Zawiesić siRNAITSN myszy w buforze siRNA zawierającym 20 mM HEPES i 150 mM chlorku sodu o pH 7,4 do końcowego stężenia 2 μg/μl. Trzymaj go na lodzie przed wymieszaniem.</li>
 <li>Przygotuj liposomy: kompleksysiRNA ITSN w stosunku 8 liposomów nmol: 2 μg RNA (lub liposomy 400 nmol: 100 μg siRNAITSN). W niniejszym badaniu dodaliśmy 50 μl siRNAITSN z roztworu podstawowego (50 μM) do 100 μl świeżo przygotowanych liposomów za pomocą probówki Eppendorfa wolnej od RNA / DNA-azy. Należy pamiętać, że stężenie siRNAITSN jest bardzo ważne, ponieważ jednorazowo można wstrzyknąć myszy maksymalnie 150 μl mieszaniny.</li>
 <li>Trzymaj mieszaninę na lodzie, czekając na wstrzyknięcie myszom.</li>
</ol>
3. Wstrzyknięcie żyły zaoczodołowej myszy (wewnętrzny kąt oczodołu)
Wszystkie eksperymenty na myszach zostały zatwierdzone i przeprowadzone zgodnie z wytycznymi Komitetu ds. Opieki i Użytkowania Zwierząt Uniwersytetu Rush.
<ol>
 <li>Znieczulić mysz przez dootrzewnowe wstrzyknięcie ketaminy 50 mg/kg masy ciała i 5 mg/kg masy ciała ksylazyny (mieszanina dostępna w handlu). W zależności od masy ciała i wieku zwierzęcia dostosuj objętość i stężenie środków znieczulających. Myszy użyte w badaniu to samce myszy CD1 w wieku 6-8 tygodni i ważące około 25 gramów. Strzykawki są tuberkulinowe typu 1 ml z dołączoną igłą.</li>
 <li>Przytrzymaj uszy myszy jedną ręką i obróć mysz w bok, aby odsłonić wewnętrzny kąt oka. Celuj przyśrodkowo do plica semilunaris; Unikaj dotykania gałki ocznej.</li>
 <li>Zbliżyć się do karunku łzowego oka, trzymając strzykawkę zawierającą mieszaninę pod kątem 45 stopni we wszystkich trzech osiach.</li>
 <li>Powoli wstrzyknąć mieszaninę i pozwolić myszy dojść do siebie wstrzykniętą stroną do góry. Jeśli w miejscu wkłucia igły utworzy się duża kropla płynu, wycofaj igłę, odessaj kroplę do strzykawki i spróbuj ponownie. Wielokrotne wstrzyknięcia najlepiej wykonywać naprzemiennie w oczach, aby umożliwić doskonałą regenerację. Jeśli nie masz pewności, technikę tę można sprawdzić, wstrzykując niebieski barwnik (50 μl, 0,5% fioletu krystalicznego w metanolu) i wystawiając płuca myszy na obserwację niebieskiego układu naczyniowego.</li>
 <li>Myszom w tym badaniu wstrzykiwano je co 3dni przez 3 tygodnie bez ofiar śmiertelnych lub działań niepożądanych.</li>
</ol>
4. Perfuzja płuc myszy i pobieranie tkanek do badań biochemicznych
<ol start="0">
 <li>Ustawić pompę perystaltyczną tak, aby pracowała z prędkością 1,5 ml/min.</li>
 <li>Przygotuj nasadę: respirator, stół operacyjny, instrumenty, sterylne waciki, patyczki higieniczne, sznurki, zlewki, woda destylowana, zrównoważona sól Hanka, znacznik.</li>
 <li>Znieczulić mysz przez dootrzewnowe wstrzyknięcie mieszaniny znieczulenia (100 mg/kg masy ciała ketaminy i 10 mg/kg masy ciała ksylazyny).</li>
 <li>Na poziomie szyi usuń gruczoły ślinowe i odsłoń tchawicę.</li>
 <li>Zacznij od laparotomii, wytnij przeponę, a następnie torakotomię, odsłaniając płuca i serce.</li>
 <li>Usuń grasicę.</li>
 <li>Korzystając z mikroskopii świetlnej dla lepszej dokładności, cewnikuj tętnicę płucną.</li>
 <li>Wykonaj tracheostomię i zaintubuj mysz za pomocą tracheostomii. Ustaw wentylator na szybkość 150 uderzeń/min i objętość wyrzutową 150 μl.</li>
 <li>Jako wylot otwórz lewe przedsionek.</li>
 <li>Ukrwić naczynia krwionośne płuc myszy z krwi przez 5 minut, używając pompy perystaltycznej i roztworu Hanka ogrzanego w temperaturze 37 °C.</li>
 <li>Perfuzjuj znacznik (8 nm złota albumina16) przez dodatkowe 10 minut przy tym samym natężeniu przepływu.</li>
 <li>Przepłukać niezwiązany znacznik przez 5 minut perfuzji płuc roztworem Hanka.</li>
 <li>Następnie utrwalić płuca in situ przez 10-minutową perfuzję 4% (wag./obj.) formaldehydu, 2,5% aldehydu glutarowego i 1% kwasu garbnikowego w buforze 0,1 PIPES, pH 7,2.</li>
 <li>Zebrać płuca, usunąć nadmiar tkanki, odciąć małe bloki (3/3 mm) i umieścić je w oznakowanej fiolce scyntylacyjnej zawierającej 2 ml mieszaniny utrwalającej. </li>
</ol>
 
Myszy umrą w pełni znieczulone podczas zabiegu.
5. Przetwarzanie tkanki płucnej myszy dla EM
<ol>
 <li>Przygotuj roztwory podstawowe: 1% Palade OsO4, octan weronalu i bufor Kellenbergera.
 <ol class="lalpha">
 <li>- 1% bufor Palade-OsO4 zawiera: 1 ml octanu bulionu weronalnego, 1,25 ml 4% OsO4, 1 ml 0,1 N kwasu solnego oraz wodę destylowaną do 5 ml końcowej objętości.</li>
 <li>- Roztwór podstawowy octanu weronalu otrzymuje się przez rozpuszczenie 1,15 g octanu sodu andydrou i 2,94 g barbitalu w 100 ml wody destylowanej.</li>
 <li>-Roztwór Kellenbergera zawiera 2 ml octanu weronalu, 2,8 ml 0,1 N kwasu solnego, 0,05 g octanu uranylu i 5,1 ml wody destylowanej o pH = 6.</li>
 </ol>
 </li>
 <li>Przemyć bloki płuc w 0,1 M buforze kakodylanu sodu o pH = 7,4, krótko 3 razy.</li>
 <li>Utrwalić próbki w 4% (wag./obj.) formaldehydzie, 2,5% aldehydu glutarowego w buforze 0,1 PIPES, pH 7,2, przez 1 godzinę, w temperaturze pokojowej.</li>
 <li>Post-fix z 1% Palade-Osmium przez 1 godzinę w kapturze, na lodzie, w ciemności.</li>
 <li>Spłukać raz buforem Kellenbergera.</li>
 <li>Próbki należy inkubować w buforze Kellenbergera przez 2 godziny do nocy, w temperaturze pokojowej.</li>
 <li>Spłucz raz w 50% etanolu.</li>
 <li>Odwodnić stopniowaną serią etanolu, 5 min/każda: 70%, 95%, a następnie 2 x 15 min 100% etanolu.</li>
 <li>Przełącz się na 100% tlenek propylenu, 2 x 15 min.</li>
 <li>Usuń tlenek propylenu i dodaj mieszaninę 50% tlenku propylenu i 50% Epon 812, inkubuj przez noc, obracając się na kołu, w temperaturze pokojowej.</li>
 <li>Następnego ranka usuń mieszaninę i dodaj świeży Epon 812, przynajmniej na 4-5 godzin na kole.</li>
 <li>Za pomocą podwójnie stożkowych foremek, wypełnionych do połowy świeżym 100% Epon 812, dodaj wybrane próbki i umieść je na krawędziach.</li>
 <li>Przenieść formy do inkubatora ustawionego w temperaturze 60 °C i pozostawić do utwardzenia przez 48-72 godziny.</li>
 <li>Po polimeryzacji wyślij bloki do cienkich (60-70 nm grubości) przekrojów.</li>
</ol>

<ol><li>Predescu, S. A., Predescu, D. N., Knezevic, I., Klein, I. K., Malik, A. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intersectin-1s+regulates+the+mitochondrial+apoptotic+pathway+in+endothelial+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biol.+Chem%22%5BJournal%5D)">Intersectin-1s regulates the mitochondrial apoptotic pathway in endothelial cells.</a> J. Biol. Chem. 282 (282), 17166-17178 (2007).</li>
<li>Uddin, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cationic+lipids+used+in+non-viral+gene+delivery+systems%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechnology+and+Molecular+Biology+Review%22%5BJournal%5D)">Cationic lipids used in non-viral gene delivery systems.</a> Biotechnology and Molecular Biology Review. 2 (2), 58-67 (2007).</li>
<li>Barenholz, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Influence+of+lipid+composition+on+the+thermotropic+behavior+and+size+distribution+of+mixed+cationic+liposomes%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Colloid+Interface+Sci%22%5BJournal%5D)">Influence of lipid composition on the thermotropic behavior and size distribution of mixed cationic liposomes.</a> J. Colloid Interface Sci. (356), 46-53 (2011).</li>
<li>Predescu, D. N., Neamu, R., Bardita, C., Wang, M., Predescu, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Impaired+caveolae+function+and+upregulation+of+alternative+endocytic+pathways+induced+by+experimental+modulation+of+intersectin-1s+expression+in+mouse+lung+endothelium%5BTitle%5D)+AND+%22Biochem.+Res.+Int.%22%5BJournal%5D)">Impaired caveolae function and upregulation of alternative endocytic pathways induced by experimental modulation of intersectin-1s expression in mouse lung endothelium.</a> Biochem. Res. Int.. (2012), 672705(2012).</li>
<li>Higuchi, Y., Kawakami, S., Hashida, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Strategies+for+in+vivo+delivery+of+siRNAs%3A+recent+progress%5BTitle%5D)+AND+%22BioDrugs%22%5BJournal%5D)">Strategies for in vivo delivery of siRNAs: recent progress.</a> BioDrugs. 24 (24), 195-205 (2010).</li>
<li>Caracciolo, G., Amenitsch, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cationic+liposome%2FDNA+complexes%3A+from+structure+to+interactions+with+cellular+membranes%5BTitle%5D)+AND+%22Eur.+Biophys.+J%22%5BJournal%5D)">Cationic liposome/DNA complexes: from structure to interactions with cellular membranes.</a> Eur. Biophys. J. , (2012).</li>
<li>Barnier Quer, C., Elsharkawy, A., Romeijn, S., Kros, A., Jiskoot, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cationic+liposomes+as+adjuvants+for+influenza+hemagglutinin%3A+more+than+charge+alone%5BTitle%5D)+AND+%22Eur.+J.+Pharm.+Biopharm%22%5BJournal%5D)">Cationic liposomes as adjuvants for influenza hemagglutinin: more than charge alone.</a> Eur. J. Pharm. Biopharm. 81 (81), 294-302 (2012).</li>
<li>Rai, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Liposomal+delivery+of+MicroRNA-7-expressing+plasmid+overcomes+epidermal+growth+factor+receptor+tyrosine+kinase+inhibitor-resistance+in+lung+cancer+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Cancer+Ther%22%5BJournal%5D)">Liposomal delivery of MicroRNA-7-expressing plasmid overcomes epidermal growth factor receptor tyrosine kinase inhibitor-resistance in lung cancer cells.</a> Mol. Cancer Ther. (10), 1720-1727 (2011).</li>
<li>McLean, J. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Organ-specific+endothelial+cell+uptake+of+cationic+liposome-DNA+complexes+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Am.+J.+Physiol%22%5BJournal%5D)">Organ-specific endothelial cell uptake of cationic liposome-DNA complexes in mice.</a> Am. J. Physiol. (273), H387-H404 (1997).</li>
<li>Soutschek, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Therapeutic+silencing+of+an+endogenous+gene+by+systemic+administration+of+modified+siRNAs%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Therapeutic silencing of an endogenous gene by systemic administration of modified siRNAs.</a> Nature. (432), 173-178 (2004).</li>
<li>Barenholz, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Liposomes+enhance+bioremediation+of+oil-contaminated+soil%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Liposome+Res%22%5BJournal%5D)">Liposomes enhance bioremediation of oil-contaminated soil.</a> J. Liposome Res. (13), 1-8 (2003).</li>
<li>Zamboni, W. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Liposomal%2C+nanoparticle%2C+and+conjugated+formulations+of+anticancer+agents%5BTitle%5D)+AND+%22Clin.+Cancer+Res%22%5BJournal%5D)">Liposomal, nanoparticle, and conjugated formulations of anticancer agents.</a> Clin. Cancer Res. (11), 8230-8234 (2005).</li>
<li>Newman, M. S., Colbern, G. T., Working, P. K., Engbers, C., Amantea, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparative+pharmacokinetics%2C+tissue+distribution%2C+and+therapeutic+effectiveness+of+cisplatin+encapsulated+in+long-circulating%2C+pegylated+liposomes+%28SPI-077%29+in+tumor-bearing+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Chemother+Pharmacol%22%5BJournal%5D)">Comparative pharmacokinetics, tissue distribution, and therapeutic effectiveness of cisplatin encapsulated in long-circulating, pegylated liposomes (SPI-077) in tumor-bearing mice.</a> Cancer Chemother Pharmacol. (43), 1-7 (1999).</li>
<li>Martino, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Efficient+siRNA+delivery+by+the+cationic+liposome+DOTAP+in+human+hematopoietic+stem+cells+differentiating+into+dendritic+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biomed.+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Efficient siRNA delivery by the cationic liposome DOTAP in human hematopoietic stem cells differentiating into dendritic cells.</a> J. Biomed. Biotechnol. (2009), 410260(2009).</li>
<li>Zhang, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+delivery+system+targeting+bone+formation+surfaces+to+facilitate+RNAi-based+anabolic+therapy%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Med%22%5BJournal%5D)">A delivery system targeting bone formation surfaces to facilitate RNAi-based anabolic therapy.</a> Nat. Med. 18 (18), 307-314 (2012).</li>
<li>Predescu, D., Palade, G. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Plasmalemmal+vesicles+represent+the+large+pore+system+of+continuous+microvascular+endothelium%5BTitle%5D)+AND+%22Am.+J.+Physiol%22%5BJournal%5D)">Plasmalemmal vesicles represent the large pore system of continuous microvascular endothelium.</a> Am. J. Physiol. (265), H725-H733 (1993).</li>
<li>Koh, T. W., Verstreken, P., Bellen, H. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dap160%2Fintersectin+acts+as+a+stabilizing+scaffold+required+for+synaptic+development+and+vesicle+endocytosis%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Dap160/intersectin acts as a stabilizing scaffold required for synaptic development and vesicle endocytosis.</a> Neuron. (43), 193-205 (2004).</li>
<li>Miyawaki-Shimizu, K., et al. Lung Cell Mol. Physiol. (290), L405-L413 (2006).</li>
</ol>

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Opierając się na wcześniejszych badaniach opublikowanych przez innych9 i nas1, 18 opracowaliśmy tę metodologię długoterminowego knockdown ITSN-1 in vivo poprzez wielokrotne podawanie dożylne (co 72 godziny, przez 24 kolejne dni) specyficznych kompleksów siRNA / liposomów. To eksperymentalne podejście jest skuteczne, może być stosowane bezpiecznie i wielokrotnie, a także może być łatwo rozszerzone w celu zbadania udziału genu kodującego dowolne białko będące przedmiotem zainteresowania w śró...

Nagie siRNA nie może przeniknąć przez błonę komórkową, będąc naładowanym ujemnie, i łatwo ulega degradacji przez enzymy we krwi, tkankach i komórkach. Nawet przy niedawnych modyfikacjach strukturalnych mających na celu poprawę stabilności, akumulacja siRNA w miejscu docelowym po podaniu jest niezwykle niska i wymaga wydajnego nośnika wewnątrzkomórkowego5. Liposomy kationowe okazały się bezpiecznymi nośnikami kwasów nukleinowych z potencjałem do przenoszenia dużych fragmentów DNA/RNA do komórek poprzez enkapsulację i ochronę kwasów nukleinowych przed degradacją enzymatyczną6. Ponadto liposomy kationowe spontanicznie oddziałują z DNA/RNA, promując w ten sposób transfer genów do komórek2. Ostatnio liposomy zostały zastosowane do dostarczania szczepionek i leków o niskiej masie cząsteczkowej7. Liposomalne dostarczanie plazmidu z ekspresją mikroRNA-7 pokonuje oporność receptora naskórkowego czynnika wzrostu na inhibitory kinazy tyrozynowej w komórkach raka płuc8. W przypadku celowania w śródbłonek naczyniowy dostarczanie dożylne jest niezbędne, ponieważ jest mało prawdopodobne, aby kompleksy przekroczyły barierę śródbłonka i wynaczyniły się do śródmiąższu9. W porównaniu z innymi narządami, EC z mikrokrążenia płuc mają największy wychwyt i zachłannie internalizują liposom kationowym i kompleksy DNA/RNA, a następnie węzły chłonne i łaty Peyera9. Udowodniono, że dożylne podawanie siRNA w modelach gryzoni za pomocą iniekcji zaoczodołowych lub żył ogonowych jest nieszkodliwe nawet w wysokich stężeniach, takich jak 50 mg/kg10. W opublikowanym piśmiennictwie skład liposomów kationowych różni się w zależności od preparatu lipidów i ich stosunku równomolowego11, 12. Istnieje szeroki wachlarz potencjalnych zastosowań wykorzystujących liposomy kationowe do dostarczania genów in vivo, niezależnie od tego, czy chodzi o regulację w dół/nadmierną ekspresję białek, dostarczanie szczepionek czy terapie przeciwnowotworowe13-15. Ważne jest, aby pamiętać, że wydajność interakcji DNA/RNA-błona komórkowa jest regulowana przez sprzężenie kształtu między generowanymi kompleksami a lipidami błonowymi. Sugeruje to, że dostosowanie składu lipidów do docelowych profili błony komórkowej może być korzystne i skutkować wysokimi wskaźnikami transfekcji w określonym typie komórki6.

<table><tbody><tr><td>Bromek dimetylodioctadecylu amonu (DOAB)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D2779</td><td></td></tr><tr><td>Stabilizator LiposoFast (mini-ekstruder)</td><td>Avestin Inc.</td><td>LF-STB</td><td></td></tr><tr><td>Membrana poliwęglanowa, średnica 19 mm, pory 50 nm</td><td>Avestin Inc.</td><td>LFM-50</td><td></td></tr><tr><td>Cholesterol</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C-8667</td><td></td></tr><tr><td>Chloroform</td><td>Mallinckrodt Chemicals</td><td>4432-04</td><td></td></tr><tr><td>Zrównoważone sole Hanka</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H1387</td><td></td></tr><tr><td>Kolba okrągłodenna</td><td>Fisher Scientific</td><td>FHB-275-030X</td><td></td></tr><tr><td>Mysie siRNAITSN - na cel </td><td>Dharmacon/ ThermoScientific</td><td>J-046912-11</td><td></td></tr><tr><td>Pompa perystaltyczna</td><td>Ismatec</td><td>REGLO-CDF cyfrowy z głowicą</td><td></td>pompy RHOO</tr><tr><td>Wentylator</td><td>Hugo Sachs Electronik</td><td>NA</td><td></td></tr><tr><td>Barbital</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>B-0500</td><td></td></tr><tr><td>Octan uranylu</td><td>EM Sciences</td><td>22400</td><td></td></tr><tr><td>Epon812</td><td>EM Sciences</td><td>Wycofane przez producenta</td><td></td></tr><tr><td>Tlenek propylenu</td><td>EM Sciences</td><td>20400</td><td></td></tr><tr><td>Formy do zatapiania</td><td>EM Sciences</td><td>69923-05</td><td></td></tr><tr><td>Kwas garbnikowy</td><td>EM Sciences</td><td>21710</td><td></td></tr><tr><td>8 nm znacznik złotej albuminy</td><td></td><td>Przygotowane w laboratorium jako w16</td><td></td></tr><tr><td colspan="4">Komentarze</td></tr><tr><td colspan="4">Wyposażony w 2 Avestin 1 ml strzykawki gazoszczelne (kat. # LF-1)</td></tr><tr><td colspan="4">Pyrex, 100 ml</td></tr><tr><td colspan="4">Zmodyfikowane siRNA, in vivo</td></tr><tr><td colspan="4">Część IDEX corp.</td></tr><tr><td colspan="4">D-79232 marzec, Niemcy</td></tr><tr><td colspan="4">Zastąpiony przez Embed812, kat. # 14120</td></tr></tbody></table>

długotrwałe wyciszanie intersectin-1 w płucach myszy poprzez wielokrotne dostarczanie specyficznego sirna przez kationowe liposomy. ocena efektów knockdown za pomocą mikroskopii elektronowej

Long-term Silencing of Intersectin-1s in Mouse Lungs by Repeated Delivery of a Specific siRNA via Cationic Liposomes. Evaluation of Knockdown Effects by Electron Microscopy

Poprzednie badania wykazały, że knockdown ITSN-1s (KDITSN), endocytarnego białka zaangażowanego w regulację przepuszczalności naczyń płucnych i przeżywalności komórek śródbłonka (ECs), indukował apoptotyczną śmierć komórki, co było główną przeszkodą w rozwoju systemu hodowli komórkowej z przedłużonym hamowaniem ITSN-1s1. Wykorzystując liposomy kationowe jako nośniki, zbadaliśmy wyciszanie genu ITSN-1s w płucach myszy poprzez ogólnoustrojowe podawanie siRNA ukierunkowanego na gen ITSN-1 (siRNAITSN). Liposomy kationowe mają kilka zalet w dostarczaniu siRNA: są bezpieczne przy wielokrotnym dawkowaniu, nieimmunogenne, nietoksyczne i łatwe do wytworzenia2. Wydajność i aktywność biologiczna liposomów zależą od ich wielkości, ładunku, składu lipidowego, stabilności, dawki i drogi podania3W tym przypadku uzyskano skuteczny ispecyficzny KD ITSN w płucach myszy przy użyciu kombinacji cholesterolu i bromku dimetylodioktadecylowo-amonowego. Dożylne dostarczenie siRNAITSN / kationowych kompleksów liposomów przejściowo powaliło białko ITSN-1 i mRNA w płucach myszy w 3 dniu, które powróciły po dodatkowych 3 dniach. Wykorzystując liposomy kationowe jako powtarzalne bezpieczne nośniki, badanie trwało 24 dni. W związku z tym leczenie retro-orbitalne świeżo wytworzonymi kompleksami podawano co 3 dni, indukując utrzymujący się KDITSN przez cały czas trwania badania4. Tkanki myszy zebrane w kilku punktach czasowych poITSN siRNA poddano analizom mikroskopii elektronowej (EM) w celu oceny wpływu przewlekłego KDITSN w śródbłonku płuc. Obrazowanie EM o wysokiej rozdzielczości pozwoliło nam ocenić zmiany morfologiczne wywołane przez KDITSN w łożysku naczyniowym płuc (tj. przerwanie bariery śródbłonkowej, zmniejszenie liczby kaweoli i regulacja w górę alternatywnych szlaków transportowych), cechy niewykrywalne przez mikroskopię świetlną. Ogólnie rzecz biorąc, odkrycia te ustaliły ważną rolę ITSN-1 w funkcjonowaniu EC i homeostazie płuc, ilustrując jednocześnie skuteczność dostarczania liposomów siRNA in vivo.

Poziomy białka i mRNA ITSN-1s monitorowano w kilku punktach czasowych po dostarczeniu siRNAITSN za pomocą techniki Western blot oraz konwencjonalnej i ilościowej PCR, zgodnie z opisem w4. Poziomy białka i mRNA ITSN-1s w płucach myszy traktowanych siRNAITSN były o około 75% niższe w stosunku do kontroli podczas ciągłego wyciszania ITSN-1s przez 21 dni. Wobec braku ITSN-1s, dynamina-2, główny partner oddziaływania ITSN-1s i kluczowy element procesu odrywania kaweol od błony plazmatycznej, n...

Powtarzające się retro-orbitalne iniekcje kompleksów liposomów kationowych/siRNA/ITSN-1s u myszy, co 72 godziny przez 24 dni, skutecznie dostarczają duplex siRNA do mikrokrążenia płuc myszy, zmniejszając ekspresję mRNA i białka ITSN-1s o 75%. Technika ta jest wysoce powtarzalna w modelu zwierzęcym, nie ma żadnych skutków ubocznych i pozwala uniknąć ofiar śmiertelnych.

Długotrwałe wyciszanie intersectin-1 w płucach myszy poprzez wielokrotne dostarczanie specyficznego siRNA przez kationowe liposomy. Ocena efektów knockdown za pomocą mikroskopii elektronowej

Previous  studies showed that knockdown of ITSN-1s (KDITSN), an endocytic  protein involved in regulating lung vascular permeability and endothelial cells ...

Ogólnym celem następującego eksperymentu jest ocena wpływu długotrwałego wyciszenia ekspresji genu intersecting one s na strukturę i funkcję płuc myszy. Jest to realizowane poprzez przygotowanie specyficznych kompleksów liposomalnych duplex INA w celu ukierunkowania ich na naczynia krwionośne płuc myszy w drugim etapie. Kompleksy liposomalne INA są podawane drogą iniekcji zaocznej, a zabieg ten jest powtarzany co 72 godziny przez 24 kolejne dni, aby uzyskać wydajną inhibicję ekspresji intersecting one S'S.Następnie pobiera się próbki tkanki płuc wstrzykniętych myszy do analiz biochemicznych oraz badań EM, aby ocenić poziom białka i mRNA intersectin 1 oraz przeprowadzić szczegółowe analizy morfologiczne płuc. Wyniki uzyskane metodą western blot lizatów płuc z zastosowaniem specyficznych przeciwciał przeciwko intersectin 1 oraz analizy Q-R-T-P-C-R wykazują specyficzny i efektywny knockdown intersectin 1 przez 24 kolejne dni. Główną zaletą tej techniki w porównaniu z istniejącymi metodologiami, takimi jak rymery czy lentiwirusy, jest fakt, że dostarczanie liposomów onic do płuc jest powtarzalne, bezpieczne, nietoksyczne i wysoce skuteczne w śródbłonku płuc.Pomysł na tę metodę pojawił

long-term-silencing-intersectin-1s-mouse-lungs-repeated-delivery

Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

Długotrwałe wyciszenie Intersectin-1s w płucach myszy poprzez wielokrotne dostarczanie specyficznego siRNA za pomocą kationowych liposomów. Ocena efektów Knockdown za pomocą mikroskopii elektronowej

Siatkowka śródplazmatyczna odgrywa kluczową rolę w biogenezie białek oraz w homeostazie wapnia. Opracowaliśmy system eksperymentalny, który pozwala nam zbadać rolę kanałów przecieku Ca2+ oraz scharakteryzować ich domniemane mechanizmy regulacyjne. System ten obejmuje wyciszanie genów za pomocą siRNA oraz obrazowanie Ca2+ w żywych komórkach.

Obrazowanie poziomu wapnia w żywych komórkach połączone z wyciszaniem genów za pomocą siRNA identyfikuje kanały przecieku Ca2+ w błonie ER i ich mechanizmy regulacyjne

Ten raport opisuje prostą i szybką technikę dokanałowego nakłuwania igły w celu miejscowej transfekcji siRNA w odcinku lędźwiowym rdzenia kręgowego u myszy w krótkotrwałym znieczuleniu światłem.

In vivo (in vivo) Transfekcja SiRNA i knockdown genu w rdzeniu kręgowym poprzez szybkie nieinwazyjne wstrzyknięcia dooponowe w odcinek lędźwiowy u myszy

W tym protokole opisujemy metody efektywnej transfekcji linii komórkowych mysich makrofagów za pomocą siRNA za pomocą 96-dołkowego systemu Amaxa Nucleofector Shuttle System, stymulacji makrofagów lipopolisacharydem i monitorowania wpływu na produkcję cytokin zapalnych.

Wykorzystanie interferencji RNA do zbadania wrodzonej odpowiedzi immunologicznej u makrofagów myszy

Tutaj opisujemy procedurę hamowania funkcji genów u komarów wektorów chorób za pomocą chitozanu/interferujących nanocząsteczek RNA, które są połykane przez larwy.

Wyciszanie genów za pośrednictwem chitozanu/interferujących nanocząstek RNA w larwach komarów wektorów chorób

MikroRNA odgrywają kluczową rolę w mózgu i są potencjalnymi celami do modelowania neurodegeneracji. Jednak zaburzanie poziomów miRNA jest trudne ze względu na krótką długość miRNA i niedostępność tkanki mózgowej. Ten film przedstawia metodę projektowania antagomiru i dostarczania specyficznego dla mózgu przy użyciu neuropeptydu u myszy.

Prosta alternatywa dla wstrzyknięcia stereotaktycznego w celu specyficznego dla mózgu knockdownu miRNA

Tutaj prezentujemy protokół specyficznego zubożenia mRNA za pośrednictwem siRNA, a następnie analizę immunofluorescencyjną w celu oceny montażu i organizacji wrzeciona mejotycznego w oocytach myszy. Protokół ten jest odpowiedni do in vitro zubożenia transkryptów i oceny funkcjonalnej różnych czynników wrzecionowych i/lub MTOC w oocytach.

Ocena wrzeciona mejotycznego w oocytach myszy za pomocą wyciszania za pośrednictwem siRNA

Celem tego protokołu jest użycie kationowych/anionowych liposomów z peptydem neurotargetującym jako systemu dostarczania OUN, aby umożliwić siRNA przejście przez BBB.  Optymalizacja systemu dostarczania leków, takich jak siRNA, pozwoliłaby na więcej opcji leczenia prionów i innych chorób neurodegeneracyjnych.

Dostarczanie terapeutycznego siRNA do OUN za pomocą liposomów kationowych i anionowych

Hamowanie mikroRNA specyficzne dla tkanek to technologia, która jest słabo rozwinięta w dziedzinie mikroRNA. W tym artykule opisujemy protokół skutecznego hamowania rodziny mikroRNA miR-181 w komórkach mioblastów z serca. Technologia nanowektorowa jest wykorzystywana do dostarczania gąbki mikroRNA, która wykazuje znaczące inhibicję rodziny miR-181 specyficznej dla układu krążenia in vivo.

In vivo (in vivo) Nanowektorowe dostarczanie gąbki mikroRNA specyficznej dla serca

Opisujemy metodę użycia superparamagnetycznych nanocząstek tlenku żelaza pokrytych polietylenoiminą (PEI) do transfekcji makrofagów za pomocą siRNA. Te nanocząstki mogą skutecznie dostarczać siRNA do makrofagów in vitro i in vivo oraz wyciszać ekspresję docelowych genów.

Nanocząstki tlenku żelaza pokryte polietylenopiną jako nośnik do dostarczania małych interferujących RNA do makrofagów in vitro i in vivo

Dostarczamy protokół do stabilnego niszczenia genów kodujących białka macierzy zewnątrzkomórkowej (ECM) w mioblastach C2C12 za pomocą małego spinki do włosów (sh) RNA. Na przykładzie ADAMTSL2 opisujemy metody walidacji skuteczności knockdown na poziomie mRNA, białka i komórki podczas różnicowania mioblastów C2C12 do miotub.

Stabilny knockdown genów kodujących białka macierzy zewnątrzkomórkowej w linii komórkowej mioblastów C2C12 przy użyciu małego spinki do włosów (sh)RNA

Poznaj metodę długotrwałego wyciszania intersectin-1 w płucach myszy przy użyciu kationowych liposomów z siRNA. Technika obejmuje wielokrotne wstrzyknięcia retroorbitalne co 72 godziny przez 24 dni, co skutkuje redukcją poziomów mRNA i białka ITSN-1s o 75%.

Długotrwałe wyciszanie intersectin-1 w płucach myszy poprzez wielokrotne dostarczanie specyficznego siRNA przez kationowe liposomy. Ocena efektów knockdown za pomocą mikroskopii elektronowej (Wideo) | JoVE Journal

Długotrwałe wyciszanie intersectin-1 w płucach myszy poprzez wielokrotne dostarczanie specyficznego siRNA przez kationowe liposomy. Ocena efektów knockdown za pomocą mikroskopii elektronowej

Przeglądaj więcej filmów