Specyfikacja neuronów glutaminergicznego kresomózgowia z ludzkich pluripotencjalnych komórek macierzystych

Ogólnym celem tej procedury jest wygenerowanie neuronów głowowych z ludzkich embrionalnych komórek macierzystych lub H-EKS poprzez przejście przez punkty kontrolne, które są podobne do tych obserwowanych podczas rozwoju człowieka. Osiąga się to poprzez umożliwienie HSC spontanicznego różnicowania się w zawiesinie w pożywce HESC, a następnie przeniesienie ich do pożywki indukcyjnej neuronów w celu bardziej selektywnego różnicowania. Następnie ciała zarodkowe lub agregaty PSC mogą przyczepić się do płytek poddanych działaniu hodowli tkankowej, gdzie komórki rozszerzają się i różnicują w monowarstwę.

Z centrami tworzącymi komórki nabłonka nerwowego morfologicznie podobne do komórek kilometrowych. Następnie komórki nabłonka nerwowego są izolowane i umieszczane w kulturach zawiesinowych, gdzie tworzą neurosfery. Na koniec neurosfery są powlekane na szkiełkach nakrywkowych, gdzie mogą się dalej różnicować.

Ostatecznie można uzyskać wyniki, które pokazują określone typy neuronów powstałych w wyniku barwienia immunologicznego lub elektrofizjologii. Implikacje tej techniki rozciągają się na szeroką gamę chorób dziedziczonych genetycznie, ponieważ neurony specyficzne dla pacjenta mogą być również generowane z indukowanych pluripotencjalnych komórek macierzystych, gdzie można wyjaśnić mechanizm działania, a także potencjalne terapie. Chociaż ta metoda może dostarczyć wglądu w rozwój podtypów neuro głowowych szponów z pluripotencjalnych komórek macierzystych.

Może być również stosowany w innych systemach, takich jak choroby ludzkie związane z neuronami głowowymi szponu Aby wygenerować ludzkie pluripotencjalne agregaty komórek macierzystych, zacznij od hodowli ludzkich pluripotencjalnych komórek macierzystych na karmnikach fibroblastów embrionalnych myszy w pożywce HESC uzupełnionej podstawowym FGF przez pięć do siedmiu dni, kolonie będą duże, ale nadal niezróżnicowane. Gdy kolonie osiągną właściwy etap w 50-mililitrowej probówce. Przygotować roztwór o stężeniu jednego miligrama na mililitr w pożywce D-M-E-M-F 12 zgodnie z protokołem tekstowym.

Odessać pożywkę z komórek, a następnie przepłukać je raz za pomocą D-M-E-M-F 12. Po wyjęciu washa dodaj jeden mililitr dis bays do każdej studzienki i inkubuj w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez trzy do pięciu minut. Po upływie trzech minut sprawdź pod mikroskopem, czy nie ma zawiniętych krawędzi, które wyglądają na nieco ciemniejsze.

W razie potrzeby inkubuj komórki przez dłuższy czas. Gdy komórki są gotowe, usuń roztwór dase i przemyj komórki raz D-M-E-M-F 12 przed zastąpieniem płukania 1,5 mililitra pożywki HESC w celu odłączenia i rozbicia komórek. Umieść końcówkę szklanej pipety o pojemności 10 mililitrów na komórkach w kierunku prawej dolnej ściany studzienki i niewielkim ruchem w górę iw dół przesuń się w poprzek studzienki na drugą stronę, zanim wrócisz w przeciwnym kierunku.

Gdy wszystkie komórki znajdą się w zawiesinie, umieść je w 15-mililitrowych probówkach i odwiruj je przy 200 G przez dwie minuty przed usunięciem pożywki z osadu. Używając pożywki HESC, przenieś komórki do kolby w celu hodowli. Na przykład w przypadku komórek z sześciu studzienek HSC należy użyć jednej kolby T 75 z 50 mililitrami HESC. Średni.

Inkubuj komórki w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez 12 godzin. Następnie, aby usunąć wszelkie resztki komórek, przenieś komórki i pożywkę do 50-mililitrowej probówki i umyj komórki raz przed przeniesieniem ich z 50 mililitrami świeżej pożywki do nowej kolby. Kontynuuj karmienie komórek w ten sposób do piątego dnia.

Piątego dnia należy odwirować komórki i przenieść je do nowej kolby T 75. Za pomocą 50 mililitrów pożywki do indukcji neuronalnej lub NIM inkubuj je przez dwa do trzech dni, zastępując połowę NIM każdego dnia po płytce inkubacyjnej, komórki używają lamininy lub FBS, aby pomóc im przyczepić się do płytek na płytkę. Używając FBS, dodaj 1,5 mililitra pożywki z komórkami do każdego.

Dobrze delikatnie potrząśnij płytką, aby rozłożyć agregaty i pozwól komórkom przyczepić się przez noc. W temperaturze 37 stopni Celsjusza następnego dnia zastąp całe podłoże dwoma mililitrami NIM na studzienkę. Po dniu lub dwóch inkubacji każde skupisko rozprzestrzeni się, tworząc monowarstwę, aw ciągu kilku dni centra większości tych komórek będą morfologicznie wyglądać podobnie do komórek kolumerów.

Około 14 do 17 dni komórki kolumerowe będą wydawać się bardziej zwarte. Czasami komórki tworzą grzbiety lub pierścienie z widocznym światłem w środku. Przed wyizolowaniem komórek należy je zbadać pod kątem obecności komórek nabłonkowych spoza UE i zeskrobać je za pomocą końcówki pipety.

Aby wyizolować komórki nabłonka nerwowego, które znajdują się w środku kolonii. Użyj mikropipety i sterylnej pipety z filtrem o pojemności jednego mililitra, aby wywrzeć nacisk na środek kolonii, aby się uniosła. Uważaj, aby zewnętrzna część kolonii również się nie oderwała.

Przenieś dwie płytki z wyizolowanymi komórkami do 15-mililitrowej probówki i wiruj w temperaturze 200 G przez dwie minuty. Po usunięciu pożywki przenieść komórki do kolby T 25 poddanej działaniu kultury nietkankowej zawierającej 10 mililitrów NIM. Po dodaniu B 27 inkubuj przez noc następnego dnia, komórki powinny mieć wygląd podobny do kuli.

Czasami izolowane są również komórki obwodowe, które zwykle przyczepiają się do dna kolby. Jeśli tak się stanie, przenieś kuliste komórki do nowej kolby, pozostawiając przyłączone komórki za hodowlą. Neurosfery i zawieszenie przez tydzień w NIMB 27 w celu promowania wytrzymałości i proliferacji komórek.

Dodaj cykliczny A MP i insulinopodobny czynnik wzrostu jeden. Pod koniec tygodnia neurosfery będą zawierały głowowe komórki progenitorowe i będą gotowe do posiewu na szkiełkach nakrywkowych w celu końcowego różnicowania. Aby przygotować szkiełka nakrywkowe pokryte poliuretanową lamininą w 24 dołkach, płytki dołkowe rozpoczynają się od pokrycia czystych szkiełek nakrywkowych roztworem poliuretanu o stężeniu 0,1 miligrama na mililitr w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez noc, aby pokryć szkiełka nakrywkowe lamininą w ilości 50 mikrolitrów po 20 mikrogramów na mililitr lamininy w różnicowaniu neuronalnym.

Średnia do każdego szkiełka nakrywkowego poddanego obróbce poliuretanowej. Należy uważać, aby płyn dotykał tylko samego szkiełka nakrywkowego. Inkubuj je w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez jedną do dwóch godzin.

Po inkubacji lamininy zebrać i umyć neurosfery w D-M-E-M-F 12. Jeśli komórki są zbyt duże, aby prawidłowo się przyczepić, dodaj około dwóch mililitrów Accutane i inkubuj komórki w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez trzy minuty. Następnie dodać równą objętość inhibitora trypsyny i po odcentrowaniu komórek w temperaturze 200 G przez trzy minuty, zastąpić roztwór NDM i użyć P 200 do rozbicia komórek na małe skupiska.

Umieścić je na wstępnie pokrytych szkiełkach nakrywkowych, odessać większość podłoża i przenieść komórki na sześciocentymetrową szalkę Petriego w kilku kroplach pożywki, tak aby ich wybór stał się łatwiejszy bez usuwania lamininy z wstępnie pokrytych szkiełek nakrywkowych. Przenieś około czterech do pięciu neurosfer do każdej z nich. Pozwól neurosferom przyczepić się przez co najmniej dwie do czterech godzin przed dodaniem 0,5 mililitra pożywki różnicującej neuro uzupełnionej B 27 cyklicznie.

MP i czynniki neurotroficzne zastępują połowę pożywki co drugi dzień. Komórki mogą być utrzymywane przez kilka miesięcy, jak pokazano tutaj. Protokół ten opisuje, w jaki sposób różnicować ludzkie PSC w głowowe neurony glutaminergiczne szponu poprzez kilka krytycznych etapów.

Tworzenie PSC agreguje indukcję komórek nabłonka nerwowego, generowanie przodków głowowych szponów i końcowe różnicowanie tych progenitorów w neurony głowowe szponów. System ten jest solidny i skuteczny na przykład w generowaniu neuronów głowowych, progenitorowych i glutaminergicznym. Bez dodawania czynników izujących, HSC różnicowały się w linię neuronalną i 24 dni po różnicowaniu.

Większość prekursorów neuronalnych była dodatnia dla Fox G one, czynnika transkrypcyjnego A wyrażanego przez cefalon, ale ujemna dla HOKs B 4, markera A dla tylnych komórek mózgu i rdzenia kręgowego, co sugeruje, że pomyślnie wygenerowano progenitorów telonu głowowego. Ci przodkowie telonów cefalicznych posiadają fenotyp grzbietowy, na co wskazuje ekspresja PAC sześć. Marker wyrażony przez przodków grzbietowych, ale nie NK X 2,1 Marker dla przodków brzusznych.

Po dalszym różnicowaniu te głowowe przodki grzbietowe różnicowały się w neurony glutaminergiczne, które były dodatnie dla markera glutaminergicznego. Neurony TBR jeden, które pozostały dodatnie dla TBR jeden, były również dodatnie dla markerów neuronalnych, tubuliny beta trzy lub mapy drugiej. Komórki te wykazywały również ekspresję pęcherzykowego transportera glutaminianu one lub V glut one, markera dojrzałych neuronów glutaminergiczne, co sugeruje efektywne wytwarzanie głowowych neuronów glutaminergicznym talon w hodowli.

Po tej procedurze można wykonać inne metody, takie jak elektrofizjologia, aby odpowiedzieć na dodatkowe pytania, takie jak to, czy te neurony mogą tworzyć połączenia synaptyczne z innymi komórkami. Po obejrzeniu tego filmu powinieneś dobrze zrozumieć. Musiał on zróżnicować ludzkie pluripotencjalne komórki macierzyste i głowowe neurony glutaminergiczne w kilku krytycznych etapach.

Tworzenie pluripotencjalnych komórek macierzystych agreguje indukcję komórek nabłonka nerwowego, wytwarzanie komórek progenitorowych głowowych i końcowe różnicowanie tych komórek progenitorowych w neurony głowowe.