Name: Specyfikacja neuronów glutaminergicznego kresomózgowia z ludzkich pluripotencjalnych komórek macierzystych (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-04-14T14:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 49 s
Description: Poznaj metodę różnicowania ludzkich komórek macierzystych w neurony kresomózgowiowe. Technika obejmuje indukcję neuroepitelialną, formowanie sfer neuro i dojrzewanie terminalne.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Autorzy chcieliby podziękować dr Y. Sasai za hojne dostarczenie przeciwciała FOXG1. Prace te były wspierane przez Connecticut Stem Cell Research Grants (08-SCB-UCHC-022 i 11-SCB24) oraz Spastic Paraplegia Foundation.

1. Generowanie ludzkich pluripotencjalnych agregatów komórek macierzystych (D1-D4)
<ol>
	<li>Ludzkie pluripotencjalne komórki macierzyste są hodowane na mysich fibroblastach embrionalnych (MEF) w obecności pożywki hESC uzupełnionej podstawowym czynnikiem wzrostu fibroblastów (bFGF, 4 ng/ml). Po 5-7 dniach w hodowli, kiedy kolonie są duże, ale jeszcze niezróżnicowane, są gotowe do następnego kroku.</li>
	<li>Najpierw należy przygotować roztwór enzymu. W probówce o pojemności 50 ml rozpuścić dypazę (lub kolagenazę) w stężeniu 1 mg/ml w pożywce DMEM/F12. Ponieważ roztwory te najlepiej mieszają się po podgrzaniu, umieść probówkę zawierającą pożywkę i enzym w łaźni wodnej o temperaturze 37 °C na 10-15 minut, a następnie wysterylizuj ją za pomocą filtra Steriflip.</li>
	<li>Odessać pożywkę z komórek, przepłukać je DMEM/F12 i również to odessać. Dodać 1 ml dypazy do każdej studzienki i umieścić w inkubatorze na 3-5 minut w przypadku hESC (do 10 minut w przypadku iPSC). Spójrz na komórki pod mikroskopem; Gdy krawędzie lekko się zawijają/wyglądają na nieco ciemniejsze, komórki są gotowe do następnego kroku. Najlepiej sprawdzić ogniwa po 3 minutach i w razie potrzeby włożyć je z powrotem. Używając tego protokołu po raz pierwszy, najlepiej jest zacząć od tylko jednej płytki komórek na raz, ponieważ ważne jest, aby usunąć komórki z papy tak szybko, jak to możliwe.</li>
	<li>Odessać dypazę z komórek. Delikatnie (na tym etapie komórki są bardzo wrażliwe i stosunkowo łatwo odklejają się od płytki) dodać 1,5 ml pożywki DMEM/F12 do każdej studzienki, aby spłukać dypazę. Odessać DMEM/F12 i dodać 1,5 ml pożywki hESC do każdej studzienki.</li>
	<li>Aby odłączyć i rozbić komórki, umieść końcówkę szklanej pipety o pojemności 10 ml w kierunku prawego dolnego rogu studzienki (dotykając komórek) i przesuwaj pipetę w górę iw dół (w pionie) - pociągnięcie w górę powinno znajdować się w bliskiej odległości od postępującego ruchu w dół. Po dotarciu do drugiej strony studni powtórz w kierunku poziomym.</li>
	<li>Gdy wszystkie komórki znajdą się w zawiesinie, umieść je w probówkach o pojemności 15 ml i odwiruj w sile 200 x g przez 2 minuty. Na dnie rurki powinna znajdować się osadka komórek. Odessać pożywkę znad osadu.</li>
	<li>Wielkość kolby do hodowli komórkowej, która powinna być wykorzystana do utrzymania agregatów, zależy od pierwotnej ilości komórek. W przypadku 6 dołków (1 płytka) hESC należy użyć jednej kolby T75 poddanej hodowli nietkankowej z 50 ml pożywki hESC. Przenieść komórki z etapu 1.6 do kolby i inkubować w temperaturze 37 °C.</li>
	<li>W celu pozbycia się resztek komórek, podłoże komórkowe i kolbę należy wymienić około 12 godzin później. Aby to zrobić, umieść wszystkie pożywki/komórki w probówce o pojemności 50 ml, odwiruj komórki (200 x g przez 2 minuty) i odessaj stare podłoże. Następnie dodać 50 ml świeżej pożywki hESC do komórek i umieścić w nowej kolbie T75. Komórki mogą być następnie karmione codziennie zgodnie z tą samą procedurą (do 5 dnia).</li>
</ol>
2. Indukcja komórek neuroepitelialnych (D5-D17)
<ol>
	<li>Przenieść komórki/pożywkę do probówki o pojemności 50 ml i odwirować komórki przez 2 minuty przy 200 x g. Następnie odessać supernatant i przenieść komórki do nowej kolby T75 (niepoddanej działaniu hodowli tkankowej) z 50 ml pożywki do indukcji neuronalnej (NIM).</li>
	<li>Gdy komórki znajdą się w NIM, połowę pożywki należy wymieniać co drugi dzień. Agregaty powinny stać się na tyle duże, że po kilku minutach same opadną na dno stożkowej probówki o pojemności 50 ml (nie jest wymagane wirowanie). Po 2-3 dniach w NIM (łącznie D7-D8) komórki powinny być gotowe do powlekania. Laminina lub płodowa surowica bydlęca (FBS) może być wykorzystana, aby pomóc komórkom przyczepić się do płytek.</li>
	<li>Liczba potrzebnych 6-dołkowych płytek do hodowli tkankowej zależy od gęstości komórek, ponieważ każdy agregat powinien być w stanie rosnąć na płytce przez kilka kolejnych dni bez dotykania żadnej z pozostałych. Średnio komórki z jednej kolby T75 dadzą około 4-6 6-dołkowych płytek o wartości komórek.</li>
	<li>
	<ol class="ualpha">
		<li>Jeśli używasz lamininy, rozcieńcz ją w NIM do 10-20 μg/ml, aby pokryć płytkę 6-dołkową (~0,5 ml/dołek). Po powlekaniu przez 2-3 godziny, komórki płytkowe agregują się na płytkach 6-dołkowych (~20-30 agregatów na dołek). Po połączeniu kruszyw dodać 1,5 ml NIM.</li>
		<li>W przypadku stosowania FBS należy przygotować mieszaninę 90% NIM i 10% FBS (1,5 ml/dołek). Dodać 1,5 ml pożywki z komórkami do każdego dołka, delikatnie potrząsać płytką w przód i w tył, aby rozprowadzić agregaty, i pozwolić komórkom przyłączyć O/N w inkubatorze. Pamiętaj, aby zmienić pożywkę (2 ml / studzienkę NIM) następnego ranka, aby usunąć FBS.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Po dniu lub dwóch powlekania każde kruszywo rozłoży się, tworząc monowarstwę. W ciągu kilku dni środki większości tych komórek będą morfologicznie wyglądać podobnie do komórek kolumnowych (wydłużone). W tym okresie należy zmieniać NIM co drugi dzień. Niektóre linie PSC (zwłaszcza iPSC) mogą mniej efektywnie tworzyć komórki kolumnowe. Jeśli tak się stanie, pomocne może być dodanie inhibitorów BMP i TGF (Dorsomorphin29, SB43154219 przy 2 μM) w stadium 2.</li>
	<li>Około 14-17 dni komórki kolumnowe będą wydawać się bardziej zwarte. Czasami komórki te tworzą grzbiety lub pierścienie z widocznym światłem w środku. Oprócz morfologii kolumnowej, komórki na tym etapie wyrażają markery neuronabłonkowe, takie jak PAX6 i SOX112,26.</li>
	<li>Przed rozpoczęciem izolacji należy najpierw zbadać komórki, aby ustalić, czy obecne są w nich komórki nieneuronabłonkowe. Obiektywny marker może być wykorzystany do wskazania kolonii nieneuronabłonkowych. Można je następnie wyeliminować, zeskrobując je końcówką do pipety.</li>
</ol>
3. Generacja przodków kresomózgowia (D17-D24)
<ol>
	<li>Centra kolonii zawierają komórki neuronabłonkowe i powinny być odizolowane od reszty kolonii. Można to zrobić za pomocą mikropipety i sterylnej końcówki do pipety z filtrem o pojemności 1 ml. Kiedy na środkową część kolonii wywiera się niewielki nacisk, na ogół unosi się ona dość łatwo. Uważaj, aby zewnętrzna część kolonii również się nie oderwała. Jeśli kłęby są uparte i nie odpadną samoistnie, można je usunąć, wycinając je za pomocą igły pod mikroskopem w sterylnym kapturze. Przenieś środkowe porcje kolonii do probówki o pojemności 15 ml i wiruj w masie 200 x g przez 2 minuty.</li>
	<li>Pożywkę należy odessać z komórek. Dwie płytki z komórkami można następnie przenieść do kolby T25 poddanej działaniu kultury nietkankowej zawierającej 10 ml NIM z dodatkiem witaminy B27 (bez witaminy A, 1:50). Użyj 5-10 ml pożywki na jedną płytkę komórek.</li>
	<li>Kiedy komórki są oglądane następnego dnia, powinny mieć wygląd przypominający kulę. Konieczne jest przeniesienie tych komórek do nowej kolby (w obecności NIM i B27, 1:50), ponieważ często to właśnie komórki obwodowe wkradają się i przyczepiają do dna kolby.</li>
	<li>Neurosfery powinny być następnie hodowane w zawiesinie przez tydzień przy użyciu NIM uzupełnionego witaminą B27 (1:50). W celu zwiększenia wytrzymałości i proliferacji komórek, cykliczny AMP (cAMP, 1 μM) oraz insulinowy czynnik wzrostu (IGF1, 10 ng/ml) mogą być dodawane do pożywki podczas hodowli zawiesinowej. W tym momencie neurosfery zawierają prekursory kresomózgowia (FOXG1+) i są gotowe do posiewu na szkiełkach nakrywkowych w celu końcowego różnicowania.</li>
</ol>
4. Dalsze różnicowanie do neuronów kresomózgowia (D25+)
<ol>
	<li>
	<ol class="ualpha">
		<li>Przygotować szkiełka nakrywkowe pokryte poliornityną/lamininą (na płytkach 24-dołkowych) do posiewu komórek. Szkiełka nakrywkowe są najpierw czyszczone, a następnie powlekane ornityną (w stężeniu 0,1 mg/ml, 37 °C, O/N, i przechowywane w zamrażarce). 
		 Powłoka poliornitynowa: 
		<ol>
			<li>Wysterylizuj szkiełka nakrywkowe: Umieść szkiełka nakrywkowe w zlewce z kwasem azotowym i delikatnie wstrząsaj w wyciągu przez godzinę. Wylej kwas azotowy, spłucz kilkakrotnie wodą demineralizowaną i pozostaw szkiełka nakrywkowe pod bieżącą wodą demineralizowaną na co najmniej 15 minut. Umieść szkiełka nakrywkowe w 95% etanolu i wstrząsaj przez 30 minut (jeśli używasz natychmiast) lub przechowuj w etanolu w temperaturze pokojowej.</li>
			<li>W sterylnym kapturze wylać zawartość 50 ml probówki zawierającej wysterylizowane szkiełka nakrywkowe do pokrywki płytki 6-dołkowej. Za pomocą wysterylizowanych kleszczy zbieraj po jednym szkiełku nakrywkowym na raz i ustaw pionowo w jednym dołku na 24-dołkowej płytce. Powtórz tę czynność, aby każda studzienka miała szkiełko nakrywkowe.</li>
			<li>Po całkowitym wyschnięciu stukaj w płytki, aż szkiełka nakrywkowe opadną płasko w każdym dołku. Następnie dodać 100 μl poliornityny (0,1 mg/ml w sterylnym dH2O) do każdego szkiełka nakrywkowego i inkubować płytki O/N w temperaturze 37 °C.</li>
			<li>Następnego dnia wyjmij płytki z inkubatora i pozwól im ostygnąć do temperatury pokojowej. Odessać poliornitynę z każdego szkiełka nakrywkowego (od krawędzi szkiełka nakrywkowego), uważając, aby nie dotknąć ani nie zarysować szkiełek nakrywkowych w tym procesie. Pozostaw szkiełka nakrywkowe do wyschnięcia na około 30 minut przed praniem.</li>
			<li>Dodać 1 ml sterylnego dH2O do każdej studzienki, odstawić na 10 minut i odessać wodę z każdej studzienki. Powtórz ten krok prania jeszcze dwa razy. Po całkowitym wyschnięciu płytek (pozostaw pokrywki w kapturze) nałóż pokrywki, przykryj folią aluminiową i przechowuj w temperaturze -20 °C.</li>
		</ol>
		</li>
		<li>
		<ol>
			<li>Aby pokryć szkiełka nakrywkowe lamininą, należy dodać 50 μl mieszaniny pożywki różnicującej neuronalnej i lamininy (końcowe stężenie 20 μg/ml) do każdego szkiełka nakrywkowego poddanego działaniu poliornityny, uważając, aby płyn dotykał tylko samego szkiełka nakrywkowego (i nie rozlewał się). Inkubować je w temperaturze 37 °C przez 1-2 godziny przed przygotowaniem komórek do przyłączenia.</li>
		</ol>
		</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Zebrać i odwirować neurosfery w stężeniu 200 x g przez 2 minuty w probówce o pojemności 15 ml. Odessać supernatant.</li>
	<li>
	<ol class="ualpha">
		<li>Przepłucz komórki za pomocą DMEM-F12 i ponownie odwiruj komórki. Jeśli neurosfery są zbyt duże, aby prawidłowo się przyłączyć, na tym etapie można je zdysocjować za pomocą Accutazy.</li>
		<li>W przypadku stosowania Accutase: Po umyciu komórek DMEM-F12, neurosfery są dysocjowane na małe skupiska poprzez dodanie Accutazy (~ 2 ml) i inkubację komórek w temperaturze 37 °C przez 3 minuty. Następnie dodaj taką samą ilość inhibitora trypsyny (~2 ml) i odwiruj komórki w stężeniu 200 x g przez 3 min. Komórki należy następnie ponownie zawiesić w NDM i rozbić za pomocą pipety P200. Małe grona można następnie pokryć na wstępnie powlekanych szkiełkach nakrywkowych.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Odessać większość pożywki i umieścić komórki na 6-centymetrowej szalce Petriego w kilku kroplach pożywki, aby ich wybór stał się łatwiejszy. Dodaj około 4-5 neurosfer do każdego wstępnie pokrytego szkiełka nakrywkowego. Nie ma potrzeby uprzedniego odsysania lamininy.</li>
	<li>Pozwól neurosferom przyczepić się przez co najmniej 2-4 godziny. Po ich dobrym utrwaleniu należy dodać więcej podłoża (0,5 ml/szkiełko nakrywkowe). Powinien składać się z pożywki różnicującej neuronalnej uzupełnionej witaminą B27 (1:50), cAMP (1 μM) i czynnikami neurotroficznymi (BDNF, GDNF i IGF, wszystkie w stężeniu 10 ng / ml). W tym momencie połowa pożywki może być wymieniana co drugi dzień, a komórki te mogą być utrzymywane przez kilka miesięcy.</li>
</ol>

<ol><li>Takahashi, K., Tanabe, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Induction+of+pluripotent+stem+cells+from+adult+human+fibroblasts+by+defined+factors%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Induction of pluripotent stem cells from adult human fibroblasts by defined factors.</a> Cell. 131, 861-872 (2007).</li>
<li>Thomson, J. A., Itskovitz-Eldor, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Embryonic+stem+cell+lines+derived+from+human+blastocysts%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Embryonic stem cell lines derived from human blastocysts.</a> Science. 282, 1145-1147 (1998).</li>
<li>Yu, J., Vodyanik, M. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Induced+pluripotent+stem+cell+lines+derived+from+human+somatic+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Induced pluripotent stem cell lines derived from human somatic cells.</a> Science. 318, 1917-1920 (2007).</li>
<li>Jessell, T. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neuronal+specification+in+the+spinal+cord%3A+inductive+signals+and+transcriptional+codes%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Rev.+Genet%22%5BJournal%5D)">Neuronal specification in the spinal cord: inductive signals and transcriptional codes.</a> Nat. Rev. Genet. 1, 20-29 (1038).</li>
<li>Wilson, S. I., Edlund, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neural+induction%3A+toward+a+unifying+mechanism%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Neural induction: toward a unifying mechanism.</a> Nat. Neurosci. 4, 1161-1168 (2001).</li>
<li>Reubinoff, B. E., Itsykson, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neural+progenitors+from+human+embryonic+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Neural progenitors from human embryonic stem cells.</a> Nat. Biotechnol. 19, 1134-1140 (2001).</li>
<li>Zhang, S. C., Wernig, M., Duncan, I. D., Brustle, O., Thomson, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vitro+differentiation+of+transplantable+neural+precursors+from+human+embryonic+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">In vitro differentiation of transplantable neural precursors from human embryonic stem cells.</a> Nat. Biotechnol. 19, 1129-1133 (2001).</li>
<li>Hu, B. Y., Weick, J. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neural+differentiation+of+human+induced+pluripotent+stem+cells+follows+developmental+principles+but+with+variable+potency%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Neural differentiation of human induced pluripotent stem cells follows developmental principles but with variable potency.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 107, 4335-4340 (2010).</li>
<li>Singh Roy, N., Nakano, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Enhancer-specified+GFP-based+FACS+purification+of+human+spinal+motor+neurons+from+embryonic+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Exp.+Neurol%22%5BJournal%5D)">Enhancer-specified GFP-based FACS purification of human spinal motor neurons from embryonic stem cells.</a> Exp. Neurol. 196, 224-234 (2005).</li>
<li>Lee, H., Shamy, G. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Directed+differentiation+and+transplantation+of+human+embryonic+stem+cell-derived+motoneurons%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cells%22%5BJournal%5D)">Directed differentiation and transplantation of human embryonic stem cell-derived motoneurons.</a> Stem Cells. 25, 1931-1939 (2007).</li>
<li>Boulting, G. L., Kiskinis, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+functionally+characterized+test+set+of+human+induced+pluripotent+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">A functionally characterized test set of human induced pluripotent stem cells.</a> Nat. Biotechnol. 29, 279-286 (2011).</li>
<li>Li, X. J., Du, Z. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Specification+of+motoneurons+from+human+embryonic+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Specification of motoneurons from human embryonic stem cells.</a> Nat. Biotechnol. 23, 215-221 (2005).</li>
<li>Perrier, A. L., Tabar, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Derivation+of+midbrain+dopamine+neurons+from+human+embryonic+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Derivation of midbrain dopamine neurons from human embryonic stem cells.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 101, 12543-12548 (2004).</li>
<li>Roy, N. S., Cleren, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functional+engraftment+of+human+ES+cell-derived+dopaminergic+neurons+enriched+by+coculture+with+telomerase-immortalized+midbrain+astrocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Med%22%5BJournal%5D)">Functional engraftment of human ES cell-derived dopaminergic neurons enriched by coculture with telomerase-immortalized midbrain astrocytes.</a> Nat Med. 12, 1259-1268 (2006).</li>
<li>Yan, Y., Yang, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Directed+differentiation+of+dopaminergic+neuronal+subtypes+from+human+embryonic+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cells%22%5BJournal%5D)">Directed differentiation of dopaminergic neuronal subtypes from human embryonic stem cells.</a> Stem Cells. 23, 781-790 (2005).</li>
<li>Meyer, J. S., Shearer, R. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Modeling+early+retinal+development+with+human+embryonic+and+induced+pluripotent+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Modeling early retinal development with human embryonic and induced pluripotent stem cells.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 106, 16698-16703 (2009).</li>
<li>Osakada, F., Ikeda, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Toward+the+generation+of+rod+and+cone+photoreceptors+from+mouse%2C+monkey+and+human+embryonic+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Toward the generation of rod and cone photoreceptors from mouse, monkey and human embryonic stem cells.</a> Nat Biotechnol. 26, 215-224 (2008).</li>
<li>Carpenter, M. K., Inokuma, M. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Enrichment+of+neurons+and+neural+precursors+from+human+embryonic+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Exp.+Neurol%22%5BJournal%5D)">Enrichment of neurons and neural precursors from human embryonic stem cells.</a> Exp. Neurol. 172, 383-397 (2001).</li>
<li>Chambers, S. M., Fasano, C. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Highly+efficient+neural+conversion+of+human+ES+and+iPS+cells+by+dual+inhibition+of+SMAD+signaling%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Highly efficient neural conversion of human ES and iPS cells by dual inhibition of SMAD signaling.</a> Nat. Biotechnol. 27, 275-280 (2009).</li>
<li>Chambers, S. M., Qi, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Combined+small-molecule+inhibition+accelerates+developmental+timing+and+converts+human+pluripotent+stem+cells+into+nociceptors%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Combined small-molecule inhibition accelerates developmental timing and converts human pluripotent stem cells into nociceptors.</a> Nat. Biotechnol. 30, 715-720 (2012).</li>
<li>Kawasaki, H., Mizuseki, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Induction+of+midbrain+dopaminergic+neurons+from+ES+cells+by+stromal+cell-derived+inducing+activity%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Induction of midbrain dopaminergic neurons from ES cells by stromal cell-derived inducing activity.</a> Neuron. 28, 31-40 (2000).</li>
<li>Rubenstein, J. L., Beachy, P. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Patterning+of+the+embryonic+forebrain%5BTitle%5D)+AND+%22Curr.+Opin.+Neurobiol%22%5BJournal%5D)">Patterning of the embryonic forebrain.</a> Curr. Opin. Neurobiol. 8, 18-26 (1998).</li>
<li>Hevner, R. F., Hodge, R. D., Daza, R. A., Englund, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transcription+factors+in+glutamatergic+neurogenesis%3A+conserved+programs+in+neocortex%2C+cerebellum%2C+and+adult+hippocampus%5BTitle%5D)+AND+%22Neurosci.+Res%22%5BJournal%5D)">Transcription factors in glutamatergic neurogenesis: conserved programs in neocortex, cerebellum, and adult hippocampus.</a> Neurosci. Res. 55, 223-233 (2006).</li>
<li>Watanabe, K., Kamiya, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Directed+differentiation+of+telencephalic+precursors+from+embryonic+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Directed differentiation of telencephalic precursors from embryonic stem cells.</a> Nat. Neurosci. 8, 288-296 (2005).</li>
<li>Watanabe, K., Ueno, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+ROCK+inhibitor+permits+survival+of+dissociated+human+embryonic+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">A ROCK inhibitor permits survival of dissociated human embryonic stem cells.</a> Nat. Biotechnol. 25, 681-686 (2007).</li>
<li>Pankratz, M. T., Li, X. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Directed+neural+differentiation+of+human+embryonic+stem+cells+via+an+obligated+primitive+anterior+stage%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cells%22%5BJournal%5D)">Directed neural differentiation of human embryonic stem cells via an obligated primitive anterior stage.</a> Stem Cells. 25, 1511-1520 (2007).</li>
<li>Li, X. J., Zhang, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Coordination+of+sonic+hedgehog+and+Wnt+signaling+determines+ventral+and+dorsal+telencephalic+neuron+types+from+human+embryonic+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Coordination of sonic hedgehog and Wnt signaling determines ventral and dorsal telencephalic neuron types from human embryonic stem cells.</a> Development. 136, 4055-4063 (2009).</li>
<li>Zeng, H., Guo, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Specification+of+region-specific+neurons+including+forebrain+glutamatergic+neurons+from+human+induced+pluripotent+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Specification of region-specific neurons including forebrain glutamatergic neurons from human induced pluripotent stem cells.</a> PLoS One. 5, e11853(2010).</li>
<li>Kim, D. S., Lee, J. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Robust+enhancement+of+neural+differentiation+from+human+ES+and+iPS+cells+regardless+of+their+innate+difference+in+differentiation+propensity%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cell+Rev%22%5BJournal%5D)">Robust enhancement of neural differentiation from human ES and iPS cells regardless of their innate difference in differentiation propensity.</a> Stem Cell Rev. 6, 270-281 (2010).</li>
<li>Zhang, X., Huang, C. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pax6+is+a+human+neuroectoderm+cell+fate+determinant%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">Pax6 is a human neuroectoderm cell fate determinant.</a> Cell Stem Cell. 7, 90-100 (2010).</li>
<li>Stern, C. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Initial+patterning+of+the+central+nervous+system%3A+how+many+organizers%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Rev.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Initial patterning of the central nervous system: how many organizers.</a> Nat. Rev. Neurosci. 2, 92-98 (2001).</li>
<li>Ma, L., Hu, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+embryonic+stem+cell-derived+GABA+neurons+correct+locomotion+deficits+in+quinolinic+acid-lesioned+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">Human embryonic stem cell-derived GABA neurons correct locomotion deficits in quinolinic acid-lesioned mice.</a> Cell Stem Cell. 10, 455-464 (2012).</li>
<li>Li, W., Wei, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generation+of+rat+and+human+induced+pluripotent+stem+cells+by+combining+genetic+reprogramming+and+chemical+inhibitors%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">Generation of rat and human induced pluripotent stem cells by combining genetic reprogramming and chemical inhibitors.</a> Cell Stem Cell. 4, 16-19 (2009).</li>
<li>Lowry, W. E., Richter, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generation+of+human+induced+pluripotent+stem+cells+from+dermal+fibroblasts%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Generation of human induced pluripotent stem cells from dermal fibroblasts.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 105, 2883-2888 (2008).</li>
<li>Dimos, J. T., Rodolfa, K. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Induced+pluripotent+stem+cells+generated+from+patients+with+ALS+can+be+differentiated+into+motor+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Induced pluripotent stem cells generated from patients with ALS can be differentiated into motor neurons.</a> Science. 321, 1218-1221 (2008).</li>
<li>Ebert, A. D., Yu, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Induced+pluripotent+stem+cells+from+a+spinal+muscular+atrophy+patient%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Induced pluripotent stem cells from a spinal muscular atrophy patient.</a> Nature. 457, 277-280 (2009).</li>
<li>Lee, G., Papapetrou, E. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Modelling+pathogenesis+and+treatment+of+familial+dysautonomia+using+patient-specific+iPSCs%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Modelling pathogenesis and treatment of familial dysautonomia using patient-specific iPSCs.</a> Nature. 461, 402-406 (2009).</li>
<li>Park, I. H., Arora, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Disease-specific+induced+pluripotent+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Disease-specific induced pluripotent stem cells.</a> Cell. 134, 877-886 (2008).</li>
<li>Chamberlain, S. J., Chen, P. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Induced+pluripotent+stem+cell+models+of+the+genomic+imprinting+disorders+Angelman+and+Prader-Willi+syndromes%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Induced pluripotent stem cell models of the genomic imprinting disorders Angelman and Prader-Willi syndromes.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 107, 17668-17673 (2010).</li>
<li>Kiskinis, E., Eggan, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Progress+toward+the+clinical+application+of+patient-specific+pluripotent+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Clin.+Invest%22%5BJournal%5D)">Progress toward the clinical application of patient-specific pluripotent stem cells.</a> J. Clin. Invest. 120, 51-59 (2010).</li>
<li>Koch, P., Tamboli, I. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Presenilin-1+L166P+mutant+human+pluripotent+stem+cell-derived+neurons+exhibit+partial+loss+of+gamma-secretase+activity+in+endogenous+amyloid-beta+generation%5BTitle%5D)+AND+%22Am.+J.+Pathol%22%5BJournal%5D)">Presenilin-1 L166P mutant human pluripotent stem cell-derived neurons exhibit partial loss of gamma-secretase activity in endogenous amyloid-beta generation.</a> Am. J. Pathol. 180, 2404-2416 (2012).</li>
<li>Walsh, R. M., Hochedlinger, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Modeling+Rett+syndrome+with+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Modeling Rett syndrome with stem cells.</a> Cell. 143, 499-500 (2010).</li>
<li>Egawa, N., Kitaoka, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Drug+Screening+for+ALS+Using+Patient-Specific+Induced+Pluripotent+Stem+Cells%5BTitle%5D)+AND+%22Sci.+Transl.+Med%22%5BJournal%5D)">Drug Screening for ALS Using Patient-Specific Induced Pluripotent Stem Cells.</a> Sci. Transl. Med. 4, (2012).</li>
<li>Kola, I., Landis, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Can+the+pharmaceutical+industry+reduce+attrition+rates%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Drug+Discovery%22%5BJournal%5D)">Can the pharmaceutical industry reduce attrition rates.</a> Nature Reviews Drug Discovery. 3, 711-716 (2004).</li>
</ol>

Autorzy oświadczają, że nie mają konkurencyjnych interesów finansowych.

W procesie różnicowania neuronalnego występuje kilka krytycznych etapów. Ważne jest, aby upewnić się, że ludzkie PSC są pluripotencjalne, ponieważ w przeciwnym razie komórki mogą być już skłonne do stania się linią nieneuronalną. Można to potwierdzić poprzez barwienie ludzkich PSC przeciwciałami przeciwko markerom pluripotencji, takim jak Oct4, Sox2, Nanog i Tra-1-60 1-3. Jeśli ludzkie PSC nie przyczepiają się zbyt dobrze po ich pasażowaniu, można dodać inhibitor ROCK (Y27632), aby pomóc. Dla tych, którzy mają...

Ludzkie pluripotencjalne komórki macierzyste (PSC), w tym zarówno ludzkie embrionalne komórki macierzyste (hESC), jak i indukowane pluripotencjalne komórki macierzyste (iPSC), mają zdolność do generowania każdego typu komórek w ciele, w tym neuronów1-3. Ukierunkowane różnicowanie różnych podtypów neuronów z ludzkich PSC jest kluczem do zastosowania tych komórek w medycynie regeneracyjnej. Generowanie funkcjonalnych podtypów neuronów podczas rozwoju jest złożonym procesem obejmującym indukcję linii neuronalnej, specyfikację regionalnych komórek progenitorowych wzdłuż osi rostro-ogonowej oraz różnicowanie postmitotycznych typów neuronów od regionalnych progenitorów4,5. Począwszy od 2001 r., stworzono kilka systemów do generowania linii neuronalnej z hESC, które zapewniły platformę dla kolejnej generacji podtypów neuronów6,7. Opierając się na zasadach rozwoju, kilka typów neuronów, takich jak neurony ruchowe rdzenia kręgowego8-12, neurony dopaminergiczne śródmózgowia13-15 i komórki siatkówki nerwowej16,17 zostały skutecznie określone z ludzkich PSC. Dokonano tego poprzez zastosowanie krytycznych morfogenów, które są ważne dla specyfikacji tych typów neuronów podczas rozwoju in vivo. Opracowano również inne protokoły promujące różnicowanie hESC w neurony przy użyciu dodatkowych czynników18-20, takich jak małe cząsteczki, lub poprzez współhodowlę z innymi typami komórek, aby pomóc w promowaniu różnicowania21.
Ludzka kora nowa jest wysoce rozwinięta i zawiera wiele typów komórek, w tym neurony glutaminergiczne, które odgrywają ważną rolę w uczeniu się, pamięci i funkcjach poznawczych22,23. Pierwszym krokiem w generowaniu neuronów glutaminergicznego w hodowli jest określenie komórek progenitorowych kresomózgowia. Grupa Yoshiki Sasai po raz pierwszy poinformowała o ukierunkowanym różnicowaniu prekursorów kresomózgowia od mysich ESC (mESC) przy użyciu hodowli zawiesiny bez surowicy w obecności DKK1 (która hamuje sygnalizację Wnt), a także LeftyA (która hamuje sygnalizację węzłową). Następnie kilka grup, w tym nasza, zgłosiło również specyfikację prekursorów kresomózgowia z ludzkich PSC w pożywce wolnej od surowicy 25-27. Wytwarzanie prekursorów kresomózgowia z ludzkich PSC nie wymaga stosowania egzogennych morfogenów, a wydajność w wytwarzaniu tych prekursorów jest znacznie wyższa niż w przypadku mESC 26,27. Tutaj opisano chemicznie zdefiniowany system indukcji neuronalnej, który został dobrze ugruntowany przez grupę7 Zhanga. Bez dodatku egzogennych czynników kaudalizujących, protokół ten skutecznie generuje prekursory kresomózgowia z ludzkich PSC27. Tych przodków można następnie różnicować na przodków grzbietowych lub brzusznych, regulując sygnalizację Wnt i jeża sonicznego (SHH). Przodkowie grzbietowi mogą dalej efektywnie różnicować się w neurony glutaminergiczne27. Ponadto protokół ten działa również dobrze w przypadku generowania neuronów glutaminergicznego z ludzkich iPSC28, co pozwala na generowanie neuronów specyficznych dla pacjenta, które można wykorzystać do zbadania mechanizmu działania, a także potencjalnych terapii dla szerokiej gamy chorób. Co więcej, nasz system stanowi również platformę do badania rozwoju i specyfikacji różnych typów neuronów w kresomózgowiu.

<table><tbody><tr><td>Zmodyfikowana pożywka orła firmy Dulbecco z mieszanką składników odżywczych F12 (DMEM/F12)</td><td>Gibco</td><td>11330-032</td><td></td></tr><tr><td>Zamiennik serum nokautującego</td><td>Gibco</td><td>10828-028</td><td></td></tr><tr><td>L-glutamina (200 mM)</td><td>Gibco</td><td>25030</td><td></td></tr><tr><td>Aminokwasy endogenne</td><td>Gibco</td><td>1140-050</td><td></td></tr><tr><td>2-Mercapt&#8211; tanol (14,3 M)</td><td>Sigma</td><td>M-7522</td><td></td></tr><tr><td>Pożywka neuropodstawowa</td><td>Gibco</td><td>21103-049</td><td></td></tr><tr><td>N2</td><td>Gibco</td><td>17502-048</td><td></td></tr><tr><td>B27</td><td>Gibco</td><td>12587-010</td><td></td></tr><tr><td>Heparyna</td><td>Sigma</td><td>H3149</td><td></td></tr><tr><td>Bromowodorek poli-L-ornityny (poliornityna)</td><td>Sigma</td><td>116K5103</td><td></td></tr><tr><td>Laminina (człowiek)</td><td>Sigma</td><td>L-6274</td><td></td></tr><tr><td>Laminin (mysz)</td><td>Invitrogen</td><td>23017-015</td><td></td></tr><tr><td>FBS</td><td>Gemini</td><td>100-106</td><td></td></tr><tr><td>Albumina surowicy bydlęcej (BSA)</td><td>Sigma</td><td>A-7906</td><td></td></tr><tr><td>Dispase</td><td>Gibco</td><td>17105-041</td><td></td></tr><tr><td>Collagenase</td><td>Invitrogen</td><td>17104-019</td><td></td></tr><tr><td>Accutase</td><td>Innovative Cell Technologie</td><td>AT104</td><td></td></tr><tr><td>ROCK Inhibitor</td><td>Stemgent</td><td>04-0012</td><td></td></tr><tr><td>SB431542</td><td>Stemgent</td><td>04-0010</td><td></td></tr><tr><td>Dorsomorphin</td><td>Stemgent</td><td>04-0024</td><td></td></tr><tr><td>Czynnik wzrostu fibroblastów 2 (FGF2, bFGF)</td><td>Invitrogen</td><td>13256-029</td><td></td></tr><tr><td>Inhibitor trypsyny</td><td>Gibco</td><td>17075</td><td></td></tr><tr><td>0,1% żelatyny</td><td>Przeciwciało Millipore</td><td>ES-006-B</td><td></td></tr><tr><td>Foxg1</td><td>Przeciwciało Dr. Y. Sasai</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Hoxb4 (1:50)</td><td>Badania rozwojowe Przeciwciało Hybridoma Bank</td><td>I12</td><td></td></tr><tr><td>Pax6 (1:5000)</td><td>Badania rozwojowe Przeciwciało Hybridoma Bank</td><td>PAX6</td><td></td></tr><tr><td>Nkx2.1 (1:200)</td><td>Chemicon</td><td>MAB5460</td><td></td></tr><tr><td>Przeciwciało Tbr1 (1:2000)</td><td>Chemicon</td><td>Przeciwciało AB9616</td><td></td></tr><tr><td>vGLUT1 (1:100)</td><td>Systemy synaptyczne</td><td>135302</td><td></td></tr><tr><td>Czynnik neurotroficzny pochodzenia mózgowego (BDNF)</td><td>PrepoTech Inc.</td><td>450-02</td><td></td></tr><tr><td>Neurotroficzny czynnik glejowy (GDNF)</td><td>PrepoTech Inc.</td><td>450-10</td><td></td></tr><tr><td>Insulinowy czynnik wzrostu 1 (IGF1)</td><td>PrepoTech Inc.</td><td>100-11</td><td></td></tr><tr><td>Cykliczny AMP (cAMP)</td><td>Sigma</td><td>D-0260</td><td></td></tr><tr><td>Jeż Soniczny (SHH)</td><td>R& D</td><td>1845-SH</td><td></td></tr><tr><td>Probówki 50 ml</td><td>Becton Dickinson (BD)</td><td>352098</td><td></td></tr><tr><td>Probówki 15 ml</td><td>BD</td><td>352097</td><td></td></tr><tr><td>płytki 6-dołkowe</td><td>BD</td><td>353046</td><td></td></tr><tr><td>24-dołkowe</td><td>Kolby BD</td><td>353047</td><td></td></tr><tr><td>T25 (niepoddane obróbce)</td><td>Kolby 353009</td><td></td><td></td></tr><tr><td>T75 (niepoddane obróbce)</td><td>BD</td><td>353133</td><td></td></tr><tr><td>Szkiełka nakrywkowe</td><td>Chemiglass Life Sciences</td><td>1760-012</td><td></td></tr><tr><td>6 cm szalki Petriego</td><td>BD</td><td>353004</td><td></td></tr><tr><td>Pipety szklane 9''</td><td>Fisher</td><td>13-678-20D</td><td></td></tr><tr><td>Filtry Steriflip (0,22 &mu; M)</td> <td>Filtry Millipore</td><td>SCGP00525</td><td></td></tr><tr><td>Stericup 1,000 ml (0,22 &mu; M)</td> Mikroskop kontrastowy <td>Millipore</td><td>SCGPU10RE</td><td></td></tr><tr><td>fazowy (Obserwator A1)</td>Inkubator dwutlenku węgla <td>Zeiss</td><td>R2625</td><td></td></tr><tr><td>(Hera Cell 150)</td>Kaptur bezpieczeństwa biologicznego <td>Thermo Electron Corporation</td><td></td><td></td></tr><tr><td>(Sterilgard III Advance)</td><td>Wirówka Baker Company</td><td></td><td></td></tr><tr><td>(5702 R)</td><td>Eppendorf</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

specyfikacja neuronów glutaminergicznego kresomózgowia z ludzkich pluripotencjalnych komórek macierzystych

The Specification of Telencephalic Glutamatergic Neurons from Human Pluripotent Stem Cells

Tutaj opisano krok po kroku do efektywnego generowania neuronów glutaminergicznego z ludzkich pluripotencjalnych komórek macierzystych (PSC). Proces różnicowania jest inicjowany przez rozbicie ludzkich PSC na grudki, które zaokrąglają się, tworząc agregaty, gdy komórki są umieszczane w hodowli zawiesinowej. Agregaty są następnie hodowane w pożywce hESC od 1 do 4 dni, aby umożliwić spontaniczne różnicowanie. W tym czasie komórki mają zdolność przekształcania się w dowolny z trzech listków zarodkowych. Od 5 do 8 dnia komórki umieszcza się w pożywce do indukcji neuronów, aby wepchnąć je do linii neuronalnej. Około 8 dnia komórki mogą przyczepić się do 6 dołków i różnicować się, w tym czasie tworzą się komórki neuronabłonkowe. Te komórki neuroepitelialne można wyizolować w 17 dniu. Komórki mogą być następnie przechowywane jako neurosfery, dopóki nie będą gotowe do posiewu na szkiełkach nakrywkowych. Używając podstawowej pożywki bez żadnych czynników kaudalizujących, komórki neuroepiteliczne są określane jako prekursory kresomózgowia, które następnie mogą być dalej różnicowane w grzbietowe progenitory kresomózgowia i neurony glutaminergiczne. Ogólnie rzecz biorąc, nasz system zapewnia narzędzie do generowania ludzkich neuronów glutaminergiczne, dzięki którym naukowcy mogą badać rozwój tych neuronów i choroby, które na nie wpływają.

W niniejszym opracowaniu opisano protokół różnicowania ludzkich PSC w telencefaliczne neurony glutaminergiczne poprzez kilka kluczowych etapów: formowanie agregatów PSC, indukcję komórek neuroepithelialnych, generowanie progenitorów telencefalicznych oraz końcowe różnicowanie tych progenitorów w neurony telencefaliczne (Rycina 1). System ten jest stabilny i wydajny w generowaniu progenitorów telencefalicznych oraz neuronów glutaminergicznych. Przykładowo (Rycina 2), bez dodawania czynnik...

Ta procedura prowadzi do powstania neuronów kresomózgowiowych poprzez przejście przez punkty kontrolne, które są podobne do tych obserwowanych podczas rozwoju człowieka. Komórki mogą się spontanicznie różnicować, są wystawione na działanie czynników, które popychają je w kierunku linii neuronalnej, są izolowane i są powlekane na szkiełkach nakrywkowych, aby umożliwić końcowe różnicowanie i dojrzewanie.

Specyfikacja neuronów glutaminergicznego kresomózgowia z ludzkich pluripotencjalnych komórek macierzystych

Here, a stepwise procedure for efficiently generating telencephalic glutamatergic neurons from human pluripotent stem cells (PSCs) has been described. The ...

Ogólnym celem tej procedury jest generowanie neuronów głowowych z ludzkich embrionalnych komórek macierzystych (hESC) poprzez przechodzenie przez punkty kontrolne analogiczne do tych obserwowanych podczas rozwoju człowieka. Osiąga się to najpierw poprzez umożliwienie hESC spontanicznego różnicowania w zawiesinie w medium do hESC, a następnie przeniesienie ich do medium indukującego różnicowanie neuronalne w celu bardziej selektywnego różnicowania. Następnie ciałom embrionalnym lub agregatom PSC umożliwia się przytwierdzenie do płytek traktowanych do hodowli tkanek, gdzie komórki namnażają się i różnicują w monowarstwę.W centrach tworzą się komórki neuroepithelialne, morfologicznie podobne do komórek kilometer. Następnie komórki neuroepithelialne są izolowane i przenoszone do kultur zawiesinowych, w których tworzą neurosfery. Na koniec neurosfery są wysiewane na szkiełka podstawowe, gdzie mogą ulegać dalszemu różnicowaniu.W rezultacie można uzyskać dane wykazujące konkretne typy utworzonych neuronów za pomocą barwienia immunocytochemicznego lub elektrofizjologii. Zastosowania tej techniki obejmują szeroką gamę chorób uwarunkowanych genetycznie, ponieważ z indukowanych pluripotentnych komórek macierzystych można generować neurony specyficzne dla pacjenta, co pozwala na wyjaśnienie mechanizmu działania choroby oraz potencjalnych terapii. Metoda ta może również dostarczyć informacji na temat rozwoju neuronów podtypu talamokortykalnego z pluripotentnych komórek macierzystych.Metodę tę można zastosować również w innych układach, takich jak choroby ludzkie związane z neuronami cephalic talon. Aby wytworzyć agregaty ludzkich pluripotencjalnych komórek macierzystych, należy rozpocząć od hodowli ludzkich pluripotencjalnych komórek macierzystych na karmiących fibroblastach embrionalnych myszy w medium HESC uzupełnionym o basic FGF przez okres od pięciu do siedmiu dni; kolonie będą duże, lecz wciąż niezróżnicowane. Gdy kolonie osiągną odpowiedni etap, w probówce o pojemności 50 ml należy przygotować roztwór dis bays o stężeniu 1 mg/ml w medium D-M-E-M-F 12 zgodnie z protokołem tekstowym.Odssać pożywkę z komórek, a następnie przepłukać je raz medium D-M-E-M-F 12. Po usunięciu płuczki dodać jeden mililitr dis bays do każdej studni i inkubować w temperaturze 37 °C przez trzy do pięciu minut. Po trzech minutach sprawdzić pod mikroskopem, czy krawędzie zwinięły się i stały się nieco ciemniejsze.W razie potrzeby inkubować komórki dłużej. Gdy komórki będą gotowe, usunąć roztwór dase i przemyć komórki raz pożywką D-M-E-M-F 12, a następnie zastąpić płuczkę 1,5 ml pożywki HESC, aby odłączyć i rozbić skupiska komórek. Umieścić końcówkę szklanej pipety o pojemności 10 ml na komórkach w kierunku prawej dolnej ścianki dołka i wykonując niewielkie ruchy góra-dół, przemieścić ją przez dołek na drugą stronę, a następnie wrócić w przeciwnym kierunku.Gdy wszystkie komórki znajdą się w zawiesinie, należy umieścić je w probówkach o pojemności 15 ml i odwirować przy 200 G przez dwie minuty, a następnie usunąć medium z osadu. Przenieść komórki do kolby hodowlanej, używając medium HESC. Na przykład w przypadku komórek z sześciu studni HSC, należy użyć jednej kolby T 75 z 50 ml medium HESC.Inkubować komórki w temperaturze 37 °C przez 12 godzin. Następnie, aby usunąć resztki komórkowe, przenieść komórki wraz z medium do probówki o pojemności 50 ml i wypłukać komórki raz, a następnie przenieść je w 50 ml świeżego medium do nowej kolby. Kontynuować dokarmianie komórek w ten sposób do piątego dnia.Piątego dnia odwirować komórki i przenieść je do nowej kolby T 75. Inkubować je przez dwa do trzech dni w 50 mililitrach medium do indukcji neuronalnej (NIM), wymieniając codziennie połowę NIM. Po inkubacji wysiać komórki, używając lamininy lub FBS, aby wspomóc ich przyleganie do płytek. W przypadku użycia FBS, dodać do każdej płytki 1,5 mililitra medium z komórkami.Następnie delikatnie wstrząśnij płytką, aby rozprzestrzenić agregaty, i pozostaw komórki do przyczepienia na noc. Następnego dnia, w temperaturze 37 °C, wymień całe medium na 2 mL NIM na każdą studzienkę. Po jednym lub dwóch dniach inkubacji każdy agregat rozprzestrzeni się, tworząc monowarstwę, a w ciągu kilku dni centra większości tych komórek będą morfologicznie przypominać komórki kolunarne.Około 14. do 17. dnia komórki kolumnowe będą wydawać się bardziej zwarte. Czasami komórki tworzą grzebienie lub pierścienie z widocznym światłem wewnątrz. Przed izolacją komórek należy sprawdzić, czy nie występują komórki nabłonka nie-EU, a następnie zdrapać je za pomocą końcówki pipety.Aby wyizolować komórki neuroepithelial znajdujące się w centrum kolonii, należy użyć mikropipety oraz sterylnej, filtrowanej pipety o objętości 1 ml, aby wywrzeć nacisk na środek kolonii, powodując jej oderwanie. Należy uważać, aby zewnętrzna część kolonii również się nie oddzieliła.Przenieś komórki wyizolowane z dwóch płytek do probówki o pojemności 15 ml i wiruj przy 200 G przez dwie minuty. Po usunięciu medium przenieś komórki do kolby T 25 (nieprzeznaczonej do hodowli tkankowej) zawierającej 10 ml NIM. Po dodaniu B 27 inkubuj przez noc; następnego dnia komórki powinny przyjąć sferyczny wygląd.Czasami izolowane są również komórki peryferyjne, które zazwyczaj przylegają do dna kolby. W takim przypadku należy przenieść komórki sferyczne do nowej kolby, pozostawiając przylegające komórki w poprzedniej kulturze. Neurosfery należy hodować w zawiesinie przez jeden tydzień w NIMB 27, aby wspomóc przeżywalność i proliferację komórek.Dodaj cykliczny AMP oraz insulinopodobny czynnik wzrostu 1. Pod koniec tygodnia neurosfery będą zawierać progenitory cefaliczne i będą gotowe do wysiania na szkiełka podstawowe w celu terminalnego różnicowania. Aby przygotować szkiełka podstawowe powlekane poliuretanem i lamininą w płytkach 24-dołkowych, należy rozpocząć od powlekania czystych szkiełek podstawowych roztworem poliuretanu o stężeniu 0,1 mg/ml w temperaturze 37 °C przez noc, a następnie powlec szkiełka lamininą, stosując 50 µL lamininy o stężeniu 20 µg/ml w medium do różnicowania neuronalnego.Nanieście pożywkę na każde szkiełko zakrywkowe potraktowane poliuretanem, dbając o to, aby ciecz stykała się wyłącznie z samym szkiełkiem. Inkubuj je w temperaturze 37 °C przez jedną do dwóch godzin.Po inkubacji z lamininą zebrać i przemyć neurosfery w medium D-M-E-M-F 12. Jeśli komórki są zbyt duże, aby prawidłowo przylegać, dodać około 2 mL Accutane i inkubować komórki w temperaturze 37 °C przez 3 minuty. Następnie dodać równą objętość inhibitora trypsyny, a po odwirowaniu komórek przy 200 ×g przez 3 minuty, zastąpić roztwór medium NDM i za pomocą pipety P 200 rozbić komórki na małe skupiska.Umieść je na wcześniej pokrytych szkiełkach podstawkowych, odessa większość pożywki i przenieś komórki do szalki Petriego o średnicy sześciu centymetrów w kilku kroplach pożywki, aby ułatwić ich selekcję bez usuwania lamininy z pokrytych szkiełek. Przenieś około czterech do pięciu neurosfer na każde szkiełko. Pozostaw neurosfery do przyczepienia na co najmniej dwie do czterech godzin przed dodaniem 0,5 ml pożywki do różnicowania neuronów uzupełnionej o B 27 cyclic.Co drugi dzień należy wymienić połowę medium na medium z dodatkiem MP i czynników neurotroficznych. Komórki mogą być utrzymywane przez kilka miesięcy, jak pokazano tutaj. Niniejszy protokół opisuje, jak różnicować ludzkie PSC w taloniczne cefaliczne neurony glutaminergiczne poprzez kilka krytycznych etapów.Tworzenie agregatów PSC indukuje komórki neuroepithelialne, generuje progenitorów talon cephalic oraz prowadzi do różnicowania końcowego tych progenitorów w neurony talon cephalic. System ten jest wydajny i skuteczny w generowaniu na przykład progenitorów cephalic oraz neuronów glutaminergicznych. Bez dodania czynników różnicujących, HSC różnicowały się w kierunku linii neuralnej w ciągu 24 dni od rozpoczęcia różnicowania.Większość prekursorów neuronalnych była pozytywna w kierunku Fox G1, czynnika transkrypcyjnego ekspresjonowanego przez cephalon, lecz negatywna w kierunku HOXB4, markera komórek tylnego mózgowia i rdzenia kręgowego, co sugeruje pomyślną generację progenitorów telencefalicznych. Progenitory telencefaliczne te wykazują fenotyp grzbietowy, o czym świadczy ekspresja PAX6, markera ekspresjonowanego przez progenitory grzbietowe, przy jednoczesnym braku ekspresji NKX2.1, markera progenitorów brzusznych.Po dalszej różnicowaniu, te cefaliczne progenitorzy grzbietowi zróżnicowały się w neurony glutaminergiczne, które były pozytywne pod kątem markera glutaminergicznego. Neurony TBR1, które pozostawały pozytywne dla TBR1, były również pozytywne dla markerów neuronalnych beta-III tubuliny lub MAP2. Komórki te wykazywały również ekspresję pęcherzykowego transportera glutaminianu 1 lub Vglut1, markera dojrzałych neuronów glutaminergicznych, co sugeruje wydajną generację cefalicznych neuronów glutaminergicznych w hodowli.Po zastosowaniu tej procedury można przeprowadzić inne metody, takie jak elektrofizjologia, aby odpowiedzieć na dodatkowe pytania, na przykład czy neurony te mogą tworzyć połączenia synaptyczne z innymi komórkami. Po obejrzeniu tego filmu powinni Państwo posiadać pełną wiedzę na ten temat. Proces ten polegał na różnicowaniu ludzkich pluripotencjalnych komórek macierzystych w cefaliczne neurony glutaminergiczne poprzez kilka krytycznych etapów.Tworzenie agregatów pluripotencjalnych komórek macierzystych, indukcja komórek neuroepithelialnych, generowanie prekursorów głowowych oraz końcowe różnicowanie tych prekursorów w neurony głowowe.

the-specification-telencephalic-glutamatergic-neurons-from-human

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Neuronauka

Specyfikacja neuronów glutamergicznych telencfalon z ludzkich wielopotencjalnych komórek macierzystych

Opracowaliśmy protokół indukcji neuroblastów bezpośrednio z pluripotencjalnych ludzkich embrionalnych komórek macierzystych utrzymywanych w ściśle określonych warunkach z zastosowaniem małych cząsteczek, co umożliwia pozyskanie dużej ilości ludzkich progenitorów neuronalnych oraz typów komórek neuronalnych rozwijającego się OUN w celu regeneracji tkanki nerwowej.

Efektywne wyprowadzanie ludzkich progenitorów neuronalnych i neuronów z pluripotencjalnych ludzkich embrionalnych komórek macierzystych z zastosowaniem indukcji małymi cząsteczkami

Protokoły różnicowania neuronalnego pluripotencjalnych ludzkich komórek macierzystych (hPSCs) są często czasochłonne i wymagają zaawansowanych umiejętności w hodowli komórkowej. W niniejszej pracy dostosowaliśmy procedurę różnicowania opartą na małych cząsteczkach do formatu płytek wielodobojowych, co umożliwia prostą, szybką i wydajną generację ludzkich neuronów w sposób kontrolowany.

Szybka i wydajna generacja neuronów z ludzkich pluripotencjalnych komórek macierzystych w formacie płyt wielodołkowych

Ten film pokazuje proces różnicowania ciał embrionalnych (EB) w agregaty neuroepiteliczne i ich późniejszego podziału na komórki neuronalne i glejowe. Metoda ta pozwala na efektywne generowanie komórek neuronalnych i glejowych in vitro, które służą jako systemy testowe do badania toksyczności, a także oceny różnych szlaków zaangażowanych w neurotoksyczność.

Generowanie neuronów i komórek glejowych z ludzkich indukowanych pluripotencjalnych ciał embrionalnych pochodzących z komórek macierzystych

Ten film pokazuje proces indukowania ludzkich pluripotencjalnych komórek macierzystych do różnicowania się w neurony poprzez transfekcję ich zmodyfikowanymi lentiwirusami przenoszącymi gen neurogennego czynnika transkrypcyjnego pod kontrolą elementu reagującego na tetracyklinę, a następnie leczenie pochodną tetracykliny i pożywką do dojrzewania.

Różnicowanie ludzkich pluripotencjalnych komórek macierzystych w neuronach przy użyciu zmodyfikowanych lentiwirusów

My, opierając się na wiedzy z biologii rozwojowej i opublikowanych badaniach, opracowaliśmy zoptymalizowany protokół do efektywnego generowania neuronów dopaminergicznych A9 śródmózgowia zarówno z ludzkich embrionalnych komórek macierzystych, jak i ludzkich indukowanych pluripotencjalnych komórek macierzystych, co byłoby przydatne do modelowania chorób i terapii zastępczej w chorobie Parkinsona.

Ukierunkowane różnicowanie neuronów dopaminergicznych z ludzkich pluripotencjalnych komórek macierzystych

Dendrytyczne kolce neuronów piramidowych są miejscami najbardziej pobudzających synaps w korze mózgowej ssaków. Metoda ta opisuje ilościową analizę 3D morfologii kręgosłupa w ludzkich korowych piramidowych neuronach glutaminergicznym pochodzących z indukowanych pluripotencjalnych komórek macierzystych.

Trójwymiarowa kwantyfikacja kolców dendrytycznych z neuronów piramidowych pochodzących z ludzkich indukowanych pluripotencjalnych komórek macierzystych

Ludzkie indukowane pluripotencjalne komórki macierzyste (hiPSC) są uważane za potężne narzędzie do badań przesiewowych leków i substancji chemicznych oraz do rozwoju nowych modeli in vitro do testowania toksyczności, w tym neurotoksyczności. W tym miejscu opisano szczegółowy protokół różnicowania hiPSC w neurony i komórki glejowe.

Protokół różnicowania ludzkich indukowanych pluripotencjalnych komórek macierzystych w mieszane kultury neuronów i gleju do badań neurotoksyczności

W tym protokole staramy się opisać powtarzalną metodę łączenia zdysocjowanych ludzkich neuronów i astrocytów pochodzących z pluripotencjalnych komórek macierzystych w kokultury sfer 3D, utrzymywania tych sfer w warunkach swobodnego pływania, a następnie mierzenia aktywności obwodów synaptycznych kul za pomocą immunoanalizy i zapisów z matrycy wieloelektrodowej.

Modelowanie mikroukładów synaptycznych z kokulturami 3D astrocytów i neuronów z ludzkich pluripotencjalnych komórek macierzystych

Upośledzony transport i morfologia mitochondriów są zaangażowane w różne choroby neurodegeneracyjne. Prezentowany protokół wykorzystuje indukowane pluripotencjalne neurony przodomózgowia pochodzące z komórek macierzystych do oceny transportu mitochondrialnego i morfologii w dziedzicznej paraplegii spastycznej. Protokół ten pozwala na scharakteryzowanie transportu mitochondrialnego wzdłuż aksonów i analizę ich morfologii, co ułatwi badanie chorób neurodegeneracyjnych.

Analiza transportu i morfologii mitochondriów w indukowanych przez człowieka pluripotencjalnych neuronach pochodzących z komórek macierzystych w dziedzicznej paraplegii spastycznej

Opisujemy metodę różnicowania rdzenia kręgowego, indukowanych przez człowieka astrocytów i neuronów pochodzących z pluripotencjalnych źródeł oraz ich wspólnej hodowli do zapisu elektrofizjologicznego.

Stworzenie platformy elektrofizjologicznej do modelowania ALS z wykorzystaniem specyficznych regionalnie astrocytów i neuronów pochodzących z ludzkich pluripotencjalnych komórek macierzystych

Wywodzenie linii jelitowego układu nerwowego (ENS) z ludzkich pluripotencjalnych komórek macierzystych (hPSC) stanowi skalowalne źródło komórek do badania rozwoju i chorób ENS oraz do wykorzystania w medycynie regeneracyjnej. W tym miejscu przedstawiono szczegółowy protokół in vitro do wyprowadzania neuronów jelitowych z hPSC przy użyciu chemicznie zdefiniowanych warunków hodowli.

Różnicowanie linii jelitowego układu nerwowego od ludzkich pluripotencjalnych komórek macierzystych

Poznaj metodę różnicowania ludzkich komórek macierzystych w neurony kresomózgowiowe. Technika obejmuje indukcję neuroepitelialną, formowanie sfer neuro i dojrzewanie terminalne.

Specyfikacja neuronów glutaminergicznego kresomózgowia z ludzkich pluripotencjalnych komórek macierzystych

Przeglądaj więcej filmów