Badanie polaryzacji makrofagów przy użyciu makrofagów pochodzących ze szpiku kostnego

Generowanie makrofagów pochodzących ze szpiku kostnego do analizy polaryzacji. Kości udowe i piszczelowe są izolowane od myszy i pobierane są komórki szpiku kostnego. Komórki są następnie hodowane w pożywce zawierającej czynniki wzrostu w celu wywołania tworzenia makrofagów.

Po siedmiu dniach hodowli makrofagi pochodzące ze szpiku kostnego są traktowane różnymi bodźcami i spolaryzowanymi makrofagami. Odpowiedzi aktywacji są analizowane za pomocą cytometrii przepływowej, PCR w czasie rzeczywistym i uzyskuje się wyniki analizy Western BLOS, które wykazują wysoką czystość makrofagów pochodzących ze szpiku kostnego ze spolaryzowanymi odpowiedziami aktywacji na M1 lub M2. Bodźce kłamią.

Implikacją tej techniki jest podejście do terapii lub diagnozy chorób związanych z różnorodnością, w tym oporności na insulinę i CRO, ponieważ makrofagi naciekające T są głównym graczem w tym kontekście, wizualna demonstracja tej metody ma kluczowe znaczenie, ponieważ przyspieszenie komórek szpiku kostnego jest nieco trudne, a wydajność ma kluczowe znaczenie dla uzyskania wystarczającego przygotowania komórek do indukowania tworzenia makrofagów Praca w sterylnym kapturze. Rozpocznij ten protokół od kości udowej i piszczelowej wyizolowanych od myszy w wieku od sześciu do ośmiu tygodni w naczyniu do hodowli tkankowej. Opłucz kości w PBS, a następnie użyj nożyczek, aby rozciąć oba końce kości, uważając, aby nie usunąć zbyt dużo, trzymając kość kleszczami.

Wprowadzić igłę o rozmiarze 21 na 23 z 10-mililitrową strzykawką zawierającą zimny PBS z 2% FBS aktywowanym ogrzewaniem do jednego końca kości. Nacisnąć tłok, aby wypłukać szpik do nowego naczynia do hodowli tkankowej. Następnie przepuść szpik przez tę samą igłę cztery do sześciu razy, aby oddzielić komórki.

Następnie wlej komórki do sitka komórkowego o grubości 70 mikronów, aby usunąć grudki komórek, kości, włosy i inne komórki lub tkanki. Zbierz przepływ w stożkowej rurce o pojemności 50 mililitrów. Gdy roztwór przejdzie przez filtr, dodaj trzy objętości 0,8% chlorku amonu do przepływu i inkubuj na lodzie przez 10 minut.

Aby usunąć czerwone krwinki po inkubacji, należy obracać komórki w temperaturze 500 razy G przez pięć minut w temperaturze czterech stopni Celsjusza. Po wirowaniu ponownie zawiesić osad komórkowy w 20 do 50 mililitrach zimnego PBS z 2% FBS. Policz komórki za pomocą hemocytometru.

Wiruj komórki w temperaturze 500 razy G przez pięć minut w czterech stopniach Celsjusza. Po wylaniu supinatu. Przystąp do indukowania tworzenia BMDM zgodnie z opisem w następnej sekcji protokołu Aby wywołać tworzenie BMDM Resus, zawiesić izolowane komórki szpiku kostnego w pożywce wzrostowej BMDM w stężeniu dwukrotnym.

Wyśrodkuj sześć komórek na mililitr nasiona od jednego do dwóch razy od 10 do sześciu komórek w każdym dołku sześcio- lub 12-dołkowej płytki do hodowli tkankowej i inkubuj komórki w temperaturze 37 stopni Celsjusza. Wysiew w tym stężeniu ułatwi oderwanie do cytometrii przepływowej po trzech dniach. Zmień na świeżą pożywkę wzrostową BMDM w siódmym dniu.

Tworzenie dojrzałego BMDM ocenia się za pomocą analizy cytometrii przepływowej i przeciwciał sprzężonych z fluorolami w celu wykrycia komórek wykazujących ekspresję CD 11 B i F 4 80. Po zweryfikowaniu powstawania dojrzałego BMDM, zmiana na świeże to zmodyfikowane przez Cove medium do echo z 10% FBS i LPS lub LPS i interferonem gamma dla aktywacji M1 lub IL 4 lub IL 13 dla aktywacji M 2. Inkubować komórki w temperaturze 37 stopni Celsjusza po 24 godzinach.

Zbierz stymulowane b MDM, odłączając je od naczynia. Aby to zrobić, usuń pożywkę z komórek i przemyj PBS bez wapnia i magnezu. Następnie dodaj ciepłą 0,05% trypsynę zawierającą 0,48 milimola, EDTA inkubuj w temperaturze 37 stopni Celsjusza nie dłużej niż 10 minut, aby uniknąć utraty białek powierzchniowych z powodu nadmiernego trawienia.

Następnie dwukrotnie umyj komórki PBS zawierającym 10% FBS i przenieś je do probówek o pojemności 1,2 mililitra. Użyj przeciwciał do wykrycia ekspresji antygenów powierzchniowych komórek, w tym CD 11 BF four 80, CD 11 C, CD 2 0 6, CD 69, CD 80 lub CD 86 w różnych punktach czasowych. Stosowanie standardowych procedur barwienia cytometrią przepływową przy użyciu ilościowej reakcji PCR.

Określ poziomy ekspresji IL one, beta, TNF, alfa i IL six, aby ocenić aktywację M1 lub IL 10, IL 13, arginazy jeden i PPAR gamma, aby ocenić aktywację M2. Na koniec wykonaj western blot, aby ocenić aktywację szlaków sygnalizacji komórkowej zaangażowanych w aktywację makrofagów M1 lub M, aby ocenić czystość dojrzałego BMDM. Po indukcji przeprowadzono analizę cytometryczną przepływową przy użyciu przeciwciał przeciwko CD 11 BF four 80, CD 11 C i CD 2 0 6 B. MDM najpierw bramkowano na FSC i SSC w celu usunięcia DRI i koniugatów.

Dojrzałe b MDM zdefiniowano jako CD 11 B dodatnie F cztery 80 dodatnie subpopulacje, które są widoczne w prawym górnym rogu tego wykresu i zagrażały 95 do 99% bramkowanej populacji w celu oceny polaryzacji makrofagów. Przeprowadzono dalszą analizę. Pierwsze bramkowanie przeprowadzono w celu zidentyfikowania makrofagów naciekających tkanki, które są komórkami CD 11 B dodatnimi F cztery 80 dodatnie.

Wśród tych makrofagów M1, które są CD 11 C dodatnie i CD 2 0 6 ujemne, pojawiają się w ćwiartce drugiej, podczas gdy makrofagi M, które są CD 11 C ujemne i CD 2 0 6 dodatnie pojawiają się w kwadrancie czwartym. Aby ocenić aktywację makrofagów, komórki inkubowano z LPS w celu indukcji aktywacji M1 lub IL 4 w celu aktywacji M dwa. Po aktywacji rozmiar makrofagów zwiększył się, o czym świadczy przesunięcie FSCA makrofagów M1 lub M dwóch po 24 godzinach od stymulacji w porównaniu z M zero nieleczonym.

Po stymulacji przeanalizowano również markery powierzchniowe związane z aktywacją makrofagów. Markery wczesnej odpowiedzi CD 69 oceniano pięć lub 24 godziny po stymulacji, markery CD 80 i CD 86 analizowano po 48 godzinach od stymulacji. Jak pokazano tutaj, zwiększoną obfitość powierzchniowych CD 69, CD 80 i CD 86 zaobserwowano w stymulowanych makrofagach w celu oceny klasycznej i alternatywnej aktywacji makrofagów.

Osoby stymulowane LPS lub IL cztery przez 24 godziny zostały zebrane, a całkowity RNA został wyekstrahowany do analizy za pomocą ilościowego PCR w czasie rzeczywistym, jak pokazano tutaj. Podwyższoną ekspresję arginazy one i PPAR gamma wykryto w makrofagach M 2 w porównaniu z nieleczoną ekspresją cytokin prozapalnych makrofagów. Interleukina jeden beta TNF alfa zwiększyła się w makrofagach M1 w celu oceny aktywacji szlaku NF kappa B przez przeciwciała LPS przeciwko P 65 i P 65 związane z fosfo zastosowano w analizie western blot, jak pokazano tutaj.

Silniejsze pasmo przeciwko fosforylowanemu P 65 obserwuje się po podjęciu leczenia LPS. Łącznie dane te wskazują na makrofagi pochodzące ze szpiku kostnego ze spolaryzowanymi odpowiedziami aktywacji na bodźce M1 lub M2. Po obejrzeniu tego filmu powinieneś dobrze zrozumieć, jak generować makrofagi pochodzące ze szpiku kostnego, a następnie analizę aktywacji spolaryzowanej.

Próbując wykonać tę procedurę, należy pamiętać o ocenie czystości zróżnicowanych makrofagów przed przetestowaniem ich odpowiedzi. Po tej procedurze można przeprowadzić metodę taką jak transfekcja przejściowa genów lub SHRA, aby odpowiedzieć na dodatkowe pytanie, takie jak: w jaki sposób geny są zaangażowane w regulację aktywacji makrofagów?