Name: Badanie polaryzacji makrofagów przy użyciu makrofagów pochodzących ze szpiku kostnego (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-06-23T14:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 7 s
Description: Poznaj metodę polaryzacji makrofagów pochodzących ze szpiku kostnego myszy. Technika ta umożliwia analizę odpowiedzi aktywacyjnych M1 i M2 przy użyciu cytometrii przepływowej i PCR.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Ta praca była wspierana przez American Heart Association (BGIA 7850037 do dr Beiyan Zhou).

1. Izolacja komórek szpiku kostnego
<ol>
	<li>Odizoluj kości udowe i piszczelowe od 6-8 tygodniowych myszy, spłucz włosy, a następnie rozetnij kość.</li>
	<li>Użyj igły 21G i strzykawki o pojemności 10 ml, aby wypłukać szpik do zimnego, inaktywowanego termicznie płodowego surowicy bydlęcej PBS + 2% (FBS) (3-5 ml / mysz).</li>
	<li>Przepuść szpik przez igłę 21G 4-6 razy, aby oddzielić komórki.</li>
	<li>Przepuść komórki przez sitko o wielkości 70 μm, aby usunąć grudki komórek, kości, włosy i inne komórki/tkanki.</li>
	<li>Dodać 3 objętości roztworu NH4Cl (0,8% roztwór NH4Cl, technologia komórek macierzystych) i inkubować na lodzie przez 10 minut w celu usunięcia czerwonych krwinek.</li>
	<li>Wirować komórki w temperaturze 500 x g przez 5 minut w temperaturze 4 °C.</li>
	<li>Zawiesić osad komórkowy w zimnym PBS+2%FBS (20-50 ml, w zależności od ilości komórek).</li>
</ol>
2. Indukcja Formacja BMDM
<ol>
	<li>Zawiesić izolowane komórki szpiku kostnego w pożywce wzrostowej BMDM (2x106 komórek/ml).</li>
</ol>
Podłoże wzrostu BMDM:
Zmodyfikowane podłoże Dulbecco (IMDM) Iscove'a + 10% FBS + 15% przefiltrowane (0,2 μm) supernatant hodowli komórek L-929 (ATCC, CCL-1) (zawierający czynnik stymulujący monocyty, M-CSF) lub 10 ng/ml M-CSF.
Uwaga: Supernatant komórek L-929 zawiera M-CSF18. Aby zapewnić skuteczną aktywność kondycjonowanej pożywki, 5 X 105 komórek L-929 wysiewa się w kolbach T75 cm2 przez 6-7 dni, kondycjonowane podłoże zbiera się i przepuszcza przez filtr 0,45 μM przed użyciem. Średnie podwielokrotności można zużyć natychmiast lub przechowywać w temperaturze -80 °C przez 1-2 miesiące.
<ol start="2">
	<li>Komórki nasienne na 6 lub 12-dołkowych płytkach do hodowli tkankowej (w zależności od projektu eksperymentalnego) (Corning Costar).</li>
	<li>Zmień świeżą pożywkę wzrostową BMDM w dniu 3.</li>
	<li>W 7 dniu tworzenie dojrzałego BMDM ocenia się za pomocą analizy cytometrii przepływowej i przeciwciał sprzężonych z fluoroforami w celu wykrycia komórek wykazujących ekspresję CD11b i F4/80.</li>
</ol>
3. Aktywacja spolaryzowana BMDM
<ol>
	<li>W 7 dniu zmień na świeżą pożywkę stymulacyjną: do aktywacji M1 użyj IMDM zawierającego 10% FBS i 100 ng/ml LPS lub 100 ng/ml LPS z 50 ng/ml IFNγ; do aktywacji M2 użyj IMDM zawierającego 10% FBS z 10 ng/ml IL-4 i/lub 10 ng/ml IL-13.</li>
	<li>Zbierz stymulowane BMDM, odłączając je od naczynia za pomocą ciepłej 0,05% trypsyny, a następnie dwukrotnie myjąc komórki PBS zawierającym 10% FBS.</li>
</ol>
Uwaga: Aby odłączyć i ponownie zawiesić dojrzałe makrofagi po różnicowaniu, można użyć 0,05% roztworu trypsyny (zawierającego 0,48 mM EDTA, Invitrogen) lub 2-5 mM EDTA w PBS wolnym od Ca i Mg lub zrównoważonym buforze Hanka (HBSS). W przypadku stosowania pożywki trawiennej zawierającej trypsynę, komórki są poddawane działaniu środka w temperaturze 37 °C przez mniej niż 10 minut, aby uniknąć utraty białek powierzchniowych z powodu nadmiernego trawienia.
<ol start="3">
	<li>Użyj przeciwciał do wykrywania ekspresji antygenów powierzchniowych komórek, w tym CD11b, F4/80, CD11c, CD206, CD69, CD80 lub CD86 w różnych punktach czasowych przy użyciu standardowych procedur barwienia cytometrią przepływową.</li>
	<li>Określ ekspresję genów charakterystycznych dla aktywowanych makrofagów M1 i M2, w tym IL-1β, TNF-α i IL-6 (aktywacja M1) lub IL-10, IL-13, arginazy1 i PPARγ (aktywacja M2) za pomocą qRT-PCR. Określ aktywację komórkowych szlaków sygnałowych zaangażowanych w aktywację makrofagów M1 lub M2 za pomocą analizy western blot.</li>
</ol>

<ol><li>Meng, Z. X., Wang, G. X., Lin, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+microrna+circuitry+links+macrophage+polarization+to+metabolic+homeostasis%5BTitle%5D)+AND+%22Circulation%22%5BJournal%5D)">A microrna circuitry links macrophage polarization to metabolic homeostasis.</a> Circulation. , (2012).</li>
<li>Lumeng, C. N., Bodzin, J. L., Saltiel, A. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Obesity+induces+a+phenotypic+switch+in+adipose+tissue+macrophage+polarization%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Clin.+Invest%22%5BJournal%5D)">Obesity induces a phenotypic switch in adipose tissue macrophage polarization.</a> J. Clin. Invest. 117, 175-184 (2007).</li>
<li>Gordon, S., Taylor, P. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Monocyte+and+macrophage+heterogeneity%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Rev.+Immunol%22%5BJournal%5D)">Monocyte and macrophage heterogeneity.</a> Nat. Rev. Immunol. 5, 953-964 (2005).</li>
<li>Gordon, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Alternative+activation+of+macrophages%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Rev.+Immunol%22%5BJournal%5D)">Alternative activation of macrophages.</a> Nat. Rev. Immunol. 3, 23-35 (2003).</li>
<li>Tabas, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Macrophage+death+and+defective+inflammation+resolution+in+atherosclerosis%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Rev.+Immunol%22%5BJournal%5D)">Macrophage death and defective inflammation resolution in atherosclerosis.</a> Nat. Rev. Immunol. 10, 36-46 (2010).</li>
<li>Odegaard, J. I., Ricardo-Gonzalez, R. R., Goforth, M. H., Morel, C. R., Subramanian, V., Mukundan, L., Eagle, A. R., Vats, D., Brombacher, F., Ferrante, A. W., Chawla, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Macrophage-specific+pparg+controls+alternative+activation+and+improves+insulin+resistance%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Macrophage-specific pparg controls alternative activation and improves insulin resistance.</a> Nature. 447, 1116-1120 (2007).</li>
<li>Odegaard, J. I., Ricardo-Gonzalez, R. R., Red Eagle, A., Vats, D., Morel, C. R., Goforth, M. H., Subramanian, V., Mukundan, L., Ferrante, A. W., Chawla, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Alternative+m2+activation+of+kupffer+cells+by+ppard+ameliorates+obesity-induced+insulin+resistance%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Metabolism%22%5BJournal%5D)">Alternative m2 activation of kupffer cells by ppard ameliorates obesity-induced insulin resistance.</a> Cell Metabolism. 7, 496-507 (2008).</li>
<li>Vats, D., Mukundan, L., Odegaard, J. I., Zhang, L., Smith, K. L., Morel, C. R., Greaves, D. R., Murray, P. J., Chawla, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Oxidative+metabolism+and+pgc-1%5Bbeta%5D+attenuate+macrophage-mediated+inflammation%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Metabolism%22%5BJournal%5D)">Oxidative metabolism and pgc-1[beta] attenuate macrophage-mediated inflammation.</a> Cell Metabolism. 4, 13-24 (2006).</li>
<li>Mosser, D. M., Edwards, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Exploring+the+full+spectrum+of+macrophage+activation%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Immunol%22%5BJournal%5D)">Exploring the full spectrum of macrophage activation.</a> Nat Rev Immunol. 8, 958-969 (2008).</li>
<li>Arkan, M. C., Hevener, A. L., Greten, F. R., Maeda, S., Li, Z. -W., Long, J. M., Wynshaw-Boris, A., Poli, G., Olefsky, J., Karin, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ikk-b+links+inflammation+to+obesity-induced+insulin+resistance%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Med%22%5BJournal%5D)">Ikk-b links inflammation to obesity-induced insulin resistance.</a> Nat. Med. 11, 191-198 (2005).</li>
<li>Saberi, M., Woods, N. -B., de Luca, C., Schenk, S., Lu, J. C., Bandyopadhyay, G., Verma, I. M., Olefsky, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hematopoietic+cell-specific+deletion+of+toll-like+receptor+4+ameliorates+hepatic+and+adipose+tissue+insulin+resistance+in+high-fat-fed+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Metab%22%5BJournal%5D)">Hematopoietic cell-specific deletion of toll-like receptor 4 ameliorates hepatic and adipose tissue insulin resistance in high-fat-fed mice.</a> Cell Metab. 10, 419-429 (2009).</li>
<li>Kang, K., Reilly, S. M., Karabacak, V., Gangl, M. R., Fitzgerald, K., Hatano, B., Lee, C. -H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Adipocyte-derived+th2+cytokines+and+myeloid+ppard+regulate+macrophage+polarization+and+insulin+sensitivity%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Metabolism%22%5BJournal%5D)">Adipocyte-derived th2 cytokines and myeloid ppard regulate macrophage polarization and insulin sensitivity.</a> Cell Metabolism. 7, 485-495 (2008).</li>
<li>Bouhlel, M. A., Derudas, B., Rigamonti, E., Dievart, R., Brozek, J., Haulon, S., Zawadzki, C., Jude, B., Torpier, G., Marx, N., Staels, B., Chinetti-Gbaguidi, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pparg+activation+primes+human+monocytes+into+alternative+m2+macrophages+with+anti-inflammatory+properties%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Metabolism%22%5BJournal%5D)">Pparg activation primes human monocytes into alternative m2 macrophages with anti-inflammatory properties.</a> Cell Metabolism. 6, 137-143 (2007).</li>
<li>Bronte, V., Zanovello, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulation+of+immune+responses+by+l-arginine+metabolism%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Rev.+Immunol%22%5BJournal%5D)">Regulation of immune responses by l-arginine metabolism.</a> Nat. Rev. Immunol. 5, 641-654 (2005).</li>
<li>Zhuang, G., Meng, C., Guo, X., Cheruku, P. S., Shi, L., Xu, H., Li, H., Wang, G., Evans, A. R., Safe, S., Wu, C., Zhou, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+novel+regulator+of+macrophage+activation%3A+Mir-223+in+obesity-associated+adipose+tissue+inflammation%5BTitle%5D)+AND+%22Circulation%22%5BJournal%5D)">A novel regulator of macrophage activation: Mir-223 in obesity-associated adipose tissue inflammation.</a> Circulation. 125, 2892-2903 (2012).</li>
<li>Kradin, R. L., McCarthy, K. M., Preffer, F. I., Schneeberger, E. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Flow-cytometric+and+ultrastructural+analysis+of+alveolar+macrophage+maturation%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Leukoc.+Biol%22%5BJournal%5D)">Flow-cytometric and ultrastructural analysis of alveolar macrophage maturation.</a> J. Leukoc. Biol. 40, 407-417 (1986).</li>
<li>Stein, M., Keshav, S., Harris, N., Gordon, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Interleukin+4+potently+enhances+murine+macrophage+mannose+receptor+activity%3A+A+marker+of+alternative+immunologic+macrophage+activation%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Exp.+Med%22%5BJournal%5D)">Interleukin 4 potently enhances murine macrophage mannose receptor activity: A marker of alternative immunologic macrophage activation.</a> J. Exp. Med. 176, 287-292 (1992).</li>
<li>Strassmann, G., Bertolini, D. R., Kerby, S. B., Fong, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulation+of+murine+mononuclear+phagocyte+inflammatory+products+by+macrophage+colony-stimulating+factor.+Lack+of+il-1+and+prostaglandin+e2+production+and+generation+of+a+specific+il-1+inhibitor%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Immunol%22%5BJournal%5D)">Regulation of murine mononuclear phagocyte inflammatory products by macrophage colony-stimulating factor. Lack of il-1 and prostaglandin e2 production and generation of a specific il-1 inhibitor.</a> J. Immunol. 147, 1279-1285 (1991).</li>
<li>Biswas, S. K., Mantovani, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Macrophage+plasticity+and+interaction+with+lymphocyte+subsets%3A+Cancer+as+a+paradigm%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Immunol%22%5BJournal%5D)">Macrophage plasticity and interaction with lymphocyte subsets: Cancer as a paradigm.</a> Nat. Immunol. 11, 889-896 (2010).</li>
<li>Sica, A., Mantovani, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Macrophage+plasticity+and+polarization%3A+In+vivo+veritas%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Clin.+Invest%22%5BJournal%5D)">Macrophage plasticity and polarization: In vivo veritas.</a> J. Clin. Invest. 122, 787-795 (2012).</li>
</ol>

Nie stwierdzono konfliktu interesów.

Przedstawiamy tutaj prostą i łatwą do adaptacji procedurę in vitro w celu wywołania aktywacji makrofagów pochodzących z komórek progenitorowych szpiku kostnego. Procedura ta może być wykorzystana do badania mechanizmów odpowiedzialnych za polaryzację makrofagów. Czystość dojrzałych makrofagów uzyskanych przy użyciu tego protokołu wynosi średnio od 95 do 99% i nie są wymagane żadne dodatkowe procedury oczyszczania. Aby zbadać funkcję określonych genów będących przedmiotem zainteresowania w kontekście polaryzacji...

W odróżnieniu od klasycznych reakcji zapalnych, makrofagi, które infiltrują tkanki, często wykazują spolaryzowany stan aktywacji, który odgrywa kluczową rolę w regulacji funkcji fizjologicznych tkanki gospodarza1-8. Po stymulacji aktywację makrofagów można podzielić na klasyczną (M1) i alternatywną (M2) aktywację2, 4, 9 . Aktywacja makrofagów M1 zależy od receptorów Toll-podobnych (TLR) i aktywacji czynnika jądrowego kappa B (NFκB) / kinazy N-końcowej c-Jun 1 (JNK1), co prowadzi do produkcji cytokin zapalnych, takich jak TNF-α i IL-1β oraz aktywacji iNOS, która powoduje zwiększoną produkcję reaktywnych form tlenu, takich jak tlenek azotku (NO) 10, 11 . W przeciwieństwie do tego, aktywacja makrofagów M2 rekrutuje szlaki PPARγ, PPARδ lub IL-4-STAT6, prowadząc do alternatywnej, przeciwzapalnej (M2) aktywacji, która jest związana z regulacją w górę receptora mannozy CD206 i arginazy 1(Arg1) 6, 12-14 .
Makrofagi pochodzące ze szpiku kostnego (BMDM) stanowią idealny model in vitro do zrozumienia mechanizmów kontrolujących polaryzację aktywowanych makrofagów15. W szczególności aktywacja makrofagów M1 może być indukowana przez stymulację lipopolisacharydami (LPS), podczas gdy polaryzacja makrofagów M2 może być indukowana przez IL-4 i / lub IL-13. Dojrzałe makrofagi pochodzące ze szpiku kostnego i aktywowane makrofagi można zidentyfikować za pomocą analizy cytometrii przepływowej pod kątem ekspresji antygenów powierzchniowych, w tym CD11b, F4/80, CD11c, CD206, CD69, CD80 i CD869, 16, 17. Ponadto zmiany w produkcji cytokin i szlakach sygnalizacji komórkowej związane z polaryzacją makrofagów można mierzyć odpowiednio za pomocą ilościowego RT-PCR i western blot. Podsumowując, makrofagi pochodzące ze szpiku kostnego myszy mogą służyć jako odpowiedni model do badania polaryzacji makrofagów in vitro.

<table><tbody><tr><td>IMDM</td><td>Thermo Scientific</td><td>SH30259.01</td><td></td></tr><tr><td>Płodowa surowica bydlęca</td><td>Invitrogen</td><td>10438-026</td><td></td></tr><tr><td>Mysz GM-CSF</td><td>PeproTech</td><td>315-03</td><td></td></tr><tr><td>NH4Cl</td><td>StemCell Technologies</td><td>7850</td><td></td></tr><tr><td>L-929</td><td>ATCC</td><td>CCL-1</td><td></td></tr><tr><td>70 &mu; m Filtr siatkowy do komórek</td><td>BD Biosciences</td><td>352350</td><td></td></tr><tr><td>10 x PBS</td><td>Thermo Scientific</td><td>AP-9009-10</td><td></td></tr><tr><td>Anty-mysz CD11b-APC</td><td>eBioscience</td><td>17-0112-81</td><td></td></tr><tr><td>Anty-mysz F4/80-FITC</td><td>eBioscience</td><td>11-4801-81</td><td></td></tr><tr><td>Anty-mysz CD69-PE</td><td>eBioscience</td><td>12-0691-81</td><td></td></tr><tr><td>Anty-mysz CD86-PE</td><td>eBioscience</td><td>12-0862-81</td><td></td></tr><tr><td>Jod propidynowy</td><td>Invitrogen</td><td>P3566</td><td></td></tr></tbody></table>

badanie polaryzacji makrofagów przy użyciu makrofagów pochodzących ze szpiku kostnego

Investigation of Macrophage Polarization Using Bone Marrow Derived Macrophages

Artykuł opisuje łatwy w użyciu adaptacyjny model in vitro do badania polaryzacji makrofagów. W obecności GM-CSF/M-CSF krwiotwórcze komórki macierzyste/progenitorowe ze szpiku kostnego są kierowane do różnicowania monocytowego, a następnie stymulacji M1 lub M2. Stan aktywacji można śledzić za pomocą zmian w antygenach powierzchniowych komórki, ekspresji genów i szlakach sygnalizacji komórkowej.

Schematycznego opisu procedury generowania BMDM przedstawiono na Rysunku 1. Wysoką czystość dojrzałych makrofagów można zaobserwować w 7. dniu, kiedy stanowią one od 95 do 99% komórek CD11b+F4/80+ (Rysunek 2). Polaryzację makrofagów można zbadać przy użyciu przeciwciał przeciwko CD11b, F4/80, CD11c i CD206, a następnie przeprowadzić analizę cytometryczną. Jak pokazano na Rysunku 3, makrofagi M1 są wykrywane jako komórki CD11b+F4/80+CD11c+CD206- (Q2), natomiast makrofagi ...

Artykuł opisuje łatwy w użyciu adaptacyjny model in vitro do badania polaryzacji makrofagów. W obecności GM-CSF/M-CSF krwiotwórcze komórki macierzyste/progenitorowe ze szpiku kostnego są kierowane do różnicowania monocytowego, a następnie stymulacji M1 lub M2. Stan aktywacji można śledzić za pomocą zmian w antygenach powierzchniowych komórki, ekspresji genów i szlakach sygnalizacji komórkowej.

Badanie polaryzacji makrofagów przy użyciu makrofagów pochodzących ze szpiku kostnego

The article describes a readily easy adaptive in vitro model to investigate macrophage polarization. In the presence of GM-CSF/M-CSF, hematopoietic ...

W celu uzyskania makrofagów pochodzących z szpiku kostnego do analizy polaryzacji. Kości udowe i piszczelowe są izolowane od myszy, a następnie pobierane są komórki szpiku kostnego. Komórki są następnie hodowane w pożywce zawierającej czynniki wzrostu w celu indukcji różnicowania w makrofagi.Po siedmiu dniach hodowli makrofagi pochodzące z szpiku kostnego poddaje się działaniu różnych bodźców w celu ich polaryzacji. Odpowiedzi aktywacyjne analizuje się za pomocą cytometrii przepływowej, qPCR oraz analizy western blot; otrzymane wyniki wykazują wysoką czystość makrofagów pochodzących z szpiku kostnego z polaryzacją odpowiedzi aktywacyjnej w kierunku fenotypu M1 lub M2, w zależności od zastosowanego bodźca.Zastosowanie tej techniki ma znaczenie dla terapii lub diagnostyki różnorodnych powiązanych ze sobą chorób, w tym insulinooporności oraz CRO, ponieważ makrofagi infiltrujące tkankę są w tym kontekście kluczowymi elementami. Wizualna prezentacja tej metody jest niezbędna, ponieważ izolacja komórek szpiku kostnego jest dość trudna, a wydajność ma krytyczne znaczenie dla uzyskania wystarczającej liczby komórek do badania w celu indukowania tworzenia makrofagów. Pracując w sterylnej komorze z laminarnym przepływem powietrza, rozpocznij protokół od kości udowych i piszczeli wyizolowanych od myszy w wieku od sześciu do ośmiu tygodni, umieszczonych w naczyniu do hodowli tkankowej. Przepłucz kości w PBS, a następnie za pomocą nożyczek roztnij oba końce kości, uważając, aby nie usunąć zbyt dużo tkanki podczas trzymania kości pęsetą.Do jednego końca kości wprowadź igłę o rozmiarze 21 lub 23 G połączoną ze strzykawką 10 ml zawierającą zimny PBS z 2% FBS aktywowanym termicznie. Naciśnij tłok, aby wypłukać szpik do nowej szalki hodowlanej. Następnie przepuść szpik przez tę samą igłę od czterech do sześciu razy w celu dysocjacji komórek.Następnie przelej komórki przez sitko komórkowe o rozmiarze oczek 70 µm, aby usunąć skupiska komórek, fragmenty kości, włosy oraz inne komórki lub tkanki. Przesącz zbierz do stożkowej probówki o pojemności 50 mL. Po przejściu roztworu przez filtr, dodaj do przesączu trzykrotność jego objętości 0,8% chlorku amonu i inkubuj w lodzie przez 10 minut.Aby usunąć erytrocyty po inkubacji, odwiruj komórki z prędkością 500 ×g przez pięć minut w temperaturze 4 °C. Po wirowaniu resuspenduj osad komórkowy w 20–50 ml zimnego PBS z 2% FBS. Policz komórki, używając cytometru krwi.Odwiruj komórki z prędkością 500 ×g przez pięć minut w temperaturze 4 °C. Po odlaniu supernatantu przystąp do indukcji powstawania BMDM zgodnie z opisem w następnej sekcji protokołu. Aby zindukować powstawanie BMDM, resuspenderuj wyizolowane komórki szpiku kostnego w pożywce wzrostowej BMDM przy dwukrotnym stężeniu.Wysiej komórki w zagęszczeniu 6 × 10⁶ komórek na ml (od 1 do 2 × 10⁶ komórek w każdej studni) na płytce hodowlanej do kultur tkankowych z 6 lub 12 studniami i inkubuj komórki w temperaturze 37 °C. Wysiewanie w tym stężeniu ułatwi odzyskiwanie komórek do cytometrii przepływowej po trzech dniach. W siódmym dniu wymień pożywkę na świeżą pożywkę do wzrostu BMDM.Powstanie dojrzałych BMDM ocenia się za pomocą analizy cytometrii przepływowej oraz przeciwciał sprzężonych z fluoroforem w celu wykrycia komórek wykazujących ekspresję CD 11 B i F four 80. Po potwierdzeniu powstania dojrzałych BMDM, należy zmienić pożywkę na świeżą modyfikowaną pożywkę Is cove's do echo's z 10% FBS oraz LPS lub LPS i interferon gamma dla aktywacji M1, bądź IL four lub IL 13 dla aktywacji M2. Komórki inkubuje się w temperaturze 37 °C przez 24 godziny.Zbierz stymulowane b MDMs, odrywając je od powierzchni naczynia. W tym celu usuń medium z komórek i przemyj je PBS bez dodatku wapnia i magnezu. Następnie dodaj ciepłą 0,05% trypsynę zawierającą 0,48 mM EDTA i inkubuj w temperaturze 37°C nie dłużej niż 10 minut, aby uniknąć utraty białek powierzchniowych na skutek nadmiernego trawienia.Następnie komórki należy przemyć dwukrotnie w PBS zawierającym 10% FBS i przenieść do probówek do próbek o pojemności 1,2 mililitra. Do wykrywania ekspresji antygenów powierzchni komórkowych, w tym CD 11b, F4/80, CD 11c, CD 206, CD 69, CD 80 lub CD 86, w różnych punktach czasowych należy użyć przeciwciał. Procedurę barwienia wykonuje się zgodnie ze standardowymi metodami cytometrii przepływowej oraz ilościową PCR.Oznacz poziomy ekspresji IL-1β, TNF-α i IL-6 w celu oceny aktywacji M1 lub IL-10, IL-13, arginazy 1 i PPAR-γ w celu oceny aktywacji M2. Na koniec przeprowadź analizę western blotting, aby ocenić aktywację szlaków sygnałowych komórkowych zaangażowanych w aktywację makrofagów M1 lub M2 w celu zweryfikowania czystości dojrzałych BMDM. Po indukcji przeprowadzono analizę cytometryczną z użyciem przeciwciał przeciwko CD11b, F4/80, CD11c i CD206. W pierwszej kolejności BMDM wyselekcjonowano na podstawie FSC i SSC, aby usunąć debris i konjugaty.Dojrzałe b MDM zdefiniowano jako subpopulacje CD 11 B pozytywne i F four 80 pozytywne, które widoczne są w prawym górnym rogu tego wykresu i stanowiły od 95 do 99% populacji bramkowanej w celu oceny polaryzacji makrofagów. Przeprowadzono dalszą analizę. W pierwszej kolejności wykonano bramkowanie w celu zidentyfikowania makrofagów naciekających tkankę, którymi są komórki CD 11 B pozytywne i F four 80 pozytywne.Wśród tych makrofagów M1, które są CD11c dodatnie i CD206 ujemne, pojawiają się w kwadrancie drugim, podczas gdy makrofagi M2, będące CD11c ujemne i CD206 dodatnie, pojawiają się w kwadrancie czwartym. Aby ocenić aktywację makrofagów, komórki inkubowano z LPS w celu indukcji aktywacji M1 lub z IL-4 w celu aktywacji M2. Po aktywacji rozmiar makrofagów wzrósł, co potwierdzono poprzez przesunięcie FSCA makrofagów M1 lub M2 w 24 godzinie po stymulacji w porównaniu z nieleczonymi makrofagami M0.Po stymulacji przeanalizowano również markery powierzchniowe związane z aktywacją makrofagów. Marker wczesnej odpowiedzi CD 69 oceniano po 5 lub 24 godzinach od stymulacji, natomiast markery CD 80 i CD 86 analizowano po 48 godzinach od stymulacji. Jak tutaj pokazano, w stymulowanych makrofagach zaobserwowano zwiększoną obecność powierzchniowych markerów CD 69, CD 80 i CD 86 w celu oceny klasycznej i alternatywnej aktywacji makrofagów.Komórki stymulowane LPS lub IL-4 przez 24 godziny zostały zebrane, a całkowite RNA wyekstrahowano w celu analizy metodą ilościowej reakcji PCR w czasie rzeczywistym, jak pokazano tutaj. W makrofagach M2 wykryto zwiększoną ekspresję arginazy 1 oraz PPAR gamma w porównaniu z makrofagami niepoddanymi działaniu czynników. Ekspresja cytokin prozapalnych, takich jak interleukina 1 beta oraz TNF alpha, wzrosła w makrofagach M1. Aby ocenić aktywację ścieżki NF kappa B przez LPS, w analizie western blot, jak pokazano tutaj, wykorzystano przeciwciała przeciwko P65 oraz fosfo-P65.Po zastosowaniu LPS obserwuje się silniejszy prążek przeciwciała przeciwko fosforylowanemu P 65. Wspólnie dane te wskazują na makrofagi pochodzące z szpiku kostnego o spolaryzowanych odpowiedziach aktywacyjnych na bodźce M1 lub M2. Po obejrzeniu tego filmu powinni Państwo posiadać dobrą wiedzę na temat tego, jak generować makrofagi pochodzące z szpiku kostnego, a następnie przeprowadzać analizę polaryzacji aktywacji.Podczas wykonywania tej procedury ważne jest, aby pamiętać o ocenie czystości zróżnicowanych makrofagów przed badaniem ich odpowiedzi. Po przeprowadzeniu tej procedury można zastosować metodę taką jak przejściowa transfekcja genów lub SHRA, aby odpowiedzieć na dodatkowe pytania, na przykład: w jaki sposób geny uczestniczą w regulacji aktywacji makrofagów?

investigation-macrophage-polarization-using-bone-marrow-derived

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Immunologia i infekcje

Badanie polaryzacji makrofagów z wykorzystaniem makrofagów pochodzących z szpiku kostnego

Makrofagi odgrywają centralną rolę w homeostazie i patologii wielu tkanek. Przedstawiony tutaj protokół opisuje metody usuwania makrofagów in vivo, otrzymywania spolaryzowanych makrofagów z aspiratów szpiku kostnego oraz adoptywnego transferu makrofagów do myszy. Techniki te pozwalają na określenie roli, jaką spolaryzowane makrofagi odgrywają w zdrowiu i chorobie.

Wyczerpanie i rekonstytucja makrofagów u myszy

W tym filmie demonstrujemy procedurę indukowania różnicowania i polaryzacji monocytów pochodzących z krwi obwodowej na makrofagi M1 lub M2. Inkubacja z czynnikiem stymulującym tworzenie kolonii granulocytów-makrofagów, lipopolisacharydem i interferonem-gamma daje prozapalne makrofagi M1, podczas gdy inkubacja z czynnikiem stymulującym tworzenie kolonii makrofagów i interleukiną-4 indukuje przeciwzapalną produkcję makrofagów M2.

Różnicowanie i polaryzacja komórek pochodzących z monocytów w komórki podobne do makrofagów

Makrofagi pochodzące z monocytów są ważnymi komórkami wrodzonego układu odpornościowego. W tym miejscu opisujemy łatwy w użyciu model in vitro do generowania tych komórek. Korzystając z wirowania gradientowego, izolacji ujemnych kulek i określonych warunków hodowli komórek, można wygenerować makrofagi pochodzące z monocytów do badań fenotypowych i funkcjonalnych.

Model in vitro do badania heterogeniczności różnicowania i polaryzacji ludzkich makrofagów

Prezentujemy prosty i skuteczny protokół do generowania ludzkich makrofagów. Płaszcze kożuchowe są przetwarzane przez wirowanie gradientowe o podwójnej gęstości, a izolowane monocyty są następnie różnicowane do makrofagów w workach do hodowli komórkowych pokrytych teflonem. Maksymalizuje to wydajność makrofagów i ułatwia pobieranie komórek do kolejnych eksperymentów.

Izolacja ludzkich monocytów przez wirowanie z podwójnym gradientem i ich różnicowanie do makrofagów w workach do hodowli komórkowych pokrytych teflonem

Przeprogramowanie metaboliczne jest cechą charakterystyczną i warunkiem wstępnym polaryzacji makrofagów M1 i M2. Niniejszy manuskrypt opisuje test do pomiaru podstawowych parametrów glikolizy i funkcji mitochondriów w makrofagach pochodzących ze szpiku kostnego myszy. Narzędzie to można zastosować do zbadania, w jaki sposób poszczególne czynniki wpływają na metabolizm i fenotyp makrofagów.

Charakterystyka metaboliczna spolaryzowanych makrofagów pochodzących ze szpiku kostnego M1 i M2 przy użyciu analizy strumienia zewnątrzkomórkowego w czasie rzeczywistym

Przedstawiamy protokół uzyskiwania sygnatur proteomicznych ludzkich makrofagów i stosowania go do określania wpływu środowiska o niskiej zawartości tlenu na polaryzację makrofagów.

Analiza proteomiczna polaryzacji ludzkich makrofagów w środowisku o niskiej zawartości tlenu

Ten protokół dostarcza metodę badania zakażenia Mycobacterium tuberculosis w ludzkich makrofagach spolaryzowanych M1 lub M2 w oparciu o różnicowanie monocytów krwi obwodowej do komórek podobnych do makrofagów, które są zakażone znakowanym przez GFP wirulentnym szczepem H37Rv, i analizowane za pomocą cytometrii przepływowej przy użyciu 10-kolorowego panelu, w tym ekspresji wybranych markerów M1/M2.

Polaryzacja ludzkich komórek pochodzących z monocytów M1 i M2 oraz analiza za pomocą cytometrii przepływowej po zakażeniu Mycobacterium tuberculosis

Makrofagi podobne do M2 związane z nowotworami (TAM) są związane z progresją guza i złym rokowaniem w raku. Protokół ten służy jako szczegółowy przewodnik do powtarzalnego różnicowania i polaryzacji komórek podobnych do monocytów THP-1 w makrofagi podobne do M2 w ciągu 14 dni. Model ten jest podstawą do badania przeciwzapalnego działania TAM w mikrośrodowisku guza.

Różnicowanie i polaryzacja makrofagów do fenotypu podobnego do M2 przy użyciu ludzkiej linii komórkowej białaczki THP-1 podobnej do monocytów

Obecny protokół opisuje izolację i hodowlę makrofagów pochodzących ze szpiku kostnego od myszy.

Izolacja i hodowla makrofagów pochodzących ze szpiku kostnego od myszy

Tutaj prezentujemy szczegółowy protokół oceny potencjału immunomodulacyjnego powierzchni implantów in vitro, mający na celu poprawę wiarygodności i odtwarzalności obecnych protokołów oraz promowanie dalszych badań. Profile cytokin wydzielniczych, ekspresję mRNA i markery powierzchni komórek monitorowano za pomocą makrofagów pochodzących z monocytów krwi w celu zbadania polaryzacji makrofagów hodowanych na tytanie.

Polaryzacja i charakterystyka ludzkich makrofagów pochodzących z monocytów typu M1 i M2 na powierzchniach implantów

Poznaj metodę polaryzacji makrofagów pochodzących ze szpiku kostnego myszy. Technika ta umożliwia analizę odpowiedzi aktywacyjnych M1 i M2 przy użyciu cytometrii przepływowej i PCR.

Badanie polaryzacji makrofagów przy użyciu makrofagów pochodzących ze szpiku kostnego

Przeglądaj więcej filmów