Name: Wytwarzanie chipów mikroprzepływowych i metoda wykrywania grypy (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-03-26T13:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 43 s
Description: Poznaj metodę wytwarzania mikroprzepływowych chipów termoplastycznych do wykrywania wirusa grypy A. Technologia integruje ekstrakcję kwasów nukleinowych, odwrotną transkrypcję i amplifikację PCR w jednym urządzeniu.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

To badanie było wspierane przez National Institutes of Health (NIH) grant R01 EB008268.

1. Produkcja chipów12
<ol>
 <li>Przygotuj dwie blaszki z granulek Zeonex 690R: rozprowadź 8-9 gramów granulek Zeonex równomiernie na środku metalowej płytki, podgrzej na rozgrzanej prasie w temperaturze 198 °C przez 5 minut, a następnie powoli naciskaj do 2,500 psi przez kolejne 5 minut. Aby wykonać ten krok, użyliśmy gorącej prasy Carver.</li>
 <li>Wytłocz kanał mikroprzepływowy w płytce za pomocą formy epoksydowej. Szczegóły dotyczące produkcji formy przedstawiono w innym miejscu12 (projekt kanału na rysunku 2b): umieść jedną tabliczkę na formie epoksydowej; Podgrzej je na rozgrzanej prasie w temperaturze 157 °C przez 10 minut, a następnie powoli dociśnij do 1 000 psi przez kolejne 10 minut. Usuń płytkę nazębną z formy ręcznie lub za pomocą szczypiec, zanim ostygnie. (Uwaga: podczas tego kroku noś rękawice termiczne.)</li>
 <li>Wywierć otwory w wytłoczonym wiórze na wlocie, króćcu odpływowym i wylocie kanału mikroprzepływowego. Do wykonania trzech otworów użyliśmy wiertła o średnicy 1,25 mm.</li>
 <li>Połącz wytłoczony chip z inną płytką (na górze): Umyj frytki kolejno IPA, RNAse Away i wodą dejonizowaną; Wysuszyć je na powietrzu i podgrzać na rozgrzanej prasie w temperaturze 131 °C przez 10 minut, a następnie prasować pod ciśnieniem 350 psi przez kolejne 10 minut.</li>
 <li>Przymocuj nanoporty na portach wlotowych, odpływowych i wylotowych oddzielnie za pomocą żywicy epoksydowej J-B Weld; Utwardzaj przez 15 do 24 godzin zgodnie z instrukcjami producenta.</li>
 <li>Przepłukać kanał SPE 50 μl RNAse Away, a następnie 100 μl wody wolnej od nukleaz.</li>
 <li>Załadować kanał SPE 4 μl roztworu do szczepienia (metakrylan metylu z 3% w/v benzofenonu), a następnie usieciować metakrylan przez inkubację przez 10 minut w piecu UV przy długości fali UV 365 nm i 2,000 mJ/cm2. Usuń resztki roztworu do szczepienia za pomocą próżni. Użyliśmy odkurzacza ściennego. Aby uzyskać najlepsze wyniki, należy użyć świeżego roztworu. Zazwyczaj dopuszczalne jest jednak przechowywanie przygotowanego roztworu w temperaturze 4 °C przez okres do jednego tygodnia.</li>
 <li>Przygotować roztwór kolumny SPE (wszystkie v/v %): 16% dimetakrylanu etylenu, 24% metakrylanu butylu, 42% 1-dodekanolu, 18% cykloheksanolu i dodać 1% 2-dimetyloamino-4-(metylo-fenyloamino)-fenol jako fotoinicjator.</li>
 <li>Wyjąć taką samą objętość roztworu mikrosfer krzemionki jak roztwór kolumny SPE (w celu uzyskania mieszaniny 1:1) i całkowicie wysuszyć w temperaturze 70 °C przez noc w piecu próżniowym. Rozdrobnij granulkę, stukając w rurkę przy zamkniętej pokrywie. Dodaj roztwór kolumny SPE do wysuszonej probówki z mikrosfery krzemionki i odwiruj do wymieszania.</li>
 <li>Załaduj 4 μl roztworu SPE do tego samego kanału, a następnie usieciuj go za pomocą promieniowania UV przez 2,5 minuty. Następnie odwróć chip i naświetlaj przez kolejne 2,5 minuty. Spolimeryzowana kolumna SPE powinna być nieprzezroczystym białym ciałem stałym.</li>
 <li>Przemyj kanał 500 μl 100% metanolu, aby wypłukać nadmiar reagentów. To płukanie usuwa również wewnątrzpolimerowe rozpuszczalniki porogenne, tworząc w ten sposób otwartą strukturę porów kolumny SPE po wysuszeniu w warunkach otoczenia.</li>
 <li>Przymocuj dwie cienkowarstwowe grzałki do dolnej części chipa za pomocą taśmy termoprzewodzącej. Boki grzejników należy wyrównać z krawędzią szerokich kanałów w celu oddzielnej denaturacji i wyżarzania (patrz rysunek 1).</li>
 <li>Umieść pięć termopar w chipie przez ślepe zaułki otwartych kanałów bocznych każdego chipa (patrz rysunek 2b). Termopary pozostają w tych kanałach poprzez pasowanie wtłaczane. Taśma została użyta do dalszego ustalenia położenia termopar.</li>
</ol>
2. Metoda ekstrakcji do fazy stałej
<ol>
 <li>Przygotuj 96 μl 70% etanolu z wodą podprowadzoną DEPC i autoklawowaną (dejonizowaną lub filtrowaną przez milipory).</li>
 <li>Dodaj 4 μl 25X RNA Secure do 96 μl 70% etanolu w jednej probówce i zduplikuj tę samą mieszaninę ze 100% etanolem w osobnej probówce.</li>
 <li>Przygotuj 300 μl buforu kanałowego, mieszając następujące elementy: 75 μl 6 M tiocyjanianu guanidyny (GuSCN), 150 μl 2-propanolu, 63 μl wody wolnej od nukleaz i 12 μl 25X RNA Secure.</li>
 <li>Przygotuj 312 μl buforu do lizy przez zmieszanie: 100 μl 6 M GuSCN, 200 μl 2-propanolu i 12 μl 25X RNA Secure.</li>
 <li>Podgrzewaj 70% etanol, 100% etanol, bufor kanałowy i do lizy w temperaturze 60 °C przez 10-20 minut, aby aktywować RNA Secure.</li>
 <li>Aby zrównoważyć kanał mikroprzepływowy, należy przepuścić bufor kanału przez kanał SPE z natężeniem przepływu 0,8 ml/h.</li>
 <li>Badaną próbkę należy szybko rozmrozić w VTM w temperaturze 37 °C w łaźni wodnej i natychmiast po rozmrożeniu usunąć próbkę z łaźni wodnej.</li>
 <li>Odwirować próbkę z prędkością 13 000 obr./min przez 10 minut i przenieść 100 μl supernatantu do 300 μl buforu do lizy. Uzupełnić mieszaninę, dodając 6 μl nośnego RNA o wielkości 1 μg/μl.</li>
 <li>Wiruj do wymieszania, a po wirowaniu przez 5 sekund załaduj cały lizat do strzykawki Luer-lok o pojemności 1 cm3.</li>
 <li>Przepuścić lizat przez kanał SPE z natężeniem przepływu 0,8 ml/godz.</li>
 <li>Przemyj kanał SPE 100 μl 70% etanolu, a następnie 100 μl 100% etanolu w ilości 1 ml / godz. (W końcówce strzykawki znajduje się 50 μl martwej objętości, która nie zostanie wypchnięta, więc w rzeczywistości tylko 50 μl przechodzi przez kanał).</li>
 <li>Umieścić pustą strzykawkę w miejscu oznaczenia 0,5 ml i przepuścić powietrze przez kanał, aby wysuszyć ją z prędkością 1 ml/h.</li>
 <li>Przepuść 67,5 μl wody wolnej od nukleaz przez kanał, aby wymyć związane kwasy nukleinowe z prędkością 0,5 ml/godz. i zbierz 13,5 μl z nanoportu w porcie odpadowym. (Utrata płynu jest spowodowana 54 μl martwej objętości w końcówce strzykawki i kanale SPE).</li>
</ol>
3. RT-PCR
<ol>
 <li>Przygotować 36,5 μl głównej mieszanki RT-PCR podczas etapu suszenia na powietrzu (2.12) przy użyciu odczynników znajdujących się w zestawach Qiagen OneStep RT-PCR.</li>
 <li>Załaduj odczynnik RT-PCR do nanoportu w porcie odpadów i wymieszaj z RNA, aby uzyskać następującą reakcję RT-PCR o objętości 50 μl: 13,5 μl eluowanego RNA w wodzie wolnej od nukleaz, 4 μl mieszaniny enzymów RT-PCR, 10 μl roztworu Q, 10 μl1X jednoetapowy bufor, 2 μl 25 mM MgCl2, 1 μl 50 μM starter forward 5'-GAC CRA TCC TGT CAC CTC TGA C-3', 1 μl 50 μM reverse primer 5'-AGG GCA TTY TGG ACA AAK CGT CTA-3', 2 μl dNTP, 0,75 μl 1,0% w/v BSA, 0,73 μl PEG8000 i 5,02 μl wody wolnej od nukleaz.</li>
 <li>Załaduj mieszaninę RT-PCR do kanału RT za pomocą delikatnego podciśnienia (użyliśmy odkurzacza ściennego) i uszczelnij Nanoport zamkniętą złączką.</li>
 <li>Zastosuj 35 V do grzałki 1. Przechowywać odczynniki w kanale RT przez 30 minut po osiągnięciu równowagi grzałki 1 w temperaturze 50 °C. Przechowywać odczynniki w kanale RT przez 15 minut po osiągnięciu równowagi grzałki 1 w temperaturze 95 °C.</li>
 <li>Zastosować 27 V do grzałki 1 i 50 V do grzałki 2, odczekać około trzech minut lub do momentu, gdy grzałka 1 osiągnie równowagę w temperaturze 60 °C, a grzałka 2 osiągnie równowagę w temperaturze 95 °C.</li>
 <li>Wepchnij odczynniki do kanału PCR w tempie 0,5 μl /min. Powinno minąć około 20 minut, zanim odczynniki przepłyną przez kanał serpentynowy.</li>
 <li>Gdy próbka dotrze do końca kanału serpentynowego, należy zebrać produkty PCR na wylocie za pomocą pipetora i końcówki o odpowiedniej wielkości.</li>
</ol>
4. Wykrywanie produktów PCR
<ol>
 <li>Do wykrywania produktów używamy testu DNA Agilent High Sensitivity. Aby uruchomić ten test, wyjmij zestaw Agilent High Sensitivity DNA Kit z lodówki na 30 minut przed badaniem.</li>
 <li>Włącz Bioanalyzer i otwórz oprogramowanie 2100 Expert.</li>
 <li>Załaduj 1 μl produktów PCR do testu i postępuj zgodnie z protokołem Agilent (<a href="http://gcf.pbrc.edu/docs/Agilent/Agilent%20Manual.pdf" target="_blank">http://gcf.pbrc.edu/docs/Agilent/Agilent%20Manual.pdf</a>).</li>
 <li>Analizuj i rejestruj dane.</li>
</ol>

<ol><li>Nicholls, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pandemic+Influenza%3A+The+Inside+Story%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Biol%22%5BJournal%5D)">Pandemic Influenza: The Inside Story.</a> PLoS Biol. 4, (2006).</li>
<li>WHO | World now at the start of 2009 influenza pandemic. , World Health Organization. Geneva, Switzerland. Available from: 
 <a target="_blank" href="http://www.who.int/mediacentre/news/statements/2009/h1n1_pandemic_phase6_20090611/en/">http://www.who.int/mediacentre/news/statements/2009/h1n1_pandemic_phase6_20090611/en/</a> (2009).</li>
<li>WHO | Pandemic (H1N1) 2009 - update 112. , World Health Organization. Geneva, Switzerland. Available from: 
 <a target="_blank" href="http://www.who.int/csr/don/2010_08_06/en/">http://www.who.int/csr/don/2010_08_06/en/</a> (2009).</li>
<li>Wenzel, J. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analytical+performance+determination+and+clinical+validation+of+the+novel+roche+realtime+ready+influenza+A%2FH1N1+detection+set%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Clinical+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Analytical performance determination and clinical validation of the novel roche realtime ready influenza A/H1N1 detection set.</a> Journal of Clinical Microbiology. 48, 3088-3094 (2010).</li>
<li>Chan, K. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analytical+sensitivity+of+rapid+influenza+antigen+detection+tests+for+swine-origin+influenza+virus+%28H1N1%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Clinical+Virology%3A+the%22%5BJournal%5D)">Analytical sensitivity of rapid influenza antigen detection tests for swine-origin influenza virus (H1N1.</a> Journal of Clinical Virology: the. 45, 205-207 (2009).</li>
<li>Ginocchio, C. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evaluation+of+multiple+test+methods+for+the+detection+of+the+novel+2009+influenza+A+%28H1N1%29+during+the+New+York+City+outbreak%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of%22%5BJournal%5D)">Evaluation of multiple test methods for the detection of the novel 2009 influenza A (H1N1) during the New York City outbreak.</a> Journal of. 45, 191-195 (2009).</li>
<li>Aeron, C. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Performance+of+influenza+rapid+point-of-care+tests+in+the+detection+of+swine+lineage+A%28H1N1%29+influenza+viruses%5BTitle%5D)+AND+%22Influenza+and+Other+Respiratory+Viruses%22%5BJournal%5D)">Performance of influenza rapid point-of-care tests in the detection of swine lineage A(H1N1) influenza viruses.</a> Influenza and Other Respiratory Viruses. 3, 171-176 (2009).</li>
<li>Takahashi, H., Otsuka, Y., Patterson, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Diagnostic+tests+for+influenza+and+other+respiratory+viruses%3A+determining+performance+specifications+based+on+clinical+setting%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Infection+and+Chemotherapy%22%5BJournal%5D)">Diagnostic tests for influenza and other respiratory viruses: determining performance specifications based on clinical setting.</a> Journal of Infection and Chemotherapy. 16, 155-161 (2010).</li>
<li>Selvaraju, S. B., Selvarangan, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evaluation+of+Three+Influenza+A+and+B+Real-Time+Reverse+Transcription-PCR+Assays+and+a+New+2009+H1N1+Assay+for+Detection+of+Influenza+Viruses%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Clinical+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Evaluation of Three Influenza A and B Real-Time Reverse Transcription-PCR Assays and a New 2009 H1N1 Assay for Detection of Influenza Viruses.</a> Journal of Clinical Microbiology. 48, 3870-3875 (2009).</li>
<li>Northrup, M. A., Ching, M. T., White, R. M., Watson, R. T. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aNorthrup%2C+MA+%22Transducer%2793%2C+seventh+international+conference+on+solid+state+sensors+and+actuators%22">Transducer'93, seventh international conference on solid state sensors and actuators</a>. , 924-926 (1993).</li>
<li>Bhattacharyya, A., Klapperich, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Thermoplastic+microfluidic+device+for+on-chip+purification+of+nucleic+acids+for+disposable+diagnostics%5BTitle%5D)+AND+%22Analytical+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Thermoplastic microfluidic device for on-chip purification of nucleic acids for disposable diagnostics.</a> Analytical Chemistry. 78, 788-792 (2006).</li>
<li>Cao, Q., Kim, M. -C., Klapperich, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Plastic+microfluidic+chip+for+continuous-flow+polymerase+chain+reaction%3A+Simulations+and+experiments%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechnology+Journal%22%5BJournal%5D)">Plastic microfluidic chip for continuous-flow polymerase chain reaction: Simulations and experiments.</a> Biotechnology Journal. 6, 177-184 (1002).</li>
<li>Cao, Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microfluidic+Chip+for+Molecular+Amplification+of+Influenza+A+RNA+in+Human+Respiratory+Specimens%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+ONE%22%5BJournal%5D)">Microfluidic Chip for Molecular Amplification of Influenza A RNA in Human Respiratory Specimens.</a> PLoS ONE. 7, e33176(2012).</li>
<li>Rådström, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Purification+and+Characterization+of+PCR-Inhibitory+Components+in+Blood+Cells%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Clin.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Purification and Characterization of PCR-Inhibitory Components in Blood Cells.</a> J. Clin. Microbiol. 39, 485-493 (2001).</li>
<li>Boddinghaus, B., Wichelhaus, T. A., Brade, V., Bittner, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Removal+of+PCR+Inhibitors+by+Silica+Membranes%3A+Evaluating+the+Amplicor+Mycobacterium+tuberculosis+Kit%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Clin.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Removal of PCR Inhibitors by Silica Membranes: Evaluating the Amplicor Mycobacterium tuberculosis Kit.</a> J. Clin. Microbiol. 39, 3750-3752 (2001).</li>
<li>Andreasen, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Improved+microRNA+quantification+in+total+RNA+from+clinical+samples%5BTitle%5D)+AND+%22Methods%22%5BJournal%5D)">Improved microRNA quantification in total RNA from clinical samples.</a> Methods. 50, S6-S9 (2010).</li>
</ol>

Autorzy zadeklarowali brak sprzecznych interesów finansowych.

Przedstawiona tutaj metoda diagnostyczna wykazała zdolność zintegrowanego mikroprzepływowego chipa z tworzywa sztucznego do amplifikacji RNA grypy A z próbek pacjentów o wysokiej swoistości i niskiej granicy wykrywalności. 13 Zaprojektowaliśmy ten chip do potencjalnych testów w miejscu opieki nad pacjentem: (a) kontrola temperatury i płynności została uproszczona, (b) chip jest tani i nadaje się do produkcji o wysokiej przepustowości przy użyciu formowania wtryskowego, oraz (c) chip jest jednorazowy i przeznac...

Miliony zgonów zostały zgłoszone podczas trzech pandemii grypy w XX wieku1. Co więcej, ostatnia pandemia grypy została ogłoszona przez Światową Organizację Zdrowia (WHO) 2 w 2009 roku, a na dzień 1 sierpnia 2010roku WHO poinformowała o 18 449 zgonach3. Pandemia ta po raz kolejny pokazała wysokie obciążenie chorobami zakaźnymi oraz potrzebę szybkiego i dokładnego wykrywania grypy, aby umożliwić szybkie potwierdzenie choroby, odpowiednią reakcję w zakresie zdrowia publicznego i skuteczne leczenie4.
Istnieje kilka metod powszechnie stosowanych do diagnozowania grypy, w tym szybkie testy immunologiczne, bezpośrednie testy antygenowe (DFA) i metody hodowli wirusów. Szybkie testy immunologiczne dramatycznie tracą czułość5-8, podczas gdy pozostałe dwie metody są pracochłonne i czasochłonne9. Testy molekularne oferują wiele korzyści, w tym krótki czas realizacji, wysoką czułość i wyższą swoistość. Kilka podmiotów komercyjnych pracuje nad szybkimi testami molekularnymi (zwanymi również testami kwasów nukleinowych lub NAT) na choroby zakaźne, a kilka z nich ma w planach testy na grypę. Jednak większość z nich wymaga przygotowania próbki poza chipem. Żadna z poprawek do Clinical Laboratory Improvement Improvement (CLIA) nie uchyla testów molekularnych zawierających przygotowanie próbki w kartridżu lub module testowym.
Technologia lab-on-a-chip odgrywa ważną rolę w rozwoju urządzeń do testowania w miejscu opieki nad pacjentem. Po wprowadzeniu pierwszego chipa PCR w 1993 r.10 włożono wiele wysiłku w opracowanie chipów do testowania kwasów nukleinowych. Jednak tylko kilka z nich zintegrowało przygotowanie próbek surowych z dalszym wzmacnianiem.
Wcześniej pokazaliśmy miniaturyzację kolumny do ekstrakcji fazy stałej (SPE) w plastikowy chip mikroprzepływowy11 oraz rozwój i optymalizację chipa do PCR o ciągłym przepływie12. W tym miejscu rozszerzamy wcześniejsze prace, aby zintegrować SPE z krokami RT i PCR w jeden chip do diagnostyki klinicznej i wykazać jego zdolność do amplifikacji kwasów nukleinowych z wymazów z nosogardzieli (NP) i aspiratów pacjenta.

<table><tbody><tr><td>1-dodekanol</td><td>Sigma-Aldrich, St. Louis, MO</td><td>443816-500G</td><td></td></tr><tr><td>2,2-dimetoksy-2-fenyloacetofenon</td><td>Sigma-Aldrich, St. Louis, MO</td><td>196118-50G</td><td></td></tr><tr><td>2100 Bioanalyzer</td><td>Agilent Technologies, Santa Clara, CA</td><td>G2943CA</td><td></td></tr><tr><td>2-Propanol</td><td>Sigma-Aldrich, St. Louis, MO</td><td>19516</td><td></td></tr><tr><td>Benzofenon</td><td>Sigma-Aldrich, St. Louis, MO</td><td>239852-50G</td><td></td></tr><tr><td>BSA</td><td>Thermo Fisher Scientific, Pittsburge, PA</td><td>A7979-50ML</td><td></td></tr><tr><td>Metakrylan butylu</td><td>Sigma-Aldrich, St. Louis, MO</td><td>235865-100 ml</td><td></td></tr><tr><td>Nośnik RNA</td><td>Qiagen, Walencja, CA</td><td>1017647</td><td></td></tr><tr><td>Cyclohexanol</td><td>Sigma-Aldrich, St. Louis, MO</td><td>105899-1L</td><td></td></tr><tr><td>Etanol</td><td>Sigma-Aldrich, St. Louis, MO</td><td>E7023</td><td></td></tr><tr><td>Dimetakrylan etylenu</td><td>Sigma-Aldrich, St. Louis, MO</td><td>335861</td><td></td></tr><tr><td>Dimetakrylan glikolu etylenowego</td><td>Sigma-Aldrich, St. Louis, MO</td><td>335681-100ML</td><td></td></tr><tr><td>Szklana strzykawka 250 &mu; l</td><td>Hamilton, Reno, NV</td><td>81127</td><td></td></tr><tr><td>Tiocyjanian guanidyny</td><td>Sigma-Aldrich, St. Louis, MO</td><td>50981</td><td></td></tr><tr><td>Zestaw DNA o wysokiej czułości</td><td>Agilent Technologies, Santa Clara, CA</td><td>5067-4626</td><td></td></tr><tr><td>Rzeźbiarka na gorąco</td><td>, Wabash, IN</td><td>4386</td><td></td></tr><tr><td>Epoksydy spawalnicze J-B</td><td>Mcmaster-Carr, Elmhurst, IL</td><td>7605A11</td><td></td></tr><tr><td>Strzykawki Luer-Lok</td><td>BD-Medical, Franklin Lakes, NJ</td><td>309628</td><td></td></tr><tr><td>Chlorek magnezu</td><td>Thermo Fisher Scientific, pittsburge, PA</td><td>AB-0359</td><td></td></tr><tr><td>Metanol</td><td>Sigma-Aldrich, St. Louis, MO</td><td>494437</td><td></td></tr><tr><td>Metakrylan metylu</td><td>Sigma-Aldrich, St. Louis, MO</td><td>M55909</td><td></td></tr><tr><td>Nanoport</td><td>Upchurch Scientific</td><td>N-333-01</td><td></td></tr><tr><td>Nanoport Montaż</td><td>Upchurch Scientific</td><td>F-120x</td><td></td></tr><tr><td>Woda wolna od nukleaz</td><td>Thermo Fisher Scientific, pittsburge, PA</td><td>PR-P1193</td><td></td></tr><tr><td>Zestaw OneStep RT-PCR</td><td>Qiagen, Walencja, CA</td><td>210210</td><td></td></tr><tr><td>PEG8000</td><td>Sigma-Aldrich, St. Louis, MO</td><td>41009</td><td></td></tr><tr><td>Zasilacz</td><td>VWR, Radnor, PA</td><td>300V</td><td></td></tr><tr><td>RNAse Away</td><td>Sigma-Aldrich, St. Louis, MO</td><td>83931-250ML</td><td></td></tr><tr><td>RNASecure</td><td>Applied Biosystems, Foster City, CA</td><td>AM7005</td><td></td></tr><tr><td>Mikrosfery krzemionkowe</td><td>Polysciences, Warrington, PA</td><td>24324-15</td><td></td></tr><tr><td>Pompa strzykawkowa </td><td>Aparat Harvard, Holliston, MA</td><td>HA2000P/10</td><td></td></tr><tr><td>Taśma przewodząca ciepło</td><td>Mcmaster-Carr, Elmhurst, IL</td><td>6838A11</td><td></td></tr><tr><td>Termopara</td><td>Omega Engineering, Stamford, CT</td><td>5SRTC-TT-J-40-36</td><td></td></tr><tr><td>Grzejniki cienkowarstwowe</td><td>Minco, Minneapolis, MN</td><td>HK5166R529L12A</td><td></td></tr><tr><td>Ultraviolet</td><td>Crossreder UPV, Upland, CA</td><td>CL-1000</td><td></td></tr><tr><td>Zeonex</td><td>Zeon Chemicals, Louisville, KY</td><td>690R</td><td></td></tr></tbody></table>

wytwarzanie chipów mikroprzepływowych i metoda wykrywania grypy

Microfluidic Chip Fabrication and Method to Detect Influenza

Szybka i skuteczna diagnostyka odgrywa ważną rolę w kontrolowaniu chorób zakaźnych, umożliwiając skuteczne zarządzanie i leczenie pacjentów. W tym miejscu prezentujemy zintegrowany mikroprzepływowy chip termoplastyczny ze zdolnością do amplifikacji wirusa grypy A w wymazach z nosogardzieli (NP) i aspiratach pacjenta. Po załadowaniu próbki pacjenta, urządzenie mikroprzepływowe sekwencyjnie przeprowadza etapy lizy komórek na chipie, oczyszczania i zatężania RNA w ramach ekstrakcji do fazy stałej (SPE), odwrotnej transkrypcji (RT) i reakcji łańcuchowej polimerazy (PCR) w komorach RT-PCR. Wykrywanie punktów końcowych odbywa się za pomocą bioanalizatora poza chipem (Agilent Technologies, Santa Clara, CA). W przypadku urządzeń peryferyjnych użyliśmy pojedynczej pompy strzykawkowej do napędzania odczynnika i próbek, podczas gdy dwie grzałki cienkowarstwowe zostały użyte jako źródła ciepła dla komór RT i PCR. Chip został zaprojektowany tak, aby był jednowarstwowy i odpowiedni do produkcji o wysokiej przepustowości w celu skrócenia czasu i kosztów produkcji. Chip mikroprzepływowy stanowi platformę do analizy szerokiej gamy wirusów i bakterii, ograniczoną jedynie zmianami w konstrukcji odczynników potrzebnymi do wykrywania nowych patogenów.

Typowy wynik dla próbki z płukania nosogardzieli zakażonej wirusem grypy A przedstawiono na Rysunku 3. Ze względu na różną ilość wirusa grypy w próbkach poszczególnych pacjentów, końcowe stężenie produktu PCR będzie się różnić. Dobry wynik dla próbki dodatniej powinien charakteryzować się niskim poziomem szumów, dwoma wyraźnymi pikami drabinki (35 i 10380 bp) oraz pojedynczym pikiem produktu o zaprojektowanej wielkości (107 bp). Choć w kontrolach ujemnych pik produktu teoretycznie nie powinien wystąpić, ...

Zintegrowany mikroprzepływowy układ termoplastyczny został opracowany do użytku jako diagnostyka molekularna. Chip wykonuje ekstrakcję kwasów nukleinowych, odwrotną transkryptazę i PCR. Opisano metody wytwarzania i uruchamiania chipa.

Wytwarzanie chipów mikroprzepływowych i metoda wykrywania grypy

Fast  and effective diagnostics play an important role in controlling infectious  disease by enabling effective patient management and treatment. Here, we ...

Ogólnym celem następnego eksperymentu jest wykrycie wirusa grypy typu A przy użyciu chipa mikroprzepływowego. Najpierw należy przepuścić próbkę z buforem lizującym przez kanał SPE, aby zlizować wirusa i wyekstrahować RNA, a następnie połączyć odczynnik R-T-P-C-R z wyekstrahowanym RNA i uruchomić kanał odwrotnej transkrypcji, aby przekształcić wirusowe RNA w cDNA. Następnie mieszaninę wprowadza się do kanału PCR w celu amplifikacji DNA; uzyskane wyniki wskazują rozmiar i stężenie amplikonu na podstawie sygnału fluorescencyjnego z elektroforezy kapilarnej.Główną zaletą tej technologii jest to, że przyjmuje ona surową próbkę pacjenta oraz integruje ekstrakcję kwasów nukleinowych, oczyszczanie, odwrotną transkrypcję i amplifikację w jednym chipie. Aby stworzyć dwie płytki, należy równomiernie rozmieścić około dziewięciu gramów granulatów XN X w centrum metalowej płyty, a następnie umieścić ją w prasie podgrzanej do 198 °C na pięć minut. Następnie powoli zwiększyć nacisk do 2 500 PSI przez kolejne pięć minut. Teraz należy umieścić jedną płytkę w formie z epoksydu, wstępnie podgrzanej do 157 °C przez 10 minut, i powoli zwiększyć nacisk do 1000 PSI przez kolejne 10 minut.Następnie, używając rękawic termicznych, wyjmij płytkę i formę z prasy na gorąco, a następnie usuń płytkę z formy, zanim ostygnie. Wywierć trzy otwory w wypukłym chipie: po jednym przy wlocie, otworze odpływowym oraz wylocie kanału mikrofluidycznego. Następnie przemyj chipy izopropanolem (IPA), a potem roztworem RNAs away oraz wodą dejonizowaną.Osusz chipy powietrzem; aby je złączyć, najpierw podgrzej je do 131 °C przez 10 minut, a następnie przymuś pod ciśnieniem 350 PSI przez kolejne 10 minut. Używając żywicy epoksydowej JB Weld, przymocuj nanoporty oddzielnie do wlotu odpływowego oraz do portów wylotowych, a następnie utwardzaj przez 15 do 24 godzin. Zgodnie z instrukcjami producenta, przepłucz kanał SPE 50 µL roztworu RNAs away, a następnie 100 µL wody wolnej od nukleaz.Następnie należy napełnić kanał SPE 4 µL świeżo przygotowanego roztworu szczepiącego w celu sieciowania metakrylanu, inkubować przez 10 minut w piecu UV, a następnie usunąć pozostały roztwór szczepiący za pomocą próżni. Osad z wysuszonych mikrosfer należy rozbić, opukując probówkę z zamkniętą zakrętką. Następnie dodaje się 100 µL świeżo przygotowanego roztworu do kolumny SPE i miesza w wirówce vortex.Nanieś 4 µL roztworu SPE do tego samego kanału, a następnie przeprowadź sieciowanie za pomocą naświetlania UV przez 2,5 minuty z każdej strony, aż do uzyskania nieprzezroczystej, białej spolimeryzowanej kolumny SPE. Przepłucz kanał 500 µL 100% metanolu, aby usunąć nadmiar reagentów oraz wewnątrzpolimerowe rozpuszczalniki pirogenne. Przymocuj dwa cienkowarstwowe grzałki do spodu chipa za pomocą taśmy termoprzewodzącej.Należy pamiętać, że boki grzałek muszą być wyrównane z krawędzią szerokich kanałów na czas trwania procesu. Oddzielnie umieść pięć termopar w chipie, wprowadzając je przez zaślepione otwarte kanały boczne każdego chipu. Aby ustabilizować położenie termopar, dodaj 4 µL RNA secure do 96 µL 70% etanolu w jednej probówce oraz do 100% etanolu w drugiej probówce. Przygotuj również 300 µL buforu kanałowego oraz 316 µL buforu do lizy.Podgrzewaj roztwory w temperaturze 60 °C przez 15 minut, aby aktywować RNA secure, a następnie wyrównać warunki w kanale mikrofluidycznym. Przepuść bufor kanałowy przez kanał SPE z szybkością przepływu 0,8 ml/h.Następnie szybko rozmroź próbkę bobu w VTM w temperaturze 37 °C. Wyjmij próbkę natychmiast po rozmrożeniu. Wiruj próbkę z prędkością 13 000 RPM przez 10 minut.Przenieś 100 µL supernatantu do 300 µL buforu lizującego, dodaj 6 µL nośnika RNA o stężeniu 1 µg/µL i wymieszaj w wstrząsarku wortex. Następnie wiruj przez 5 s i przelej cały lizat do strzykawki 1 CC z końcówką Luer Lock. Przepuść lizat przez kanał SPE z szybkością przepływu 0,8 mL/h.Następnie przemyj kanał SPE 100 µL 70% etanolu, a następnie 100 µL 100% etanolu z prędkością 1 mL/h. Umieść pustą strzykawkę na oznaczeniu 0,5 mL i przepchnij powietrze przez kanał, aby go osuszyć, z prędkością 1 mL/h. Teraz przepuść przez kanał 67,5 µL wody wolnej od nukleaz, aby eluować związane kwasy nukleinowe z prędkością 0,5 mL/h, a następnie pobierz 13,5 µL z nanoportu przy porcie odpływowym.Nanieś 36,5 µL mieszaniny RT-PCR. Wymieszaj w nanoporcie przy porcie odpływowym, a następnie połącz z matrycą RNA, aby uzyskać 50 µL reakcji RT-PCR. Następnie wprowadź mieszaninę RT-PCR do kanału RT za pomocą delikatnej próżni.Uszczelnij nano port za pomocą zamkniętej złączki. Przyłóż napięcie 35 V do grzałki jeden. Pozostaw odczynniki w kanale RT przez 30 minut po tym, jak grzałka jeden osiągnie temperaturę 50 °C.Przetrzymuj odczynniki w kanale RT przez 15 minut po ustabilizowaniu temperatury pierwszego grzejnika na poziomie 95 °C. Następnie przyłóż 27 V do pierwszego grzejnika i 50 V do drugiego grzejnika, aby ustabilizować temperaturę pierwszego grzejnika na 60 °C, a drugiego grzejnika na 95 °C. Wprowadź odczynniki do kanału PCR z przepływem 0,5 µL/min.Około 20 minut później, gdy odczynniki dotrą do końca kanału serpentynowego, należy zebrać produkty PCR z wylotu, używając pipety i końcówki o odpowiedniej pojemności do testu Agilent high sensitivity DNA. Zestaw Agilent high sensitivity DNA należy wyjąć z lodówki na 30 minut przed badaniem. Włącz bioanalizator i uruchom oprogramowanie 2, 100 expert.Należy nanieść 1 µL produktów PCR do testu i postępować zgodnie z protokołem firmy Agilent. Następnie należy przeanalizować i zapisać dane w tym przepływie pracy. Próbkę z nosogardzieli pacjenta miesza się z buforem lizującym, a następnie nanosi na chip.Chip zostaje uruchomiony, a produkty PCR wirusa grypy są odczytywane przy użyciu komercyjnego chipa do elektroforezy kapilarnej. Ze względu na różną ilość wirusa grypy w próbkach poszczególnych pacjentów, końcowe stężenie produktu PCR będzie się różnić. Poprawny wynik powinien charakteryzować się niskim poziomem szumów, wyraźnymi pikami drabinki w zakresie od 10 do 380 par zasad oraz pojedynczym pikiem produktu o zaprojektowanej wielkości 107 par zasad w przypadku próbki pozytywnej.Po obejrzeniu tego filmu powinni Państwo posiadać gruntowną wiedzę na temat tego, jak wykonać i uruchomić mikroprzepływowy chip do wykrywania wirusa grypy.

microfluidic-chip-fabrication-and-method-to-detect-influenza

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Bioinżynieria

Produkcja mikrofluidycznych chipów i metoda wykrywania grypy

W tym wywiadzie dr Klapperich omawia wytwarzanie termoplastycznych urządzeń mikroprzepływowych oraz ich zastosowanie w opracowywaniu nowych metod diagnostycznych.

Zastosowania mikroprzepływowe w diagnostyce jednorazowej

Virochip to panwirulowa macierz mikroukładów zaprojektowana do jednoczesnego wykrywania wszystkich znanych wirusów, a także nowych wirusów, w oparciu o konserwatywną homologię sekwencji. W niniejszym materiale demonstrujemy, jak przeprowadzić badanie z użyciem Virochip w celu analizy próbek klinicznych pod kątem obecności wirusów znanych i nieznanych.

Wykorzystanie panwirusej macierzy mikroarray (Virochip) do przesiewowego badania próbek klinicznych w kierunku patogenów wirusowych

Technologia detekcji kolorymetrycznej ampliPHOX jest przedstawiona jako niedroga alternatywa dla detekcji fluorescencyjnej w macierzach mikroukładów. W oparciu o fotopolimeryzację, ampliPHOX wytwarza stałe polimerowe plamki widoczne gołym okiem w zaledwie kilka minut. Wyniki są następnie obrazowane i automatycznie interpretowane za pomocą prostego, a zarazem wydajnego pakietu oprogramowania.

Kolorymetryczna detekcja ampliPHOX na mikrotablicy DNA do wykrywania grypy

Mikrofluidyczne platformy kropelkowe są obiecującymi narzędziami do eksperymentów wysokoprzepustowych, ponieważ umożliwiają one niskokosztowe generowanie piko-litrowych, samoczynnie odseparowanych komór z częstotliwością rzędu kHz. Dzięki integracji z szybkimi, czułymi i wysokorozdzielczymi metodami spektroskopii fluorescencyjnej, duże ilości informacji generowanych w tych systemach mogą być efektywnie wydobywane, przetwarzane i wykorzystywane.

Metody detekcji fluorescencyjnej dla mikroprzepływowych platform kroplkowych

Metoda ta opisuje zastosowanie systemu obrazowania opartego na barwnikach w podczerwieni do wykrywania H1N1 w płyku z płukania oskrzelowo-pęcherzykowego (BAL) zakażonych myszy z wysoką czułością. Metodykę tę można przeprowadzić na płytce 96- lub 384-dołkowej, wymaga ona objętości materiału badawczego &lt;10 μl i umożliwia jednoczesny screening wielu patogenów.

Metoda wysokoprzepustowego wykrywania wirusa grypy

W tym artykule prezentujemy mikroprzepływowy chip do analizy pojedynczych komórek. Umożliwia ilościowe oznaczanie wewnątrzkomórkowych białek, enzymów, kofaktorów i drugich przekaźników za pomocą testów fluorescencyjnych lub testów immunologicznych.

Mikroprzepływowy chip do wszechstronnej analizy chemicznej pojedynczych komórek

Prezentujemy mikroprzepływowy biochip elektrochemiczny do wykrywania hybrydyzacji DNA. Po funkcjonalizacji sondy ssDNA bada się swoistość, czułość i granicę wykrywalności za pomocą komplementarnych i niekomplementarnych celów ssDNA. Wyniki ilustrują wpływ zdarzeń hybrydyzacji DNA na układ elektrochemiczny, przy granicy wykrywalności wynoszącej 3,8 nM.

Mikroprzepływowy biochip elektrochemiczny do bezznacznikowej analizy hybrydyzacji DNA

Korzystając z drukowanej strategii mikromacierzy glikanowej, konwencjonalny test na 96-dołkowej płytce został zminiaturyzowany do analizy awidności hemaglutyniny wirusa grypy A i swoistości dla receptorów zawierających kwas sjalowy.

Zminiaturyzowany test mikromacierzy glikanów do oceny awidności i swoistości hemaglutynin wirusa grypy A

Platforma mikroprzepływowego biosensoru została zaprojektowana i wykonana przy użyciu taniej technologii fotorezystu z suchą folią do szybkiej i czułej kwantyfikacji różnych analitów. Ten jednorazowy system pozwala na elektrochemiczny odczyt testów enzymatycznych immobilizowanych na chipie za pomocą techniki stop-flow.

Elektrochemiczna platforma biosensorów mikroprzepływowych oparta na suchym filmie fotorezystu: produkcja urządzenia, przygotowanie testu na chipie i obsługa systemu

Mikrofluidyka to potężne narzędzie do tworzenia testów diagnostycznych. Jednak często wymagany jest drogi sprzęt i materiały, a także pracochłonne techniki wytwarzania i obsługi. W tym miejscu szczegółowo opisujemy protokół wytwarzania akrylowego urządzenia mikroprzepływowego do magnetycznych testów immunologicznych opartych na mikro- i nanocząsteczkach w tanich i prostych w użyciu.

Mikromielenie mikroprzepływowe urządzenia akrylowego sterowane numerycznie z ograniczeniem naprzemiennym dla testów immunologicznych opartych na nanocząstkach magnetycznych

Różne patogeny bakteryjne mogą powodować infekcje dróg oddechowych i prowadzić do poważnych problemów zdrowotnych, jeśli nie zostaną dokładnie wykryte i szybko leczone. Szybkie i dokładne wykrywanie tych patogenów za pomocą amplifikacji izotermicznej za pośrednictwem pętli zapewnia skuteczne zarządzanie i kontrolę infekcji dróg oddechowych w warunkach klinicznych.

Szybkie wykrywanie patogenów bakteryjnych powodujących infekcje dolnych dróg oddechowych za pomocą amplifikacji izotermicznej opartej na chipach mikroprzepływowych

Poznaj metodę wytwarzania mikroprzepływowych chipów termoplastycznych do wykrywania wirusa grypy A. Technologia integruje ekstrakcję kwasów nukleinowych, odwrotną transkrypcję i amplifikację PCR w jednym urządzeniu.

Wytwarzanie chipów mikroprzepływowych i metoda wykrywania grypy

Przeglądaj więcej filmów