Wytwarzanie chipów mikroprzepływowych i metoda wykrywania grypy

Ogólnym celem poniższego eksperymentu jest wykrycie wirusa grypy typu A za pomocą chipa mikroprzepływowego. Najpierw przeprowadź próbkę z buforem do lizy przez kanał SPE, aby przeciąć wirusa i wyekstrahować RNA, załadować odczynnik R-T-P-C-R wyekstrahowanym RNA i uruchomić kanał odwrotnej transkrypcji, aby przekształcić wirusowe RNA w CDNA. Następnie wprowadzić mieszaninę do kanału PCR w celu amplifikacji DNA, uzyskuje się wyniki, które pokazują wielkość i stężenie amplikonu na podstawie sygnału fluorescencyjnego z elektroforezy kapilarnej.

Główną zaletą tej technologii jest to, że akceptuje surową próbkę pacjenta i integruje ekstrakcję kwasów nukleinowych, oczyszczanie, odwrotną transkrypcję i amplifikację w jednym chipie Aby utworzyć dwie płytki, rozprowadź około dziewięciu gramów granulek XN X równomiernie na środku metalowej płytki, umieść na prasie rozgrzanej do 198 stopni Celsjusza na pięć minut. Następnie powoli naciskaj do 2 500 PSI przez kolejne pięć minut. Teraz umieść jedną płytkę nazębną na formie epoksydowej, rozgrzej ją w temperaturze 157 stopni Celsjusza przez 10 minut i powoli naciskaj do 1000 PSI przez kolejne 10 minut.

Następnie, zakładając rękawice termiczne, usuń płytkę nazębną i pleśń z gorącej prasy, a następnie usuń płytkę nazębną z formy, zanim ostygnie. Wywierć trzy otwory w wytłoczonym chipie, po jednym na wlocie, porcie odpływowym i wylocie kanału mikroprzepływowego. Następnie umyj chipsy alkoholem IPA, a następnie RNA i wodą dianny.

Wysusz frytki powietrzem, aby je związać, najpierw rozgrzej w temperaturze 131 stopni Celsjusza przez 10 minut, a następnie dociśnij do 350 PSI przez kolejne 10 minut. Używając żywicy epoksydowej JB Weld, przymocuj nanoporty do odpływu wlotowego, a porty wylotowe utwardzaj oddzielnie przez 15 do 24 godzin. Zgodnie z instrukcjami producenta, przepłucz kanał SPE 50 mikrolitrami RNA, a następnie 100 mikrolitrami wody wolnej od nukleaz.

Teraz załaduj kanał SPE czterema mikrolitrami świeżo przygotowanego roztworu do szczepienia, aby usieciować inkubację metakrylanu przez 10 minut w piecu UV, usuń resztki roztworu do szczepienia za pomocą próżni. Rozdrobnij wysuszone granulki mikrosfery, stukając w rurkę przy zamkniętej pokrywie. Następnie dodaj 100 mikrolitrów świeżo przygotowanego roztworu kolumny SPE i zwiruj do wymieszania.

Załaduj cztery mikrolitry roztworu SPE do tego samego kanału sieciowego przez promieniowanie UV przez 2,5 minuty z każdej strony, w wyniku czego otrzymasz nieprzezroczystą, białą, spolimeryzowaną kolumnę SPE. Umyj kanał 500 mikrolitrami 100% metanolu, aby wypłukać nadmiar reagentów i wewnątrzpolimerowych rozpuszczalników pirogenicznych. Przymocuj dwie cienkowarstwowe grzałki do dolnej części chipa za pomocą taśmy przewodzącej ciepło.

Należy pamiętać, że boki grzejników muszą być wyrównane z krawędzią szerokich kanałów na czas trwania Dene i klęcząc osobno, umieść pięć termopar w chipie przez ślepe zaułki otwarte kanały boczne każdej taśmy wiórowej. Aby ustalić położenie termopar, dodaj cztery mikrolitry 25 XRNA bezpieczne do 96 mikrolitrów 70% etanolu w jednej probówce i do 100% etanolu w drugiej probówce. Przygotuj również 300 mikrolitrów buforu kanałowego i 316 mikrolitrów buforu do lizy.

Podgrzewaj roztwory w temperaturze 60 stopni Celsjusza przez 15 minut. Aby aktywować RNA zabezpieczyć, a następnie zrównoważyć kanał mikroprzepływowy. Przepuść bufor kanału przez kanał SPE z natężeniem przepływu 0,8 mililitra na godzinę.

Teraz szybka próbka testowa bobu w VTM w temperaturze 37 stopni Celsjusza. Usunąć próbkę zaraz po jej rozmrożeniu. Odwirować próbkę z prędkością 13 000 obr./min przez 10 minut.

Przenieś 100 mikrolitrów supernatantu do 300 mikrolitrów buforu do lizy i dodaj sześć mikrolitrów po jednym mikrogramie na mikrolitr nośnika, wir RNA do wymieszania. Następnie wiruj przez pięć sekund i załaduj cały lizat do jednej strzykawki CC z blokadą przynęty. Przepuść lizat przez kanał SPE z natężeniem przepływu 0,8 mililitra na godzinę.

Następnie umyj kanał SPE 100 mikrolitrami 70% etanolu, a następnie 100 mikrolitrami 100% etanolu w ilości jednego mililitra na godzinę. Umieść pustą strzykawkę w miejscu 0,5 mililitra i przepchnij powietrze przez kanał, aby wysuszyć ją w tempie jednego mililitra na godzinę. Teraz przepuść 67,5 mikrolitrów wody wolnej od nukleaz przez kanał, aby wymyć związane kwasy nukleinowe z prędkością 0,5 mililitra na godzinę i zbierz 13,5 mikrolitrów z nanoportu w porcie odpadów.

Załaduj 36,5 mikrolitra mistrza R-T-P-C-R. Wymieszać w porcie nano w porcie odpadów i wymieszać z matrycą RNA, aby uzyskać 50 mikrolitrową reakcję R-T-P-C-R. Następnie załaduj mieszaninę R-T-P-C-R do kanału RT za pomocą delikatnego podciśnienia.

Uszczelnij port nano za pomocą zamkniętej złączki. Zastosuj 35 woltów do grzejnika pierwszego. Utrzymuj odczynniki w kanale RT przez 30 minut po grzałce, jeden z nich osiągnie równowagę w 50 stopniach Celsjusza.

Utrzymuj odczynniki w kanale RT przez 15 minut po osiągnięciu przez grzałkę równowagi w temperaturze 95 stopni Celsjusza. Następnie zastosuj 27 woltów do grzejnika pierwszego i 50 woltów do grzejnika, dwa do grzejnika równoważącego, jeden przy 60 stopniach Celsjusza i grzejnik dwa przy 95 stopniach Celsjusza. Wepchnij odczynniki do kanału PCR w ilości 0,5 mikrolitra na minutę.

Około 20 minut później, gdy odczynniki zbliżą się do końca kanału serpentynowego, zbierz produkty PCR na wylocie, używając odpowiedniej wielkości pipetera i końcówki do testu DNA o wysokiej czułości Agilent. Wyjmij zestaw Agilent do badania DNA o wysokiej czułości z lodówki na 30 minut przed badaniem. Włącz bioanalizator i otwórz oprogramowanie eksperckie 2 100.

Załaduj jeden mikrolitr produktów PCR do testu i postępuj zgodnie z protokołem Agilent. Analizuj i rejestruj dane w tym przepływie pracy. Próbka z nosa i gardła pacjenta jest mieszana z buforem do lizy i nakładana na chip.

Chip jest uruchamiany, a produkty PCR wirusa grypy są czerwone przy użyciu komercyjnego chipa do elektroforezy kapilarnej. Ze względu na różne ilości wirusa grypy w próbce każdego pacjenta, końcowe stężenie produktu PCR będzie się różnić. Dobry wynik powinien charakteryzować się niskim poziomem szumów, aby usunąć piki drabinkowe przy 35 i 10, 380 parze zasad oraz pik pojedynczego produktu przy zaprojektowanej wielkości produktu 107 pary zasad dla próbki dodatniej.

Po obejrzeniu tego filmu powinieneś dobrze zrozumieć, jak wyprodukować i uruchomić chip z mikropłynem w celu wykrycia wirusa grypy.