Name: Tworzenie ludzkiego nabłonka gruczołu krokowego za pomocą rekombinacji tkankowej mezenchymy zatok moczowo-płciowych gryzoni i ludzkich komórek macierzystych (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-06-22T14:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 44 s
Description: Poznaj izolację mezenchymy zatok moczowo-płciowych gryzoni i tworzenie ludzkiego nabłonka gruczołu krokowego z komórkami macierzystymi. Ta metoda pozwala badać mechanizmy inicjacji raka prostaty.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Pragniemy podziękować za wsparcie Sekcji Urologii Uniwersytetu w Chicago, kierowanej przez dr Arieh Shalhav, oraz dyrektor ds. badań urologicznych, dr Carrie Rinker-Schaeffer. Chcielibyśmy również podziękować za wsparcie ze strony University of Chicago Comprehensive Cancer Center (UCCCC) kierowanego przez dr. Michelle Le Beau Pragniemy również podziękować fachowej pomocy technicznej Centrum Zasobów Tkanek Ludzkich kierowanego przez dr Marka Lingena oraz pomocy Leslie Martin i Mary Jo Fekete. Dziękujemy również Podstawowej Placówce Immunohistochemicznej prowadzonej przez Terri Li. Praca ta została sfinansowana przez Wydział Chirurgii Uniwersytetu w Chicago, Sekcję Urologii; Grant Naukowy Amerykańskiego Towarzystwa Onkologicznego (ACS-IRG, #IRG-58-004); stypendium na wsparcie centrum onkologicznego (P30 CA14599); Fundacja Brinsona; Fundusz Rodzinny Alvina Bauma; Rada Kobieca Fundacji Badań nad Rakiem Uniwersytetu w Chicago; S. Kregel jest wspierany przez HHMI: Med-into-Grad Fellowship (56006772) oraz Cancer Biology Training Grant (T32-CA09594). Na koniec chcielibyśmy podziękować Robertowi Clarkowi, dr VenkateshKrishnanowi i Nathanowi Stadickowi za ich krytyczną ocenę manuskryptu.

To badanie zostało przeprowadzone w ścisłej zgodności z zaleceniami zawartymi w Przewodniku dotyczącym opieki i użytkowania zwierząt laboratoryjnych National Institutes of Health. Protokół został zatwierdzony przez University of Chicago Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC, numery protokołów 72066 i 72231). Wszystkie operacje przeprowadzano w znieczuleniu i dołożono wszelkich starań, aby zminimalizować cierpienie. Ludzka linia embrionalnych komórek macierzystych WA01 (H1; Rejestracja NIH #0043) została uzyskana z WiCell (Madison, WI) i hodowana przy użyciu protokołu niezależnego od zasilania przy użyciu pożywek mTeSR1 (Stem Cell Technologies; Vancouver, Kolumbia Brytyjska). Komórki ES wykorzystano w ciągu dziesięciu przejść rozmrażania.
1. Izolacja zatoki moczowo-płciowej od zarodków myszy lub szczura
<ol>
	<li>Poddaj eutanazji mysz w ciąży w czasie (dzień 17,5) lub szczura (dzień 18,5) poprzez wdychanie CO2 przez 5 minut. Śmierć potwierdza się przez ustanie parametrów życiowych u szczura. Następnie skręć mu kark w sposób humanitarny. W tym momencie szczur zostaje poddany eutanazji. Spryskaj 70% etanolem, aby wysterylizować skórę brzucha i boki. Przetnij warstwę skóry brzucha i mięśni, a następnie przetnij macicę, oddziel zarodki szczura od worka owodniowego i przetnij pępowinę. Przenieś zarodki do 50 ml probówki Falcon zawierającej lodowaty roztwór soli Hanka (HBSS) i trzymaj na lodzie. Płody są poddawane eutanazji poprzez ścięcie głowy nożyczkami chirurgicznymi.</li>
	<li>Umieścić zarodek na szalce Petriego o średnicy 100 mm. Przeciąć zarodek na pół nożyczkami na poziomie pępka (ryc. 1A). Usuń żołądek i jelito cienkie. Ujawnij jajniki w zarodku żeńskim i jądra w zarodku męskim (ryc. 1B i 1C). (Jajniki znajdują się na biegunach ogonowych nerek. Jądra znajdują się w przybliżeniu na poziomie pęcherza moczowego). Na tym etapie rozwoju UGSM wyizolowany zarówno z zarodków męskich, jak i żeńskich jest zdolny do indukowania linii nabłonka gruczołu krokowego w obecności testosteronu gospodarza. 4 Jednak po tym okresie rozwoju pąki gruczołu krokowego zaczynają formować się w UGSM, a izolacja czystego UGSM jest bardzo trudna. 4</li>
	<li>Pod mikroskopem preparacyjnym przeciąć ścianę brzucha w środkowej linii nożyczkami Vannas, aby odsłonić pęcherz moczowy i tylną ścianę brzucha. Uwolnić górne drogi rodne od przyczepów (w zarodkach męskich należy przeciąć moczowód, przewód Wolffa i przewód Müllera; w zarodkach żeńskich przeciąć moczowód i przewód Müllera). Uwolnij pęcherz moczowy z pępowiny. Przetnij kość łonową i tępo oddziel od przedniej ściany zatoki moczowo-płciowej za pomocą kleszczyków Dumont z cienką końcówką. Na koniec oddziel tylną ścianę zatoki moczowo-płciowej od odbytnicy. Przeciąć zatokę moczowo-płciową z pęcherzem moczowym na dolnym końcu (od cewki moczowej) i przechowywać zatokę moczowo-płciową en bloc (z pęcherzem) w lodowatym HBSS.</li>
</ol>
2. Oddzielenie mezenchymy zatoki moczowo-płciowej
<ol>
	<li>Usunąć pęcherz moczowy z zatoki moczowo-płciowej pod mikroskopem preparacyjnym (ryc. 1D).</li>
	<li>Przenieś zatokę moczowo-płciową do rurki sokoła zawierającej 1% trypsyny w HBSS wolnym od wapnia (Ca2+) i magnezu (Mg2+). Umieścić probówkę w lodówce w temperaturze 4 °C na 75 minut.</li>
	<li>Usuń trypsynę i zneutralizuj trypsynizację za pomocą 10% płodowej surowicy Bovin (FBS) w pożywce DMEM/F12.</li>
	<li>Ostrożnie drażnij lepki rękaw mezenchymalny z rurki nabłonkowej za pomocą igły lub kleszczyków Dumonta z cienką końcówką (utrzymanie rurki nabłonkowej w stanie nienaruszonym zmniejsza ryzyko zanieczyszczenia mezenchymy komórkami nabłonkowymi; może to spowodować tworzenie się gruczołów gryzoni wraz z ludzkim nabłonkiem gruczołowym pochodzącym z komórek macierzystych) (Ryc. 1D). 12</li>
	<li>Przenieś UGSM do nowej probówki Falcon zawierającej pożywkę DMEM/F12 + 10% FBS + 1% penicyliny/streptomycyny (Pen/Strep; 0,5 mg/ml) + 1% aminokwasów endogennych (NEAA) plus 1nM R1881. Umieścić probówkę w inkubatorze w temperaturze 37 °C z 5% CO2 przez noc.</li>
	<li>Odwirować tkankę przy sile 200 x g i odrzucić supernatant. Przemyć roztworem soli fizjologicznej z buforu fosforanowego (PBS) (nie naruszać osadu tkankowego).</li>
	<li>Dodaj 0,2% kolagenazy (w DMEM/F12), aby ponownie zawiesić tkankę. Inkubować w temperaturze 37 °C z delikatnym kołysaniem przez 1 godzinę.</li>
	<li>Energicznie trzykrotnie przemieszaj tkankę trawienną, aż stanie się jednorodną mieszaniną jednokomórkową i dodaj pożywkę DMEM/F12 + 10% FBS + 1% P/S + 1% NEAA + 1nM R1881, aby zneutralizować kolagenazę.</li>
	<li>Odwirować przy 200 x g, a następnie przemyć przez ponowne zawieszenie komórek UGSM w HBSS i powtórzyć trzy razy, aby całkowicie umyć UGSM. Na koniec zawiesić komórki mezenchymalne w DMEM/F12 i policzyć komórki za pomocą hemocytometru lub urządzenia do liczenia komórek.</li>
	<li>Dysocjacja komórek hES hodowanych przy użyciu protokołu bezpodajnego z pożywkami mTeSR1 (Stem Cell Technologies; Vancouver, Kolumbia Brytyjska) za pomocą trawienia Accutase (Millipore; Billerica, Massachusetts). Umyj komórki hES podczas logarytmicznej fazy ich wzrostu w ciepłym podłożu DMEM/F12, następnie dodaj ciepły 1x roztwór Accutase i inkubuj w temperaturze 37 °C przez 15-20 minut, aż pojedyncze komórki zostaną równomiernie oddzielone od kolonii. Dodaj równą ilość 1x zdefiniowanego inhibitora trypsyny (Invitrogen; Grand Island, NY), aby zneutralizować Accutase i delikatnie pipetować w górę iw dół, aby wymieszać i rozbić grudki komórek. Pipetować komórki do probówki wirówkowej i wirować przez 3 minuty przy 200 x g, a następnie ponownie zawiesić osad komórkowy w pożywce DMEM/F12. Ponownie odwirować probówkę przez 3 minuty przy 200 x g i usunąć supernatant, a następnie ponownie zawiesić w zimnym HBSS lub DMEM/F12 w żądanej objętości.</li>
	<li>Dodaj komórki hES o stosunku 1:2,5 komórek hES/mezenchymalnych. 3 Będzie to skład komórkowy komórek 1E5 UGSM z 4E4 hESC na 10 ml wstrzyknięcia (pojedynczy UGS szczura zwykle daje około 2E6 komórek mezenchymalnych). Wirować przy 200 x g przez 5 minut, a następnie wyrzucić supernatant. Zawiesić ponownie z 75% Matrigelem (BD Biosciences, San Jose, CA; zmieszany z 25% zimnym HBSS dla łatwiejszej obsługi) i umieścić rurkę w lodzie w celu wstrzyknięcia kapsułki podnerkowej.</li>
</ol>
3. Przeszczepienie rekombinowanej tkanki pod torebkę nerkową
<ol>
	<li>Przygotuj sterylne pole operacyjne.</li>
	<li>Znieczulij samca nagiej myszy atymiczną ketaminą/ksylazyną i.p.; użyj świeżej mieszanki zawierającej stosunek 1:1:8 ketaminy:ksylazyny:soli fizjologicznej. Dawkowanie będzie wynosić 100 mg/kg ketaminy i 2,5 mg/kg ksylazyny. Zwierzęta, które nie reagują na szczypanie palcami, powinny znajdować się w pozycji całkowicie pod stopami przez 20-30 minut.</li>
	<li>Chirurgicznie przygotuj mysz, goląc miejsce operowane (jeśli nie używasz nude myszy), oczyszczając je trzema naprzemiennymi chusteczkami z 70% alkoholem, a następnie roztworem betadyny i nakładając obłożenie chirurgiczne.</li>
	<li>Nałóż maść nawilżającą do oczu (maść do oczu Altalume) na oczy myszy, aby zapobiec wysuszeniu podczas znieczulenia.</li>
	<li>Podczas operacji monitorowane jest częstość oddechów i temperatura ciała myszy. Częstość oddechów powinna być stała i utrzymywać się w granicach 40-90 oddechów/min. Temperatura wewnętrzna ciała jest monitorowana poprzez obserwację koloru błon śluzowych i różowych podeszew stóp. </li>
	<li>Wykonaj podłużne nacięcie skóry o długości 1,0 cm na plecach. Kontynuuj cięcie ściany brzucha w podłużnym nacięciu o długości 0,5 cm.</li>
	<li>Delikatnie wyciśnij nerkę z brzucha i utrzymuj powierzchnię nerki wilgotną za pomocą kropli sterylnej soli fizjologicznej.</li>
	<li>Delikatnie nakłuć torebkę nerkową za pomocą pustej igły strzykawkowej o rozmiarze 27G. Wystarczy bardzo płytkie nakłucie. Będzie to miejsce, w którym włożysz igłę, aby wstrzyknąć mieszankę komórkową.</li>
	<li>Napełnij igłę strzykawki w rozmiarze 28 10 μl mieszaniny komórek. Powoli wprowadzić miejsce nakłucia i wniknąć w miąższ nerki, aby dotrzeć do obszaru pod torebką nerkową. Wstrzyknąć 10 μl mieszaniny komórkowej w celu utworzenia bolusa na nerce pod kapsułką nerkową. Wycofanie igły.</li>
	<li>Zwróć nerkę do jamy brzusznej. Zabezpiecz warstwę mięśniową otrzewnej za pomocą nylonowych szwów 4-0.</li>
	<li>Zamknij skórę za pomocą szwu lub zszywki.</li>
	<li>Oczyść krew ze skóry za pomocą sterylnej soli fizjologicznej.</li>
</ol>
4. Analgezja pooperacyjna i monitorowanie
<ol>
	<li>Wstrzyknąć zwierzęciu buprenorfinę (0,1 mg/kg co 12 godzin) lub ketoprofen (3-5 mg/kg w soli fizjologicznej co 12 godzin) w celu opanowania bólu pooperacyjnego oraz 1 ml soli fizjologicznej o temperaturze 37 °C i.p., aby utrzymać zwierzę w cieple i zapobiec odwodnieniu.</li>
	<li>Umieść zwierzę w czystej klatce i umieść je na łagodnej poduszce grzewczej.</li>
	<li>Wyślij zwierzęta z powrotem do pokoju dla zwierząt, gdy odzyskają przytomność i będą poruszać się w klatce.</li>
	<li>Obserwuj zwierzę codziennie pod kątem nieoczekiwanych objawów choroby i infekcji przez następne trzy dni. Myszy są monitorowane z obserwacją czynności w klatkach, w tym dostępu do jedzenia i wody, 1 dzień po operacji. Jeśli myszy wykazują mniejszą aktywność, Ketoprofen podaje się ponownie dootrzewnowo raz dziennie.</li>
	<li>Usuń zszywki lub szwy skóry 2 tygodnie po zabiegu.</li>
	<li>Tkanki ksenoprzeszczepu można pobrać już po 8 tygodniach od zabiegu. Ksenoprzeszczepy można obrazować in vivo za pomocą ultradźwięków małych zwierząt (ryc. 2A), a utrwalone tkanki można ciąć i barwić pod kątem różnych białek za pomocą immunohistochemii (ryc. 3).</li>
</ol>

<ol><li>Taylor, R. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Formation+of+human+prostate+tissue+from+embryonic+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Methods%22%5BJournal%5D)">Formation of human prostate tissue from embryonic stem cells.</a> Nat. Methods. 3, 179-181 (2006).</li>
<li>Cunha, G. R., Chung, L. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stromal-epithelial+interactions--I.+Induction+of+prostatic+phenotype+in+urothelium+of+testicular+feminized+%28Tfm%2Fy%29+mice%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Steroid+Biochem%22%5BJournal%5D)">Stromal-epithelial interactions--I. Induction of prostatic phenotype in urothelium of testicular feminized (Tfm/y) mice.</a> J. Steroid Biochem. 14, 1317-1324 (1981).</li>
<li>Cunha, G. R., Chung, L. W., Shannon, J. M., Taguchi, O., Fujii, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hormone-induced+morphogenesis+and+growth%3A+role+of+mesenchymal-epithelial+interactions%5BTitle%5D)+AND+%22Recent+Prog.+Horm.+Res%22%5BJournal%5D)">Hormone-induced morphogenesis and growth: role of mesenchymal-epithelial interactions.</a> Recent Prog. Horm. Res. 39, 559-598 (1983).</li>
<li>Staack, A., Donjacour, A. A., Brody, J., Cunha, G. R., Carroll, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mouse+urogenital+development%3A+a+practical+approach%5BTitle%5D)+AND+%22Differentiation%22%5BJournal%5D)">Mouse urogenital development: a practical approach.</a> Differentiation. 71, 402-413 (2003).</li>
<li>Cunha, G. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Normal+and+abnormal+development+of+the+male+urogenital+tract.+Role+of+androgens%2C+mesenchymal-epithelial+interactions%2C+and+growth+factors%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Androl%22%5BJournal%5D)">Normal and abnormal development of the male urogenital tract. Role of androgens, mesenchymal-epithelial interactions, and growth factors.</a> J. Androl. 13, 465-475 (1992).</li>
<li>Cunha, G. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Growth+factors+as+mediators+of+androgen+action+during+the+development+of+the+male+urogenital+tract%5BTitle%5D)+AND+%22World+J.+Urol%22%5BJournal%5D)">Growth factors as mediators of androgen action during the development of the male urogenital tract.</a> World J. Urol. 13, 264-276 (1995).</li>
<li>Aboseif, S., El-Sakka, A., Young, P., Cunha, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mesenchymal+reprogramming+of+adult+human+epithelial+differentiation%5BTitle%5D)+AND+%22Differentiation%22%5BJournal%5D)">Mesenchymal reprogramming of adult human epithelial differentiation.</a> Differentiation. 65, 113-118 (1999).</li>
<li>Marker, P. C., Donjacour, A. A., Dahiya, R., Cunha, G. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hormonal%2C+cellular%2C+and+molecular+control+of+prostatic+development%5BTitle%5D)+AND+%22Dev.+Biol%22%5BJournal%5D)">Hormonal, cellular, and molecular control of prostatic development.</a> Dev. Biol. 253, 165-174 (2003).</li>
<li>Cunha, G. R., Sekkingstad, M., Meloy, B. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Heterospecific+induction+of+prostatic+development+in+tissue+recombinants+prepared+with+mouse%2C+rat%2C+rabbit+and+human+tissues%5BTitle%5D)+AND+%22Differentiation%22%5BJournal%5D)">Heterospecific induction of prostatic development in tissue recombinants prepared with mouse, rat, rabbit and human tissues.</a> Differentiation. 24, 174-180 (1983).</li>
<li>Van der Griend, D. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Role+of+CD133+in+Normal+Human+Prostate+Stem+Cells+and+Malignant+Cancer+Initiating+Cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Res%22%5BJournal%5D)">The Role of CD133 in Normal Human Prostate Stem Cells and Malignant Cancer Initiating Cells.</a> Cancer Res. 68, 9703-9711 (2008).</li>
<li>Van der Griend, D. J., Konishi, Y., De Marzo, A. M., Isaacs, J. T., Meeker, A. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dual-label+centromere+and+telomere+FISH+identifies+human%2C+rat%2C+and+mouse+cell+contribution+to+Multispecies+recombinant+urogenital+sinus+xenografts%5BTitle%5D)+AND+%22Prostate%22%5BJournal%5D)">Dual-label centromere and telomere FISH identifies human, rat, and mouse cell contribution to Multispecies recombinant urogenital sinus xenografts.</a> Prostate. , (2009).</li>
<li>Vander Griend, D. J., Konishi, Y., De Marzo, A. M., Isaacs, J. T., Meeker, A. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dual-label+centromere+and+telomere+FISH+identifies+human%2C+rat%2C+and+mouse+cell+contribution+to+Multispecies+recombinant+urogenital+sinus+xenografts%5BTitle%5D)+AND+%22Prostate%22%5BJournal%5D)">Dual-label centromere and telomere FISH identifies human, rat, and mouse cell contribution to Multispecies recombinant urogenital sinus xenografts.</a> Prostate. 69, 1557-1564 (2009).</li>
<li>Thomson, J. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Embryonic+stem+cell+lines+derived+from+human+blastocysts%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Embryonic stem cell lines derived from human blastocysts.</a> Science. 282, 1145-1147 (1998).</li>
<li>Ludwig, T. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Feeder-independent+culture+of+human+embryonic+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Methods%22%5BJournal%5D)">Feeder-independent culture of human embryonic stem cells.</a> Nat. Methods. 3, 637-646 (2006).</li>
<li>Prokhorova, T. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Teratoma+formation+by+human+embryonic+stem+cells+is+site+dependent+and+enhanced+by+the+presence+of+Matrigel%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cells+Dev%22%5BJournal%5D)">Teratoma formation by human embryonic stem cells is site dependent and enhanced by the presence of Matrigel.</a> Stem Cells Dev. 18, 47-54 (2009).</li>
<li>Hameed, O., Sublett, J., Humphrey, P. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Immunohistochemical+stains+for+p63+and+alpha-methylacyl-CoA+racemase%2C+versus+a+cocktail+comprising+both%2C+in+the+diagnosis+of+prostatic+carcinoma%3A+a+comparison+of+the+immunohistochemical+staining+of+430+foci+in+radical+prostatectomy+and+needle+biopsy+tissues%5BTitle%5D)+AND+%22Am.+J.+Surg.+Pathol%22%5BJournal%5D)">Immunohistochemical stains for p63 and alpha-methylacyl-CoA racemase, versus a cocktail comprising both, in the diagnosis of prostatic carcinoma: a comparison of the immunohistochemical staining of 430 foci in radical prostatectomy and needle biopsy tissues.</a> Am. J. Surg. Pathol. 29, 579-587 (2005).</li>
<li>Wang, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+human+prostatic+epithelial+model+of+hormonal+carcinogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Res%22%5BJournal%5D)">A human prostatic epithelial model of hormonal carcinogenesis.</a> Cancer Res. 61, 6064-6072 (2001).</li>
<li>Yao, V., Parwani, A., Maier, C., Heston, W. D., Bacich, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Moderate+expression+of+prostate-specific+membrane+antigen%2C+a+tissue+differentiation+antigen+and+folate+hydrolase%2C+facilitates+prostate+carcinogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Res%22%5BJournal%5D)">Moderate expression of prostate-specific membrane antigen, a tissue differentiation antigen and folate hydrolase, facilitates prostate carcinogenesis.</a> Cancer Res. 68, 9070-9077 (2008).</li>
<li>Cunha, G. R., Cooke, P. S., Kurita, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Role+of+stromal-epithelial+interactions+in+hormonal+responses%5BTitle%5D)+AND+%22Arch.+Histol.+Cytol%22%5BJournal%5D)">Role of stromal-epithelial interactions in hormonal responses.</a> Arch. Histol. Cytol. 67, 417-434 (2004).</li>
<li>Xin, L., Ide, H., Kim, Y., Dubey, P., Witte, O. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+regeneration+of+murine+prostate+from+dissociated+cell+populations+of+postnatal+epithelia+and+urogenital+sinus+mesenchyme%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">In vivo regeneration of murine prostate from dissociated cell populations of postnatal epithelia and urogenital sinus mesenchyme.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 100, Suppl 1. 11896-11903 (2003).</li>
<li>Yu, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lentiviral+vectors+with+two+independent+internal+promoters+transfer+high-level+expression+of+multiple+transgenes+to+human+hematopoietic+stem-progenitor+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Ther%22%5BJournal%5D)">Lentiviral vectors with two independent internal promoters transfer high-level expression of multiple transgenes to human hematopoietic stem-progenitor cells.</a> Mol. Ther. 7, 827-838 (2003).</li>
<li>Anderson, J. S., Bandi, S., Kaufman, D. S., Akkina, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Derivation+of+normal+macrophages+from+human+embryonic+stem+%28hES%29+cells+for+applications+in+HIV+gene+therapy%5BTitle%5D)+AND+%22Retrovirology%22%5BJournal%5D)">Derivation of normal macrophages from human embryonic stem (hES) cells for applications in HIV gene therapy.</a> Retrovirology. 3, 24(2006).</li>
<li>Takahashi, K., Yamanaka, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Induction+of+pluripotent+stem+cells+from+mouse+embryonic+and+adult+fibroblast+cultures+by+defined+factors%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Induction of pluripotent stem cells from mouse embryonic and adult fibroblast cultures by defined factors.</a> Cell. 126, 663-676 (2006).</li>
<li>Maherali, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+high-efficiency+system+for+the+generation+and+study+of+human+induced+pluripotent+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">A high-efficiency system for the generation and study of human induced pluripotent stem cells.</a> Cell Stem Cell. 3, 340-345 (2008).</li>
</ol>

Autorzy nie pozostają w konflikcie interesów z prezentowaną pracą.

Rekombinacja tkanek za pomocą UGSM jest niezwykle przydatną techniką do badania rozwoju prostaty i zdarzeń molekularnych prowadzących do inicjacji raka prostaty. Potencjał indukcyjny PMG został wykorzystany do wielu zastosowań w badaniach nad prostatą; Obejmują one zwiększenie wchłaniania komórek prostaty przez linie komórkowe i guzy, badanie interakcji zrębu i nabłonka oraz tworzenie międzygatunkowych rekombinacji prostaty. 7,17-20 Właściwe przygotowanie PMG ma jednak kluczowe znaczenie dla powodzenia eksper...

Istnieje ogromne zapotrzebowanie na lepsze systemy do modelowania raka prostaty przez ludzi. W szczególności niezwykle pouczające byłyby odpowiednie ludzkie systemy modelowe normalnych, niezłośliwych tkanek prostaty, które mogą być genetycznie manipulowane w celu bezpośredniego rozpoznania roli określonych genów w inicjacji raka prostaty. Nadejście ery genomicznej zidentyfikowało liczne geny, które mogą odgrywać rolę w powstawaniu raka. Brak eksperymentalnych systemów modelowych dla ludzi poważnie osłabia jednak naszą zdolność do funkcjonalnego testowania i charakteryzowania genów podatności na raka prostaty. Idealny system modelowy ułatwiłby szybkie i szybsze analizy funkcjonalne genów podatności na raka w połączeniu z odpowiednimi transgenicznymi systemami modelowymi gryzoni. Co więcej, taki ludzki system modelowy umożliwiłby molekularną charakterystykę mechanizmów sygnalizacyjnych kancerogenezy prostaty w kierunku odkrycia i walidacji nowych terapii zapobiegających powstawaniu raka prostaty.
Ludzkie embrionalne komórki macierzyste (hESC) są zdolne do tworzenia ludzkich tkanek prostaty jako ksenoprzeszczepy. W 2006 roku Taylor i wsp. donieśli, że hESC mogą być indukowane do tworzenia nabłonka gruczołu krokowego in vivo po ponownym połączeniu z mezenchymą zatok moczowo-płciowych (UGSM) gryzoni w okresie 8-12 tygodni. 1 Badania te opierały się na wcześniejszych pracach laboratorium Cunha, które wykazały, że embrionalny UGSM gryzoni może sprzyjać różnicowaniu komórek macierzystych i populacji komórek nabłonka zarodka in vivo. 2,3 Gruczoł krokowy rozwija się z zarodka zwanego zatoką moczowo-płciową (UGS), a przed 17. dniem embrionalnym (mysz E17; dzień E18 u szczura) UGS może zostać usunięty i fizycznie podzielony na nabłonek (UGSE) i mezenchymę (UGSM). 4 To podejście oparte na rekombinacji tkanek znacznie poszerzyło naszą wiedzę na temat rozwoju i kancerogenezy prostaty, w szczególności czynnika wzrostu i hormonalnych szlaków sygnałowych oraz relacji molekularnych między zrębem prostaty a nabłonkiem. 5-8 Metoda ta polega na połączeniu ex vivo PMGS z komórkami macierzystymi lub nabłonkowymi tego samego lub odrębnego gatunku, a te rekombinanty komórkowo-tkankowe są wszczepiane i hodowane oraz ksenoprzeszczepy w organizmie gospodarza myszy. 4,9 Po okresie wzrostu in vivo implant zawiera struktury gruczołowe nabłonka gruczołu krokowego osadzone w tkance zrębu. Można przeprowadzić dalsze barwienie, aby ustalić, czy takie struktury są naprawdę prostaty i są pochodzenia ludzkiego. 10,11

<table><tbody><tr><td>Hank' s Zrównoważony roztwór soli (HBSS)</td><td>GIBCO</td><td>14170</td><td></td></tr><tr><td>DMEM/F12</td><td>GIBCO</td><td>11330</td><td></td></tr><tr><td>R1881</td><td>Sigma</td><td>965-93-5</td><td>Wymieszać do 1 ug/ml w etanolu (1,000x stock)</td></tr><tr><td>NEAA</td><td>GIBCO</td><td>11140</td><td></td></tr><tr><td>Pen-Strep Solution</td><td>GIBCO</td><td>15070</td><td>100x kolba</td></tr><tr><td>Matrigel</td><td>BD Biosciences</td><td>354230</td><td></td></tr><tr><td>KETASET (chlorowodorek ketaminy) </td><td>Fort Dodge Animal Health</td><td>NDC 0856-2013-01</td><td>100 mg/ml; rozcieńczyć w stosunku 1:10 w sterylnym roztworze soli fizjologicznej </td></tr><tr><td>AnaSed (ksylazyna) </td><td>VET-A-MIX, Inc.</td><td>NADA 139-236</td><td>20 mg/ml; rozcieńczyć 1:10 w sterylnej soli fizjologicznej</td></tr><tr><td>Trypsyna</td><td>BD Biosciences</td><td>215240</td><td></td></tr><tr><td>Kolagenaza </td><td>Sigma</td><td>C2014</td><td></td></tr><tr><td>Ketoprofen </td><td>Fort Dodge</td><td>NDC 0856-4396-01</td><td>100 mg/ml; rozcieńczyć 1:1,000 w sterylnej soli fizjologicznej</td></tr><tr><td>Maść do oczu Altalube </td><td>Altaire Pharmaceuticals, Inc.</td><td>NLC 56641-19850</td><td></td></tr><tr><td>Leica MZ16 F Mikroskop stereoskopowy</td><td>Leica</td><td></td><td>Można użyć każdej dobrej lunety preparcyjnej.</td></tr><tr><td>Nożyczki sprężynowe Vannas</td><td>Fine Science Tools</td><td>15001-08</td><td></td></tr><tr><td>Strzykawka</td><td>Hamilton</td><td>84855</td><td></td></tr><tr><td>Igła Hamilton, mała RN, rozmiar 28, 0.5 cala, styl punktowy #3 ()</td><td>Hamilton</td><td>7803-02</td><td>Niestandardowe </td></tr><tr><td>podkładki do przygotowania etanolu</td><td>Fisher Scientific</td><td>06-669-62</td><td></td></tr><tr><td>Sterylne gaziki</td><td>Fisher Scientific</td><td>22-415-469</td><td></td></tr><tr><td>Ethicon Vicryl Szew (4-0 FS-2)</td><td>MedVet International</td><td>J392H</td><td>Igła, rozpuszczalna szew </td></tr><tr><td>Autoclip 9 mm Klipsy do ran</td><td>Becton Dickenson</td><td>427631</td><td></td></tr><tr><td>PVP Jodowe podkładki przygotowawcze</td><td>Fisher Scientific</td><td>06-669-98</td><td></td></tr><tr><td>Nożyczki do dyspreparowania z końcem</td><td>Fine Science Tools</td><td>14072-10</td><td></td></tr><tr><td>Kleszczyki Dumont z cienką końcówką</td><td>Fine Science Tools</td><td>11252-50</td><td></td></tr><tr><td>Uchwyt na igłę z nożyczkami</td><td>Fine Science Tools</td><td>12002-14</td><td></td></tr></tbody></table>

tworzenie ludzkiego nabłonka gruczołu krokowego za pomocą rekombinacji tkankowej mezenchymy zatok moczowo-płciowych gryzoni i ludzkich komórek macierzystych

Formation of Human Prostate Epithelium Using Tissue Recombination of Rodent Urogenital Sinus Mesenchyme and Human Stem Cells

Postęp w badaniach nad rakiem prostaty jest poważnie ograniczony przez dostępność systemów modelowych pochodzenia ludzkiego i niedoświadczonych hormonów, które ograniczają naszą zdolność do zrozumienia genetycznych i molekularnych zdarzeń leżących u podstaw inicjacji choroby prostaty. W kierunku opracowania lepszych systemów modelowych do badania kancerogenezy gruczołu krokowego u ludzi, my i inni wykorzystaliśmy unikalny potencjał indukcyjny pro-prostaty embrionalnego zrębu prostaty gryzoni, zwanego mezenchymą zatok moczowo-płciowych (UGSM). Po rekombinacji z pewnymi populacjami komórek pluripotencjalnych, takimi jak embrionalne komórki macierzyste, UGSM indukuje tworzenie normalnego ludzkiego nabłonka prostaty w sposób zależny od testosteronu. Taki ludzki system modelowy może być wykorzystany do zbadania i eksperymentalnego przetestowania zdolności potencjalnych genów podatności na raka prostaty w przyspieszonym tempie w porównaniu z typowymi badaniami transgenicznymi na gryzoniach. Ponieważ ludzkie embrionalne komórki macierzyste (hESC) mogą być genetycznie modyfikowane w hodowli przy użyciu indukowalnej ekspresji genów lub wektorów knock-down siRNA przed rekombinacją tkanek, taki model ułatwia testowanie funkcjonalnych konsekwencji genów lub kombinacji genów, które uważa się za sprzyjające lub zapobiegające kancerogenezie.
Technika izolowania czystych populacji komórek UGSM jest jednak trudna, a nauka często wymaga kogoś z wcześniejszym doświadczeniem, aby osobiście nauczać. Co więcej, inokulacja mieszanin komórkowych pod torebką nerkową gospodarza z obniżoną odpornością może być technicznie trudna. W tym miejscu nakreślono i zilustrowano prawidłową izolację PMG od zarodków gryzoni oraz implantację torebek nerkowych mieszanin tkankowych w celu utworzenia ludzkiego nabłonka gruczołu krokowego. Takie podejście, na obecnym etapie, wymaga ksenoprzeszczepu in vivo embrionalnych komórek macierzystych; Przyszłe zastosowania mogą potencjalnie obejmować tworzenie gruczołów in vitro lub wykorzystanie indukowanych pluripotencjalnych populacji komórek macierzystych (iPSC).

Opierając się na przełomowym raporcie Taylor et al., nasze laboratorium opracowało protokół przeszczepiania z wykorzystaniem powszechnie stosowanej ludzkiej linii komórek macierzystych z embrionu H1 (oznaczonej przez NIH jako WA01, genetycznie męskiej).1 Linia ta została poddana rygorystycznej kontroli jakości i wykazuje prawidłowy kariotyp.13 Przy odpowiedniej hodowli komórki hES mogą być utrzymywane, namnażane i kriokonserwowane w stanie niezróżnicowanym i pluripotencjalnym, stosując meto...

Aby odkryć najwcześniejsze mechanizmy molekularne leżące u podstaw inicjacji raka prostaty, desperacko potrzebne są nowatorskie i innowacyjne systemy i podejścia do modelowania ludzi. Potencjał mezenchymy zatok układu moczowo-płciowego przed gruczołem krokowym (UGSM) do indukowania pluripotencjalnych populacji komórek macierzystych do tworzenia ludzkiego nabłonka prostaty jest potężnym narzędziem eksperymentalnym w badaniach nad prostatą.

Tworzenie ludzkiego nabłonka gruczołu krokowego za pomocą rekombinacji tkankowej mezenchymy zatok moczowo-płciowych gryzoni i ludzkich komórek macierzystych

Progress in prostate cancer research is severely  limited by the availability of human-derived and hormone-na&iuml;ve model systems,  which limit our ...

Ogólnym celem tej procedury jest wyizolowanie mezenchymy zatoki moczowo-płciowej (UGSM) z zarodków gryzoni oraz implantacja mieszanin tkanek do torebki nerki w celu stworzenia ludzkiego nabłonka prostaty. Osiąga się to poprzez najpierw wyizolowanie zatoki moczowo-płciowej z zarodków myszy lub szczura. Następnie mezenchyma zatoki moczowo-płciowej zostaje oddzielona od nabłonka.Następnie zawiesiny pojedynczych komórek mezenchymy zatoki moczowo-płciowej łączy się z pluripotencjalnymi komórkami macierzystymi. Na koniec mieszaninę komórkową implantuje się pod torebkę nerkową myszy biorcy. W efekcie można uzyskać wyniki wykazujące utworzenie ludzkiego nabłonka prostaty na nerce mysiej, co potwierdza się poprzez walidację ekspresji ludzkiego PSA.Choć metoda ta może dostarczyć wglądu w funkcje prostaty i inicjację choroby, można ją zastosować również do innych układów, takich jak ksenoprzeszczepy guzów prostaty człowieka oraz indukcja cotygodniowych linii komórek nowotworowych w celu wytworzenia guzów. Po eutanazji myszy lub szczura w określonym czasie ciąży i wyizolowaniu embrionów, należy oddzielić je od pęcherzyka płodowego, przeciąć pępowinę i przenieść do probówki o pojemności 50 ml z

formation-human-prostate-epithelium-using-tissue-recombination-rodent

Research

JoVE Journal

Medicine

Medycyna

Tworzenie nabłonka prostaty u ludzi poprzez rekombinację tkanki mezenchymatycznej zatoczek układu moczowo-płciowego gryzoni i ludzkich komórek macierzystych

W tym filmie demonstrujemy hodowlę izolowanych komórek nabłonka prostaty myszy przy użyciu techniki hodowli opartej na pierścieniu żelowym matrycy. Takie podejście może dostarczyć uzupełniających informacji na temat zdolności różnicowania komórek nabłonka prostaty do tworzenia struktur gruczołowych 3D w odpowiedzi na manipulację genetyczną lub farmakologiczną.

Test organoidów prostaty: technika hodowli ex vivo oparta na pierścieniu żelowym Matrix w celu zbadania zdolności różnicowania komórek nabłonka prostaty

W tym filmie opisujemy procedurę sekcji układu moczowo-płciowego lub UGS od męskiego modelu myszy. Ten UGS jest dalej analizowany ex vivo w celu wyizolowania gruczołu krokowego i zbadania jego roli w rozwoju raka prostaty.

Ekstrakcja prostaty z układu moczowo-płciowego myszy: technika oddzielania gruczołu krokowego od innych narządów moczowych i płciowych u samców myszy

Opisujemy produkcję skompresowanych granulek hormonów, jak również podskórne chirurgiczne wszczepianie implantów myszom. Strategia ta może być połączona ze wzrostem ksenoprzeszczepów komórkowych i tkankowych pod torebką nerkową nagich myszy w celu oceny kancerogenezy hormonalnej i regulacji łagodnego wzrostu prostaty.

Ksenograf torebki nerkowej i podskórna implantacja osadu w celu oceny kancerogenezy gruczołu krokowego i łagodnego przerostu gruczołu krokowego

Ten protokół opisuje decelularyzację nerek szczura Sprague Dawley poprzez wstępną perfuzję detergentów przez układ krwionośny, wytwarzając bezkomórkowe matryce zewnątrzkomórkowe nerek, które służą jako szablony do ponownego zasiedlenia ludzkimi komórkami nabłonka nerkowego. Recelularyzacja i zastosowanie testu perfuzji resazuryny do monitorowania wzrostu odbywa się w specjalnie zaprojektowanych bioreaktorach perfuzyjnych.

Repopulacja komórek nabłonkowych i przygotowanie rusztowań macierzy zewnątrzkomórkowej gryzoni do rozwoju tkanki nerkowej

Ten manuskrypt opisuje protokoły mikropreparacji prostaty i chirurgicznej kastracji u myszy laboratoryjnej. Przedstawiamy również reprezentatywne wyniki uzyskane przez te protokoły. Na koniec omawiamy zalety i wykorzystanie tych protokołów.

Mysia mikropreparacja prostaty i kastracja chirurgiczna

Genetycznie modyfikowane myszy są użytecznymi modelami do badania mechanizmów raka prostaty. W tym miejscu przedstawiamy protokół identyfikacji i preparowania płatów prostaty z układu moczowo-płciowego myszy, różnicowania ich na podstawie histologii oraz izolowania i hodowli pierwotnych komórek prostaty in vitro jako sferoid do dalszych analiz.

Identyfikacja, charakterystyka histologiczna i sekcja płatów prostaty myszy dla modeli hodowli sferoidalnych 3D in vitro

Tutaj prezentujemy protokół, który pomaga w postępowaniu z ludzkimi organoidami pierwotnymi prostaty, a następnie sugerujemy punkty końcowe do oceny fenotypu. Opisano wysiew, utrzymanie kultur, odzysk z żelu matrycowego, kwantyfikację morfologiczną, osadzanie i sekcjonowanie, cięcie FFPE, barwienie całego mocowania oraz zastosowanie testów komercyjnych.

Postępowanie z ludzką pierwotną hodowlą organoidów gruczołu krokowego i ich ocena

Organoidy prostaty myszy stanowią obiecujący kontekst do oceny mechanizmów regulujących różnicowanie. W artykule opisano ulepszone podejście do ustalania organoidów prostaty i przedstawiono metody (1) zbierania lizatu białkowego z organoidów oraz (2) utrwalania i barwienia organoidów do mikroskopii konfokalnej z pełną mocą.

Ocena zdolności różnicowania komórek nabłonka prostaty myszy za pomocą hodowli organoidów

Implanty inżynierii tkankowej do chirurgii rekonstrukcyjnej rzadko wychodzą poza próby przedkliniczne ze względu na pracochłonne hodowle ex vivo, które zawierają skomplikowane i kosztowne elementy rusztowania. W tym miejscu przedstawiamy jednoetapową procedurę przeznaczoną do odprowadzania moczu za pomocą dostępnego rusztowania rurkowego na bazie kolagenu zawierającego autologiczne mikroprzeszczepy.

Model chirurgiczny jednoetapowych rurek urotelialnych inżynierii tkankowej u świnek miniaturowych

Protokół ten opisuje generowanie modelu mięśni prostaty wyhodowanego w 2D. Obejmuje dysocjację organoidów, zasiewanie komórek, różnicowanie, ocenę integralności nabłonka oraz zakażenie in vitro uropatogenicznym Escherichia coli. Model zapewnia dostępność wierzchołkową i nadaje się do badania interakcji gospodarz-patogen, przezwyciężając ograniczenia tradycyjnych trójwymiarowych systemów organoidalnych.

Opracowanie modelu opartego na organoidzie prostaty myszy do badania interakcji gospodarz-patogen

Ten protokół przedstawia zoptymalizowaną metodę izolacji nabłonka żeńskiej moczowodu myszy do analiz wtórnych, w tym cytometrii przepływowej, immunobarwienia i hodowli organoidalnej. Metody dały wzbogacone, żywe komórki nabłonkowe cewki moczowej, co potwierdzono za pomocą analizy cytometrii przepływowej, pełnego obrazowania i wydajnego tworzenia organoidów.

Zoptymalizowana metoda izolacji nabłonka cewki moczowej żeńskiej myszy do analizy pojedynczych komórek i immunofluorescencji

Poznaj izolację mezenchymy zatok moczowo-płciowych gryzoni i tworzenie ludzkiego nabłonka gruczołu krokowego z komórkami macierzystymi. Ta metoda pozwala badać mechanizmy inicjacji raka prostaty.

Tworzenie ludzkiego nabłonka gruczołu krokowego za pomocą rekombinacji tkankowej mezenchymy zatok moczowo-płciowych gryzoni i ludzkich komórek macierzystych (Wideo) | JoVE Journal

Tworzenie ludzkiego nabłonka gruczołu krokowego za pomocą rekombinacji tkankowej mezenchymy zatok moczowo-płciowych gryzoni i ludzkich komórek macierzystych

Przeglądaj więcej filmów