Tworzenie ludzkiego nabłonka gruczołu krokowego za pomocą rekombinacji tkankowej mezenchymy zatok moczowo-płciowych gryzoni i ludzkich komórek macierzystych

Ogólnym celem tej procedury jest wyizolowanie układu moczowo-płciowego gryzoni, mezenchymy zatokowej lub PMG z zarodków gryzoni i mieszanin tkanek implantu do torebki nerkowej, która może tworzyć ludzki nabłonek prostaty. Osiąga się to poprzez najpierw wyizolowanie zatoki moczowo-płciowej od zarodków myszy lub szczurów. Następnie mezenchyma zatoki moczowo-płciowej jest oddzielana od nabłonka.

Następnie jednokomórkowe zawiesiny mezenchymy zatok moczowo-płciowych łączy się z pluripotencjalnymi komórkami macierzystymi. Na koniec mieszaninę komórek wszczepia się pod torebkę nerkową myszy gospodarza. Ostatecznie można uzyskać wyniki, które pokazują ludzki nabłonek prostaty utworzony na nerce myszy poprzez walidację ekspresji PSA specyficznej dla człowieka.

Chociaż metoda ta może zapewnić wgląd w funkcję prostaty i inicjację choroby, może być również stosowana do innych systemów, takich jak ksenoprzeszczep ludzkich guzów prostaty i indukcja cotygodniowych linii komórek rakotwórczych w celu tworzenia guzów. Po eutanazji ciężarnej myszy lub szczura i wyizolowaniu zarodków, oddziel je od worka owodniowego, przetnij pępowinę i przenieś do 50-mililitrowej probówki zawierającej lodowate motki. Zrównoważyć roztwór soli i trzymać na lodzie.

Umieść zarodek na 100-milimetrowej szalce Petriego i użyj nożyczek, aby przeciąć go na pół na poziomie bolusa. Usuń żołądek i jelito cienkie, a następnie zlokalizuj jajniki w zarodku żeńskim, które znajdują się na biegunach rozpieszczania nerek lub jądrze u mężczyzny znajdującym się na poziomie pęcherza moczowego. Pod zakresem sekcji.

Użyj nożyczek Venice, aby przeciąć ścianę brzucha, aby odsłonić pęcherz moczowy i tylną ścianę brzucha. Uwolnij górne drogi rodne z przyczepów i uwolnij pępowinę. Przetnij kość łonową i za pomocą kleszczyków Dumont z cienką końcówką.

Dosadnie oddziel go od przedniej ściany zatoki moczowo-płciowej. Oddziel tylną ścianę zatoki moczowo-płciowej od odbytnicy i przetnij zatokę moczowo-płciową z pęcherzem moczowym na dolnym końcu. Następnie oddziel pęcherz moczowy od zatoki moczowo-płciowej.

Przechowuj zatokę moczowo-płciową i blok w lodowatym HBSS. Przenieś zatokę moczowo-płciową do 50-mililitrowej probówki zawierającej 1% trypsyny w HBSS bez wapnia i magnezu i inkubuj w temperaturze czterech stopni Celsjusza przez 30 minut. Po inkubacji usuń trypsynę i dodaj 10% FBS i DM pożywkę MF 12, aby zneutralizować trawienie.

Następnie użyj igły lub kleszczyków z cienką końcówką, aby ostrożnie drażnić lepki mezenchymalny rękaw z rurki nabłonkowej. Utrzymanie rurki nabłonkowej w stanie nienaruszonym zmniejsza ryzyko zanieczyszczenia komórek nabłonkowych mezenchymy. Może to spowodować tworzenie się gruczołów gryzoni wraz z ludzkim nabłonkiem gruczołowym pochodzącym z komórek macierzystych.

Przenieś UGSM do nowej 50-mililitrowej probówki zawierającej pożywkę DMM F 12 zawierającą 10% FBS, 1% paciorkowca, 1% aminokwasów endogennych i jeden nanomolowiec. R 1 8 81 Inkubować probówkę w temperaturze 37 stopni Celsjusza z 5% CO2 przez noc. Następnego dnia odwirować tkankę o stężeniu 200 G. Odrzucić supernatant i użyć PBS do przemycia osadu.

Po usunięciu PBS ponownie zawiesić tkankę w 0,2% kolagenazie w D-M-A-M-F 12 i inkubować w temperaturze 37 stopni Celsjusza, delikatnie kołysząc przez godzinę, energicznie zawirować tkankę trawienną trzy razy, aż stanie się jednorodną mieszaniną jednokomórkową i zneutralizować kolagenazę, dodając pożywkę D-M-A-M-F 12 z 10% FBS, 1% paciorkowcem, 1% aminokwasami endogennymi i jednym nanomolowym R 1, 8, 81. Umyj komórki trzykrotnie, granulując je w 200 G i Resus, zawieszając je w HBSS. Na koniec resus zawiesić komórki mezenchymalne w DMM F 12 i użyć cytometru hemologicznego, aby je policzyć w celu przeprowadzenia przeszczepu.

Po przygotowaniu sterylnego obszaru chirurgicznego i znieczuleniu męskiej atymicznej nagiej myszy za pomocą wstrzyknięcia IP ketaminy ksylazyny, zgodnie z protokołem tekstowym, wykonaj uszczypnięcie palca u nogi, aby potwierdzić poziom sedacji, przygotuj mysz chirurgicznie, goląc miejsce operowane, jeśli to konieczne, i oczyścić je trzema naprzemiennymi chusteczkami z 70% alkoholem, a następnie roztworem Betadyny. Po nałożeniu maści do oczu wykonaj jednocentymetrowe nacięcie podłużne na plecach i kontynuuj cięcie ściany brzucha z 0,5-centymetrowym nacięciem podłużnym. Delikatnie wyciśnij nerkę z brzucha i użyj kropli sterylnej soli fizjologicznej, aby utrzymać ją wilgotną.

Następnie, za pomocą igły strzykawkowej o rozmiarze 27, delikatnie nakłuć torebkę nerkową, aby utworzyć miejsce wstrzyknięcia dla mieszaniny komórek. Następnie napełnij igłę strzykawki o rozmiarze 28 10 mikrolitrami mieszaniny komórek i powoli włóż ją w miejsce nakłucia, penetrując miąższ nerki. Aby dotrzeć do obszaru pod torebką nerkową.

Wstrzyknąć 10 mikrolitrów mieszaniny komórkowej, aby utworzyć bolus na nerce pod kapsułką nerkową i wycofać igłę. Wróć nerkę do jamy brzusznej i zabezpiecz warstwę mięśniową otrzewnej czterema nylonowymi szwami. Zamknij skórę szwami lub zszywkami i użyj sterylnej soli fizjologicznej, aby usunąć krew ze skóry.

Na zdjęciu znajduje się obraz ultrasonograficzny rosnącego ksenoprzeszczepu osiem tygodni po implantacji. Zakreślony obszar reprezentuje ksenoprzeszczep na powierzchni nerki. Obrazy te pokazują wzrost ksenoprzeszczepu na powierzchni nerki.

Po 12 tygodniach ludzkie komórki ES wszczepione przy braku zatoki moczowo-płciowej, mezenchyma utworzą duże potworniaki, podczas gdy mezenchyma zatokowa układu moczowo-płciowego wszczepiona samodzielnie nie utworzy żadnej dostrzegalnej struktury. Pokazane w środku. Panele tego rysunku są reprezentatywnymi barwieniami immunohistochemicznymi ludzkiego nabłonka gruczołu krokowego pochodzącego z komórek macierzystych w porównaniu z dorosłą ludzką tkanką prostaty.

Jak pokazano tutaj po lewej stronie, gruczoły zawierają warstwę nabłonka AR dodatniego luminalnego. Jest to również PSA dodatnie, warstwa komórek podstawnych nabłonka P 63 dodatnia i rzadka chromogranina. Komórki neuroendokrynne, gruczoły nie są rakiem, o czym świadczy ujemne barwienie A-M-A-C-R podczas kastracji gospodarza.

Dodatnie komórki luminalne AR PSA nie są już obecne, co świadczy o charakterystycznej zależności od androgenów. Podejmując się tego zabiegu, należy pamiętać o zachowaniu szczególnej ostrożności przy oddzielaniu mezenchymy zatoki moczowo-płciowej od nabłonka. Ponieważ zanieczyszczenie nabłonka zatok moczowo-płciowych utworzy gruczoły i potencjalnie zakłóci wyniki.