Trójwymiarowe obrazowanie nocyceptywnych śródnaskórkowych włókien nerwowych w biopsjach ludzkiej skóry

Ogólnym celem niniejszej procedury jest przeprowadzenie immunohistochemii na skrawkach biopsji skóry ludzkiej w celu zbadania zmian morfologicznych wewnątrzepidermalnych włókien nerwowych związanych z neuropatią bólową przy użyciu obrazowania trójwymiarowego. Jest to realizowane poprzez przeprowadzenie w pierwszej kolejności trzydniowego protokołu immunohistochemii na wolnopływających skrawkach z poszczególnych biopsji skóry ludzkiej. Drugim krokiem jest obrazowanie skrawków skóry o grubości 50 µm przy użyciu mikroskopu konfokalnego.

Następnie pliki obrazów z widoku przepływu są przetwarzane za pomocą oprogramowania MRS w celu utworzenia trójwymiarowego pliku wideo z oryginalnych obrazów immunofluorescencyjnych. Ostatnim krokiem jest użycie oprogramowania vdw lub podobnego do skompresowania pliku wideo. W rezultacie obrazowanie trójwymiarowe umożliwia badanie zmian morfologicznych związanych z bolesną neuropatią.

Obecnie gęstość naskórkowych włókien nerwowych mierzona śródoperacyjnie jest wykorzystywana jako ilościowa metoda diagnostyki neuropatii. Podwójne znakowanie tych śródskórnych włókien nerwowych z użyciem biomarkera nocyceptywnego może pomóc w wyjaśnieniu mechanizmów bólu związanego z tym powikłaniem. Obecny protokół obrazowania dwuwymiarowego posiada liczne ograniczenia, w tym nakładanie się włókien nerwowych.

W przeciwieństwie do tego, obrazowanie trójwymiarowe stwarza możliwość dalszej analizy zmian morfologicznych związanych z neuropatią, takich jak obrzęk i blaknięcie aksonów, a także pomiarów objętości aksonów. Należy zauważyć, że w celu uzyskania wysokiej jakości obrazów, pozwalających na wygenerowanie sensownych animacji trójwymiarowych, konieczne jest podjęcie odpowiednich środków. Metoda ta może dostarczyć wglądu w mechanizmy neuropatii bólowej. Można ją również zastosować do innych próbek, takich jak grube hodowle organów lub trójwymiarowe hodowle komórkowe, w celu badania i pomiaru złożonych zmian w morfologii trójwymiarowej.

Po utrwaleniu i wykonaniu skrawków z biopsji skóry ludzkiej, zgodnie z opisem w części pisemnej niniejszego protokołu, należy oznakować płytkę 96-dołkową przeznaczoną do barwienia, jak pokazano na tym obrazie. Następnie należy dodać 150 µL sygnału image ITFX do każdego dołka w pierwszym rzędzie oznakowanej płytki 96-dołkowej oraz pipetować 150 µL one XPBS do wszystkich dołków w drugim i trzecim rzędzie. Za pomocą pętli szczepiącej należy przenieść skrawki o wielkości 50 mm pobrane z biopsji dystalnej części nogi pacjenta do jednego z dołków zawierających image.

Następnie przenosi się odcinek o długości 50 milimetrów pobrany z części proksymalnej u tego samego pacjenta do kolejnej dołki zawierającej obraz. Powtarza się tę procedurę dla odcinków dystalnych kończyny dolnej oraz proksymalnych części uda u trzech kolejnych pacjentów. Inkubuje się odcinki w obrazie na wstrząsarce płaskiej przez 30 minut; podczas inkubacji odcinków z biopsji w obrazie przygotowuje się 5% roztwór blokujący i miesza go w wortexie aż do całkowitego rozpuszczenia BSA. Po upływie 30 minut proces kończy się.

Przenieść skrawki do PBS w drugim rzędzie i inkubować przez 10 minut na kołysarce, a następnie płukać w PBS w trzecim rzędzie przez 10 minut. Ponownie przy użyciu kołysarki pipetować 150 µL 5% BSA, roztworu blokującego, do każdej studni w czwartym rzędzie i przenieść do nich skrawki; inkubować skrawki w 5% roztworze blokującym BSA przez jedną do dwóch godzin w temperaturze pokojowej na płaskiej kołysarce. Podczas tej inkubacji przygotować 1% roztwór płuczący, mieszając go w wirówce vorex do całkowitego rozpuszczenia BSA, a następnie rozcieńczyć przeciwciała pierwszorzędowe do wymaganego stężenia w tym roztworze.

Następnie dodaj 150 µL rozcieńczonych przeciwciał pierwszorzędowych do dołków w piątym rzędzie płytki 96-dołkowej. Po upływie czasu inkubacji przenieś skrawki z roztworu blokującego do odpowiednich dołków z przeciwciałami pierwszorzędowymi. Następnie szczelnie zamknij płytkę za pomocą parafilmu i folii aluminiowej, aby zapobiec wysychaniu oraz ekspozycji na światło, i inkubuj przez noc w temperaturze 4 °C na płaskim wytrząsarce. Następnego dnia dodaj 150 µL roztworu płuczącego z 1% BSA do każdego dołka w rzędach szóstym, siódmym i ósmym; przepłucz skrawki w tych roztworach przez jedną godzinę w temperaturze pokojowej przy ciągłym wytrząsaniu, upewniając się, że płytka jest chroniona przed światłem podczas każdego płukania. Podczas gdy skrawki inkubują w ostatnim płukaniu w roztworze 1% BSA, rozcieńcz przeciwciała drugorzędowe w roztworze płuczącym z 1% BSA zgodnie z instrukcjami zawartymi w pisemnej części protokołów.

Po upływie czasu inkubacji dodaj 150 µL rozcieńczonych przeciwciał wtórnych do odpowiednich dołków w dziewiątym rzędzie płytki 96-dołkowej. Przenieś przekroje do tych dołków, przykryj płytkę parafilmem i folią aluminiową, a następnie inkubuj przez noc w temperaturze 4 °C na kołysce laboratoryjnej. Następnego dnia dodaj 150 µL roztworu płuczącego z 1% BSA do każdego dołka w rzędach 10, 11 i 12 i płucz przekroje w tym roztworze przez jedną godzinę każdy, analogicznie jak poprzednio.

Podczas inkubacji przekrojów biopsji w ostatnim płukaniu w 1%BSA roztworze płuczącym, przygotować szkiełka mikroskopowe, nanosząc pipetą 50 µl 1%BSA roztworu płuczącego na każde szkiełko z osobna. Wyjąć przekrój z ostatniego płukania i umieścić go w kropli 50 µl 1%BSA roztworu płuczącego na wyznaczonym szkiełku mikroskopowym. Po zoptymalizowaniu położenia przekroju, usunąć nadmiar 1%BSA roztworu płuczącego za pomocą szklanej pipety z gruszką, zachowując ostrożność, aby nie dotknąć preparatu.

Nanieś jedną kroplę medium montażowego Prolonged Gold przeciw wyblaknięciu z DPI obok biopsji na szkiełku przedmiotowym. Następnie weź szkiełko nakrywkowe o wymiarach 22 by 22 millimeter i ostrożnie połóż je na biopsji oraz kropli medium montażowego. Usuń wszelkie pęcherzyki powietrza za pomocą końcówki pipety i zetrzyj nadmiar Prolonged Gold.

Odczynnik Antifa. Powtórz procedurę dla każdej sekcji i pozostaw szkiełka mikroskopowe do wyschnięcia przez noc w temperaturze pokojowej, w ciemności, do następnego dnia. Obrazuj sygnały fluorescencyjne przy użyciu mikroskopu konfokalnego; w niniejszym protokole wykorzystano skaningowy mikroskop konfokalny Olympus flow view 500 z obiektywem imersyjnym 40 x i dwukrotnym powiększeniem (zoom), przy użyciu oprogramowania flow view w wersji 5.0.

Użyj Alexa floor 4 88 oraz Alexa floor 6 47, aby odpowiednio wzbudzić zielony laser helowo-neonowy 543 nm oraz czerwony laser helowo-neonowy 633 nm. Aby wzmocnić sygnały, ustaw apertury konfokalne dla każdego detektora na 400 µm. Skanowanie sekwencyjne należy przeprowadzić w rozdzielczości 10 24 na 10 24.

Aby zmaksymalizować separację sygnału, należy zarejestrować trójwymiarową serię Z, stosując interwały kroku Z wynoszące 1.2 micron w oparciu o optymalną jednostkę skanowania, obliczoną przez oprogramowanie flow view z uśrednianiem dwóch klatek kalmana w pierwszych otwartych plikach flow view w oprogramowaniu MRSX 64 lub podobnym. Aby zwizualizować zestawy obrazów 3D, należy dostosować wyświetlanie w celu zwiększenia kontrastu sygnału specyficznego dla nerwów. Należy utworzyć powierzchnię w celu wizualizacji granicy skóry właściwej i naskórka.

Użyj narzędzia konturu w trybie rysowania, aby wyznaczyć granicę. Przypisz do granicy półprzezroczystą powierzchnię, aby widzieć znajdujące się pod nią sygnały fluorescencyjne i przechwytywać statyczne obrazy sygnałów fluorescencyjnych 3D. Aby utworzyć migawki z filmu 3D, skorzystaj z funkcji animacji, aby stworzyć zestaw animacji filmu 3D, generując filmy składające się z 200 klatek, animowanych z prędkością 15 klatek na sekundę.

Zapisz każdy film jako surowy plik AVI, a końcowy plik AVI skompresuj za pomocą oprogramowania VirtualDub lub podobnego. Ten film przedstawia obrazy 3D nocyceptywnych wewnątrzepidermalnych włókien nerwowych. Ten pierwszy obraz ukazuje zielone, pozytywne pod kątem PGP wewnątrzepidermalne włókna nerwowe, reprezentujące całkowitą liczbę wewnątrzepidermalnych włókien nerwowych, a także czerwone, pozytywne pod kątem TrkA wewnątrzepidermalne włókna nerwowe, reprezentujące nocyceptywne wewnątrzepidermalne włókna nerwowe.

Na koniec przedstawiono obraz wykazujący PGP-dodatnie nocyceptywne wewnątrzepidermalne włókna nerwowe w próbce skóry z przypadku pierwszego; pasek skali reprezentuje 20 µm. Następny film przedstawia obrazy 3D obrzęków aksonalnych w wewnątrzepidermalnych włóknach nerwowych w neuropatiach bólowych. Obrzęki aksonalne, zaznaczone grotami strzałek, widoczne są wzdłuż wewnątrzepidermalnych włókien nerwowych znakowanych PGP sygnałem zielonym w obrębie splotu podskórnego.

W próbce skóry z przypadku drugiego pasek skali reprezentuje 10 mikronów. Ten obraz 3D przedstawia rozgałęzienia aksonalne w wewnątrzepidermalnych włóknach nerwowych w przebiegu neuropatii bólowej. Rozgałęzienia aksonalne, wskazane grotami strzałek, są widoczne wzdłuż wewnątrzepidermalnych włókien nerwowych znakowanych PGP zielonym sygnałem w próbce skóry z przypadku trzeciego.

Pasek skali reprezentuje 20 microns Po opanowaniu technika ta może zostać wykonana w ciągu czterech dni, po trzy i pół godziny dziennie w przypadku immunohistochemii oraz 35 minut na próbkę w przypadku obrazowania konfokalnego i animacji 3D. Podczas wykonywania tej procedury należy pamiętać o prawidłowym przenoszeniu i montowaniu tkanek, zachowując ostrożność, aby uniknąć rozerwania lub uszkodzenia próbek materiału Po wykonaniu tej procedury. W celu udzielenia odpowiedzi na dodatkowe pytania można zastosować inne metody, takie jak trójwymiarowa analiza tric do oceny innowacji skórnych.

Czy rozgałęzianie się włókien nerwów brzusznych odgrywa istotną rolę w rozwoju bolesnej neuropatii?