Name: Trójwymiarowe obrazowanie nocyceptywnych śródnaskórkowych włókien nerwowych w biopsjach ludzkiej skóry (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-04-29T13:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 22 s
Description: Poznaj trójwymiarową analizę nocyceptywnych włókien nerwowych w biopsjach skóry. Ta metoda immunohistochemiczna z mikroskopią konfokalną pozwala badać zmiany morfologiczne związane z bolesnymi neuropatiami.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Ta praca była wspierana przez National Institutes of Health Grants K08 NS061039-01A2, Program for Neurology Research & Discovery, oraz Instytut Badań Medycznych im. A. Alfreda Taubmana na Uniwersytecie Michigan. W pracy wykorzystano rdzeń morfologii i analizy obrazu Centrum Badań i Szkoleń nad Cukrzycą w Michigan, finansowany przez National Institutes of Health Grant 5P90 DK-20572 z National Institute of Diabetes and Digestive and Kidney Diseases. Autorzy chcieliby podziękować Robinsonowi Singletonowi i Gordonowi Smithowi (University of Utah) za hojne przekazanie próbek ludzkiej skóry w celu wsparcia początkowego rozwoju techniki immunohistochemicznej biomarkerów nocyceptywnych.

Część A: Immunohistochemia
Przygotowanie płytki 96-dołkowej i zapobieganie barwieniu tła Biopsje skóry z ponczu są pobierane od ludzi i inkubowane przez 12-24 godziny w roztworze utrwalającym (2% paraformaldehydu z 0,75 M roztworem L-lizyny (pH 7,4) i 0,05 mM periodianem sodu) w temperaturze 4 °C, jak opisano wcześniej 8. Próbki są następnie kriozabezpieczone w roztworze soli fizjologicznej buforowanej fosforanami (PBS) z 20% glicerolem w temperaturze 4 °C przez okres do 1 tygodnia, zatopione w podłożu montażowym o optymalnej temperaturze cięcia (OCT), a następnie podzielone na sekcje o grubości 50 μm na kriostacie. Opisany poniżej protokół jest przeznaczony dla 8 odcinków skóry, co stanowi maksymalną liczbę skrawków skóry, które można poddać immunohistochemii swobodnej w jednej 96-dołkowej płytce.
DZIEŃ 1:
1. Zapobieganie nieswoistej immunoreaktywności w warstwie rogowej naskórka
<ol>
 <li>Oznaczyć płytkę 96-dołkową, jak pokazano na rysunku 1.</li>
 <li>Dodać 150 μl sygnału Image-IT FX (Image-IT), skutecznego do blokowania barwienia tła 11,12, do każdej studzienki w rzędzie 1 płytki 96-dołkowej.</li>
 <li>Dodać 150 μl 1X PBS do każdego dołka w rzędzie 2 i 3 płytki 96-dołkowej.</li>
 <li>Pobrać dwa skrawki 50 μm na pacjenta: jeden wycinek z biopsji pobranej w DL, jeden wycinek z biopsji pobranej w PT. Pętla zaszczepiająca (LeLoop) służy do przenoszenia skrawków z jednego płukania do drugiego, aby uniknąć uszkodzeń morfologicznych. Delikatnie przenieść każdy odcinek o wielkości 50 μm, za pomocą pętli zaszczepiającej, do indywidualnego dołka w rzędzie 1, zawierającego Image-IT. Inkubuj sekcje w Image-IT przez 30 minut w RT na płaskim rockerze.</li>
 <li>Przepłukać sekcje dwukrotnie 1X PBS (rzędy 2 i 3) przez 10 minut w temperaturze pokojowej. Umieść płytkę studzienkową na płaskim kołysku między płukaniami.</li>
</ol>
2. Przygotowanie 5% roztworu blokującego BSA i 1% roztworu płuczącego
<ol>
 <li>Podczas inkubacji skrawków biopsji w Image-IT należy przygotować 5% roztwór blokujący (5% BSA, 0,3% TX-100, 0,1 M PBS-Vortex roztwór aż do całkowitego rozpuszczenia BSA).</li>
 <li>Dodać 150 μl 5% roztworu blokującego BSA do każdego dołka w rzędzie 4.</li>
 <li>Za pomocą pętli zaszczepiającej przenieś skrawki do indywidualnych studzienek z 5% roztworem blokującym BSA. Inkubuj sekcje w 5% roztworze blokującym BSA przez 1-2 godziny przy temperaturze pokojowej na płaskim wahaczu.</li>
</ol>
3. Przygotowanie 1% roztworu płuczącego BSA i rozcieńczenie przeciwciał pierwszorzędowych
<ol>
 <li>Podczas inkubacji skrawków w 5% roztworze blokującym BSA, należy przygotować 1% roztwór do płukania (1% BSA, 0,3% TX-100, 0,1 M PBS-Vortex roztwór, aż BSA całkowicie się rozpuści).</li>
 <li>Podczas gdy sekcje inkubują się w 5% roztworze blokującym BSA, rozcieńczyć przeciwciała pierwszorzędowe w 1% roztworze do płukania.
 <ol>
 <li>Na osiem sekcji (8 x 150 μl = 1 200 μl) potrzeba łącznie 1 200 μl. Przeciwciała pierwszorzędowe składają się z 1 500 μl (około 20% dodatkowej objętości).</li>
 <li>Rozcieńczenia przeciwciał pierwszorzędowych: PGP, 1:500; Trk A, 1:500 w 1% roztworze płuczącym BSA.</li>
 </ol>
 </li>
</ol>
4. Inkubacja biopsji podzielonej na sekcje w pierwotnym przeciwciałie
<ol>
 <li>Dodać 150 μl rozcieńczonych przeciwciał pierwszorzędowych do wyznaczonych dołków płytki 96-dołkowej (rząd 5).</li>
 <li>Przenieść skrawki z 5% roztworu blokującego (wiersz 4) do wyznaczonych studzienek na przeciwciała pierwotne (wiersz 5).</li>
 <li>Uszczelnij 96-dołkową płytkę parafilmem i folią aluminiową, aby uniknąć wysuszenia i ekspozycji na światło.</li>
 <li>Inkubować 96-dołkową płytkę O/N w temperaturze 4 °C na płaskim kołysku.</li>
</ol>
DZIEŃ 2:
5. Płukanie biopsji w 1% roztworze do płukania BSA
<ol>
 <li>Dodać 150 μl 1% roztworu płuczącego BSA do każdej studzienki w rzędzie 6, 7 i 8.</li>
 <li>Przepłukać sekcje trzykrotnie 1% roztworem płuczącym BSA (rzędy 6, 7 i 8) przez 1 godzinę za każdym razem w temperaturze suchej masy. Przykryj płytkę studzienki folią aluminiową i umieść na płaskim wahaczu między płukaniami.</li>
</ol>
6. Rozcieńczenie przeciwciał drugorzędowych
<ol>
 <li>Podczas gdy skrawki inkubuje się w ostatnim płukaniu 1% roztworu płuczącego BSA (wiersz 8), rozcieńczyć przeciwciała drugorzędowe w 1% roztworze płuczącym BSA:
 <ol>
 <li>Na osiem sekcji (8 x 150 μl = 1 200 μl) potrzeba łącznie 1 200 μl. Przeciwciała drugorzędowe składają się z 1 500 μl (około 20% dodatkowej objętości).</li>
 <li>Rozcieńczenia przeciwciał drugorzędowych: dla PGP (Alexa Fluor 488 osła anty-królik, 1:250), dla Trk A (Alexa Fluor 647 ośla anty-koza, 1:250) w 1% roztworze płuczącym BSA.</li>
 </ol>
 </li>
</ol>
7. Inkubacja biopsji wycinkowych w przeciwciałach wtórnych
<ol>
 <li>Dodać 150 μl rozcieńczonych przeciwciał drugorzędowych do wyznaczonych dołków na 96-dołkowej płytce (wiersz 9).</li>
 <li>Przenieść skrawki z 1% roztworu blokującego BSA (wiersz 8) do dołka przeciwciał drugorzędowych (wiersz 9).</li>
 <li>Uszczelnij 96-dołkową płytkę parafilmem i folią aluminiową, aby uniknąć wysuszenia i ekspozycji na światło.</li>
 <li>Inkubować skrawki w wyznaczonych przeciwciałach drugorzędowych O/N w temperaturze 4 °C na płaskim wahaczu.</li>
</ol>
8. Płukanie biopsji w 1% roztworze do płukania BSA
<ol>
 <li>Dodać 150 μl 1% roztworu płuczącego BSA do każdej studzienki w rzędzie 10, 11 i 12.</li>
 <li>Przepłukać sekcje trzykrotnie 1% roztworem płuczącym BSA (rzędy 10, 11 i 12) za każdym razem przez 1 godzinę w temperaturze pokojowej. Przykryj płytkę studzienki folią aluminiową i umieść na płaskim wahaczu między płukaniami.</li>
</ol>
9. Przygotowanie preparatów mikroskopowych i montaż biopsji sekcyjnych
<ol>
 <li>Podczas inkubacji skrawków biopsji w ostatnim płukaniu 1% roztworu płuczącego BSA (rząd 12), należy przygotować szkiełka mikroskopowe.</li>
 <li>Umieszczać 50 μl 1% roztworu płuczącego BSA na jednym szkiełku na raz.</li>
 <li>Usunąć skrawki z 1% roztworu płuczącego BSA (rząd 12) i umieścić je w kropli 50 μl 1% roztworu płuczącego BSA na wyznaczonym szkiełku mikroskopowym. Po zoptymalizowaniu położenia sekcji, usunąć nadmiar 1% roztworu płuczącego BSA za pomocą szklanej pipety z bańką, zachowując środki ostrożności, aby uniknąć dotykania próbki.</li>
</ol>
UWAGA: Upewnij się, że sekcja nie jest zagięta; próbka powinna przylegać płasko do powierzchni szkiełka mikroskopowego.
<ol start="4">
 <li>Umieść 1 kroplę odczynnika do mocowania zapobiegającego blaknięciu Prolong Gold z DAPI w pobliżu biopsji na szkiełku mikroskopowym. Weź szkiełko nakrywkowe mikroskopu o wymiarach 22x22 mm i delikatnie umieść je na biopsji i kropli odczynnika przeciwblaknięcia Prolong Gold z kroplą DAPI. Powtórz te czynności dla każdej sekcji.</li>
 <li>Pozwól szkiełkom mikroskopowym wyschnąć O/N przy RT w ciemności.</li>
</ol>
UWAGA: Usuń wszelkie pęcherzyki powietrza za pomocą końcówki pipety. Zetrzyj nadmiar odczynnika zapobiegającego blaknięciu Prolong Gold.
Część B: Obrazowanie konfokalne
10. Obrazowanie konfokalne
<ol>
 <li>Obrazuj sygnały fluorescencji za pomocą laserowego skaningowego mikroskopu konfokalnego Olympus FluoView 500 z 40-krotnym obiektywem olejowym (1,3 NA) i dwukrotnym zoomem za pomocą oprogramowania FluoView w wersji 5.0.</li>
 <li>Użyj Alexa Fluor 488 i Alexa Fluor 647, aby wzbudzić odpowiednio zielony laser HeNe 543 nm i czerwony laser HeNe 633 nm. Sygnał Alexa Fluor 488 jest reprezentowany przez zieloną tabelę przeglądową (LUT), a Alexa Fluor 647 przez czerwoną tablicę LUT.</li>
 <li>Ustaw apertury konfokalne dla każdego detektora na 400 μm, aby wzmocnić sygnały. Skany sekwencyjne powinny być wykonywane w rozdzielczości 1,024 x 1,024, aby zmaksymalizować separację sygnału.</li>
 <li>Rejestruj trójwymiarowe obrazy z serii Z przy użyciu interwałów kroku Z 1,2 μm (w oparciu o optymalną jednostkę skanującą obliczoną przez oprogramowanie FluoView) z uśrednianiem Kalmana (dwie klatki).</li>
</ol>
Część C: Trójwymiarowa wizualizacja i animacja
11. Trójwymiarowa (3D) wizualizacja i animacja
<ol>
 <li>Otwórz pliki Fluoview w oprogramowaniu Imaris x64 (wersja 7.3, Bitplane AG), aby zobrazować zestawy obrazów 3D.</li>
 <li>Dostosuj wyświetlacz zgodnie z potrzebami, aby zwiększyć kontrast sygnału specyficznego dla nerwu.</li>
 <li>Utwórz powierzchnię, aby uwidocznić granicę skórno-naskórkową. Użyj narzędzia Kontur w trybie rysowania, aby narysować obwiednię.</li>
 <li>Przypisz półprzezroczystą powierzchnię do granicy, aby zobaczyć leżące pod nią sygnały fluorescencyjne.</li>
 <li>Uchwyć nieruchome obrazy sygnałów fluorescencyjnych 3D, aby utworzyć obrazy migawkowe filmu 3D.</li>
 <li>Użyj funkcji Animacja, aby utworzyć film 3D. Obrazy można kilkakrotnie obrócić o 360 stopni, aby pokazać każdy sygnał osobno i połączyć (rysunki 2, 3 i 4). Ustaw animację, aby tworzyć filmy składające się z 200 klatek animowanych z prędkością 15 klatek na sekundę. Zapisz każdy film jako nieprzetworzony plik AVI.</li>
 <li>Skompresuj końcowy film AVI za pomocą oprogramowania VirtualDub (wersja 1.9.4).</li>
</ol>

<ol><li>Lauria, G., Holland, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Epidermal+innervation%3A+changes+with+aging%2C+topographic+location%2C+and+in+sensory+neuropathy%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurol.+Sci%22%5BJournal%5D)">Epidermal innervation: changes with aging, topographic location, and in sensory neuropathy.</a> J. Neurol. Sci. 164 (2), 172-178 (1999).</li>
<li>Sullivan, K. A., Hayes, J. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mouse+models+of+diabetic+neuropathy%5BTitle%5D)+AND+%22Neurobiol.+Dis%22%5BJournal%5D)">Mouse models of diabetic neuropathy.</a> Neurobiol. Dis. 28 (3), 276-285 (2007).</li>
<li>McArthur, J. C., Stocks, E. A., Hauer, P., Cornblath, D. R., Griffin, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Epidermal+nerve+fiber+density%3A+normative+reference+range+and+diagnostic+efficiency%5BTitle%5D)+AND+%22Arch.+Neurol%22%5BJournal%5D)">Epidermal nerve fiber density: normative reference range and diagnostic efficiency.</a> Arch. Neurol. 55 (12), 1513-1520 (1998).</li>
<li>Griffin, J. W., McArthur, J. C., Polydefkis, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Assessment+of+cutaneous+innervation+by+skin+biopsies%5BTitle%5D)+AND+%22Curr.+Opin.+Neurol%22%5BJournal%5D)">Assessment of cutaneous innervation by skin biopsies.</a> Curr. Opin. Neurol. 14 (5), 655-659 (2001).</li>
<li>Cheng, H. T., Dauch, J. R., Hayes, J. M., Yanik, B. M., Feldman, E. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nerve+growth+factor%2Fp38+signaling+increases+intraepidermal+nerve+fiber+densities+in+painful+neuropathy+of+type+2+diabetes%5BTitle%5D)+AND+%22Neurobiol.+Dis%22%5BJournal%5D)">Nerve growth factor/p38 signaling increases intraepidermal nerve fiber densities in painful neuropathy of type 2 diabetes.</a> Neurobiol. Dis. 45 (1), 280-287 (2012).</li>
<li>Lauria, G., Lombardi, R., Camozzi, F., Devigili, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Skin+biopsy+for+the+diagnosis+of+peripheral+neuropathy%5BTitle%5D)+AND+%22Histopathology%22%5BJournal%5D)">Skin biopsy for the diagnosis of peripheral neuropathy.</a> Histopathology. 54 (3), 273-285 (2009).</li>
<li>Vlckova-Moravcova, E., Bednarik, J., Dusek, L., Toyka, K. V., Sommer, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Diagnostic+validity+of+epidermal+nerve+fiber+densities+in+painful+sensory+neuropathies%5BTitle%5D)+AND+%22Muscle+Nerve%22%5BJournal%5D)">Diagnostic validity of epidermal nerve fiber densities in painful sensory neuropathies.</a> Muscle Nerve. 37 (1), 50-60 (2008).</li>
<li>Casanova-Molla, J., Morales, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Axonal+fluorescence+quantitation+provides+a+new+approach+to+assess+cutaneous+innervation%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci.+Methods%22%5BJournal%5D)">Axonal fluorescence quantitation provides a new approach to assess cutaneous innervation.</a> J. Neurosci. Methods. 200 (2), 190-198 (2011).</li>
<li>Wang, L., Hilliges, M., Jernberg, T., Wiegleb-Edstrom, D., Johansson, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protein+gene+product+9.5-immunoreactive+nerve+fibres+and+cells+in+human+skin%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Tissue+Res%22%5BJournal%5D)">Protein gene product 9.5-immunoreactive nerve fibres and cells in human skin.</a> Cell Tissue Res. 261 (1), 25-33 (1990).</li>
<li>Lauria, G., Morbin, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Expression+of+capsaicin+receptor+immunoreactivity+in+human+peripheral+nervous+system+and+in+painful+neuropathies%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Peripher.+Nerv.+Syst%22%5BJournal%5D)">Expression of capsaicin receptor immunoreactivity in human peripheral nervous system and in painful neuropathies.</a> J. Peripher. Nerv. Syst. 11 (3), 262-271 (2006).</li>
<li>Penna, G., Fibbi, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+benign+prostatic+hyperplasia+stromal+cells+as+inducers+and+targets+of+chronic+immuno-mediated+inflammation%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Immunol%22%5BJournal%5D)">Human benign prostatic hyperplasia stromal cells as inducers and targets of chronic immuno-mediated inflammation.</a> J. Immunol. 182 (7), 4056-4064 (2009).</li>
<li>Lentz, S. I., Edwards, J. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mitochondrial+DNA+%28mtDNA%29+Biogenesis%3A+Visualization+and+Duel+Incorporation+of+BrdU+and+EdU+Into+Newly+Synthesized+mtDNA+In+Vitro%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Histochem.+Cytochem%22%5BJournal%5D)">Mitochondrial DNA (mtDNA) Biogenesis: Visualization and Duel Incorporation of BrdU and EdU Into Newly Synthesized mtDNA In Vitro.</a> J. Histochem. Cytochem. 58 (2), 207-218 (2010).</li>
<li>Polydefkis, M., Hauer, P., Griffin, J. W., McArthur, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Skin+biopsy+as+a+tool+to+assess+distal+small+fiber+innervation+in+diabetic+neuropathy%5BTitle%5D)+AND+%22Diabetes+Technol.+Ther%22%5BJournal%5D)">Skin biopsy as a tool to assess distal small fiber innervation in diabetic neuropathy.</a> Diabetes Technol. Ther. 3 (1), 23-28 (2001).</li>
<li>Lauria, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Small+fibre+neuropathies%5BTitle%5D)+AND+%22Curr.+Opin.+Neurol%22%5BJournal%5D)">Small fibre neuropathies.</a> Curr. Opin. Neurol. 18 (5), 591-597 (2005).</li>
<li>Sorensen, L., Molyneaux, L., Yue, D. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+relationship+among+pain%2C+sensory+loss%2C+and+small+nerve+fibers+in+diabetes%5BTitle%5D)+AND+%22Diabetes+Care%22%5BJournal%5D)">The relationship among pain, sensory loss, and small nerve fibers in diabetes.</a> Diabetes Care. 29 (4), 883-887 (2006).</li>
<li>Lauria, G., Morbin, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Axonal+swellings+predict+the+degeneration+of+epidermal+nerve+fibers+in+painful+neuropathies%5BTitle%5D)+AND+%22Neurology%22%5BJournal%5D)">Axonal swellings predict the degeneration of epidermal nerve fibers in painful neuropathies.</a> Neurology. 61 (5), 631-636 (2003).</li>
<li>Herrmann, D. N., McDermott, M. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Epidermal+nerve+fiber+density%2C+axonal+swellings+and+QST+as+predictors+of+HIV+distal+sensory+neuropathy%5BTitle%5D)+AND+%22Muscle+Nerve%22%5BJournal%5D)">Epidermal nerve fiber density, axonal swellings and QST as predictors of HIV distal sensory neuropathy.</a> Muscle Nerve. 29 (3), 420-427 (2004).</li>
<li>Navarro, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chapter+27%3A+Neural+plasticity+after+nerve+injury+and+regeneration%5BTitle%5D)+AND+%22Int.+Rev.+Neurobiol%22%5BJournal%5D)">Chapter 27: Neural plasticity after nerve injury and regeneration.</a> Int. Rev. Neurobiol. 87, 483-505 (2009).</li>
</ol>

Brak konfliktu interesów, który można by zadeklarować.

Pomiar IENFD jest szeroko stosowany do określania stopnia neuropatii obwodowych 13,14. Obecnie najczęściej stosowany protokół mierzy jedynie gęstość włókien nerwowych, które przenikają do błony podstawnej naskórka; Nie uwzględnia rozgałęzień aksonalnych i/lub zmian morfologicznych nerwów. Ponadto nie wykazano, aby obecna analiza IENFD korelowała IENFD z obecnością bólu w PN 15.
Wcześniej informowaliśmy, że zwiększona liczba nocyceptywnego IENFD jest związana z zachowania...

Obecnie powszechną praktyką lekarzy jest ilościowe określanie gęstości wewnątrznaskórkowych włókien nerwowych (IENFD) z biopsji skóry, które mogą być używane do diagnozowania neuropatii małych włókien 3, 6-8. Biopsje pobiera się z dystalnej części nogi (DL), 10 cm powyżej kostki bocznej i bliższego uda (PT), 20 cm poniżej przedniego odcinka biodrowego kręgosłupa 9. Wszystkie IENF są znakowane za pomocą produktu genu białka 9.5 (PGP), markera neuronalnego 10-12. Obecnie standardową praktyką jest diagnozowanie neuropatii małych włókien za pomocą IENFD oznaczanego za pomocą barwienia PGP za pomocą mikroskopii jasnego pola 6. Ponadto kilka grup badawczych zastosowało protokoły immunofluorescencyjne w immunohistochemii PGP 7-9. Neuropatia małych włókien jest powszechnie związana z bólem neuropatycznym. Aby lepiej zrozumieć rolę IENF niezbędną w leczeniu bólu, opracowaliśmy technikę wspólnego znakowania całkowitego IENF z włóknami generującymi ból. Nocyceptywne IENF, w szczególności włókna Aδ i C, można badać poprzez wspólne znakowanie IENF z PGP i markerem nocyceptywnym, kinazą receptora tropomiozyny A (Trk A) 5. Trk A jest receptorem o wysokim powinowactwie do czynnika wzrostu nerwów, który jest niezbędny do rozwoju nocycepcji. Nocyceptywne włókna nerwowe Trk A-dodatnie to włókna peptyderginiczne, które wyrażają substancję P (SP) i peptyd związany z genem kalcytoniny (CGRP). Wcześniej Lauria i współpracownicy zastosowali technikę podwójnego znakowania do badania PN, koznakując PGP-dodatni IENF markerem nocyceptywnym 10. W naszym poprzednim badaniu wykazaliśmy, że Trk A-dodatni IENF, ale nie Trk A-ujemny IENF, był regulowany w górę w zwierzęcym modelu bolesnej neuropatii cukrzycowej 5. Ta technika wspólnego znakowania zapewnia możliwość porównania kwantyfikacji nocyceptywnego IENFD z całkowitym IENFD oraz możliwość badania zmian morfologicznych związanych z PN. Możliwość wizualizacji nocyceptywnego IENF i porównania kwantyfikacji całkowitego IENFD z nocyceptywnym IENFD może dostarczyć obiektywnych dowodów na obecność bólu i być może wglądu w nasilenie bólu związanego z PN. Technika ta ma również zastosowanie do skóry modeli zwierzęcych. W porównaniu z poprzednimi badaniami, obecny protokół opisuje metody analizy obrazu 3D, stwarzając możliwość uniknięcia błędów, które mogłyby wystąpić w analizie obrazu 2D.

<table><tbody><tr><td>10X PBS</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP399-4</td><td>Do uzupełnienia 1X</td></tr><tr><td>PBS Image-IT FX Signal</td><td>Invitrogen</td><td>I36933</td><td>Image-IT</td></tr><tr><td>Protein Gene Product 9.5 (Poliklonalny królik)</td><td>AbD Serotec</td><td>7863-0504</td><td>PGP</td></tr><tr><td>Tropomyozyna Pokrewna-Kinaza A (Koza poliklonalna)</td><td>R& D Systems</td><td>AF1056</td><td>Trk A</td></tr><tr><td>Alexa Fluor 488 osioł &alpha;-królik</td><td>Invitrogen</td><td>A21206</td><td>AF488 osioł &alpha;-koza</td></tr><tr><td>Alexa Fluor 647 osioł &alpha;-koza</td><td>Invitrogen</td><td>A21447</td><td>AF647 osioł &alpha;-koza</td></tr><tr><td>Albumina, z Surowicy bydlęcej</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A7906-100</td><td>BSA</td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T9284</td><td>TX-100</td></tr><tr><td>Niekalibrowana pętla</td><td>LeLoop</td><td>MP 199025</td><td>inokulacja Pętla</td></tr><tr><td>96-dołkowa Płytka testowa</td><td>Corning Incorporated</td><td>3603</td><td>Studnia</td></tr><tr><td>Odczynnik zapobiegający blaknięciu Prolong Gold z DAPI</td><td>Invitrogen</td><td>P36931</td><td>DAPI</td></tr><tr><td>Szkło osłonowe mikroskopu 22x22 mm</td><td>Fisher Scientific</td><td>12-541-B</td><td>Szkiełka nakrywkowe</td></tr><tr><td>Superfrost Plus Szkiełka mikroskopowe</td><td>Fisher Naukowe</td><td>12-550-15</td><td>Szkiełka mikroskopowe</td></tr><tr><td>Olympus Fluoview Laserowy skaningowy mikroskop konfokalny</td><td>Olympus</td><td>FV500</td><td></td></tr><tr><td>Optymalna temperatura cięcia</td><td>Sakura</td><td>4583</td><td>PAŹ</td></tr><tr><td>Kriostat Leica</td><td>Kriostat</td> <td>Leica</td><td>CM1850</td></tr></tbody></table>

trójwymiarowe obrazowanie nocyceptywnych śródnaskórkowych włókien nerwowych w biopsjach ludzkiej skóry

Three-dimensional Imaging of Nociceptive Intraepidermal Nerve Fibers in Human Skin Biopsies

Biopsja uderzeniowa skóry jest powszechnie stosowana do ilościowego określania gęstości wewnątrznaskórkowych włókien nerwowych (IENFD) w diagnostyce polineuropatii obwodowej 1,2. Obecnie powszechną praktyką jest pobieranie biopsji skóry o średnicy 3 mm z dystalnej części nogi (DL) i bliższego uda (PT) w celu oceny polineuropatii zależnych od długości 3. Jednak ze względu na wielokierunkowy charakter IENF, trudno jest zbadać nakładające się na siebie struktury nerwowe poprzez analizę obrazowania dwuwymiarowego (2D). Alternatywnie, obrazowanie trójwymiarowe (3D) może zapewnić lepsze rozwiązanie tego dylematu.
W bieżącym raporcie prezentujemy metody zastosowania obrazowania 3D do badania bolesnej neuropatii (PN). W celu identyfikacji IENF próbki skóry są przetwarzane do analizy immunofluorescencyjnej produktu genu białkowego 9.5 (PGP), markera neuronalnego pan. Obecnie standardową praktyką jest diagnozowanie neuropatii małych włókien za pomocą IENFD oznaczanych za pomocą immunohistochemii PGP przy użyciu mikroskopii jasnego pola 4. W obecnym badaniu zastosowaliśmy podwójną analizę immunofluorescencyjną w celu zidentyfikowania całkowitego IENFD za pomocą PGP i nocyceptywnego IENF, poprzez zastosowanie przeciwciał, które rozpoznają kinazę receptora tropomiozyny A (Trk A), receptor o wysokim powinowactwie do czynnika wzrostu nerwów 5. Zalety współbarwienia IENF przeciwciałami PGP i Trk A korzystnie wpływają na badanie PN poprzez wyraźne barwienie PGP-dodatnich, nocyceptywnych włókien. Te sygnały fluorescencyjne można określić ilościowo w celu określenia nocyceptywnego IENFD i zmian morfologicznych IENF związanych z PN. Obrazy fluorescencyjne są pozyskiwane za pomocą mikroskopii konfokalnej i przetwarzane do analizy 3D. Obrazowanie 3D zapewnia zdolności rotacyjne do dalszej analizy zmian morfologicznych związanych z PN. Podsumowując, współbarwienie fluorescencyjne, obrazowanie konfokalne i analiza 3D wyraźnie przynoszą korzyści w badaniu PN.

Zastosowano niniejszy protokół w celu zbadania morfologii IENF w biopsjach skóry z PT i DL u pacjentów z PN. Próbki skóry od trzech osób pobrano na University of Utah w celu zademonstrowania patomorfologii związanej z PN. Grupa badawcza obejmowała: Przypadek 1: mężczyznę w wieku 51 lat z PN w przebiegu cukrzycy typu 2 (czas trwania: 14 miesięcy; ocena bólu: 51); Przypadek 2: mężczyznę w wieku 56 lat z PN w przebiegu cukrzycy typu 2 (czas trwania: 108 miesięcy; ocena bólu: 47); oraz Przypadek 3: mężczyznę w wieku 66 lat z...

W celu zbadania zmian nocyceptywnych wewnątrznaskórkowych włókien nerwowych (IENF) w bolesnych neuropatiach (PN), opracowaliśmy protokoły, które mogłyby bezpośrednio badać trójwymiarowe zmiany morfologiczne obserwowane w nocyceptywnych IENFach. Trójwymiarowa analiza IENF ma potencjał do oceny zmian morfologicznych IENF w PN.

Trójwymiarowe obrazowanie nocyceptywnych śródnaskórkowych włókien nerwowych w biopsjach ludzkiej skóry

A punch biopsy of the skin is commonly used to quantify intraepidermal nerve fiber densities (IENFD) for the diagnosis of peripheral polyneuropathy 1,2. ...

Ogólnym celem niniejszej procedury jest przeprowadzenie immunohistochemii na skrawkach biopsji skóry ludzkiej w celu zbadania zmian morfologicznych wewnątrzepidermalnych włókien nerwowych związanych z neuropatią bólową przy użyciu obrazowania trójwymiarowego. Jest to realizowane poprzez przeprowadzenie w pierwszej kolejności trzydniowego protokołu immunohistochemii na wolnopływających skrawkach z poszczególnych biopsji skóry ludzkiej. Drugim krokiem jest obrazowanie skrawków skóry o grubości 50 µm przy użyciu mikroskopu konfokalnego.Następnie pliki obrazów z widoku przepływu są przetwarzane za pomocą oprogramowania MRS w celu utworzenia trójwymiarowego pliku wideo z oryginalnych obrazów immunofluorescencyjnych. Ostatnim krokiem jest użycie oprogramowania vdw lub podobnego do skompresowania pliku wideo. W rezultacie obrazowanie trójwymiarowe umożliwia badanie zmian morfologicznych związanych z bolesną neuropatią.Obecnie gęstość naskórkowych włókien nerwowych mierzona śródoperacyjnie jest wykorzystywana jako ilościowa metoda diagnostyki neuropatii. Podwójne znakowanie tych śródskórnych włókien nerwowych z użyciem biomarkera nocyceptywnego może pomóc w wyjaśnieniu mechanizmów bólu zwi

three-dimensional-imaging-nociceptive-intraepidermal-nerve-fibers

Research

JoVE Journal

Medicine

Medycyna

Trójwymiarowe Obrazowanie Nocyceptywnych Wewnątrznaskórkowych Włókien Nerwowych w Biopsjach Skóry Człowieka

Przedstawiono technikę pobierania in-vivo próbek płynu śródmiąższowego z odpowiednich miejsc w tkankach (w tym przypadku z eksperymentalnie wywołanego stanu zapalnego skóry) w celu pomiaru substancji biochemicznych pośredniczących w bólu i zapaleniu.

Ludzki bioanaliza in vivo do tkankowo swoistego pomiaru mediatorów nocyceptywnych i zapalnych

Przedstawiono algorytmy oceniające progi bólu cieplnego i mechanicznego w eksperymentalnie wywołanym stanie zapalnym skóry u badanych ludzi. Dwa paradygmaty testowania bólu niezależnie badają przetwarzanie nocyceptywne przez dwie główne populacje obwodowych włókien nerwowych przekazujących ból, tj. nieumielinowane włókna C oraz małe umielinowane włókna A-delta.

Wyznaczanie progu bólu termicznego i mechanicznego w zapaleniu skóry u ludzi

Immunocytochemiczna identyfikacja podtypów włókien obwodowych nerwów czuciowych (oraz wykrywanie ekspresji białek w ich obrębie) jest kluczowa dla zrozumienia molekularnych mechanizmów leżących u podstaw czucia obwodowego. W niniejszej pracy opisujemy metody przygotowania próbek tkanek obwodowych i trzewnych, takich jak skóra i kości kończyn, do specyficznego barwienia immunologicznego obwodowych włókien nerwów czuciowych.

Przygotowanie tkanek i immunobarwienie włókien nerwów czuciowych myszy unerwiających skórę i kości kończyn

Ten film pokazuje jednowłóknowe nagranie przewodnictwa nerwowego włókna C u szczurów. Znieczulony szczur jest nacinany w celu odsłonięcia nerwu kulszowego, który zapewnia czuciowe i motoryczne zasilanie kończyn dolnych. Poszczególne włókna C są następnie naświetlane. Stymulacja elektryczna jest dostarczana za pomocą elektrod bodźcowych wszczepionych w stopę, a odpowiedź jest rejestrowana z pojedynczego włókna nerwowego.

Zapis in vivo pojedynczych włókien włókien C nerwu kulszowego u szczurów

Źródło: Hamid, H. S., et al. Trójwymiarowe obrazowanie i analiza mitochondriów w obrębie śródnaskórkowych włókien nerwowych człowieka. J. Vis. Exp. (2017) Ten film przedstawia metodę wizualizacji mitochondriów specyficznych dla nerwów za pomocą obrazowania trójwymiarowego. Przedstawiono w nim proces pozyskiwania sekwencyjnych skanów wstępnie znakowanych śródnaskórkowych włókien nerwowych i generowania obrazów powierzchni 3D w celu wyizolowania i wyświetlenia mitochondriów w odniesieniu do...

Wizualizacja mitochondriów w śródnaskórkowych włóknach nerwowych

Przedstawiono protokół dynamicznego obrazowania podłużnego i selektywnego laserowego uszkadzania zakończeń nerwowych u reporterowych myszy transgenicznych.

In vivo (in vivo) Mikroskopia dwufotonowa pojedynczych zakończeń nerwowych w skórze

Skóra ssaków zawiera różnorodny wachlarz struktur - takich jak mieszki włosowe i zakończenia nerwowe - które wykazują charakterystyczne wzorce organizacji przestrzennej. Analiza skóry jako płaskiego mocowania wykorzystuje dwuwymiarową geometrię tej tkanki do tworzenia pełnowymiarowych obrazów struktur skóry o wysokiej rozdzielczości.

Obrazowanie skóry myszy metodą flat mount i jego zastosowanie do analizy wzorca mieszków włosowych i morfologii aksonów czuciowych

Ten protokół wykorzystuje trójwymiarowe (3D) techniki obrazowania i analizy do wizualizacji i ilościowego określenia mitochondriów specyficznych dla nerwów. Techniki te mają zastosowanie w innych sytuacjach, w których jeden sygnał fluorescencyjny jest używany do odizolowania podzbioru danych od innego sygnału fluorescencyjnego.

Trójwymiarowe obrazowanie i analiza mitochondriów w obrębie śródnaskórkowych włókien nerwowych człowieka

Zapis jednowłóknisty to skuteczna technika elektrofizjologiczna, która ma zastosowanie do ośrodkowego i obwodowego układu nerwowego. Wraz z przygotowaniem nienaruszonego DRG z przyczepionym nerwem kulszowym badany jest mechanizm niewydolności przewodzenia. Oba protokoły poprawiają zrozumienie związku obwodowego układu nerwowego z bólem.

Zastosowanie zapisu pojedynczego włókna in vivo i nienaruszonego zwoju korzenia grzbietowego z przyczepionym nerwem kulszowym w celu zbadania mechanizmu uszkodzenia przewodzenia

Grubość skrawków tkanek ograniczała badanie morfologiczne unerwienia skóry. Niniejszy protokół opisuje unikalną technikę oczyszczania tkanek w celu wizualizacji włókien nerwowych skóry w grubych skrawkach tkanki o grubości 300 μm pod mikroskopią konfokalną.

Demonstrowanie owłosionego i nagiego unerwienia skóry we wzorze 3D przy użyciu wielu metod barwienia fluorescencyjnego i oczyszczania tkanek

Badanie to przedstawia podejście in vivo do obrazowania dwufotonowego do wizualizacji struktur niskoprogowych zakończeń aksonów mechanoreceptorów (LTMR) w skórze przedniej łapy myszy. Wykorzystując powtarzalne, wysokorozdzielcze obrazowanie poszczególnych aksonów, metoda ta stanowi nową platformę do badania struktury i funkcji skórnego obwodu czuciowego podczas rozwoju oraz u dorosłych.

Dwufotonowe obrazowanie wewnątrzżyciowe morfologii aksonów dotykowych u skóry myszy

Poznaj trójwymiarową analizę nocyceptywnych włókien nerwowych w biopsjach skóry. Ta metoda immunohistochemiczna z mikroskopią konfokalną pozwala badać zmiany morfologiczne związane z bolesnymi neuropatiami.

Trójwymiarowe obrazowanie nocyceptywnych śródnaskórkowych włókien nerwowych w biopsjach ludzkiej skóry

Przeglądaj więcej filmów