Name: Model in vitro do badania heterogeniczności różnicowania i polaryzacji ludzkich makrofagów (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-06-12T13:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 42 s
Description: Poznaj metodę izolacji monocytów z krwi obwodowej i ich różnicowania w makrofagi o różnych typach polaryzacji. Technika ta umożliwia badanie markerów polaryzacji za pomocą PCR ilościowego.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Dziękujemy Nadine Wambsganss za doskonałą pomoc techniczną. Prace te zostały wsparte grantem z Deutsche Forschungsgemeinschaft (GL599/1-1) oraz częściowo z grantu z Funduszu Innowacyjnego FRONTIER (Uniwersytet w Heidelbergu) dla C.A.G.

1. Protokół
<ol>
 <li>Przygotuj w następujący sposób:
 <ol>
 <li>Przygotuj bufor do izolacji PBMC: "Bufor do płukania" = 0,02% EDTA w PBS (użyj 0,5 M EDTA).</li>
 <li>Przygotować bufor do izolacji monocytów: "Bufor płuczący MACS" = 0,5% BSA (250 mg) + 2 mM EDTA (200 μl) + PBS (50 ml). Odgazuj bufor.</li>
 <li>Przygotować bufor do barwienia FACS i przechowywania komórek: "Bufor FACS" = 10% FCS w PBS i "bufor utrwalający" = 1% PFA w PBS.</li>
 </ol>
 </li>
 <li>Pobierz 30 ml krwi pełnej z żyły przedramienia. Użyj EDTA jako antykoagulantu.</li>
 <li>Wyizolować PBMC (histopaque) w następujący sposób:
 <ol>
 <li>Przygotuj dwie sterylne probówki o pojemności 50 ml (bez polistyrenu).</li>
 <li>Rozcieńczyć krew z kroku 2 PBS 1:1.</li>
 <li>Dodać 25 ml histopaku + 25 ml krwi pełnej/PBS na probówkę. Upewnij się, że histopak i krew nie mieszają się.</li>
 <li>Wirować przy 400 x g przez 30 minut przy RT, bez hamulca.</li>
 <li>Odessać osocze i wyrzucić.</li>
 <li>Odessać nieprzezroczystą złączkę i pipetować do czystej probówki o pojemności 50 ml.</li>
 <li>Dodać 20 ml 0,02% EDTA do PBS.</li>
 <li>Wirować przy 250 x g przez 5 minut w temperaturze 4 °C.</li>
 <li>Odrzucić supernatant.</li>
 <li>Dodać 10 ml 0,02% EDTA do PBS.</li>
 </ol>
 </li>
 <li>Policz komórki w następujący sposób:
 <ol>
 <li>Dobrze wymieszaj, wirując przez 10 sekund.</li>
 <li>Weź 200 μl zawiesiny komórek + 300 μl 0,02% EDTA w PBS + 500 μl błękitu trypanowego (200-500 komórek / 10 kwadratów, w przeciwnym razie zmień współczynnik rozcieńczenia).</li>
 </ol>
 </li>
 <li>Wykonaj ujemną izolację monocytów w następujący sposób:
 <ol>
 <li>Odwirować komórki otrzymane w kroku 3.10 przez 10 minut, 120 x g. Odrzucić supernatant.</li>
 <li>Przemyć osad komórkowy 2x dodając 10 ml PBS + 0,02% EDTA i odwirować przez 10 min, 120 x g.</li>
 <li>Dodaj 9 ml sterylnej wody przez 3 sekundy, dodaj 1 ml 10X PBS.</li>
 <li>Przemyć jeszcze raz PBS + 0,02% EDTA i odwirować 10 min, 120 x g.</li>
 <li>Policz podczas wirowania.</li>
 <li>Rozcieńczyć w buforze EasySep w stężeniach 5 x 107/ml.</li>
 <li>Dodać 50 μl/ml koktajlu wzbogacającego monocyty.</li>
 <li>Inkubować przez 10 minut w temperaturze 4 °C.</li>
 <li>Wiruj koraliki przez 30 sek.</li>
 <li>Dodać 50 μl/ml kulek.</li>
 <li>Inkubować przez 5 minut w temperaturze 4 °C.</li>
 <li>Napełnij buforem EasySep do pełnej objętości 2,5 ml. Roztwór wydaje się teraz brązowawy.</li>
 <li>Włóż do magnesu.</li>
 <li>Poczekaj 2.5 minuty w RT. W tym czasie komórki niemonocytowe związane ze kulką magnetyczną przesuną się do ścianki rurki i tam się przykleją.</li>
 <li>Wlać bufor z niewiążącymi monocytami do świeżej sterylnej probówki. Ten roztwór wygląda na białawy.</li>
 <li>Przemyć raz PBS + 0,02% EDTA i odwirować przez 10 minut, 120 x g.</li>
 </ol>
 </li>
 <li>Komórki płytkowe w plastikowym naczyniu lub płycie wielościennej o gęstości 0,5 x 106/cm2. Dodać 1 ml pożywki hodowlanej/1 x 106 komórek.</li>
 <li>Hoduj komórki w interesujących warunkach przez 6-14 dni.</li>
 <li>Zmień nośnik po 3 dniach, zastępując 50% nośnika nowym nośnikiem (szczegółowe informacje znajdują się w Tabeli 1).</li>
 <li>Po sześciu dniach zbierz komórki do izolacji mRNA, cytometrii przepływowej, Western blot itp.</li>
</ol>

<ol><li>Gordon, S., Taylor, P. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Monocyte+and+macrophage+heterogeneity%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Rev.+Immunol%22%5BJournal%5D)">Monocyte and macrophage heterogeneity.</a> Nat. Rev. Immunol. 5, 953-964 (2005).</li>
<li>Gordon, S., Mantovani, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Diversity+and+plasticity+of+mononuclear+phagocytes%5BTitle%5D)+AND+%22European+Journal+of+Immunology%22%5BJournal%5D)">Diversity and plasticity of mononuclear phagocytes.</a> European Journal of Immunology. 41, 2470-2472 (2011).</li>
<li>Martinez, F. O., Sica, A., Mantovani, A., Locati, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Macrophage+activation+and+polarization%5BTitle%5D)+AND+%22Front.+Biosci%22%5BJournal%5D)">Macrophage activation and polarization.</a> Front. Biosci. 13, 453-461 (2008).</li>
<li>Ingersoll, M. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparison+of+gene+expression+profiles+between+human+and+mouse+monocyte+subsets%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Comparison of gene expression profiles between human and mouse monocyte subsets.</a> Blood. 115, 10-19 (2010).</li>
<li>Gleissner, C. A., Sanders, J. M., Nadler, J., Ley, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Upregulation+of+aldose+reductase+during+foam+cell+formation+as+possible+link+among+diabetes%2C+hyperlipidemia%2C+and+atherosclerosis%5BTitle%5D)+AND+%22Arterioscler.+Thromb.+Vasc.+Biol%22%5BJournal%5D)">Upregulation of aldose reductase during foam cell formation as possible link among diabetes, hyperlipidemia, and atherosclerosis.</a> Arterioscler. Thromb. Vasc. Biol. 28, 1137-1143 (2008).</li>
<li>Gleissner, C. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CXCL4+downregulates+the+atheroprotective+hemoglobin+receptor+CD163+in+human+macrophages%5BTitle%5D)+AND+%22Circ.+Res%22%5BJournal%5D)">CXCL4 downregulates the atheroprotective hemoglobin receptor CD163 in human macrophages.</a> Circ. Res. , (2009).</li>
<li>Gleissner, C. A., Shaked, I., Little, K. M., Ley, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CXC+chemokine+ligand+4+induces+a+unique+transcriptome+in+monocyte-derived+macrophages%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Immunol%22%5BJournal%5D)">CXC chemokine ligand 4 induces a unique transcriptome in monocyte-derived macrophages.</a> J. Immunol. 184, 4810-4818 (2010).</li>
<li>Martinez, F. O., Gordon, S., Locati, M., Mantovani, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transcriptional+profiling+of+the+human+monocyte-to-macrophage+differentiation+and+polarization%3A+New+molecules+and+patterns+of+gene+expression%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Immunol%22%5BJournal%5D)">Transcriptional profiling of the human monocyte-to-macrophage differentiation and polarization: New molecules and patterns of gene expression.</a> J. Immunol. 177, 7303-7311 (2006).</li>
<li>Verreck, F. A. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+il-23-producing+type+1+macrophages+promote+but+il-10-producing+type+2+macrophages+subvert+immunity+to+%28myco%29bacteria%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Human il-23-producing type 1 macrophages promote but il-10-producing type 2 macrophages subvert immunity to (myco)bacteria.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 101, 4560-4565 (2004).</li>
<li>Rey-Giraud, F., Hafner, M., Ries, C. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vitro+generation+of+monocyte-derived+macrophages+under+serum-free+conditions+improves+their+tumor+promoting+functions%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">In vitro generation of monocyte-derived macrophages under serum-free conditions improves their tumor promoting functions.</a> PLoS One. 7, e42656(2012).</li>
<li>Boyle, J. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Coronary+intraplaque+hemorrhage+evokes+a+novel+atheroprotective+macrophage+phenotype%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Pathology%22%5BJournal%5D)">Coronary intraplaque hemorrhage evokes a novel atheroprotective macrophage phenotype.</a> American Journal of Pathology. 174, 1097-1108 (2009).</li>
<li>Cho, H. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Induction+of+dendritic+cell-like+phenotype+in+macrophages+during+foam+cell+formation%5BTitle%5D)+AND+%22Physiol+Genomics%22%5BJournal%5D)">Induction of dendritic cell-like phenotype in macrophages during foam cell formation.</a> Physiol Genomics. 29, 149-160 (2007).</li>
<li>Vogt, G., Nathan, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vitro+differentiation+of+human+macrophages+with+enhanced+antimycobacterial+activity%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Clinical+Investigation%22%5BJournal%5D)">In vitro differentiation of human macrophages with enhanced antimycobacterial activity.</a> The Journal of Clinical Investigation. 121, 3889-3901 (2011).</li>
<li>Mikita, T., Porter, G., Lawn, R. M., Shiffman, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Oxidized+low+density+lipoprotein+exposure+alters+the+transcriptional+response+of+macrophages+to+inflammatory+stimulus%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Oxidized low density lipoprotein exposure alters the transcriptional response of macrophages to inflammatory stimulus.</a> Journal of Biological Chemistry. 276, 45729-45739 (2001).</li>
<li>Qin, Z. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+use+of+THP-1+cells+as+a+model+for+mimicking+the+function+and+regulation+of+monocytes+and+macrophages+in+the+vasculature%5BTitle%5D)+AND+%22Atherosclerosis%22%5BJournal%5D)">The use of THP-1 cells as a model for mimicking the function and regulation of monocytes and macrophages in the vasculature.</a> Atherosclerosis. 221, 2-11 (2012).</li>
<li>Daigneault, M., Preston, J. A., Marriott, H. M., Whyte, M. K. B., Dockrell, D. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+identification+of+markers+of+macrophage+differentiation+in+pma-stimulated+THP-1+cells+and+monocyte-derived+macrophages%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">The identification of markers of macrophage differentiation in pma-stimulated THP-1 cells and monocyte-derived macrophages.</a> PLoS One. 5, e8668(2010).</li>
<li>Wahl, L. M., Wahl, S. M., Smythies, L. E., Smith, P. D. Isolation of human monocyte populations. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aWahl%2C+LM+%22Current+Protocols+in+Immunology%22">Current Protocols in Immunology</a>. , John Wiley & Sons, Inc. (2001).</li>
<li>Waldo, S. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Heterogeneity+of+human+macrophages+in+culture+and+in+atherosclerotic+plaques%5BTitle%5D)+AND+%22Am.+J.+Pathol%22%5BJournal%5D)">Heterogeneity of human macrophages in culture and in atherosclerotic plaques.</a> Am. J. Pathol. 172, 1112-1126 (2008).</li>
<li>Martín-Fuentes, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Individual+variation+of+scavenger+receptor+expression+in+human+macrophages+with+oxidized+low-density+lipoprotein+is+associated+with+a+differential+inflammatory+response%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Immunology%22%5BJournal%5D)">Individual variation of scavenger receptor expression in human macrophages with oxidized low-density lipoprotein is associated with a differential inflammatory response.</a> The Journal of Immunology. 179, 3242-3248 (2007).</li>
</ol>

Autorzy nie muszą ujawniać żadnego konfliktu interesów.

Makrofagi pochodzące z monocytów reprezentują kluczowy typ komórek wrodzonego układu odpornościowego. Odgrywają ważną rolę w wielu chorobach zapalnych, w tym miażdżycy czy nowotworach 2. W związku z tym badanie biologii makrofagów jest niezbędne do poszerzenia naszej wiedzy na temat patofizjologii wielu chorób i umożliwienia opracowania nowych terapii.
Wiele badań dotyczy modeli mysich z nadekspresją lub brakiem pewnych interesujących genów. W przypadku makrofagów pochodzących z mon...

Makrofagi pochodzące z monocytów stanowią ważny składnik komórkowy wrodzonego układu odpornościowego i przyczyniają się do wielu ostrych lub przewlekłych procesów zapalnych 1. Makrofagi odgrywają ważną rolę w wielu chorobach zapalnych, takich jak miażdżyca czy rak 2. Makrofagi wykazują wysoki stopień plastyczności i są w stanie przyjmować różne fenotypy w zależności od lokalnego mikrośrodowiska 3. W związku z tym badanie różnicowania i heterogeniczności makrofagów ma zasadnicze znaczenie dla poszerzenia naszej wiedzy na temat patofizjologii wielu chorób oraz umożliwienia identyfikacji nowych celów terapeutycznych i opracowania nowych terapii.
W wielu przypadkach mysie modele są używane do badania patofizjologii konkretnych chorób. Jednak badaniu biologii makrofagów przy użyciu modeli mysich towarzyszy kilka niedociągnięć: (1) Proporcja liczby podzbiorów leukocytów (tj. monocytów i granulocytów) we krwi obwodowej myszy lub ludzi różni się znacząco, co sugeruje różne role monocytów w patofizjologii myszy i człowieka. (2) Istnieją znaczne różnice w ekspresji genów między monocytami krwi obwodowej myszy i człowieka, co sugeruje znaczne różnice w ich funkcji podczas zdrowia i choroby 4. (3) Pewna liczba markerów, które są używane do identyfikacji mysich monocytów i makrofagów (F4/80, LyC itp.) nie istnieje w ludzkich komórkach szpikowych, co sprawia, że przeniesienie wyników z modeli mysich do sytuacji ludzkiej jest raczej trudne.
Dlatego, aby zwiększyć nasze zrozumienie różnicowania i heterogeniczności makrofagów w chorobach ludzkich, musimy korzystać z modeli pracujących z ludzkimi makrofagami. Dlatego opisujemy tutaj model ludzkiej pierwotnej generacji makrofagów, który jest łatwy w użyciu i umożliwia badanie ludzkich makrofagów pochodzących z monocytów in vitro w różnych warunkach, co skutkuje różnymi typami polaryzacji makrofagów. W kilku badaniach wykorzystaliśmy model in vitro pierwotnych ludzkich makrofagów pochodzących z monocytów do analizy biologii makrofagów i jej potencjalnego znaczenia dla miażdżycy tętnic u ludzi 5-7.
Chociaż nie zastępuje w pełni eksperymentów z tkankami zwierzęcymi lub ludzkimi uzyskanymi pośmiertnie, opisany tutaj model pozwala na identyfikację i walidację mechanizmów chorobowych i celów terapeutycznych, które mogą być bardzo istotne dla różnych chorób ludzkich.

<table><tbody><tr><td>Probówka wirówkowa 50 ml (sterylna)</td><td>Fisher</td><td>055398</td><td></td></tr><tr><td>D-PBS (1X), płynna (bez wapnia i magnezu)</td><td>Invitrogen</td><td>14190-250</td><td></td></tr><tr><td>EDTA</td><td>Sigma</td><td>T9285</td><td></td></tr><tr><td>BSA</td><td>Sigma</td><td>A-8806</td><td></td></tr><tr><td>FCS</td> Zestaw do wzbogacania ludzkich monocytów <td>Invitrogen</td><td></td><td></td></tr><tr><td>EasySep</td><td>Technologie stemCell</td><td>19059</td><td></td></tr><tr><td>EasySep Magnet</td><td>StemCell Technologies</td><td>18000</td><td></td></tr><tr><td>Probówki FACS</td><td>Fisher</td><td>352008</td><td></td></tr><tr><td>Macrophage-SFM (1X)</td><td>Invitrogen</td><td>12065-074</td><td></td></tr><tr><td>Penicylina-streptomycyna</td><td>Sigma</td><td>P-4458</td><td></td></tr><tr><td>Nutridoma-SP</td><td>Roche</td><td>11011375001</td><td></td></tr><tr><td>ludzki M-CSF 10 &mu; g</td><td>Peprotech</td><td>300-25</td><td></td></tr><tr><td>Płytki do hodowli komórkowych 6-dołkowe</td><td>Fisher</td><td>07-200-80</td><td></td></tr></tbody></table>

model in vitro do badania heterogeniczności różnicowania i polaryzacji ludzkich makrofagów

An In vitro Model to Study Heterogeneity of Human Macrophage Differentiation and Polarization

Makrofagi pochodzące z monocytów reprezentują ważny typ komórek wrodzonego układu odpornościowego. Modele mysie badające biologię makrofagów cierpią z powodu różnic fenotypowych i funkcjonalnych między makrofagami pochodzącymi od myszy i ludzi. Dlatego opisujemy tutaj model in vitro do generowania i badania pierwotnych ludzkich makrofagów. Krótko mówiąc, po odwirowaniu w gradiencie gęstości krwi obwodowej pobranej z żyły przedramienia, monocyty izoluje się z komórek jednojądrzastych krwi obwodowej za pomocą ujemnej izolacji kulek magnetycznych. Te monocyty są następnie hodowane przez sześć dni w określonych warunkach w celu wywołania różnych typów różnicowania lub polaryzacji makrofagów. Model jest łatwy w użyciu i omija problemy spowodowane różnicami gatunkowymi między myszą a człowiekiem. Co więcej, jest bliższy warunkom in vivo niż zastosowanie unieśmiertelnionych linii komórkowych. Podsumowując, opisany tutaj model nadaje się do badania biologii makrofagów, identyfikacji mechanizmów chorobowych i nowych celów terapeutycznych. Mimo że nie zastępuje w pełni eksperymentów na tkankach zwierzęcych lub ludzkich uzyskanych post mortem, opisany tutaj model pozwala na identyfikację i walidację mechanizmów chorobowych i celów terapeutycznych, które mogą być bardzo istotne dla różnych chorób ludzkich.

Stosując opisany powyżej protokół, rutynowo otrzymujemy 25,1 x 106 ± 2,2 x 106 monocytów/100 ml krwi (średnia ± błąd standardowy z 26 niezależnych eksperymentów, Rycina 1A). Czystość monocytów, określona za pomocą barwienia cytometrycznego dla CD14, jest rutynowo wyższa niż 95% (97,1 ± 0,4%, średnia ± błąd standardowy z 3 niezależnych eksperymentów, Rycina 1B). Żywotność świeżo wyizolowanych monocytów, określona za pomocą barwienia błękitem trypanu, jest rutynowo wy...

Makrofagi pochodzące z monocytów są ważnymi komórkami wrodzonego układu odpornościowego. W tym miejscu opisujemy łatwy w użyciu model in vitro do generowania tych komórek. Korzystając z wirowania gradientowego, izolacji ujemnych kulek i określonych warunków hodowli komórek, można wygenerować makrofagi pochodzące z monocytów do badań fenotypowych i funkcjonalnych.

Model in vitro do badania heterogeniczności różnicowania i polaryzacji ludzkich makrofagów

Monocyte-derived macrophages represent an important cell type of the innate immune system. Mouse models studying macrophage biology suffer from the ...

Ogólnym celem poniższego eksperymentu jest wyizolowanie monocytów z ludzkiej krwi obwodowej i zróżnicowanie ich w kierunku różnych typów polaryzacji makrofagów. Osiąga się to poprzez najpierw wyizolowanie ludzkich komórek jednojądrzastych krwi obwodowej za pomocą wirowania w gradiacji gęstości. W drugim etapie przeprowadza się izolację ujemnych kulek w celu uzyskania czystych monocytów CD 14-dodatnich.Następnie monocyty są hodowane w określonych warunkach w celu indukcji specyficznie spolaryzowanych makrofagów. Ostatecznie różnicową ekspresję markerów polaryzacji makrofagów w odpowiedzi na warunki ich hodowli można określić za pomocą ilościowego PCR. Metoda ta może pomóc w analizie zróżnicowania makrofagów w kierunku różnych typów polaryzacji.Cecha, która jest niezwykle ważna w chorobach zapalnych, takich jak miażdżyca. Po pobraniu 30 mililitrów pełnej krwi z żyły przedramienia od ochotnika, podziel krew równomiernie na dwie niepolistyrenowe stożkowe rurki o pojemności 50 mililitrów. Następnie rozcieńczyć krew w każdej probówce 10 mililitrami PBS.Następnie dodaj 25 mililitrów opakowania histo do 25 mililitrów krwi pełnej i PBS w każdej probówce, uważając, aby opakowanie histo i kre

an-vitro-model-to-study-heterogeneity-human-macrophage

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Immunologia i infekcje

Model in vitro służący badaniu zróżnicowania i polaryzacji ludzkich makrofagów

Ten film pokazuje proces wstępowania pierwotnych monocytów do makrofagów. Pierwotne ludzkie monocyty można wyizolować i zróżnicować do fenotypu prozapalnego podobnego do M1 przy użyciu czynnika stymulującego tworzenie kolonii granulocytów-makrofagów (GM-CSF) lub do fenotypu przeciwzapalnego podobnego do M2 za pomocą czynnika stymulującego tworzenie kolonii makrofagów (M-CSF).

Hodowla in vitro i różnicowanie pierwotnych monocytów do makrofagów

W tym filmie demonstrujemy procedurę indukowania różnicowania i polaryzacji monocytów pochodzących z krwi obwodowej na makrofagi M1 lub M2. Inkubacja z czynnikiem stymulującym tworzenie kolonii granulocytów-makrofagów, lipopolisacharydem i interferonem-gamma daje prozapalne makrofagi M1, podczas gdy inkubacja z czynnikiem stymulującym tworzenie kolonii makrofagów i interleukiną-4 indukuje przeciwzapalną produkcję makrofagów M2.

Różnicowanie i polaryzacja komórek pochodzących z monocytów w komórki podobne do makrofagów

Artykuł opisuje łatwy w użyciu adaptacyjny model in vitro do badania polaryzacji makrofagów. W obecności GM-CSF/M-CSF krwiotwórcze komórki macierzyste/progenitorowe ze szpiku kostnego są kierowane do różnicowania monocytowego, a następnie stymulacji M1 lub M2. Stan aktywacji można śledzić za pomocą zmian w antygenach powierzchniowych komórki, ekspresji genów i szlakach sygnalizacji komórkowej.

Badanie polaryzacji makrofagów przy użyciu makrofagów pochodzących ze szpiku kostnego

Prezentujemy prosty i skuteczny protokół do generowania ludzkich makrofagów. Płaszcze kożuchowe są przetwarzane przez wirowanie gradientowe o podwójnej gęstości, a izolowane monocyty są następnie różnicowane do makrofagów w workach do hodowli komórkowych pokrytych teflonem. Maksymalizuje to wydajność makrofagów i ułatwia pobieranie komórek do kolejnych eksperymentów.

Izolacja ludzkich monocytów przez wirowanie z podwójnym gradientem i ich różnicowanie do makrofagów w workach do hodowli komórkowych pokrytych teflonem

Prezentowany tutaj jest protokół do wykrywania produkcji pułapek zewnątrzkomórkowych makrofagów (MET) w hodowli żywych komórek za pomocą mikroskopii i barwienia fluorescencyjnego. Protokół ten można dalej rozszerzyć w celu zbadania specyficznych markerów białka MET za pomocą barwienia immunofluorescencyjnego.

Stymulacja in vitro i wizualizacja uwalniania pułapek zewnątrzkomórkowych w zróżnicowanych ludzkich makrofagach pochodzących z monocytów

Ten protokół opisuje solidne generowanie makrofagów z ludzkich indukowanych pluripotencjalnych komórek macierzystych oraz metody ich późniejszej charakterystyki. Ekspresja markerów powierzchniowych komórek, ekspresja genów i testy funkcjonalne są wykorzystywane do oceny fenotypu i funkcji tych makrofagów pochodzących z iPSC.

Produkcja i charakterystyka ludzkich makrofagów z pluripotencjalnych komórek macierzystych

Ten protokół dostarcza metodę badania zakażenia Mycobacterium tuberculosis w ludzkich makrofagach spolaryzowanych M1 lub M2 w oparciu o różnicowanie monocytów krwi obwodowej do komórek podobnych do makrofagów, które są zakażone znakowanym przez GFP wirulentnym szczepem H37Rv, i analizowane za pomocą cytometrii przepływowej przy użyciu 10-kolorowego panelu, w tym ekspresji wybranych markerów M1/M2.

Polaryzacja ludzkich komórek pochodzących z monocytów M1 i M2 oraz analiza za pomocą cytometrii przepływowej po zakażeniu Mycobacterium tuberculosis

Makrofagi podobne do M2 związane z nowotworami (TAM) są związane z progresją guza i złym rokowaniem w raku. Protokół ten służy jako szczegółowy przewodnik do powtarzalnego różnicowania i polaryzacji komórek podobnych do monocytów THP-1 w makrofagi podobne do M2 w ciągu 14 dni. Model ten jest podstawą do badania przeciwzapalnego działania TAM w mikrośrodowisku guza.

Różnicowanie i polaryzacja makrofagów do fenotypu podobnego do M2 przy użyciu ludzkiej linii komórkowej białaczki THP-1 podobnej do monocytów

Tutaj prezentujemy szczegółowy protokół oceny potencjału immunomodulacyjnego powierzchni implantów in vitro, mający na celu poprawę wiarygodności i odtwarzalności obecnych protokołów oraz promowanie dalszych badań. Profile cytokin wydzielniczych, ekspresję mRNA i markery powierzchni komórek monitorowano za pomocą makrofagów pochodzących z monocytów krwi w celu zbadania polaryzacji makrofagów hodowanych na tytanie.

Polaryzacja i charakterystyka ludzkich makrofagów pochodzących z monocytów typu M1 i M2 na powierzchniach implantów

Monocyty i makrofagi to bardzo plastyczne i reprogramowalne komórki odpornościowe, kluczowe dla zdrowia i choroby. Wyczuwają i reagują na szeroki zakres bodźców, przyjmując określone programy różnicowania i fenotypy. Ustandaryzowaliśmy model in vitro do badania polaryzacji i przeprogramowania makrofagów, zapewniając cenne narzędzie do badań.

Przeprogramowanie modelu ludzkich makrofagów pochodzących z monocytów do testów in vitro

Poznaj metodę izolacji monocytów z krwi obwodowej i ich różnicowania w makrofagi o różnych typach polaryzacji. Technika ta umożliwia badanie markerów polaryzacji za pomocą PCR ilościowego.

Model in vitro do badania heterogeniczności różnicowania i polaryzacji ludzkich makrofagów

Przeglądaj więcej filmów