Model in vitro do badania heterogeniczności różnicowania i polaryzacji ludzkich makrofagów

Ogólnym celem poniższego eksperymentu jest wyizolowanie monocytów z ludzkiej krwi obwodowej i zróżnicowanie ich w kierunku różnych typów polaryzacji makrofagów. Osiąga się to poprzez najpierw wyizolowanie ludzkich komórek jednojądrzastych krwi obwodowej za pomocą wirowania w gradiacji gęstości. W drugim etapie przeprowadza się izolację ujemnych kulek w celu uzyskania czystych monocytów CD 14-dodatnich.

Następnie monocyty są hodowane w określonych warunkach w celu indukcji specyficznie spolaryzowanych makrofagów. Ostatecznie różnicową ekspresję markerów polaryzacji makrofagów w odpowiedzi na warunki ich hodowli można określić za pomocą ilościowego PCR. Metoda ta może pomóc w analizie zróżnicowania makrofagów w kierunku różnych typów polaryzacji.

Cecha, która jest niezwykle ważna w chorobach zapalnych, takich jak miażdżyca. Po pobraniu 30 mililitrów pełnej krwi z żyły przedramienia od ochotnika, podziel krew równomiernie na dwie niepolistyrenowe stożkowe rurki o pojemności 50 mililitrów. Następnie rozcieńczyć krew w każdej probówce 10 mililitrami PBS.

Następnie dodaj 25 mililitrów opakowania histo do 25 mililitrów krwi pełnej i PBS w każdej probówce, uważając, aby opakowanie histo i krew nie mieszały się. Następnie odwiruj probówki przez 30 minut w temperaturze 400 g i temperaturze pokojowej bez przerwy. Po wirowaniu najpierw zaaspiruj warstwę plazmy, a następnie przenieś nieprzezroczystą warstwę interfejsu do świeżej 50-mililitrowej probówki.

Umyj komórki z granicy faz w 20 mililitrach PBS plus CDTA przez pięć minut w temperaturze 250 G i czterech stopniach Celsjusza. Następnie, po odrzuceniu resusu supernatantu, zawiesić osad w 10 mililitrach PBS plus CDTA i dobrze wymieszać komórki, wirując przez 10 sekund. Teraz rozcieńczyć 200 mikrolitrów zawiesiny komórek w 300 mikrolitrach PBS plus EDTA i 500 mikrolitrach błękitu triamowego.

Aby osiągnąć około 200 do 500 komórek na 10 kwadratów i hemocytometr, rozpocznij ujemną izolację, obracając komórki trzy razy przez 10 minut przy 120 Gs Po drugim praniu zawieszamy granulkę w dziewięciu mililitrach sterylnej wody na trzy sekundy. Następnie dodaj jeden mililitr 10 XPBS po umyciu i ponownym policzeniu komórek, rozcieńcz je w łatwym do ustawienia buforze pięć razy 10 z siedmiu komórek na mililitr. Teraz inkubuj komórki przez 10 minut w czterech stopniach Celsjusza w 50 mikrolitrach na mililitr koktajlu wzbogacającego monocyty.

W ostatniej minucie inkubacji wir wzbogacający monocyty cept kuli się przez 30 sekund. Następnie dodaj 50 mikrolitrów na mililitr kulek do komórek i inkubuj kulkę w zawiesinie komórek przez kolejne pięć minut. Po drugiej inkubacji doprowadzić objętość roztworu komórkowego do 2,5 mililitra.

Przy większej ilości bufora eep roztwór będzie teraz miał brązowawy kolor. Następnie umieść rurkę w magnesie eep na dwie i pół minuty w temperaturze pokojowej. Po tym, jak komórki związane z kulkami będą miały szansę się skleić, wlej bufor zawierający niewiążące monocyty do świeżej sterylnej probówki.

Roztwór będzie teraz miał białawy kolor po jednokrotnym umyciu niezwiązanych komórek PBS plus EDTA, przeniesieniu komórek na płytkę wielodołkową, a następnie dodaniu jednego mililitra pożywki hodowlanej na jeden raz 10 do sześciu komórek na płytkę hodowlaną. Na koniec hoduj komórki w warunkach eksperymentalnych przez sześć dni, aby wywołać różnicowanie makrofagów. Po trzech dniach wymień połowę nośnika na nowy nośnik po sześciu dniach.

Zbierz komórki do żądanej analizy eksperymentalnej. Korzystając z opisanego powyżej protokołu, około 25 razy 10 z sześciu monocytów jest rutynowo uzyskiwanych ze 100 mililitrów czystości monocytów krwi, określonej przez barwienie cytometryczne przepływowe dla CD 14, jest rutynowo większe niż 95% po pierwszym dodaniu do hodowli. Monocyty są początkowo okrągłe i unoszą się w ciągu kilku godzin.

Jednak przylegają, nadając im wygląd jajka sadzonego lub wrzeciona po sześciu dniach. W hodowli z samym MCSF lub z dodatkiem utlenionego LDL w ciągu ostatnich 24 godzin, czyli około 80% komórek, które nie są narażone na utleniony LDL, jest zdolnych do życia, jak określono za pomocą jodku propidyny. Z drugiej strony barwienie utlenionym LDL powoduje około 70% żywotności komórek po sześciu dniach hodowli.

Analiza cytometryczna pokazuje, że przy przepływie MCSF komórki nadal wykazują ekspresję markera leukocytów CD 45 ro, ale obniżają poziom markera monocytów CD 14. W zależności od konkretnych warunków, które mogą indukować polaryzację makrofagów podczas hodowli komórek, konieczne są dodatkowe markery, aby zagwarantować pomyślną polaryzację. Określone warunki mogą indukować polaryzację makrofagów.

Na przykład makrofagi spolaryzowane M1 wyrażają typowe markery, takie jak IL six i TNF alfa, podczas gdy makrofagi spolaryzowane M dwa wyrażają CD 36 i CD 2 0 6, makrofagi można dalej badać w eksperymentach funkcjonalnych. Na przykład wychwyt utlenionego LDL można badać za pomocą znakowanego fluorescencyjnie LDL. W tym eksperymencie komórki wystawiono na działanie 10 mikrogramów na mililitr utlenionego LDL znakowanego DII przez cztery godziny, a jądra ponownie zabarwiły się dpi.

Histogram przedstawia pomiar cytometryczny przepływu wychwytu utlenionego LDL DII przez makrofagi indukowane MCSF z jednolitym szarym histogramem reprezentującym nieleczone komórki kontrolne i czarnym otwartym histogramem. Reprezentujące utlenione makrofagi traktowane LDL po jego opracowaniu. Technika ta umożliwia naukowcom badanie różnicowania i heterogeniczności ludzkich makrofagów.

W ten sposób umożliwia im badanie chorób zapalnych, takich jak miażdżyca, w celu zidentyfikowania nowych mechanizmów chorobowych i nowych celów terapeutycznych.