In vivo (in vivo) Obrazowanie angiogenezy guza za pomocą fluorescencyjnej wideomikroskopii konfokalnej

W tym artykule przedstawiamy metodę analizy mikronaczyń guza in vivo za pomocą dynamicznej wideomikroskopii fluorescencyjnej wzmocnionej kontrastem. Uzyskano dwa parametry ilościowe: funkcjonalną gęstość naczyń włosowatych odzwierciedlającą unaczynienie guza oraz nieszczelność wskaźnika odzwierciedlającą nieszczelność ściany śródbłonka.

Ogólnym celem poniższego eksperymentu jest ilościowe określenie mikrokrążenia w modelu guza jelita grubego Murn przy użyciu systemu konfokalnej fluorescencji wideomikroskopii. Osiąga się to poprzez najpierw dożylne wstrzyknięcie środka kontrastowego i nagranie filmów mikronaczyń guza. Następnie obrazuje się cztery ćwiartki guza, co pozwala na ilościowe określenie funkcjonalnej gęstości naczyń włosowatych.

Następnie obserwuje się przechodzenie środka kontrastowego z naczyń do śródmiąższu w celu ilościowego określenia nieszczelności wskaźnika kapilar odzwierciedlającego przepuszczalność ściany śródbłonka. Ostatecznie można określić ilościowo cechy morfologiczne i funkcjonalne naczyń nowotworowych w celu wykrycia różnic między modelami nowotworów lub po terapii celowanej. Ta technika obrazowania optycznego z dynamicznym kontrastem pozwala na analizę mikrokrążenia guza.

Odzwierciedla architekturę i funkcję naczyń nowotworowych poprzez ilościowe określenie gęstości i przepuszczalności naczyń włosowatych. Chociaż metoda ta może zapewnić wgląd w fizjologię guza, może być również stosowana do innych systemów, takich jak wstrząs anafilaktyczny, stany zapalne, choroby sercowo-naczyniowe i cukrzyca. Zacznij od ogolenia znieczulonej myszy w miejscu zainteresowania.

Następnie naciąć skórę, skierowaną w stronę narządu, który ma być zobrazowany, gdy krwawienie ustanie. Wstrzyknąć środek kontrastowy, aby określić ilościowo funkcjonalną gęstość naczyń włosowatych. Najpierw umieść sondę przed organem, który ma być zobrazowany.

Następnie włącz laser oświetlający organy. Następnie utrzymanie pewnej ręki. Powoli przesuwaj rejestrację sondy, gdy wizualizowana jest fluorescencyjna sieć kapilarna.

Aby ustabilizować dynamiczną akwizycję w czasie, umieść odrobinę żelu ultradźwiękowego na końcówce sondy, a następnie umieść sondę w podporze podręcznej. Po umieszczeniu sondy w kontakcie z interesującym nas narządem, ustabilizuj sondę. Po ustaleniu pozycji ustaw laser tak, aby rejestrował trzy obrazy co 30 sekund przez 20 minut, aby wykryć obecność nieszczelności kapilarnej.

Wyłączanie lasera pomiędzy każdym nagraniem w celu zmniejszenia wybielania środka kontrastowego po nagraniu pięciosekundowych filmów w każdym z czterech kwadrantów narządu będącego przedmiotem zainteresowania, w celu wizualizacji procesu sieci naczyń włosowatych, filmy, przy użyciu odpowiedniego oprogramowania, wykonują automatyczną segmentację naczyń na obrazach wokół wybranej średnicy w celu ilościowego określenia funkcjonalnej gęstości naczyń włosowatych, Jest to stosunek całkowitej powierzchni naczynia do całkowitej powierzchni obrazu. Następnie z dynamicznej akwizycji wykonanej w celu wykrycia obecności nieszczelności kapilarnej narysuj trzy obszary zainteresowania w naczyniach włosowatych i trzy obszary zainteresowania w śródmiąższu w punktach czasowych 0, 5, 10 i 20 minut. Na koniec uśrednij natężenia sygnału w trzech różnych naczyniach włosowatych i przyległych obszarach śródmiąższowych i oblicz procent wycieku wskaźnika.

Zgodnie z tym wzorem, gdzie IP to intensywność okołonaczyniowa lub śródmiąższowa, a II to intensywność wewnątrznaczyniowa, funkcjonalny parametr gęstości naczyń włosowatych jest zastępczym markerem gęstości mikrokrążenia, zwykle mierzonym za pomocą narzędzi patologicznych. W tym miejscu przedstawiono przykład rodzajów uzyskiwanych obrazów oraz wynik segmentacji naczyń. W tym przykładzie funkcjonalna gęstość kapilar została zmierzona na poziomie 36%Na tych zdjęciach przykład wycieku środka kontrastowego w śródmiąższu o wskaźniku przecieku 1,47 pokazano po 0, 5, 10 i 20 minutach od wstrzyknięcia.

Na każdym z obrazów naczynia pojawiają się jako struktury liniowe o wysokim sygnale natychmiast po wstrzyknięciu. W śródmiąższu nie widać żadnego sygnału. Z biegiem czasu można jednak zaobserwować, że środek kontrastowy przecieka do śródmiąższu przez nieprawidłowy guz.

Bariera śródbłonkowa Doświadczenie jest niezbędne, aby opanować tę procedurę. Jednak po opanowaniu techniki można ją ukończyć w ciągu 30 minut, jeśli zostanie wykonana prawidłowo.