Name: Wysokowydajna, zautomatyzowana ekstrakcja DNA i RNA z próbek klinicznych przy użyciu technologii TruTip w popularnych robotach do obsługi cieczy (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-06-11T13:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 47 s
Description: Poznaj zautomatyzowaną ekstrakcję DNA z krwi obwodowej przy użyciu technologii TruTip na stacji Hamilton Star. Ta metoda zapewnia wysokiej jakości genomowe DNA bez zanieczyszczeń w aplikacjach klinicznych.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Część tej pracy była wspierana przez National Institutes of Health (NIH) w ramach grantu R 44 AI072784. Dziękujemy dr Kirsten St. George, Sarze B. Griesemer, Darylowi Lamsonowi i Amy Dean z Laboratorium Chorób Wirusowych, Wadsworth Center, Departament Zdrowia Stanu Nowy Jork za ilościowe określenie wirionów grypy i dostęp do klinicznie potwierdzonych testów PCR w czasie rzeczywistym na grypę.

<ol><li>Boom, R., Sol, C. J. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid+and+simple+method+for+purification+of+nucleic+acids%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Clin.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Rapid and simple method for purification of nucleic acids.</a> J. Clin. Microbiol. 28, 495-503 (1990).</li>
<li>Baker, M. P., Mitchell, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+of+genomic+DNA+from+blood+using+a+novel+filter-based+DNA+purification+technology%5BTitle%5D)+AND+%22BioTechniques%22%5BJournal%5D)">Isolation of genomic DNA from blood using a novel filter-based DNA purification technology.</a> BioTechniques. 31, 142-145 (2001).</li>
<li>Sinclair, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((To+bead+or+not+to+bead%3A+applications+of+magnetic+bead+technology%5BTitle%5D)+AND+%22The+Scientist%22%5BJournal%5D)">To bead or not to bead: applications of magnetic bead technology.</a> The Scientist. 12, 17-24 (1998).</li>
<li>Dederich, D. A., Okwuonu, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Glass+bead+purification+of+plasmid+template+DNA+for+high+throughput+sequencing+of+mammalian+genomes%5BTitle%5D)+AND+%22Nucl.+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">Glass bead purification of plasmid template DNA for high throughput sequencing of mammalian genomes.</a> Nucl. Acids Res. 30, e32(2002).</li>
<li>Levison, P. R., Badger, S. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Recent+developments+of+magnetic+beads+for+use+in+nucleic+acid+purification%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Chromatogr.+A%22%5BJournal%5D)">Recent developments of magnetic beads for use in nucleic acid purification.</a> J. Chromatogr. A. 816, 107-111 (1998).</li>
<li>Hourfar, M. K., Schmidt, M., Seifried, E., Roth, W. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evaluation+of+an+automated+high-volume+extraction+method+for+viral+nucleic+acids+in+comparison+to+a+manual+procedure+with+preceding+enrichment%5BTitle%5D)+AND+%22Vox+Sang%22%5BJournal%5D)">Evaluation of an automated high-volume extraction method for viral nucleic acids in comparison to a manual procedure with preceding enrichment.</a> Vox Sang. 89, 71-76 (2005).</li>
<li>Perelle, S., Cavellini, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Use+of+a+robotic+RNA+purification+protocol+based+on+the+NucliSens+easyMAG+for+real-time+RT-PCR+detection+of+hepatitis+A+virus+in+bottled+water%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Virol.+Methods%22%5BJournal%5D)">Use of a robotic RNA purification protocol based on the NucliSens easyMAG for real-time RT-PCR detection of hepatitis A virus in bottled water.</a> J. Virol. Methods. 157, 80-83 (2009).</li>
<li>Riemann, K., Adamzik, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparison+of+manual+and+automated+nucleic+acid+extraction+from+whole-blood+samples%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Clin.+Lab.+Anal%22%5BJournal%5D)">Comparison of manual and automated nucleic acid extraction from whole-blood samples.</a> J. Clin. Lab. Anal. 21, 244-248 (2007).</li>
<li>Hukari, K. W., Shultz, M., Isely, N., Milson, R., West, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+completely+automated+sample+preparation+instrument+and+consumable+device+for+isolation+and+purification+of+nucleic+acids%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Lab.+Autom%22%5BJournal%5D)">A completely automated sample preparation instrument and consumable device for isolation and purification of nucleic acids.</a> J. Lab. Autom. 16, 355-365 (2011).</li>
<li>Kessler, H., Mühlbauer, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fully+automated+nucleic+acid+extraction%5BTitle%5D)+AND+%22MagNA+Pure+LC.+Clin.+Chem%22%5BJournal%5D)">Fully automated nucleic acid extraction.</a> MagNA Pure LC. Clin. Chem. 47, 1124-1126 (2001).</li>
<li>Miller, S., Seet, H., Khan, Y., Wright, C., Nadarajah, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparison+of+QIAGEN+automated+nucleic+acid+extraction+methods+for+CMV+quantitative+PCR+testing%5BTitle%5D)+AND+%22Am.+J.+Clin.+Pathol%22%5BJournal%5D)">Comparison of QIAGEN automated nucleic acid extraction methods for CMV quantitative PCR testing.</a> Am. J. Clin. Pathol. 133, 558-563 (2010).</li>
<li>Dundas, N., Leos, N. K., Mitui, M., Revell, P., Rogers, B. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparison+of+automated+nucleic+acid+extraction+methods+with+manual+extraction%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Mol.+Diagn%22%5BJournal%5D)">Comparison of automated nucleic acid extraction methods with manual extraction.</a> J. Mol. Diagn. 10, 311-316 (2008).</li>
<li>Kruhøffer, M., Voss, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evaluation+of+the+QIAsymphony+SP+workstation+for+magnetic+particle-based+nucleic+acid+purification+from+different+sample+types+for+demanding+downstream+applications%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Lab.+Autom%22%5BJournal%5D)">Evaluation of the QIAsymphony SP workstation for magnetic particle-based nucleic acid purification from different sample types for demanding downstream applications.</a> J. Lab. Autom. 15, 41-51 (2010).</li>
<li>Akonni Biosystems, Inc. Apparatus, system, and method for purifying nucleic acids. United States Patent. , US7759112 (2010).</li>
<li>Chandler, D. P., Griesemer, S. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid%2C+simple+influenza+RNA+extraction+from+nasopharyngeal+samples%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Virol.+Methods%22%5BJournal%5D)">Rapid, simple influenza RNA extraction from nasopharyngeal samples.</a> J. Virol. Methods. 183, 8-13 (2012).</li>
<li>Chan, K. H., Lai, S. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analytical+sensitivity+of+rapid+influenza+antigen+detection+tests+for+swine-origin+influenza+virus+%28H1N1%29%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Clin.+Virol%22%5BJournal%5D)">Analytical sensitivity of rapid influenza antigen detection tests for swine-origin influenza virus (H1N1).</a> J. Clin. Virol. 45, 205-207 (2009).</li>
<li>Chan, K. H., Lama, S. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparative+analytical+sensitivities+of+six+rapid+influenza+A+antigen+detection+test+kits+for+detection+of+influenza+A%5BTitle%5D)+AND+%22subtypes+H1N1%2C+H3N2+and%22%5BJournal%5D)">Comparative analytical sensitivities of six rapid influenza A antigen detection test kits for detection of influenza A.</a> subtypes H1N1, H3N2 and. 38, 169-171 (2007).</li>
<li>Fan, H. C., Blumenfeld, Y. J., Chitkara, U., Hudgins, L., Quake, S. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Noninvasive+diagnosis+of+fetal+aneuploidy+by+shotgun+sequencing+DNA+from+maternal+blood%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+USA%22%5BJournal%5D)">Noninvasive diagnosis of fetal aneuploidy by shotgun sequencing DNA from maternal blood.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 105, 16266-16271 (2008).</li>
</ol>

Autorami są pracownicy firmy Akonni Biosystems, Inc., którzy produkują materiały wykorzystane w tym artykule.
Bezpłatny dostęp i produkcja tego artykułu jest sponsorowana przez Akonni Biosystems, Inc.

Prostota koncepcji TruTip i przebiegu pracy (ilustracja 1) sprawiają, że można go łatwo dostosować, zautomatyzować, wydajnie i skutecznie dostosować do wielu matryc próbek klinicznych, objętości próbek wejściowych i systemów obsługi cieczy. Należy jednak pamiętać, że każda próbka kliniczna jest wyjątkowa i będzie się różnić pod względem lepkości, cząstek, śluzu, zanieczyszczeń powierzchniowych, drobnoustrojów i/lub tła genetycznego człowieka. Biorąc pod uwagę spodziewane różnice w składzie próbki klinicznej i zamierzone zastosowania automatycznego protokołu przygotowania próbki TruTip, może być konieczne zmodyfikowanie niektórych etapów procedury TruTip w celu osiągnięcia pożądanych wyników dla określonego typu próbki. Niezależnie jednak od rodzaju próbki, parametry TruTip, które zazwyczaj mają największy wpływ na czystość i/lub odzysk kwasów nukleinowych, obejmują:
<ol>
	<li>Mieszanie i homogenizacja próbki z buforem do lizy (i alkoholem). Podczas gdy TruTips mają stosunkowo duży rozmiar porów, homogenizacja i upłynnienie próbki jest bardzo ważne dla wydajnej lizy komórek i późniejszych etapów wiązania z monolitem TruTip. Dzięki jednorodnemu i dobrze upłynnionemu lizatowi próbki mogą przepływać przez TruTip z większymi natężeniami przepływu, co skraca całkowity czas przetwarzania próbki. Protokół badania plazmy o dużej objętości demonstruje potencjał użytkowników w zakresie dokładnej homogenizacji i skraplania trudnych próbek (on-line lub off-line), pomimo dużej objętości próbki wejściowej.</li>
	<li>Natężenia przepływu. Wolniejsze prędkości przepływu podczas wiązania lub elucji kwasów nukleinowych zazwyczaj skutkują wyższą wydajnością kwasów nukleinowych, aczkolwiek kosztem całkowitego czasu przetwarzania. Wolniejsze prędkości przepływu mogą również zmniejszyć zakres ścinania DNA.</li>
	<li>Numery cykli. Optymalna liczba cykli aspiracji i dozowania zależy od typu próbki, całkowitej objętości próbki i natężenia przepływu. Krok 1 na rysunku 1 jest zazwyczaj punktem, w którym numery cykli (i natężenia przepływu) mogą wymagać pewnej empirycznej optymalizacji, przy czym próbki takie jak aspirat do nosogardzieli (ryc. 5) stanowią jeden z trudniejszych lizatów do optymalizacji ze względu na zakres lepkości NPA od różnych pacjentów.</li>
	<li>Suszenie. Całkowite wysuszenie monolitu TruTip jest konieczne, aby zapobiec koelucji pozostałości rozpuszczalników organicznych z oczyszczoną próbką kwasu nukleinowego i zahamowaniu dalszych procesów lub testów. Ponieważ TruTip nie jest suszony poprzez wirowanie lub filtrację próżniową, ważne jest, aby zmaksymalizować zarówno natężenie przepływu, jak i liczbę cykli na etapie suszenia. Zdarza się, że po zakończeniu cykli suszenia na końcu TruTip znajduje się resztkowa kropla roztworu myjącego. Robot Hamilton ma możliwość wykonania "dotknięcia końcówki" z boku studzienki w celu uwolnienia kropli, zapewniając w ten sposób elucję bez rozpuszczalników. System epMotion nie posiada tej funkcji, ale można zaprogramować wstępne płukanie końcówki TruTip w buforze elucyjnym, aby osiągnąć ten sam efekt.</li>
</ol>
Ponieważ geometria, materiał końcówki pipety i sposób mocowania do ramion kanału robota są unikalne dla każdego producenta urządzenia, dla każdego systemu obsługi cieczy wymagana jest inna konstrukcja TruTip. Wymiary monolitu TruTip (średnica, grubość i wielkość porów) korelują ze zdolnością wiązania kwasów nukleinowych (i wydajnością elucji), jak można się spodziewać w przypadku każdej techniki ekstrakcji do fazy stałej. Podczas gdy grube (> 4 mm) matryce mogą być osadzone w 1 ml TruTip w celu zwiększenia zdolności wiązania kwasów nukleinowych dla próbek o dużej objętości i/lub wyrównania zdolności wiązania w określonych formatach TruTip, istnieje kompromis między grubością TruTip a natężeniem przepływu podczas początkowego etapu wiązania (w obecności surowych lizatów). W związku z tym czasami korzystne jest osadzanie monolitów o większej średnicy w końcówkach do pipet o większej objętości w początkowych etapach automatycznego protokołu (np. 5 ml końcówek TruTip Hamilton/Akonni do ekstrakcji dużych objętości). Biorąc jednak pod uwagę specyficzne konfiguracje TruTip dyktowane przez producentów robotów do obsługi cieczy, niekoniecznie oczekujemy, że wydajność kwasów nukleinowych TruTip będzie identyczna na platformach do obsługi cieczy różnych producentów lub we wszystkich rozmiarach TruTip.
Próbki kliniczne (z definicji) będą zawierały znaczne ilości ludzkiego genomowego DNA, chyba że zostaną pozyskane z normalnie sterylnych miejsc (np. płynu mózgowo-rdzeniowego). Czasami pożądane jest ludzkie genomowe DNA (jak na rysunku 6), podczas gdy w innych zastosowaniach ludzkie DNA stanowi niepożądane tło genomowe (jak na rysunku 5). Obecność tła DNA zwykle nie jest problematyczna, o ile całkowita ilość kwasu nukleinowego w próbce nie przekracza zdolności wiązania monolitu, a DNA tła może służyć jako nośnik, jeśli pożądany docelowy kwas nukleinowy jest obecny w śladowych ilościach. Celem protokołu ekstrakcji osocza o dużej objętości (ryc. 7) jest wyizolowanie (rozdrobnionego) DNA płodu w obecności 10-20-krotnego nadmiaru DNA matki, co jest podobne do celu przygotowania próbki w testach na choroby zakaźne, z wyjątkiem tego, że sekwencje są wysoce zgodne i można je odróżnić tylko za pomocą wysoce specyficznych testów molekularnych i/lub dyskryminacji wielkości. W tym przypadku całkowite krążące DNA jest izolowane za pomocą 5 ml TruTip, a następnie wysokocząsteczkowe i niskocząsteczkowe DNA płodu jest rozdzielane poprzez późniejsze wiązanie i elucję do 1 ml TruTip poprzez zmianę warunków bufora wiązania. Selektywne rozdzielanie wielkości i wzbogacanie docelowych kwasów nukleinowych w oparciu o ich właściwości wiązania i elucji z monolitem krzemionkowym jest znacznie innym sposobem działania niż osiągany przez membrany lub kolumny wirowe wykluczające rozmiar. Separacja wielkości i wzbogacanie DNA drobnoustrojów z DNA genomowego człowieka może zostać osiągnięte w przyszłych zastosowaniach poprzez dostosowanie wiążących i elucyjnych TruTip.
Zademonstrowane tutaj zautomatyzowane protokoły podkreślają użyteczność samego monolitu TruTip do przetwarzania różnych próbek klinicznych oraz sposób, w jaki można go dostosować do dużych objętości i specjalnych robotów do obsługi cieczy. Uproszczone metody zazwyczaj skutkują szybszymi protokołami ekstrakcji w porównaniu z innymi zautomatyzowanymi systemami. Prostota technologii TruTip zapewnia jednak również pewne korzyści kosztowe dla osób zainteresowanych zakupem nowego, zautomatyzowanego systemu oczyszczania kwasów nukleinowych, ponieważ podstawowym sprzętem wymaganym do automatyzacji procedur TruTip jest samo ramię kanału pipety, a nie pręty magnetyczne, systemy próżniowe lub wirówki pokładowe. Wykorzystanie wstępnie napełnionych płytek z odczynnikami może również zmniejszyć ilość miejsca i wymaganych materiałów eksploatacyjnych oraz podwoić przepustowość na cykl. Minimalizacja przestrzeni na pokładzie dzięki protokołom TruTip umożliwia również zaawansowanym użytkownikom integrację zautomatyzowanych procesów poprzedzających lub końcowych z TruTip. Na przykład rozwiązanie easyBlood firmy Hamilton do frakcjonowania krwi pełnej można połączyć z automatyczną metodą ekstrakcji TruTip, co znacznie usprawniłoby procesy biobankowania. Procesy po ekstrakcji, takie jak oznaczanie ilościowe kwasów nukleinowych, normalizacja, konfiguracja PCR lub sekwencjonowanie DNA, są również łatwo zintegrowane z TruTip na większych platformach do obsługi cieczy.

Oczyszczanie kwasów nukleinowych jest konieczne dla większości diagnostyki molekularnej, zastosowań badawczych i nauk przyrodniczych. Od czasu ekstrakcji fenolem/chloroformem pojawiły się różne podejścia, z których wiele opiera się na podstawowej zasadzie wiązania kwasów nukleinowych z krzemionką w obecności soli chaotropowych 1. Proces ekstrakcji został usprawniony i zautomatyzowany dzięki zastosowaniu różnych formatów opartych na kulkach i membranach, przy czym filtry wirowe, kulki magnetyczne i podobne podejścia dominują w branży nauk przyrodniczych (patrz przykłady w 2-13). Chociaż cząsteczki i membrany są skuteczne, mają znane ograniczenia w konfrontacji z trudnymi matrycami klinicznymi. Na przykład membrany i kolumny oparte na kulkach są zgodne, mają małe rozmiary porów (stąd wysokie ciśnienie wsteczne) i wymagają pewnego rodzaju podparcia, aby mogły być przetwarzane przez wirówkę lub system próżniowy. Właściwości fizyczne membran i kolumn perełkowych skutkują znacznym oporem płynów, który ogranicza rodzaj próbek, które można efektywnie przetwarzać bez zatykania materiału eksploatacyjnego, i/lub całkowitą (wejściową) objętość próbki, która może być przetwarzana jednokierunkowo przez ścieżkę przepływu. I odwrotnie, cząstki magnetyczne muszą być rozprowadzane w próbce przez mieszanie. Konieczność jednorodnego rozprowadzenia cząstek magnetycznych w roztworze ogranicza całkowitą objętość próbki wejściowej, którą można przetworzyć za pomocą większości materiałów eksploatacyjnych z kulkami magnetycznymi. Cechy kliniczne próbki (takie jak lepkość lub złożoność) mogą prowadzić do nieefektywnego stężenia cząstek magnetycznych na boku rurki lub pręta. Ponadto drobne cząstki krzemionki mogą odrywać się od kulek podczas procesu ekstrakcji, tracąc namagnesowanie i zanieczyszczając próbkę końcową.
Technologia TruTip została opracowana w celu przezwyciężenia niektórych z tych ograniczeń i ograniczeń związanych z przetwarzaniem próbek kwasów nukleinowych 14. Osadzenie porowatego monolitu w końcówce pipety powoduje obniżenie przeciwciśnienia płynu, co umożliwia kontrolę przepływu za pomocą podciśnienia (tj. zasysanie pipety). Ta cecha umożliwia znaczne uproszczenie procesu ekstrakcji i oprzyrządowania wymaganego do oczyszczania kwasów nukleinowych z trudnych typów próbek (rysunek 1). Geometria i porowatość monolitu jest dostosowana tak, aby zminimalizować zatykanie, podczas gdy grubość monolitu zapewnia wystarczającą zdolność wiązania kwasów nukleinowych dla próbek o objętości od 1,0 do 5,0 ml. Dwukierunkowy przepływ podczas aspiracji i dozowania próbki pozwala na wydłużenie czasu przebywania między ekstraktem próbki a monolitem wiążącym w celu wydajnego odzyskiwania i elucji kwasów nukleinowych, a także umożliwia przetwarzanie stosunkowo dużych objętości próbek, które przekraczają objętość samej końcówki pipety. Wcześniej informowaliśmy o opracowaniu i zastosowaniu ręcznej procedury TruTip do oczyszczania RNA grypy z próbek z nosogardzieli przy użyciu jedno- lub wielokanałowego pipetora Rainin 15. Równoważną skuteczność ekstrakcji uzyskano między zautomatyzowaną metodą QIAcube a ręczną metodą TruTip przy 106 kopiach genów grypy A na ml aspiratu nosowo-gardłowego. Celem tego badania było zademonstrowanie średnio- i wysokoprzepustowych, zautomatyzowanych procedur oczyszczania kwasów nukleinowych TruTip dla aspiratu nosowo-gardłowego (NPA) i innych klinicznie istotnych typów próbek, przy użyciu robotów do obsługi cieczy, powszechnie spotykanych w referencyjnych laboratoriach klinicznych.

<table><tbody><tr><td colspan="4">&lt;strong&gt;Odczynniki/Materiały &lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>Zestaw do ekstrakcji wirusa grypy TruTip (EPM TruTips)</td><td><a href="http://www.akonni.com/" target="_blank"><img src="/img/new_window.png"> Akonni Biosystems, Inc.</a></td><td>300-11120</td><td></td></tr><tr><td>95% etanol</td><td>Acros Organics/ThermoFisher Scientific</td><td>AC615110040</td><td></td></tr><tr><td>Acetone 99%</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>270725-4L</td><td></td></tr><tr><td>woda traktowana DEPC</td><td>Life Technologies</td><td>AM9906</td><td></td></tr><tr><td>Zbiornik na odczynniki, 30 ml</td><td>Eppendorf</td><td>960050100</td><td></td></tr><tr><td>Płytka głębokolwiek 96-dołkowa2,000 &amp;mu;l</td><td>USA Scientific</td><td>30502302</td><td></td></tr><tr><td>nakładki filtrujące epT.I.P.S. Motion Filtertips, 1,000 &amp;mu;l</td><td>Eppendorf</td><td>960050100</td><td></td></tr><tr><td colspan="4">&lt;strong&gt;Sprzęt&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>System epMotion 5070</td><td>Eppendorf</td><td>5070 000.000</td><td></td></tr><tr><td>Dozownik TM1000-8</td><td>960001061</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Statyw na zbiorniki</td><td>960002148</td><td></td><td></td></tr><tr><td colspan="4">&lt;strong&gt;Tabela 1. &lt;/strong&gt; Odczynniki i sprzęt do zautomatyzowanej ekstrakcji RNA z wymazów z nosa i gardła (NPA).</td></tr><tr><td colspan="4">&lt;strong&gt;Odczynniki/Materiały &lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>Zestaw do ekstrakcji gDNA z krwi TruTip (Hamilton TruTips)</td><td><a href="http://www.akonni.com/" target="_blank"><img src="/img/new_window.png"> Akonni Biosystems, Inc.</a></td><td>300-20341</td><td></td></tr><tr><td>95% etanol</td><td>Acros Organics/ThermoFisher Scientific</td><td>AC615110040</td><td></td></tr><tr><td>Proteinaza K</td><td>AMRESCO LLC</td><td>E195</td><td></td></tr><tr><td>stojak z filtrowanymi końcówkami Hamilton CO-RE 96 o pojemności 1 ml</td><td>Hamilton Robotics, Inc.</td><td>235905</td><td></td></tr><tr><td>stelaż z końcówkami Hamilton CO-RE 96, 1 ml, niefiltrowane</td><td>Hamilton Robotics, Inc.</td><td>235904</td><td></td></tr><tr><td>Kuweta na odczynniki 50 ml</td><td>Hamilton Robotics, Inc.</td><td>187297</td><td></td></tr><tr><td>płyta głębokodołkowa 2 ml</td><td>USA Scientific</td><td>1896-2800</td><td></td></tr><tr><td>Nunc 96 DWP-2 ml</td><td>Thermofisher</td><td>27874</td><td></td></tr><tr><td>Korytko na odczynniki</td><td>Fisher</td><td>14-222-412</td><td></td></tr><tr><td colspan="4">&lt;strong&gt;Sprzęt&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>System Hamilton STAR</td><td>Hamilton Robotics, Inc.</td><td>173027</td><td></td></tr><tr><td>Kanały niezależnej pipety 1 ml / ramię modułowe</td><td>Hamilton Robotics, Inc.</td><td>173081/173050</td><td></td></tr><tr><td>głowica 96-kanałowa 1 ml</td><td>Hamilton Robotics, Inc.</td><td>199090</td><td></td></tr><tr><td>Uchwyty na końcówki</td><td>Hamilton Robotics, Inc.</td><td>182085</td><td></td></tr><tr><td>Nośniki/wkłady na próbki</td><td>Hamilton Robotics, Inc.</td><td>173400/182238</td><td></td></tr><tr><td>Kamizelki taktyczne z wkładami balistycznymi</td><td>Hamilton Robotics, Inc.</td><td>182090</td><td></td></tr><tr><td>Nośnik Multiflex</td><td>Hamilton Robotics, Inc.</td><td>188039</td><td></td></tr><tr><td>Urządzenie grzejące z wytrząsarką HHS2</td><td>Hamilton Robotics, Inc.</td><td>199033</td><td></td></tr><tr><td>Uchwyt do kaset</td><td>Hamilton Robotics, Inc.</td><td>188047</td><td></td></tr><tr><td colspan="4">&lt;strong&gt;Tabela 2. &lt;/strong&gt; Odczynniki i sprzęt do ekstrakcji genomowego DNA z krwi pełnej w formacie 96-dołkowym.</td></tr><tr><td colspan="4">&lt;strong&gt;Odczynniki/Materiały &lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>Zestaw do ekstrakcji krążącego DNA TruTip R+D (Hamilton TruTips)</td><td><a href="http://www.akonni.com/" target="_blank"><img src="/img/new_window.png"> Akonni Biosystems, Inc.</a></td><td>Zadzwoń, aby uzyskać informacje</td><td></td></tr><tr><td>100% etanol</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>459828-1L</td><td></td></tr><tr><td>Izopropanol</td><td>Acros Organics/ThermoFisher Scientific</td><td>AC327270010</td><td></td></tr><tr><td>Proteinaza K</td><td>AMRESCO LLC</td><td>E195</td><td></td></tr><tr><td>Końcówki filtrowane 4 ml</td><td>Hamilton Robotics, Inc.</td><td>184022</td><td></td></tr><tr><td>Nienapowietrzane końcówki 1 ml</td><td>Hamilton Robotics, Inc.</td><td>235939</td><td></td></tr><tr><td>Płytki 96-dołkowe o głębokich dołkach</td><td>USA Scientific</td><td>1896-2800</td><td></td></tr><tr><td>Probówki stożkowate 50 ml</td><td>Corning/ThermoFisher Scientific</td><td>05-526B</td><td></td></tr><tr><td>Kuwety na odczynniki 50 ml</td><td>Hamilton Robotics, Inc.</td><td>187297</td><td></td></tr><tr><td>Kuwety na odczynniki o pojemności 120 ml</td><td>Hamilton Robotics, Inc.</td><td>182703</td><td></td></tr><tr><td>Kuwetki na odczynniki o dużej objętości z 96 stanowiskami</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>14-222-412</td><td></td></tr><tr><td colspan="4">&lt;strong&gt;Sprzęt&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>Podstawa / Moduł platformy stacji roboczej STARplus Autoload</td><td>Hamilton Robotics, Inc.</td><td>173025/190012</td><td></td></tr><tr><td>1 ml niezależne kanały pipety / ramię</td><td>Hamilton Robotics, Inc.</td><td>173081/173052</td><td></td></tr><tr><td>5 ml niezależny kanał / ramię modułowe</td><td>Hamilton Robotics, Inc.</td><td>184090/173050</td><td></td></tr><tr><td>Kamizelki taktyczne z kieszeniami na płyty balistyczne</td><td>Hamilton Robotics, Inc.</td><td>182090</td><td></td></tr><tr><td>Nośnik Multiflex</td><td>Hamilton Robotics, Inc.</td><td>188039</td><td></td></tr><tr><td>Uchwyt do korytek na odczynniki o pojemności 50 ml</td><td>Hamilton Robotics, Inc.</td><td>188047</td><td></td></tr><tr><td>Uchwyt do koryt z odczynnikiem 120 ml</td><td>Hamilton Robotics, Inc.</td><td>185290</td><td></td></tr><tr><td>Uchwyty na końcówki</td><td>Hamilton Robotics, Inc.</td><td>182085</td><td></td></tr><tr><td>Statywy na probówki 50 ml</td><td>Hamilton Robotics, Inc.</td><td>182245</td><td></td></tr><tr><td>Statywy na próbki 24-miejscowe</td><td>Hamilton Robotics, Inc.</td><td>173400</td><td></td></tr><tr><td>Statyw na próbki z 32 pozycjami</td><td>Hamilton Robotics, Inc.</td><td>173410</td><td></td></tr><tr><td colspan="4">&lt;strong&gt;Tabela 3. &lt;/strong&gt; Odczynniki i sprzęt do ekstrakcji DNA z plazmy w dużych objętościach.</td></tr></tbody></table>

wysokowydajna, zautomatyzowana ekstrakcja dna i rna z próbek klinicznych przy użyciu technologii trutip w popularnych robotach do obsługi cieczy

High-throughput, Automated Extraction of DNA and RNA from Clinical Samples using TruTip Technology on Common Liquid Handling Robots

TruTip to prosta technologia ekstrakcji kwasów nukleinowych, w której porowata, monolityczna matryca wiążąca jest umieszczana w końcówce pipety. Geometria monolitu może być dostosowana do konkretnych końcówek pipet o objętości od 1,0 do 5,0 ml. Duża porowatość monolitu umożliwia łatwe przechodzenie przez niego lepkich lub złożonych próbek przy minimalnym przeciwciśnieniu płynu. Przepływ dwukierunkowy maksymalizuje czas przebywania między monolitem a próbką i umożliwia przetwarzanie dużych objętości próbek w ramach jednej końcówki TruTip. Podstawowe etapy, niezależnie od objętości próbki lub geometrii TruTip, obejmują lizę komórek, wiązanie kwasów nukleinowych z wewnętrznymi porami monolitu TruTip, wymywanie niezwiązanych składników próbki i do lizy oraz elucję oczyszczonych i stężonych kwasów nukleinowych do odpowiedniego buforu. Właściwości i zdolności adaptacyjne TruTip zostały zademonstrowane w trzech zautomatyzowanych protokołach przetwarzania próbek klinicznych przy użyciu robotów do obsługi płynów Eppendorf epMotion 5070, Hamilton STAR i STARplus, w tym izolacji RNA z aspiratu nosowo-gardłowego, izolacji genomowego DNA z krwi pełnej oraz ekstrakcji i wzbogacania DNA płodu z dużych ilości osocza matki (odpowiednio).

Dane z analizy real-time PCR dla ekstrakcji RNA grypy z aspiratów nosowo-gardlowych (NPA) przedstawiono na Rysunku 5A. Szacowana wydajność ekstrakcji kwasów nukleinowych jest zbliżona do wyników uzyskanych przy zastosowaniu ręcznej wersji protokołu 15. Obserwowano liniową odpowiedź średnich wartości Ct w zakresie od 104 do 106 kopii genu ml-1 w próbkach wzbogaconych wirusem grypy (R2 = 0,99 dla grypy A i 0,98 dla grypy B), przy odchyleniach standardowych średnich wartości Ct mniejszych niż 1 cykl. Brak kontaminacji krzyżowej w systemie epMotion wykazano na Rysunku 5B, gdzie 12 pozytywnych próbek NPA zawierających 106 kopii genu ml-1 przeplatano 12 próbkami kontrolnymi z samym buforem. Średnia wartość Ct dla kontroli pozytywnych wynosiła 30,16 ± 0,14, a wszystkie próbki kontrolne z buforem były negatywne. Całkowity czas przetwarzania próbek wynosi odpowiednio 16, 28 i 40 min dla 8, 16 i 24 próbek. Ponieważ typowy kliniczny aspirat lub wymaz z nosogardzieli zawiera 107 kopii genu ml-1 (przy założeniu 1000 wirionów na TCID50 16 oraz &gt; 104 TCID50 ml-1 dla grypy 17), oczekuje się, że zautomatyzowany protokół epMotion będzie skuteczny w większości klinicznych próbek NPA.
Biorąc pod uwagę zakres testów molekularnych wykonywanych na ludzkim DNA genomicznym, głównym celem ekstrakcji kwasów nukleinowych z krwi pełnej jest uzyskanie wolnego od zanieczyszczeń DNA genomicznego o wysokiej masie cząsteczkowej. Zautomatyzowany protokół dla 96 próbek jest realizowany w ciągu 1 h, co stanowi poprawę w stosunku do innych systemów zautomatyzowanych (np. Promega MagneSil = 90 min i system Qiagen QIAamp DNA Blood BioRobot MDx = 2,5 h). Rycina 6A przedstawia profile absorbancji UV/Vis dla 45 pozytywnych próbek krwi przetworzonych jednocześnie z 45 próbkami kontrolnymi (blankami) z odczynnikami zgodnie z protokołem Hamilton STAR, przy średnim stosunku A260/280 wynoszącym 1,96 i średnim stosunku A260/230 wynoszącym 1,93. Stosunek A260/280 w zakresie 1,7–2,0 oraz stosunek A260/230 &gt;1,7 są zazwyczaj wskaźnikami bardzo czystego DNA, wolnego od resztkowych soli, białek lub rozpuszczalników i akceptowalnego dla większości dalszych zastosowań molekularnych. Żel agarozowy 1% na Rycynie 6B pokazuje, że otrzymane gDNA ma wysoką masę cząsteczkową (&gt; 24 kb) przy minimalnym rozszczepieniu. Średnia wydajność kwasów nukleinowych z pełnego zestawu 45 próbek pozytywnych wynosi 5,26 ± 0,46 μg ludzkiego DNA na 200 μl krwi pełnej, w oparciu o zestaw Life Technologies Quantifiler Human DNA Quantification Kit. Badania nad kontaminacją krzyżową, podobne do tych przedstawionych na Rycynie 5B, przeprowadzono z użyciem ujemnych kontroli w postaci blanków z buforem, rozmieszczonych naprzemiennie z próbkami pozytywnymi i ekstrahowanych równolegle; wszystkie blanki ponownie okazały się negatywne w badaniu PCR (nie pokazano). Oczyszczone gDNA nadaje się również do licznych innych analiz opartych na metodzie PCR (nie pokazano).
Wyniki w czasie rzeczywistym z ośmiu prób powtórzonych z połączonej próbki osocza macierzystego, przetworzonej za pomocą procedury TruTip dla dużych objętości, przedstawiono na Rysunku 7. Pełny protokół (w tym inkubacja z proteinazą K w trybie off-line) kończy się w ciągu około 2,5 hr, co jest porównywalne z manualnym zestawem Qiagen Circulating Nucleic Acids Kit (obecnie nie są dostępne porównywalne zautomatyzowane zestawy do ekstrakcji). Średnie wartości Ct dla wszystkich powtórzeń wyniosły odpowiednio 34,58 ± 0,66 dla płodowego DNA męskiego (CHY) oraz 29,76 ± 0,50 dla całkowitego DNA (CH1), co świadczy o doskonałej powtarzalności zautomatyzowanej metody ekstrakcji. Stężenie płodowego DNA w całkowitej puli DNA (w ekwiwalentach genomowych) obliczono na podstawie analizy punktów dopasowania w odniesieniu do standardów, co dało średnią zawartość % płodowego DNA na poziomie 2,8% dla wszystkich próbek. Rzeczywisty % płodowego DNA dla tej próbki jest nieznany, ponieważ próbki zostały połączone przed przeprowadzeniem ekstrakcji. Skład płodowego DNA w niepołączonych próbkach osocza ekstrahowanych metodą TruTip jest zazwyczaj 1,5-krotnie wyższy w porównaniu z wynikami uzyskanymi przy użyciu zestawu Qiagen Circulating Nucleic Acids Kit (brak danych na rysunku).
<img alt="Proces oczyszczania DNA: Schemat etapów izolacji DNA metodą kolumnową: Liza, Przemywanie, Suszenie powietrzem, Elucja." fo:content-width="6in" fo:src="/files/ftp_upload/50356/50356fig1highres.jpg" src="/files/ftp_upload/50356/50356fig1.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Rysunek 1"> 
Rysunek 1. Proces ekstrakcji TruTip i schemat pracy, niezależnie od zastosowanego systemu do obsługi cieczy. Inne kroki przygotowania próbek lub obsługi cieczy mogą zostać włączone do rutyn automatycznych, w zależności od możliwości konkretnego instrumentu i oprogramowania do obsługi cieczy.
<img alt="Schemat przygotowania i przechowywania mikropłytek do ekstrakcji DNA; obejmuje próbkę kliniczną oraz bufor elucyjny." fo:content-width="6in" fo:src="/files/ftp_upload/50356/50356fig2highres.jpg" src="/files/ftp_upload/50356/50356fig2.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Rysunek 2"> 
Rysunek 2. (A) Układ płyty z próbkami w urządzeniu Eppendorf epMotion 5070. (B) Rozmieszczenie odczynników/materiałów eksploatacyjnych na stole roboczym. Płyta z próbkami może zostać skonfigurowana dla maksymalnie 24 próbek (odpowiednio kolumny 1, 5 i 9), choć urządzenie epMotion przetwarza jednocześnie maksymalnie 8 próbek. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/50356/50356fig2large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększony rysunek</a>.
<img alt="Schemat płytki 96-dołkowej, pozycje próbek, obszar odpadów, konfiguracja procesu laboratoryjnego, układ eksperymentu." fo:content-width="6in" fo:src="/files/ftp_upload/50356/50356fig3highres.jpg" src="/files/ftp_upload/50356/50356fig3.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Rycina 3"> 
Rycina 3. Układ pokładu Hamilton STAR do oczyszczania genomowego DNA z krwi pełnej (nie w skali). Pozycja pokładu 1 = końcówki filtrowane Hamilton 1 ml; 2 = końcówki niefiltrowane Hamilton 1 ml; 3 = końcówki Akonni/Hamilton 1 ml LPT 2 mm TruTips; 4 = nośniki próbek krwi wejściowych (probówki do pobierania krwi lub probówki do mikrocentryfugi); 5-9 = korytka na odczynniki o pojemności 290 ml odpowiednio dla Buforu do Lizy F, Etanolu, Buforu do Płukania J, Buforu do Płukania K i Buforu do Elucji A2; 10 = płytka wiążąca 96 głębokich dołków; 11 = Płukanie J 96 głębokich dołków; 12 = Płukanie K 96 głębokich dołków; 13 = płytka do elucji 96 głębokich dołków; 14 = grzejarka/mieszadło Hamilton HHS2 z płytką inkubacyjną Nunc 96 głębokich dołków; 15 = korytko na odczynniki o pojemności 50 ml zawierające proteinazę K. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/50356/50356fig3large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić większą rycinę</a>.
<img alt="Zautomatyzowany proces pipetowania, schemat z konfiguracją mikropłytki, etapy przemywania i elucji, przepływ pracy laboratoryjnej." fo:content-width="6in" fo:src="/files/ftp_upload/50356/50356fig4highres.jpg" src="/files/ftp_upload/50356/50356fig4.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Rysunek 4"> 
Rysunek 4. Układ pokładu Hamilton STARplus do oczyszczania DNA z próbek plazmy o dużej objętości (nie w skali). System jest wyposażony w 8 kanałów 5 ml oraz 8 kanałów 1 ml (niewidoczne na schemacie pokładu). Pozycja na pokładzie 1 = filtrowane końcówki Hamilton 4 ml; 2 = Akonni/Hamilton 5 ml TruTips; 3 = wyjściowe próbki plazmy; 4 = stożkowe probówki 50 ml; 5 = koryty na odczynniki 120 ml zawierające odczynniki CN-W1, CN-W2 i CN-W4; 6 = koryta na odczynniki o małej objętości zawierające proteinazę K oraz odczynniki CN-B2, CN-B3, EBA2, EBB i CN-W3; 7 = koryto na odczynniki 290 ml zawierające odczynnik CN-L1; 8 = koryto na odczynniki 290 ml zawierające odczynnik CN-B1; 9 = płytki 96-dołkowe do Kroku 1; 10 = płytki 96-dołkowe do Kroku 2; 11 = nośniki próbek dla oczyszczonego produktu końcowego; 12 = niefiltrowane końcówki Hamilton 1 ml; 13 = Akonni/Hamilton 1 ml LPT 4 mm TruTips. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/50356/50356fig4large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić większy rysunek</a>.
<img alt="Analiza stężenia grypy, wykres słupkowy (A) i wykres fluorescencji (B), wyniki qPCR." fo:content-width="6in" fo:src="/files/ftp_upload/50356/50356fig5highres.jpg" src="/files/ftp_upload/50356/50356fig5.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Rycina 5"> 
Rycina 5. (A). Wyniki Real-time PCR z automatycznej ekstrakcji TruTip wirusa grypy dodanego do aspiratu z nosogardzieli (NPA). Objętość wejściowa NPA = 100 μl, objętość elucji = 50 μl. Wyniki stanowią średnią z 3 powtórzeń ekstrakcji z 5 różnych matryc NPA (n = 15) dla każdego poziomu rozcieńczenia i celu grypy. qPCR przeprowadzono na systemie LightCycler 480 zgodnie z wcześniej opisanymi warunkami analizy 15. (B) Nie wykryto kontaminacji krzyżowej, gdy 12 pozytywnych próbek NPA przeplatano kontrolami bez matrycy i poddano zautomatyzowanej procedurze ekstrakcji. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/50356/50356fig5large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną rycinę</a>.
<img alt="Wykres spektroskopii i wynik elektroforezy żelowej dla eksperymentu analizy i rozdziału DNA." fo:content-width="6in" fo:src="/files/ftp_upload/50356/50356fig6highres.jpg" src="/files/ftp_upload/50356/50356fig6.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Rycina 6"> 
Rycina 6. Wyniki ekstrakcji ludzkiego genomowego DNA z krwi pełnej. A) Widma UV-Vis z NanoDrop 1000 (ThermoFisher) z 10 losowo wybranych powtórzeń. B) 1% żel agarozowy z oczyszczonym gDNA za pomocą TruTip. M = Fisher 24 kb Max DNA Ladder. Ścieżki 1- 4 = ~100 ng oczyszczonego gDNA z czterech losowo wybranych powtórzeń. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/50356/50356fig6large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną rycinę</a>.
<img alt="Wykres słupkowy wartości Ct porównujący DNA męskie i całkowite w analizie PCR." fo:content-width="6in" fo:src="/files/ftp_upload/50356/50356fig7highres.jpg" src="/files/ftp_upload/50356/50356fig7.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Rycina 7"> 
Rycina 7. Wyniki PCR w czasie rzeczywistym z ośmiu powtórzeń ekstrakcji wolnokrążącego DNA z osocza za pomocą TruTip. Próbki oznaczone gwiazdkami (* lub **) zostały wyekstrahowane w różne dni. CHY określa ilość męskiego DNA płodowego, a CH1 określa całkowitą ilość obecnego DNA (płodowego i macierzystego). qPCR przeprowadzono w systemie LightCycler 480 (Roche) przy użyciu wcześniej opublikowanych testów celujących w CHY i CH1 18.

TruTip to prosta technologia ekstrakcji kwasów nukleinowych, w której porowata, monolityczna matryca wiążąca jest umieszczana w końcówce pipety. W związku z tym format przygotowania próbki jest kompatybilny z większością przyrządów do obsługi cieczy i może być używany do wielu zastosowań klinicznych o średniej i wysokiej przepustowości oraz typów próbek.

Wysokowydajna, zautomatyzowana ekstrakcja DNA i RNA z próbek klinicznych przy użyciu technologii TruTip w popularnych robotach do obsługi cieczy

TruTip is a simple nucleic acid extraction  technology whereby a porous, monolithic binding matrix is inserted into a  pipette tip. The geometry of the ...

Ogólnym celem następującego eksperymentu jest wyizolowanie ludzkiego genomowego DNA z krwi pełnej, przy użyciu technologii ekstrakcji TrueTip z wykorzystaniem stacji roboczej do obsługi cieczy Hamilton Star. Aby to osiągnąć, komórki lizuje się w roztworze składającym się z buforu do lizy próbek krwi, proteinazy K oraz etanolu; roztwór ten jest wielokrotnie zasysany i wydzielany przez końcówki TrueTip, co powoduje związanie DNA z macierzą TrueTip. Następnie przez końcówki TrueTip przepuszcza się dwa oddzielne bufory płuczące, aby usunąć pozostałe białka, bufor do lizy oraz inne zanieczyszczenia z związanych kwasów nukleinowych.W trzecim kroku matryca wiążąca prawdziwego końcówki (true tip) jest suszona poprzez wielokrotne zasysanie i wydmuchiwanie powietrza w celu odparowania pozostałego buforu piorącego; w ostatnim kroku bufor elucyjny jest przepływany w obie strony przez matrycę wiążącą, aby uwolnić DNA z matrycy. Dzięki zastosowaniu technologii true tip ekstrahowane jest wolne od zanieczyszczeń genomowe DNA o wysokiej masie cząsteczkowej, co można potwierdzić za pomocą absorbancji UV-vis, elektroforezy żelowej oraz ilościowej PCR lub sekwencjonowania. Przewagą true tip nad innymi metodami przygotowania próbek opartymi na kolumnach wirowych lub cząsteczkach magnetycznych jest łatwość automatyzacji True Tip.Metoda ta nie wymaga kosztownych systemów z wirówkami i pręcikami magnetycznymi, a uproszczony schemat pracy pozwala zaoszczędzić cenną przestrzeń na platformie roboczej. Choć dzisiaj skupimy się na krwi pełnej, Tru Tip może być stosowany również w innych zastosowaniach dotyczących próbek genomicznego DNA, a także w przypadku RNA wirusowego z próbek wymazów klinicznych czy izolacji wolnego DNA z osocza, wymieniając tylko kilka przykładów. Procedurę zademonstruje Dane Brady, inżynier automatyki z naszego laboratorium, który odegrał kluczową rolę w opracowaniu procedury ekstrakcji Tru Tip na stacji roboczej do manipulacji cieczami Hamilton.W niniejszym protokole robot do obsługi cieczy Hamilton Star jednocześnie ekstrahuje DNA z 96 studzienek krwi pełnej. Robot Hamilton Star posiada opcjonalną jednostkę grzejącą z wytrząsarką na pokładzie, która jest istotna dla trawienia enzymatycznego niektórych matryc klinicznych, takich jak krew pełna. Ponieważ system może być wyposażony w 96-kanałową głowicę pipetującą, dla każdego z etapów wykorzystania końcówek oraz dla odczynników przewidziano dedykowaną płytkę 96-dołkową.W pierwszej kolejności należy włączyć komputer oraz urządzenia towarzyszące robotowi Hamilton Star. Uruchomić oprogramowanie Hamilton Run Control. Otworzyć plik uruchamiający dostarczony przez ACON dla 96 próbek.Teraz przygotuj układ pokładu star (star deck) zgodnie z diagramem. W wszystkich pozycjach oznaczonych numerem jeden umieść końcówki filtrowane o pojemności 1 ml; w pozycji drugiej umieść końcówki niefiltrowane o pojemności 1 ml; w pozycji trzeciej umieść końcówki Conni Hamilton 1 ml LPT 2 mm true tips. Kontynuuj korzystanie z tabeli, aby wypełnić pozostałe pozycje od 5 do 12 wymaganym sprzętem laboratoryjnym, ale nie ładuj jeszcze próbek.Następnie należy rozdzielić odczynniki: 75 mililitrów buforu do lizy i wiązania. Bufor F powinien zostać umieszczony w pozycji korytka numer pięć. Alternatywnie, w celu usprawnienia przygotowań i uproszczenia układu pokładu, można zastosować płytki wstępnie napełnione buforami.Kontynuuj ładowanie robota zgodnie z procedurą. Na koniec zdejmij nakrętki z probówek z krwią i umieść je w statywach na próbki lub w czwartej pozycji pokładu. Umieść próbkę 1 z tyłu najbardziej lewego statywu, a następnie kolejno wypełniaj pozostałe statywy, tak aby próbka 96 znalazła się w przedniej prawej pozycji.Po załadowaniu wszystkich próbek należy pozwolić im osiągnąć temperaturę pokojową. Ponieważ protokół jest w pełni zautomatyzowany, istnieje niewielkie ryzyko błędu operatora. Próbki muszą zostać umieszczone w statywie w odpowiedniej kolejności, jednak w celu zapewnienia właściwego śledzenia próbek można zastosować kodowanie kreskowe.Aby uruchomić zautomatyzowany skrypt, należy wybrać przycisk odtwarzania w lewym górnym rogu okna pliku uruchamiającego i wprowadzić liczbę przetwarzanych próbek. Pierwszym krokiem wykonywanym przez skrypt jest przeniesienie 80 µL proteinazy K do płytki inkubacyjnej znajdującej się w pozycji 14 modułu inkubatora z wytrząsaniem. Następnie skrypt dozuje 200 µL próbki do każdego dołka płytki inkubacyjnej przy użyciu ramienia ośmiokanałowego.Następnie, przy użyciu ramienia 96-kanałowego, do każdej studzienki płytki inkubacyjnej dozuje się 600 µL buforu lizującego F. Następnie skrypt miesza roztwór przez 10 cykli i inkubuje go przez 20 minut w temperaturze 70 °C i przy 500 RPM w płytce z głębokimi studzienkami; temperatura wynosi jedynie 60 °C, co mieści się w zakresie aktywności proteinazy K. Podczas inkubacji próbek system dozowania cieczy kontynuuje pracę, dozując odczynniki do ekstrakcji i elucji z wysuwanek z odczynnikami zbiorczymi do odpowiadających im płytek 96-dołkowych; do każdej studzienki płytki z głębokimi studzienkami dodaje się 100 µL buforu elucyjnego A.W pozycji 13 do każdego dołka płytki głębokodna nanosi się 800 µL etanolu. W pozycji 10 do każdego dołka płytki głębokodna w pozycji 12 dodaje się 1,6 mL buforu płuczącego K, a do każdego dołka płytki głębokodna w pozycji 11 dodaje się 1,6 mL buforu płuczącego J. Po 20-minutowej inkubacji mieszaninę próbki przenosi się z płytki inkubacyjnej do płytki głębokodna zawierającej etanol w pozycji 10, gdzie zostaje ona wymieszana poprzez 12 cykli pipetowania.W trakcie całego procesu końcówki do odczynników są wyrzucane do pojemnika na odpady zgodnie z potrzebą. Program przechodzi z procesu lizy do ekstrakcji DNA, najpierw ładując 96 końcówek typu „true tips” z pozycji trzeciej platformy. Następnym krokiem jest aspiracja i dozowanie próbek z pozycji 10 w ciągu 10 cykli, co pozwala na związanie kwasów nukleinowych z monolitem końcówki „true tip”.Następnie końcówki przenoszą się do pozycji 11, w której bufor płuczący J jest przepuszczany przez monolit pięciokrotnie w celu usunięcia pozostałości lizatu, buforu oraz matrycy próbki. Następnie końcówki przenoszą się do pozycji 12, gdzie bufor płuczący K jest przepuszczany przez nie pięciokrotnie, aby usunąć białka i inne zanieczyszczenia z związanych kwasów nukleinowych. Na koniec końcówki są suszone powietrzem poprzez 80 cykli szybkiego ruchu nad płytką do płukania.Następnie końcówki właściwe przesuwają się do pozycji 13, gdzie bufor elucyjny przechodzi przez nie w dwóch cyklach powtórzonych pięciokrotnie, uwalniając DNA do płytki głębokodnowej. Końcówki właściwe zostają teraz wyrzucone do pojemnika na odpady. Program został zakończony.Wyjmij płytkę elucyjną z urządzenia i przenieś wyekstrahowane próbki do odpowiednich probówek w celu przechowywania lub dalszych zastosowań. Program można również dostosować tak, aby automatycznie przenosić końcowe próbki do wybranej probówki lub płytki w ciągu zaledwie jednej godziny. Zautomatyzowany system wyekstrahował genomiczne DNA z 96 próbek krwi przy użyciu robota.Profile absorbancji 45 dodatnich próbek krwi przetworzono jednocześnie z 45 próbkami kontrolnymi (blankami). Średni stosunek absorbancji 260 do 280 wyniósł 1,96, a średni stosunek 260 do 230 wyniósł 1,93, co sugeruje czystość próbek w żelu 1% agarose. Losowe próbki wykazały wysoką masę cząsteczkową przy minimalnym ścinaniu.Średnia wydajność wyniosła około five µg DNA na 200 µL krwi pełnej. Podczas optymalizacji zautomatyzowanego protokołu true tip szczególną uwagę poświęca się temu, aby nie dopuścić do kontaminacji krzyżowej między dołkami. PCR w czasie rzeczywistym wykazuje wyraźne oddzielenie próbek pozytywnych od negatywnych, co przedstawiono tutaj.W przypadku ekstrakcji RNA, pełny proces dla 96 próbek można przeprowadzić w czasie krótszym niż jedna godzina, przy minimalnym nakładzie pracy manualnej. Po obejrzeniu tego filmu powinieneś dobrze rozumieć, jak izolować ludzkie genomowe DNA z krwi pełnej przy użyciu technologii TRU Technology Automated na stacji roboczej do obsługi cieczy Hamilton Star.

high-throughput-automated-extraction-dna-rna-from-clinical-samples

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Bioinżynieria

Wysoka wydajność, Automatyczne wyodrębnianie DNA i RNA z próbek klinicznych z wykorzystaniem technologii TruTip na wspólnych robotach do manipulacji płynami

Opisujemy tutaj procedury ekstrakcji i oczyszczania mRNA i metabolitów z głów Drosophila. Stosujemy te techniki, aby lepiej zrozumieć perturbacje komórkowe leżące u podstaw degeneracji neuronów. Metodologie te można łatwo skalować i dostosowywać do innych projektów "omicznych".

Oczyszczanie transkryptów i metabolitów z głów Drosophila

Ten manuskrypt opisuje protokoły kliniczne dla dwóch paneli sekwencjonowania nowej generacji. Jeden panel bada nowotwory hematologiczne, podczas gdy drugi panel koncentruje się na genach powszechnie zmutowanych w guzach litych. Klasyfikacja molekularna mutacji powodujących nowotwory złośliwe u ludzi dostarcza cennych informacji prognostykujących i predykcyjnych.

Sekwencjonowanie nowej generacji do wykrywania mutacji, które można podjąć w celu działania, w guzach litych i płynnych

Translating Ribosome Affinity Purification (TRAP) jest w stanie uchwycić specyficzną dla typu komórki translację mRNA. W tym miejscu przedstawiamy pierwszy protokół TRAP poświęcony izolacji mRNA w rzadkich populacjach komórek zarodków Drosophila.

TRAP-rc, Translacja oczyszczania powinowactwa rybosomów z rzadkich populacji komórek zarodków Drosophila

Opisany jest zintegrowany system do ukierunkowanego sekwencjonowania nowej generacji próbek onkologicznych. Ten wieloplatformowy system jest zoptymalizowany pod kątem biopsji guza o niskiej jakości i małej ilości, obsługuje niskie dane wejściowe DNA, zawiera dobrze scharakteryzowane wielowariantowe kontrole i zawiera nowatorski wariant wywołujący, który jest informowany o ilościowych przedanalitycznych środkach kontroli jakości.

Integracja procesów na mokrym i suchym stanowisku laboratoryjnym optymalizuje ukierunkowane sekwencjonowanie nowej generacji biopsji nowotworów o niskiej jakości i małej ilości

Tutaj prezentowany jest zautomatyzowany przepływ pracy do wykonywania modułowego montażu "urządzenia" DNA przy użyciu modułowej metody klonowania DNA na robotach obsługujących ciecze. Protokół wykorzystuje intuicyjne narzędzie programowe do generowania list wyboru osób zajmujących się cieczami do kombinatorycznego generowania biblioteki urządzeń DNA, które demonstrujemy za pomocą dwóch platform do obsługi cieczy.

Zautomatyzowany zrobotyzowany montaż modułowych urządzeń DNA do obsługi cieczy

Uzyskanie wysokiej jakości genomowego DNA z tkanek nowotworowych jest niezbędnym pierwszym krokiem do analizy zmian genetycznych za pomocą sekwencjonowania nowej generacji. W tym artykule przedstawiamy prostą i szybką metodę wzbogacania komórek nowotworowych i uzyskiwania nienaruszonego DNA z próbek cytologicznych odcisku dotykowego.

Prosta i szybka metoda uzyskiwania wysokiej jakości DNA guza z próbek kliniczno-patologicznych za pomocą cytologii odcisku dotykowego

Prezentujemy podejście do oczyszczania mRNA związanego z rybosomami z komórek śródbłonka naczyń krwionośnych (EC) bezpośrednio w tkankach mózgu, płuc i serca myszy za pomocą specyficznego dla EC znacznika genetycznego wzmocnionego białka zielonej fluorescencji (EGFP) w rybosomach w połączeniu z oczyszczaniem RNA.

Translacja oczyszczania powinowactwa rybosomów (TRAP) do izolacji RNA z komórek śródbłonka in vivo

Szczegółowy protokół i trzy skrypty Pythona są dostępne do obsługi zrobotyzowanego systemu obsługi płynów o otwartym kodzie źródłowym do wykonywania półautomatycznego przygotowania próbek białek do eksperymentów spektrometrii mas, obejmujących etapy usuwania detergentów, trawienia białek i odsalania peptydów.

Zautomatyzowane przetwarzanie próbek proteomicznych typu shotgun przez robota laboratoryjnego typu open source

Ten protokół ma na celu wyizolowanie specyficznych dla typu komórki translujących rybosomalnych mRNA za pomocą mysiego modelu NuTRAP.

Izolowanie RNA specyficznych dla typu komórki z zatrzaskowo mrożonych próbek tkanek heterogenicznych bez sortowania komórek

Protokół opisuje metodę diagnostyczną SARS-CoV-2, która wykorzystuje automatyzację open-source do przeprowadzania testów molekularnych RT-qPCR próbek śliny. To skalowalne podejście może być stosowane w klinicznym nadzorze nad zdrowiem publicznym, a także w celu zwiększenia wydajności mniejszych laboratoriów uniwersyteckich.

Skuteczna ilościowa strategia diagnostyki śliny metodą PCR z odwrotną transkryptazą SARS-CoV-2 z wykorzystaniem robotów do pipetowania typu open source

Ten protokół opisuje opłacalną metodę przyspieszenia ekstrakcji DNA plazmidowego. Wykorzystując niestandardowe, drukowane 3D stojaki kompatybilne ze standardowymi wirującymi stojakami do płytek, naukowcy mogą przetwarzać jednocześnie do 48 kolumn wirujących z kołkami lub do 116 kolumn wirujących bez kołków, co znacznie skraca czas obsługi w porównaniu z ręcznymi metodami mikrowirówkowych.

Ekstrakcja DNA metodą kolumnową o średniej przepustowości z wykorzystaniem racków 24-dołkowych

Poznaj zautomatyzowaną ekstrakcję DNA z krwi obwodowej przy użyciu technologii TruTip na stacji Hamilton Star. Ta metoda zapewnia wysokiej jakości genomowe DNA bez zanieczyszczeń w aplikacjach klinicznych.

Wysokowydajna, zautomatyzowana ekstrakcja DNA i RNA z próbek klinicznych przy użyciu technologii TruTip w popularnych robotach do obsługi cieczy (Wideo) | JoVE Journal

Wysokowydajna, zautomatyzowana ekstrakcja DNA i RNA z próbek klinicznych przy użyciu technologii TruTip w popularnych robotach do obsługi cieczy

Przeglądaj więcej filmów