Wysokowydajna, zautomatyzowana ekstrakcja DNA i RNA z próbek klinicznych przy użyciu technologii TruTip w popularnych robotach do obsługi cieczy

Ogólnym celem następującego eksperymentu jest wyizolowanie ludzkiego genomowego DNA z krwi pełnej, przy użyciu technologii ekstrakcji TrueTip z wykorzystaniem stacji roboczej do obsługi cieczy Hamilton Star. Aby to osiągnąć, komórki lizuje się w roztworze składającym się z buforu do lizy próbek krwi, proteinazy K oraz etanolu; roztwór ten jest wielokrotnie zasysany i wydzielany przez końcówki TrueTip, co powoduje związanie DNA z macierzą TrueTip. Następnie przez końcówki TrueTip przepuszcza się dwa oddzielne bufory płuczące, aby usunąć pozostałe białka, bufor do lizy oraz inne zanieczyszczenia z związanych kwasów nukleinowych.

W trzecim kroku matryca wiążąca prawdziwego końcówki (true tip) jest suszona poprzez wielokrotne zasysanie i wydmuchiwanie powietrza w celu odparowania pozostałego buforu piorącego; w ostatnim kroku bufor elucyjny jest przepływany w obie strony przez matrycę wiążącą, aby uwolnić DNA z matrycy. Dzięki zastosowaniu technologii true tip ekstrahowane jest wolne od zanieczyszczeń genomowe DNA o wysokiej masie cząsteczkowej, co można potwierdzić za pomocą absorbancji UV-vis, elektroforezy żelowej oraz ilościowej PCR lub sekwencjonowania. Przewagą true tip nad innymi metodami przygotowania próbek opartymi na kolumnach wirowych lub cząsteczkach magnetycznych jest łatwość automatyzacji True Tip.

Metoda ta nie wymaga kosztownych systemów z wirówkami i pręcikami magnetycznymi, a uproszczony schemat pracy pozwala zaoszczędzić cenną przestrzeń na platformie roboczej. Choć dzisiaj skupimy się na krwi pełnej, Tru Tip może być stosowany również w innych zastosowaniach dotyczących próbek genomicznego DNA, a także w przypadku RNA wirusowego z próbek wymazów klinicznych czy izolacji wolnego DNA z osocza, wymieniając tylko kilka przykładów. Procedurę zademonstruje Dane Brady, inżynier automatyki z naszego laboratorium, który odegrał kluczową rolę w opracowaniu procedury ekstrakcji Tru Tip na stacji roboczej do manipulacji cieczami Hamilton.

W niniejszym protokole robot do obsługi cieczy Hamilton Star jednocześnie ekstrahuje DNA z 96 studzienek krwi pełnej. Robot Hamilton Star posiada opcjonalną jednostkę grzejącą z wytrząsarką na pokładzie, która jest istotna dla trawienia enzymatycznego niektórych matryc klinicznych, takich jak krew pełna. Ponieważ system może być wyposażony w 96-kanałową głowicę pipetującą, dla każdego z etapów wykorzystania końcówek oraz dla odczynników przewidziano dedykowaną płytkę 96-dołkową.

W pierwszej kolejności należy włączyć komputer oraz urządzenia towarzyszące robotowi Hamilton Star. Uruchomić oprogramowanie Hamilton Run Control. Otworzyć plik uruchamiający dostarczony przez ACON dla 96 próbek.

Teraz przygotuj układ pokładu star (star deck) zgodnie z diagramem. W wszystkich pozycjach oznaczonych numerem jeden umieść końcówki filtrowane o pojemności 1 ml; w pozycji drugiej umieść końcówki niefiltrowane o pojemności 1 ml; w pozycji trzeciej umieść końcówki Conni Hamilton 1 ml LPT 2 mm true tips. Kontynuuj korzystanie z tabeli, aby wypełnić pozostałe pozycje od 5 do 12 wymaganym sprzętem laboratoryjnym, ale nie ładuj jeszcze próbek.

Następnie należy rozdzielić odczynniki: 75 mililitrów buforu do lizy i wiązania. Bufor F powinien zostać umieszczony w pozycji korytka numer pięć. Alternatywnie, w celu usprawnienia przygotowań i uproszczenia układu pokładu, można zastosować płytki wstępnie napełnione buforami.

Kontynuuj ładowanie robota zgodnie z procedurą. Na koniec zdejmij nakrętki z probówek z krwią i umieść je w statywach na próbki lub w czwartej pozycji pokładu. Umieść próbkę 1 z tyłu najbardziej lewego statywu, a następnie kolejno wypełniaj pozostałe statywy, tak aby próbka 96 znalazła się w przedniej prawej pozycji.

Po załadowaniu wszystkich próbek należy pozwolić im osiągnąć temperaturę pokojową. Ponieważ protokół jest w pełni zautomatyzowany, istnieje niewielkie ryzyko błędu operatora. Próbki muszą zostać umieszczone w statywie w odpowiedniej kolejności, jednak w celu zapewnienia właściwego śledzenia próbek można zastosować kodowanie kreskowe.

Aby uruchomić zautomatyzowany skrypt, należy wybrać przycisk odtwarzania w lewym górnym rogu okna pliku uruchamiającego i wprowadzić liczbę przetwarzanych próbek. Pierwszym krokiem wykonywanym przez skrypt jest przeniesienie 80 µL proteinazy K do płytki inkubacyjnej znajdującej się w pozycji 14 modułu inkubatora z wytrząsaniem. Następnie skrypt dozuje 200 µL próbki do każdego dołka płytki inkubacyjnej przy użyciu ramienia ośmiokanałowego.

Następnie, przy użyciu ramienia 96-kanałowego, do każdej studzienki płytki inkubacyjnej dozuje się 600 µL buforu lizującego F. Następnie skrypt miesza roztwór przez 10 cykli i inkubuje go przez 20 minut w temperaturze 70 °C i przy 500 RPM w płytce z głębokimi studzienkami; temperatura wynosi jedynie 60 °C, co mieści się w zakresie aktywności proteinazy K. Podczas inkubacji próbek system dozowania cieczy kontynuuje pracę, dozując odczynniki do ekstrakcji i elucji z wysuwanek z odczynnikami zbiorczymi do odpowiadających im płytek 96-dołkowych; do każdej studzienki płytki z głębokimi studzienkami dodaje się 100 µL buforu elucyjnego A.

W pozycji 13 do każdego dołka płytki głębokodna nanosi się 800 µL etanolu. W pozycji 10 do każdego dołka płytki głębokodna w pozycji 12 dodaje się 1,6 mL buforu płuczącego K, a do każdego dołka płytki głębokodna w pozycji 11 dodaje się 1,6 mL buforu płuczącego J. Po 20-minutowej inkubacji mieszaninę próbki przenosi się z płytki inkubacyjnej do płytki głębokodna zawierającej etanol w pozycji 10, gdzie zostaje ona wymieszana poprzez 12 cykli pipetowania.

W trakcie całego procesu końcówki do odczynników są wyrzucane do pojemnika na odpady zgodnie z potrzebą. Program przechodzi z procesu lizy do ekstrakcji DNA, najpierw ładując 96 końcówek typu „true tips” z pozycji trzeciej platformy. Następnym krokiem jest aspiracja i dozowanie próbek z pozycji 10 w ciągu 10 cykli, co pozwala na związanie kwasów nukleinowych z monolitem końcówki „true tip”.

Następnie końcówki przenoszą się do pozycji 11, w której bufor płuczący J jest przepuszczany przez monolit pięciokrotnie w celu usunięcia pozostałości lizatu, buforu oraz matrycy próbki. Następnie końcówki przenoszą się do pozycji 12, gdzie bufor płuczący K jest przepuszczany przez nie pięciokrotnie, aby usunąć białka i inne zanieczyszczenia z związanych kwasów nukleinowych. Na koniec końcówki są suszone powietrzem poprzez 80 cykli szybkiego ruchu nad płytką do płukania.

Następnie końcówki właściwe przesuwają się do pozycji 13, gdzie bufor elucyjny przechodzi przez nie w dwóch cyklach powtórzonych pięciokrotnie, uwalniając DNA do płytki głębokodnowej. Końcówki właściwe zostają teraz wyrzucone do pojemnika na odpady. Program został zakończony.

Wyjmij płytkę elucyjną z urządzenia i przenieś wyekstrahowane próbki do odpowiednich probówek w celu przechowywania lub dalszych zastosowań. Program można również dostosować tak, aby automatycznie przenosić końcowe próbki do wybranej probówki lub płytki w ciągu zaledwie jednej godziny. Zautomatyzowany system wyekstrahował genomiczne DNA z 96 próbek krwi przy użyciu robota.

Profile absorbancji 45 dodatnich próbek krwi przetworzono jednocześnie z 45 próbkami kontrolnymi (blankami). Średni stosunek absorbancji 260 do 280 wyniósł 1,96, a średni stosunek 260 do 230 wyniósł 1,93, co sugeruje czystość próbek w żelu 1% agarose. Losowe próbki wykazały wysoką masę cząsteczkową przy minimalnym ścinaniu.

Średnia wydajność wyniosła około five µg DNA na 200 µL krwi pełnej. Podczas optymalizacji zautomatyzowanego protokołu true tip szczególną uwagę poświęca się temu, aby nie dopuścić do kontaminacji krzyżowej między dołkami. PCR w czasie rzeczywistym wykazuje wyraźne oddzielenie próbek pozytywnych od negatywnych, co przedstawiono tutaj.

W przypadku ekstrakcji RNA, pełny proces dla 96 próbek można przeprowadzić w czasie krótszym niż jedna godzina, przy minimalnym nakładzie pracy manualnej. Po obejrzeniu tego filmu powinieneś dobrze rozumieć, jak izolować ludzkie genomowe DNA z krwi pełnej przy użyciu technologii TRU Technology Automated na stacji roboczej do obsługi cieczy Hamilton Star.