Izolacja rodzimych mikroorganizmów glebowych z potencjałem do rozkładania biodegradowalnych folii ściółkowych z tworzyw sztucznych stosowanych w rolnictwie

Ogólnym celem poniższego eksperymentu jest wyizolowanie grzybów glebowych i bakterii, które kolonizują i degradują biodegradowalne folie ściółkowe. Osiąga się to poprzez pierwszą inkubację biodegradowalnych folii ściółkowych w siatkowych workach w glebie wystarczająco długo, aby umożliwić znaczną kolonizację przez rodzime mikroorganizmy glebowe. Po inkubacji ściółki są ekstrahowane i rozcieńczane, co daje pojedyncze izolowane kolonie każdego rodzaju ściśle związanego z hodowlą drobnoustroju.

Następnie wyizolowane drobnoustroje są łatane na świeżą, porażoną, biodegradowalną ściółkę, a także na płytki agarowe ze źródłem węgla lub bez. W celu porównania wzrostu, wyniki są następnie potwierdzane w płynnym podłożu. Wyniki wskazują na kolonizację i/lub degradację przez niektóre izolaty na podstawie skaningowej mikroskopii elektronowej i można je zweryfikować za pomocą chromatografii żelowej.

Nie zapominaj, że praca z niezidentyfikowanymi izolatami grzybów i bakterii może być niebezpieczna, dlatego podczas wykonywania tej procedury należy zawsze zachować środki ostrożności, takie jak noszenie rękawiczek, uszczelnianie probówek i naczyń hodowlanych oraz praca w komorze bezpieczeństwa biologicznego. Po inkubacji kawałków ściółki w glebie i przygotowaniu pożywek i odczynników zgodnie z protokołem tekstowym, pokrój nowe kawałki ściółki na 4,25 centymetra kwadratów, aby odkazić kawałki ściółki. Sterylizuj je w autoklawie, jeśli nie zmieni to ani nie zdegraduje ich na kawałki ściółki, które nie można sterylizować w autoklawie, takie jak te wykonane z tworzyw sztucznych.

Po przygotowaniu komory bezpieczeństwa biologicznego zgodnie z protokołem tekstowym, umieść kawałki ściółki w odkażonym kapturze w rzędach i inkubuj kawałki ściółki w świetle UV przez dwie godziny, używając czystych, wysterylizowanych kleszczy i zaczynając od pierwszego rzędu i pracując w kierunku tyłu, aby uniknąć kładzenia rąk i ramion na nowo odkażonych powierzchniach. Odwróć kawałki ściółki, kładąc porażoną stronę do dołu na czystym obszarze, wystawionym na działanie światła UV, ale nie mając wcześniej kontaktu ze ściółką. Po dwóch godzinach obróbki UV z każdej strony, ponownie, pracując od przodu do tyłu.

Użyj sterylnych kleszczy, aby usunąć kawałki ściółki z szafki bezpieczeństwa biologicznego i umieść je w sterylnych, suchych, pokrytych pojemnikach, takich jak zlewki pokryte folią. Przechowuj je w temperaturze pokojowej w ciemności pod sterylnym kapturem transferowym. Stosując technikę aseptyczną, połóż kawałki ściółki zainfekowane promieniowaniem UV na powierzchni płytek agarowych, najpierw opuszczając jeden róg i delikatnie, pozwalając, aby reszta kwadratu zetknęła się z agarem.

W przypadku folii nieprzepuszczalnych dla wody umieść cztery 10-mikrolitrowe krople stopionego, półstałego, minimalnego podłoża na rogach kawałków ściółki, aby zapewnić źródło wody i składników odżywczych do wstępnej kolonizacji hydrofobowych tworzyw sztucznych. Nie dotykaj powierzchni kawałków ściółki. Za pomocą końcówki do pipet krople stwardnieją w kulki.

Inkubować przykryte płytki pionowo przez noc w temperaturze pokojowej, aby zestaliły się. Następnie przechowuj płytki stroną agarową do góry w ciemności w temperaturze czterech stopni Celsjusza. Wszystkie materiały niezbędne do testów biologicznych są teraz przygotowane i możesz rozpocząć izolację potencjalnych grzybów rozkładających ściółkę z kawałków ściółki, które zostały zakopane w glebie.

Wykop worki siatkowe z gleby i usuń kawałki ściółki z worków siatkowych. Użyj sterylnej szpatułki i kleszczyków, aby delikatnie usunąć nadmiar ziemi ze ściółki, nie naruszając gleby, która przylega do powierzchni. Pokrój folię BDM na jednocentymetrowe kwadratowe kawałki, aż odzyskasz 0,5 grama materiału.

Na każdy powtórzony transfer próbki 0,5 grama kawałków ściółki i dołączonej gleby do 25 mililitrów. Probówki hodowlane zawierające 9,5 mililitra PBS dodają 0,5 grama gleby do probówek kontrolnych tylko z glebą lub do próbek, w których ściółka jest całkowicie zdegradowana, aby rozbić wszelkie biofilmy i oderwać komórki od kawałków ściółki. Wiruj rurki przez 30 sekund z dużą prędkością, a następnie poddaj je sonikacji w łaźni wodnej przez 10 minut i ponownie

Powinno to dać jednorodną zawiesinę komórek drobnoustrojów, które były związane z kawałkami ściółki. Do seryjnego rozcieńczania próbek. Przygotować jedną probówkę hodowlaną z 4,5 mililitrami sterylnego PBS i napełnić trzy dołki płytki głębokiej studzienką 450 mikrolitrami PBS na próbkę z oryginalnych probówek zawiesiny.

Przenieść 0,5 mililitra do 4,5 mililitra sterylnego PBS, aby uzyskać 5,0 razy 10 do ujemnego trzeciego rozcieńczenia po wirowaniu z dużą prędkością przez 30 sekund, dodać 50 mikrolitrów do 450 mikrolitrów PBS w 96-dołkowej mieszance płytek, delikatnie pipetując w górę iw dół 10 razy, powtarzać, aż do zakończenia rozcieńczeń do 5,0 razy 10 do ujemnej szóstki. Użyj wysterylizowanych płomieniowo giętych szklanych prętów, aby równomiernie rozprowadzić 100 mikrolitrów z każdego z rozcieńczeń na powierzchni agaru płytek PDA, które zawierają chloramfenikol, aby zahamować rozwój bakterii. Przechowuj talerze w pozycji pionowej przez 30 minut, aby płyn mógł się wchłonąć.

Następnie uszczelnij płytki paraformem, aby uniknąć ucieczki zarodników z niezidentyfikowanych izolatów. Inkubuj odwrócone płytki w temperaturze 20 stopni Celsjusza w ciemności przez pięć dni, aby umożliwić zarówno szybkim, jak i wolno rosnącym grzybom tworzenie kolonii w komorze bezpieczeństwa biologicznego. Zbadać płytki rozcieńczające dla pojedynczych izolowanych kolonii za pomocą jednej sterylnej wykałaczki.

Delikatnie dotknij kolonii, a następnie dotknij agaru z minimalnym podłożem grzybowym, minimalnym podłożem grzybowym oraz plastikiem i minimalnym podłożem glukozy w tej kolejności, aby zaszczepić kulki agaru na foliach z tworzywa sztucznego. Delikatnie potrzyj wykałaczką powierzchnię kropki agarowej, a następnie przesuń ją po plastikowej folii. Powtarzaj inokulację z tej samej kolonii źródłowej, aż będą cztery.

Powtórz smugi na każdej płytce po inkubacji płytek w temperaturze 20 stopni Celsjusza w ciemności przez pięć dni. Porównaj płytki, aby zidentyfikować izolaty, które lepiej rosną na kawałkach ściółki niż na minimalnym podłożu nie zawierającym dodatku węgla poza agarem. Są to potencjalne degradery ściółki.

Płytka GMM powinna zawierać najwięcej wzrostu, ponieważ jest to pozytywna płytka kontrolna, w której podłoże zawiera glukozę. Izolaty glebowe mogą nie być w tym momencie całkowicie czyste, więc użyj sterylnej wykałaczki, aby zeskrobać inokulum z grzyba, kolonizując ściółkę i rozprowadź ją w celu izolacji na agarze z dekstrozą ziemniaczaną, a następnie uszczelnij płytkę i inkubuj przez pięć dni. Po pięciodniowej inkubacji powstaną pojedyncze izolowane kolonie.

Potwierdź, że te nowo oczyszczone kolonie wykazują kolonizację ściółką w teście biologicznym na płytce podobną do tej, którą obserwuje się w przypadku oryginalnych, potencjalnie zanieczyszczonych izolatów. Po zidentyfikowaniu potencjalnych degradorów ściółki za pomocą testu biologicznego na płytce przy użyciu płynnego testu biologicznego w tym końcowym teście potwierdzającym, pod ściółką brakuje nawet agaru. Kawałki są naprawdę jedynym źródłem węgla do wzrostu mikroorganizmów w tym rygorystycznie przygotowanym podłożu, aby rozpocząć test od porażonego powierzchniowo kawałka ściółki do podłoża grzybowego pozbawionego innego dodanego węgla dla każdej kontrpróby izolatu drobnoustrojów.

Przygotuj trzy probówki do zaszczepienia. Jedna z nich, eksperymentalna tuba z pięcioma mililitrami minimalnej pożywki, oznaczona tutaj jako FMM, zawierająca kawałek ściółki o określonym rozmiarze. Po drugie, kontrola ujemna z pięcioma mililitrami minimalnej pożywki bez źródła węgla.

I po trzecie, kontrola pozytywna z pięcioma mililitrami glukozy zawierającej płyn. Tutaj oznaczone GMM. Dodatkowo należy przygotować probówkę z powtórzoną ilością minimalnej pożywki zawierającą każdą ściółkę, która ma być testowana, ale nie należy jej zaszczepiać.

Ta probówka kontrolna ujawni wszelkie wzrosty drobnoustrojów wynikające z zanieczyszczenia po wyhodowaniu i zebraniu świeżych zarodników. Zgodnie z protokołem tekstowym, w sterylnym kapturze transferowym należy zaszczepić wcześniej przygotowane probówki hodowlane milionem zarodników lub komórek drożdży, uszczelnić nakrętki i inkubować w ciemności bez wstrząsania w temperaturze 20 stopni Celsjusza. Obserwuj próbki co tydzień pod kątem wzrostu.

Wzrost grzybni grzybów na kawałkach ściółki może być widoczny w ciągu pierwszego tygodnia po inokulacji, szczególnie na krawędziach kawałków ściółki w przypadku drożdży planktonowych monitoruj wzrost za pomocą odczytów gęstości optycznej na 600 nanometrach, ponieważ grzyby strzępkowe mogą przyczepiać się bezpośrednio do kawałków ściółki. Oceń wzrost na oko i potwierdź za pomocą mikroskopii świetlnej i/lub skaningowej mikroskopii elektronowej w minimalnej ilości kontrolnej pożywki. Szukaj maleńkich białych flexów, które są zbyt małe, aby zarejestrować zmianę gęstości optycznej.

Z wykorzystaniem metod spektrofotometrycznych. Użyj pipety do pasty, aby zassać giętko i obserwować je za pomocą interferencji różnicowej. Mikroskopia kontrastowa po wyizolowaniu trzech potencjalnych izolatów rozkładających ściółkę w teście biologicznym na płytce zarówno z celulozowej ściółki zwanej ochroną przed chwastami, która była naszą kontrolą pozytywną, jak i z plastikowej ściółki na bazie skrobi o nazwie Biore.

Inkubowano je w płynnym teście biologicznym przez 68 dni i zbierano przed poddaniem ich skaningowej mikroskopii elektronowej. Zgodnie z oczekiwaniami. Hyphy grzybów zaobserwowano we wszystkich próbkach z wyjątkiem XX i YY, gdzie zaobserwowano komórki w kształcie pałeczek dla izolatów na naszej ściółce kontrolnej z celulozy.

Nie zaobserwowano wzrostu w kontrolach FMM, jak pokazano tutaj w kontrolach zaszczepionych przez ONZ dla ochrony przed chwastami, a resztkowe elementy tchawicy ściółki włókien pochodzenia roślinnego były wykrywalne tylko jako niewielkie ślady po wkłuciach widoczne w rzędach na niektórych włóknach, chociaż hyphy grzybów zaobserwowano we wszystkich trzech zaszczepionych próbkach naszej ściółki kontrolnej celulozy. Elementy tchawicy były wyraźnie widoczne tylko w próbkach SS, co sugeruje, że trawienie materiału celulozowego ujawniło, że zdrewniałe elementy tchawicy pod izolatem SS zostały wstępnie zidentyfikowane przy użyciu 18 s rybosomalnych, DNA jako soda mye w zamówieniach sodowych dla plastikowej ściółki na bazie skrobi. Izolaty nie zaobserwowano znaczącego wzrostu w minimalnej pożywce, tylko w grupie kontrolnej, pojedyncze białe plamki widoczne po wirowaniu w probówkach hodowlanych izolatów, VV i ZZ obserwowano przy użyciu mikroskopii kontrastowej interferencji różnicowej dla izolatu vv.

Specyfik był masą zarodników, przypuszczalnie pozostałością po początkowej inokulacji. Do izolatu zz. Masa składała się z luźnej siatki hyphy o średnicy około 0,2 milimetra, co sugeruje, że pierwotne inokulum zarodników wykiełkowało, ale nie wyrosło poza masę przedstawioną na zdjęciu.

Jak widać tutaj w zaszczepionych przez ONZ kontrolach plastikowej ściółki na bazie skrobi, obserwuje się nierówną teksturę. Tożsamość białych cech jest nieznana, ale nie ma ich w pokazanym tutaj filmie skolonizowanym przez izolat VV. Zarówno białe cząstki, jak i guzki znikają w filmie skolonizowanym przez izolat zz.

Ponadto ta ostatnia próbka wykazała równomierne występowanie szczelin w poprzek izolatów powierzchniowych BDM. VV i ZZ zostały wstępnie zidentyfikowane przy użyciu rybosomalnego DNA jako Penicillium i ACE odpowiednio w rzędzie hipo. Chociaż metoda ta może dostarczyć informacji na temat biodegradacji ściółki z tworzyw sztucznych dla przemysłu rolniczego, można ją również zastosować do każdego innego tworzywa sztucznego, którego biodegradacja w środowisku jest kwestionowana.

Na przykład tworzywa sztuczne, które mogą trafić do środowiska morskiego. Czy są one wykorzystywane w przemyśle spożywczym? Ja.