Name: Metoda izolacji wysp trzustkowych myszy i wewnątrzkomórkowego oznaczania cAMP (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-06-25T13:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 33 s
Description: Naucz się izolować wyspy trzustkowe myszy i oznaczać cAMP wewnątrzkomórkowo. Ta metoda pozwala badać funkcję komórek β i ich odpowiedź na różne zabiegi eksperymentalne w badaniach nad cukrzycą.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Chcielibyśmy podziękować Renee L. Pasker i Harpreet K. Brar za fachową pomoc techniczną w zakresie protokołów opisanych w tej pracy. Ponadto chcielibyśmy podziękować za mentoring Christophera B. Newgarda z Duke University i Alana D. Attie z University of Wisconsin-Madison, wraz ze wsparciem ich członków laboratorium, którzy zapewnili nam czas i wsparcie niezbędne do optymalizacji opisanych protokołów. W szczególności dziękujemy Hansowi Hohmeierowi, Danhong Lu i Helenie Winfield z Newgard Laboratory oraz Mary Rabaglii z Attie Laboratory za owocne dyskusje i rady. Praca ta była wspierana przez grant NIH DK080845 i Juvenile Diabetes 594 
Grant Fundacji Badawczej 17-2011-608 (dla M.E.K.)

<ol><li>Cryer, P. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hypoglycaemia%3A+the+limiting+factor+in+the+glycaemic+management+of+Type+I+and+Type+II+diabetes%5BTitle%5D)+AND+%22Diabetologia%22%5BJournal%5D)">Hypoglycaemia: the limiting factor in the glycaemic management of Type I and Type II diabetes.</a> Diabetologia. 45, 937-948 (2002).</li>
<li>Alberti, K. G., Zimmet, P. Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Definition%2C+diagnosis+and+classification+of+diabetes+mellitus+and+its+complications.+Part+1%3A+diagnosis+and+classification+of+diabetes+mellitus+provisional+report+of+a+WHO+consultation%5BTitle%5D)+AND+%22Diabet+Med%22%5BJournal%5D)">Definition, diagnosis and classification of diabetes mellitus and its complications. Part 1: diagnosis and classification of diabetes mellitus provisional report of a WHO consultation.</a> Diabet Med. 15, 539-553 (1998).</li>
<li>Muoio, D. M., Newgard, C. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanisms+of+disease%3A+molecular+and+metabolic+mechanisms+of+insulin+resistance+and+beta-cell+failure+in+type+2+diabetes%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Mol+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Mechanisms of disease: molecular and metabolic mechanisms of insulin resistance and beta-cell failure in type 2 diabetes.</a> Nat Rev Mol Cell Biol. 9, 193-205 (2008).</li>
<li>Kelly, C., McClenaghan, N. H., Flatt, P. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Role+of+islet+structure+and+cellular+interactions+in+the+control+of+insulin+secretion%5BTitle%5D)+AND+%22Islets%22%5BJournal%5D)">Role of islet structure and cellular interactions in the control of insulin secretion.</a> Islets. 3, 41-47 (2011).</li>
<li>Meda, P., Halban, P., Perrelet, A., Renold, A. E., Orci, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gap+junction+development+is+correlated+with+insulin+content+in+the+pancreatic+B+cell%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Gap junction development is correlated with insulin content in the pancreatic B cell.</a> Science. 209, 1026-1028 (1980).</li>
<li>Hohmeier, H. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+of+INS-1-derived+cell+lines+with+robust+ATP-sensitive+K%2B+channel-dependent+and+-independent+glucose-stimulated+insulin+secretion%5BTitle%5D)+AND+%22Diabetes%22%5BJournal%5D)">Isolation of INS-1-derived cell lines with robust ATP-sensitive K+ channel-dependent and -independent glucose-stimulated insulin secretion.</a> Diabetes. 49, 424-430 (2000).</li>
<li>Hohmeier, H. E., Newgard, C. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell+lines+derived+from+pancreatic+islets%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cell+Endocrinol%22%5BJournal%5D)">Cell lines derived from pancreatic islets.</a> Mol Cell Endocrinol. 228, 121-128 (2004).</li>
<li>Field, J. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Extraction+of+insulin+by+liver%5BTitle%5D)+AND+%22Annu+Rev+Med%22%5BJournal%5D)">Extraction of insulin by liver.</a> Annu Rev Med. 24, 309-314 (1973).</li>
<li>Emmanouel, D. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Glucagon+metabolism+in+the+rat%5BTitle%5D)+AND+%22J+Clin+Invest%22%5BJournal%5D)">Glucagon metabolism in the rat.</a> J Clin Invest. 62, 6-13 (1978).</li>
<li>Kimple, M. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Deletion+of+GalphaZ+protein+protects+against+diet-induced+glucose+intolerance+via+expansion+of+beta-cell+mass%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">Deletion of GalphaZ protein protects against diet-induced glucose intolerance via expansion of beta-cell mass.</a> J Biol Chem. 287, 20344-20355 (2012).</li>
<li>Rabaglia, M. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Alpha-Ketoisocaproate-induced+hypersecretion+of+insulin+by+islets+from+diabetes-susceptible+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Physiol+Endocrinol+Metab%22%5BJournal%5D)">Alpha-Ketoisocaproate-induced hypersecretion of insulin by islets from diabetes-susceptible mice.</a> Am J Physiol Endocrinol Metab. 289, 218-224 (2005).</li>
<li>Collins, S. C., Salehi, A., Eliasson, L., Olofsson, C. S., Rorsman, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Long-term+exposure+of+mouse+pancreatic+islets+to+oleate+or+palmitate+results+in+reduced+glucose+induced+somatostatin+and+oversecretion+of+glucagon%5BTitle%5D)+AND+%22Diabetologia%22%5BJournal%5D)">Long-term exposure of mouse pancreatic islets to oleate or palmitate results in reduced glucose induced somatostatin and oversecretion of glucagon.</a> Diabetologia. 51, 1689-1693 (2008).</li>
<li>Fueger, P. T., Hernandez, A. M., Chen, Y. C., Colvin, E. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Assessing+Replication+and+Beta+Cell+Function+in+Adenovirally-transduced+Isolated+Rodent+Islets%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Assessing Replication and Beta Cell Function in Adenovirally-transduced Isolated Rodent Islets.</a> J Vis Exp. , (2012).</li>
<li>Szot, G. L., Koudria, P., Bluestone, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Murine+pancreatic+islet+isolation%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Murine pancreatic islet isolation.</a> J Vis Exp. , (2007).</li>
<li>Szot, G. L., Koudria, P., Bluestone, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transplantation+of+pancreatic+islets+into+the+kidney+capsule+of+diabetic+mice%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Transplantation of pancreatic islets into the kidney capsule of diabetic mice.</a> J Vis Exp. , (2007).</li>
<li>Zmuda, E. J., Powell, C. A., Hai, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+method+for+murine+islet+isolation+and+subcapsular+kidney+transplantation%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">A method for murine islet isolation and subcapsular kidney transplantation.</a> J Vis Exp. , (2011).</li>
<li>Kimple, M. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+role+for+G%28z%29+in+pancreatic+islet+beta-cell+biology%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">A role for G(z) in pancreatic islet beta-cell biology.</a> J Biol Chem. 280, 31708-31713 (2005).</li>
<li>Shaw, J. E., Sicree, R. A., Zimmet, P. Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Global+estimates+of+the+prevalence+of+diabetes+for+2010+and+2030%5BTitle%5D)+AND+%22Diabetes+Res+Clin+Pract%22%5BJournal%5D)">Global estimates of the prevalence of diabetes for 2010 and 2030.</a> Diabetes Res Clin Pract. 87, 4-14 (2010).</li>
<li>Kirstetter, P., Lagneau, F., Lucas, O., Krupa, Y., Marty, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Role+of+endothelium+in+the+modulation+of+isoflurane-induced+vasodilatation+in+rat+thoracic+aorta%5BTitle%5D)+AND+%22Br+J+Anaesth%22%5BJournal%5D)">Role of endothelium in the modulation of isoflurane-induced vasodilatation in rat thoracic aorta.</a> Br J Anaesth. 79, 84-87 (1997).</li>
<li>Brown, E. T., Umino, Y., Loi, T., Solessio, E., Barlow, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Anesthesia+can+cause+sustained+hyperglycemia+in+C57%2FBL6J+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Vis+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Anesthesia can cause sustained hyperglycemia in C57/BL6J mice.</a> Vis Neurosci. 22, 615-618 (2005).</li>
<li>Vaupel, D. B., McCoun, D., Cone, E. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Phencyclidine+analogs+and+precursors%3A+rotarod+and+lethal+dose+studies+in+the+mouse%5BTitle%5D)+AND+%22J+Pharmacol+Exp+Ther%22%5BJournal%5D)">Phencyclidine analogs and precursors: rotarod and lethal dose studies in the mouse.</a> J Pharmacol Exp Ther. 230, 20-27 (1984).</li>
<li>Davis, D. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((FoxM1+is+up-regulated+by+obesity+and+stimulates+beta-cell+proliferation%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Endocrinol%22%5BJournal%5D)">FoxM1 is up-regulated by obesity and stimulates beta-cell proliferation.</a> Mol Endocrinol. 24, 1822-1834 (2010).</li>
<li>Dionne, K. E., Colton, C. K., Yarmush, M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effect+of+hypoxia+on+insulin+secretion+by+isolated+rat+and+canine+islets+of+Langerhans%5BTitle%5D)+AND+%22Diabetes%22%5BJournal%5D)">Effect of hypoxia on insulin secretion by isolated rat and canine islets of Langerhans.</a> Diabetes. 42, 12-21 (1993).</li>
<li>Linetsky, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Improved+human+islet+isolation+using+a+new+enzyme+blend%2C+liberase%5BTitle%5D)+AND+%22Diabetes%22%5BJournal%5D)">Improved human islet isolation using a new enzyme blend, liberase.</a> Diabetes. 46, 1120-1123 (1997).</li>
<li>Vaithilingam, V., Sundaram, G., Tuch, B. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Islet+cell+transplantation%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Opin+Organ+Transplant%22%5BJournal%5D)">Islet cell transplantation.</a> Curr Opin Organ Transplant. 13, 633-638 (2008).</li>
<li>Brandhorst, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Large-scale+comparison+of+Liberase+HI+and+collagenase+NB1+utilized+for+human+islet+isolation%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Transplant%22%5BJournal%5D)">Large-scale comparison of Liberase HI and collagenase NB1 utilized for human islet isolation.</a> Cell Transplant. 19, 3-8 (2010).</li>
</ol>

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Przewiduje się, że cukrzyca dotknie 7,7% światowej populacji, dlatego konieczne jest opracowanie nowych technik badawczych, aby zarówno zrozumieć, jak i leczyć cukrzycę18. Obecna izolacja wysp trzustkowych jest dobrze ugruntowanym protokołem stosowanym do eksperymentów in vitro i została wcześniej przedstawiona z niewielkimi modyfikacjami11,14,16. Chociaż wydzielanie insuliny jest powszechnym zastosowaniem w izolowanych wyspach trzustkowych, skupienie się na składnikach znajdujących się pow...

Ścisłe utrzymanie euglikemii jest konieczne, aby zapobiec chorobom takim jak neuropatia, nefropatia i retinopatia, które są cechami charakterystycznymi patologii niekontrolowanej cukrzycy typu 1 i 21. Zmniejszona funkcja i masa komórek β zarówno w cukrzycy typu 1, jak i 2 zaburzają stężenie glukozy we krwi2. Podczas gdy cukrzyca typu 1 o podłożu immunologicznym wynika z druzgocącej utraty komórek β produkujących insulinę, upośledzone wydzielanie insuliny przez β komórek i obwodowa sygnalizacja insuliny w cukrzycy typu 2 razem sprzyjają hiperglikemii, dyslipidemii i zwiększonej produkcji glukozy w wątrobie, co ostatecznie prowadzi zarówno do utraty masy komórek β, jak i zdolności wydzielania insuliny z poszczególnych komórek β3. Miejmy nadzieję, że zrozumienie mechanizmów leżących u podstaw β-komórkowych w progresji cukrzycy typu 1 i 2 zaowocuje nowymi terapiami w celu zapobiegania i leczenia tych chorób.
Modele hodowli tkanek in vitro, takie jak unieśmiertelnione linie komórek β INS-1 i MIN6, mogą być użytecznymi narzędziami do zrozumienia specyficznych funkcji komórek β. Jednak interakcje między różnymi typami komórek w obrębie wysepki mogą same regulować funkcję komórek β. Na przykład parakrynny wpływ glukagonu (uwalnianego z komórek α) i somatostatyny (uwalnianej z komórek δ) odpowiednio na zwiększanie i zmniejszanie wydzielania insuliny pokazuje znaczenie bliskości komórek komórkowych w odpowiedzi hormonalnej4. Co więcej, połączenia szczelinowe między komórkami β nasilają uwalnianie insuliny5. Ponadto, chociaż poczyniono postępy w generowaniu linii insulinoma, które lepiej replikowały fizjologiczną odpowiedź izolowanych wysp trzustkowych na glukozę (np. linie komórkowe 832/13 i 832/3 pochodzące z INS-1), ich reakcja na glukozę nadal różni się od normalnych wysepek szczurów6,7. Co więcej, odpowiedź tych klonalnych linii komórkowych insulinoma na agonistów glukagonopodobnego peptydu-1 (GLP-1) może się znacznie różnić od siebie, a także od normalnych wysp trzustkowych6. Dlatego unieśmiertelnione linie komórkowe mogą nie stanowić najlepszego modelu do oznaczania środków wpływających na produkcję cAMP.
W przeciwieństwie do linii komórkowych pochodzących z insulinomy, badanie funkcji komórek β wyłącznie na całych modelach zwierzęcych oferuje własny zestaw komplikacji. Jednym z największych wyzwań w pracy z tkanką endokrynną jest pomiar precyzyjnego stężenia uwalnianego hormonu. W szczególności wątroba odgrywa główną rolę w metabolizowaniu insuliny, a przepływ krwi w trzustce trafia bezpośrednio do wątroby. W związku z tym pomiar insuliny w osoczu może nie przedstawiać dokładnie ilości insuliny wydzielanej przez samą trzustkę lub wpływu różnych metod leczenia na szybkość wydzielania insuliny8. Ponadto nerkowy metabolizm glukagonu może ograniczać wiarygodność produkcji glukagonu z komórek α wysp trzustkowych9. W związku z tym wyizolowanie pierwotnych wysepek trzustkowych myszy do eksperymentów in vitro zapewnia bardziej precyzyjne zrozumienie, w jaki sposób wyspa reaguje na określone bodźce, co uzupełnia pomiary wykonane in vivo.
Obecny protokół izolacji mysich wysepek jest dobrze znanym protokołem używanym przez wiele grup (z niewielkimi modyfikacjami, które mogą pomóc w zwiększeniu sukcesu)10,11. Ponadto określenie produkcji cAMP pozwala na bezpośredni odczyt reakcji inkretynowej komórek β. W połączeniu z pomiarem cAMP, zawartość białka i wydzielanie insuliny można również określić ilościowo z tego samego preparatu próbki cAMP, co pomaga określić, czy defekt funkcji komórek β leży proksymalnie czy dystalnie w stosunku do cAMP10. Ostateczna zawartość cAMP i zastosowanie wydzielania insuliny w tym protokole może być bardzo potężnym narzędziem do zrozumienia wpływu składników farmaceutycznych i dietetycznych, między innymi, na cAMP i wydzielanie insuliny. Oprócz stymulacji samą glukozą, inne związki mogą być używane do pomiaru zmian w cAMP i wydzielaniu insuliny10,11.
Na koniec, chociaż insulina jest głównym hormonem, który badamy z izolowanych wysp trzustkowych, inne hormony, takie jak glukagon i somatostatyna, a także cytokiny, eikozanoidy i cykliczny monofosforan adenozyny, mogą być również mierzone, albo przez test przejściowej stymulacji, albo przez ilościowe określenie ich poziomów w pożywce hodowlanej12. Wreszcie, chociaż wykracza to poza zakres tego manuskryptu, izolacja wysp trzustkowych za pomocą opisanej metody izolacji kolagenazy pozwala na zachowanie wysp trzustkowych, dzięki czemu można realizować wiele innych dalszych zastosowań, takich jak przeszczep wysp trzustkowych, izolacja RNA do ilościowych analiz PCR w czasie rzeczywistym lub mikromacierzy, izolacja białek do Western blot, osadzanie wysp trzustkowych i obrazowanie immunofluorescencyjne oraz inkorporacja [3H]-tymidyny jako miara replikacji komórek wysp trzustkowych, niektóre z nich zostały opisane w poprzednich artykułachJoVE 13-16. Ogólnie rzecz biorąc, przestrzeganie procedury izolacji wysp trzustkowych opisanej w protokole może dostarczyć badaczowi ważnych i użytecznych informacji do opracowywania terapii i promowania odkrywania leków mających na celu poprawę funkcji komórek β.

<table><tbody><tr><td>Kolagenaza z Clostridium histolyticum odpowiednia do izolowania aktywnych wysepek</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C7657</td><td></td></tr><tr><td>Ficoll 400</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>F9378</td><td></td></tr><tr><td>Hanks Zrównoważony roztwór soli 10X</td><td>Invitrogen (Gibco)</td><td>14065-056</td><td></td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H3375</td><td></td></tr><tr><td>RPMI 1640 (proszek)</td><td>Invitrogen (Gibco)</td><td>31800-022</td><td></td></tr><tr><td>Albumina z surowicy bydlęcej (BSA)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A7888</td><td></td></tr><tr><td>3/0 Nić do szwów jedwabnych</td><td>Fine Science Tools</td><td>18020-30</td><td></td></tr><tr><td>Kleszcze Dumont #5</td><td>Narzędzia do nauki o naprawie</td><td>11251-10</td><td></td></tr><tr><td>Kleszcze 0,8 mm&nbsp; &nbsp;</td><td>Narzędzia do nauki</td> pięknej <td>11050-10</td><td></td></tr><tr><td>Nożyczki zakrzywione</td><td>Narzędzia do nauki o naczyniu plastycznym</td><td>14061-10</td><td></td></tr><tr><td>Vannas-T&uuml; Nożyczki sprężynowe bingen - proste/ostre/8,5 cm/5 mm Krawędź tnąca</td><td>Fine Science Tools</td><td>15003-08</td><td></td></tr><tr><td>Nożyczki preparacyjne</td><td>Fine Science Tools</td><td>14002-14</td><td></td></tr><tr><td>5 ml BD Luer-Lok Strzykawka</td><td>BD</td><td>309646</td><td></td></tr><tr><td>1 ml Strzykawka BD</td><td></td><td>309628</td><td></td></tr><tr><td>30 G BD Igła 1/2" Długość</td><td>BD</td><td>305106</td><td></td></tr><tr><td>27 G BD Igła 1/2" Długość</td><td>BD</td><td>305109</td><td></td></tr><tr><td>Kamień do ostrzenia</td><td>Fine Science Tools</td><td>29008-01</td><td></td></tr><tr><td>2-2-2-tribromoetanol</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T48402-25G</td><td></td></tr><tr><td>2-metylo-2-butanol</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>240486-100mL</td><td></td></tr><tr><td>Chlorek sodu (NaCl)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S9888</td><td></td></tr><tr><td>Chlorek potasu</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P3911</td><td></td></tr><tr><td>Fosforan monopotasowy (KH2PO4)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P0662</td><td></td></tr><tr><td>Wodorowęglan sodu (NaCHO3)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S6014</td><td></td></tr><tr><td>CaCl2&#183; 2H2O</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C3881</td><td></td></tr><tr><td>MgSO4&#183; 7H2O</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M9397</td><td></td></tr><tr><td>Penicylina-Streptomycyna</td><td>Invitrogen (Gibco)</td><td>15140-122</td><td></td></tr><tr><td>Inaktywowana termicznie płodowa surowica bydlęca (HI FBS)</td><td>Fisher Scientific</td><td>SH30088.03HI</td><td></td></tr><tr><td>3-izobutylo-1-metyloksantyna (IBMX)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>5879-100MG</td><td></td></tr></tbody></table>

metoda izolacji wysp trzustkowych myszy i wewnątrzkomórkowego oznaczania camp

A Method for Mouse Pancreatic Islet Isolation and Intracellular cAMP Determination

Niekontrolowana glikemia jest cechą charakterystyczną cukrzycy i sprzyja chorobom takim jak neuropatia, nefropatia i retinopatia. Wraz z rosnącym rozpowszechnieniem cukrzycy, zarówno typu 1 o podłożu immunologicznym, jak i typu 2 związanego z otyłością, badania mające na celu określenie patofizjologii cukrzycy i mechanizmów terapeutycznych mają kluczowe znaczenie. Komórki β wysp trzustkowych Langerhansa są odpowiedzialne za odpowiednie wydzielanie insuliny w odpowiedzi na podwyższone stężenie glukozy we krwi. Oprócz glukozy i innych składników odżywczych, komórki β są również stymulowane przez specyficzne hormony, zwane inkretynami, które są wydzielane z jelit w odpowiedzi na posiłek i działają na receptory komórek β, które zwiększają produkcję wewnątrzkomórkowego cyklicznego monofosforanu adenozyny (cAMP). Zmniejszona funkcja komórek β, masa i reaktywność inkretyn są dobrze poznane, aby przyczyniać się do patofizjologii cukrzycy typu 2, a także są coraz częściej łączone z cukrzycą typu 1. Obecny protokół izolacji mysi wysp trzustkowych i oznaczania cAMP może być narzędziem pomagającym w określeniu mechanizmów sprzyjających postępowi choroby i interwencji terapeutycznych, szczególnie tych, w których pośredniczą receptory inkretynowe lub pokrewne receptory, które działają poprzez modulację wewnątrzkomórkowej produkcji cAMP. Chociaż opisane zostaną tylko pomiary cAMP, opisany protokół izolacji wysp trzustkowych tworzy czysty preparat, który pozwala również na wiele innych dalszych zastosowań, w tym wydzielanie insuliny stymulowane glukozą, inkorporację [3H]-tymidyny, obfitość białka i ekspresję mRNA.

Aby zapewnić wysoką wydajność izolacji wysepek, należy ściśle przestrzegać technik chirurgicznych opisanych w protokole. Chociaż zaprezentowane tutaj techniki zostaną dostosowane do warunków każdego laboratorium, istnieje kilka krytycznych kroków, które prowadzą do sukcesu izolacji. W celu łatwiejszego dostępu do wspólnego przewodu żółciowego zaleca się przesunięcie organów na prawą stronę myszy (Rysunek 1). Ponadto pozwoli to na nadmuchanie trzustawki przy mniejszym oporze, ponieważ mniejsza masa tkanek...

Badanie in vitro funkcji komórek β przy użyciu izolowanych mysich wysepek Langerhansa jest ważnym elementem badań nad patofizjologią i terapią cukrzycy. Chociaż dostępnych jest wiele dalszych zastosowań, protokół ten szczegółowo opisuje pomiar wewnątrzkomórkowego cyklicznego monofosforanu adenozyny (cAMP) jako podstawowego parametru określającego funkcję komórek β.

Metoda izolacji wysp trzustkowych myszy i wewnątrzkomórkowego oznaczania cAMP

Uncontrolled glycemia is a hallmark of diabetes mellitus and promotes morbidities like neuropathy, nephropathy, and retinopathy. With the increasing ...

Ogólnym celem niniejszej procedury jest wyizolowanie zdrowych wysepek w celu pomiaru różnic w produkcji cyklicznego AMP w odpowiedzi na różne zabiegi eksperymentalne. Jest to realizowane poprzez najpierw napompowanie, a następnie usunięcie trzustki w drugim kroku. Zdrowe wysepki są izolowane poprzez serię wirowań i przemywań.Następnie żywe wycinki są przenoszone do świeżej pożywki do hodowli wycinków i inkubowane przez noc. W ostatnim kroku wycinki poddaje się wybranym zabiegom eksperymentalnym, a następnie przeprowadza analizę poziomu cyklicznego AMP. Ostatecznie, w celu pomiaru zmian w produkcji cyklicznego AMP w odpowiedzi na różne zabiegi zastosowane wobec wycinków, wykorzystuje się test immunoenzymatyczny.Zazwyczaj osoby rozpoczynające pracę z tą metodą napotykają trudności, ponieważ uzyskanie pełnego nadmuchania trzustki wymaga wprawy. Najpierw należy napełnić strzykawkę i kaniulę pięcioma mililitrami roztworu kolagenazy. Na kaniuli należy zamocować stępioną igłę o rozmiarze 30 G, a następnie umieścić zestaw strzykawka z kaniulą w lodzie.Po przesunięciu jelita cienkiego na prawą stronę myszy, należy zlokalizować zwieracz Oddiego, który znajduje się na końcu wspólnego przewodu żółciowego i rozszerza się na jelicie cienkim, tworząc biały trójkąt. Po zlokalizowaniu zwieracza, należy użyć pęsety Dumont nr 5 i wsunąć jej końcówkę pod wspólny przewód żółciowy, jak najbliżej jelita cienkiego, uważając, aby nie przebić przewodu.Po przebiciu jelita cienkiego i tkanki łącznej, użyj końcówki pęsety Dumont, aby uchwycić szew i przeciągnąć go pod wspólnym przewodem żółciowym. Podwiąż wspólny przewód żółciowy jak najbliżej zwieracza Oddiego, upewniając się, że węzeł jest mocno zaciśnięty, aby zapobiec wyciekowi. Następnie chwyć oba końce szwu i pociągnij je w stronę ogona, aby napiąć wspólny przewód żółciowy.Następnie, wolną ręką, za pomocą mikronozyciórek, wykonaj niewielkie nacięcie w przewodzie żółciowym wspólnym tuż nad ostatnim rozwidleniem prowadzącym do wątroby, trzymając oba końce nici tak, aby przewód żółciowy wspólny był napięty. Wyjmij strzykawkę i kaniulę z naczynia z lodem. Odstaw strzykawkę i wprowadź przygotowaną stępioną igłę G30 w miejsce nacięcia.Przewód żółciowy wspólny. Należy uważać, aby nie przebić ściany przewodu. Najtrudniejszym elementem jest uzyskanie pełnego nadmuchania trzustki.Używamy igły, która zapewnia szczelne zamknięcie. Jeśli pierwsza igła nie zapewnia odpowiedniej szczelności, należy użyć większej, np. igły o rozmiarze 27 G. Następnie powoli naciskamy tłok strzykawki, uwalniając ciśnienie w sposób pulsacyjny, aż do momentu napompowania pierwszej części trzustki.Następnie wywieraj delikatny, stały nacisk, aż trzustka przestanie się pompować. W przypadku prawidłowego napompowania tkanka egzokrynna będzie rozłożona równomiernie, a część trzustki znajdująca się na żołądku zostanie napompowana. Aby usunąć trzustkę, użyj pęsety w jednej ręce, by chwycić jelito cienkie w obrębie zwieracza od.Drugą ręką wprowadź zamkniętą końcówkę zakrzywionych nożyczek, aby oddzielić część trzustki od jelita cienkiego. Przesuń końcówkę wzdłuż jelita cienkiego w stronę różowej tkanki łącznej. Następnie chwyć jelito cienkie w pobliżu miejsca jego przyczepu do żołądka i odetnij trzustkę od pozostałej części jelita cienkiego.Chwyć jak największą część trzustki i delikatnie ją unieś. Za pomocą zakrzywionych nożyczek odetnij pozostałe połączenia między trzustką a jamą klatki piersiowej.Aby całkowicie usunąć trzustkę, należy umieścić każdą wyciętą trzustkę w około 2,5 ml roztworu kolagenazy. Przygotuj pojedyncze probówki stożkowe o pojemności 50 ml w lodzie do przemycia trzustek. Następnie przenieś każdą trzustkę do nowej probówki stożkowej o pojemności 50 ml zawierającej 25 ml kolagenazy.Następnie umieść probówki stożkowe o pojemności 50 ml zawierające trzustkę w pozycji pionowej w shakingowej kąpieli wodnej o temperaturze 37 °C, zdolnej do oscylacji z prędkością 220 do 250 RPM, przy wyłączonym wstrząsaniu. Teraz nasyć każdą probówkę stożkową o pojemności 50 ml mieszaniną 95% oxygen i 5% carbon dioxide przez pięć minut.Za pomocą pipety Pasteura szczelnie zakręć każdą probówkę, a następnie umieść je poziomo w wstrząsowej łaźni wodnej pod powierzchnią wody. Począwszy od szóstej minuty, wstrząsaj probówkami z prędkością 220 do 250 RPM przez 20 sekund co drugą minutę, przez maksymalnie 16 minut. Po wstrząsaniu odwiruj probówki z prędkością 400 do 500 Gs w temperaturze pokojowej, wyłączając wirówkę natychmiast po osiągnięciu pełnej prędkości.Następnie, nie naruszając osadu, za pomocą pułapki próżniowej odessaj około 22,5 mililitrów roztworu kolagenazy z każdej probówki. Po tym resuspenduuj osady w 12,5 mililitrach HBSS i delikatnie wymieszaj probówki w wortexie, aby rozbić osady. Po przemyciu i wymieszaniu komórek w dodatkowym HBSS, przelej każdą zawiesinę komórkową przez sito o oczkach 1000 mikronów do nowych, oddzielnych probówek stożkowych o pojemności 50 mililitrów.Następnie, po ponownym odwirowaniu zawiesin komórkowych, należy za pomocą pułapki próżniowej ostrożnie odessać cały HBSS, tak aby nie naruszyć osadu. Po usunięciu całego HBSS do każdej probówki należy dodać 4,8 milliliters roztworu 25%F. Po wymieszaniu w wortexie w celu rozbicia osadu, należy ostrożnie nalać 2,4 milliliters roztworu 23%20,5% oraz 11%fial wzdłuż ścianki, obracając 50 milliliter conical tube.Aby zapewnić równomierne warstwowanie po odwirowaniu roztworu FI call, przelej cały roztwór FI call do nowej probówki stożkowej o pojemności 50 mililitrów, uważając, aby nie przenieść osadu tkanki egzokrynowej. Do nowej probówki dolej lodowaty HBSS do poziomu 50 mililitrów. Następnie zamknij probówkę i odwróć ją cztery do sześciu razy.Aby wymieszać FI call i HBSS. Użyj pułapki próżniowej, aby ostrożnie odessać większość mieszaniny z fiolki HBSS, nie naruszając luźnego osadu. Następnie przenieś osad do nowej probówki.Za pomocą pipety Pasteura przenieść oczka do szalki Petriego zawierającej pożywkę do hodowli oczek, dbając o to, aby nie przenieść resztek tkanek ASIN. Umieścić szalkę Petriego pod mikroskopem stereoskopowym z oświetleniem dolnym.Zdrowe oczka będą miały kształt sferyczny i złoto-brązowe lub ciemnobrązowe centrum. Wszystkie oczka połączone z ASIN lub tkanką, które będą wyglądać na matowe i szare, nie powinny być używane i należy je odrzucić. Ponadto należy odrzucić większe oczka, które po inkubacji przez noc rozwiną ciemne, nekrotyczne centrum, ponieważ nie funkcjonują one prawidłowo.Jeśli preparat z oczkami zawiera dużą ilość zanieczyszczeń, należy dwukrotnie przenieść oczka ręcznie do świeżego medium; do buforu trawiennego należy dodać DNA, aby pomóc ograniczyć zlepianie się oczek. Krok ten należy rozpocząć od zgromadzenia oczek w środkowej części szalki Petriego. Za pomocą pipety P 20 przenieść oczka do nowej polistyrenowej szalki Petriego o wymiarach 15 mm na 60 mm, zawierającej 5 mL roztworu do preinkubacji, aby wypłukać z oczek pożywkę hodowlaną zawierającą glukozę.Następnie za pomocą pipety P 20 przenieś co najmniej 13 pierścieni do poszczególnych probówek do mikrocentryfugi zawierających jeden mililitr świeżo napowietrzonego buforu Krebsa-Ringera z wodorowęglanami, dbając o spójność wielkości pierścieni pomiędzy probówkami. Po inkubacji próbek w temperaturze 37 °C i 5% CO2 przez 45 minut zakręć probówki, szybko wymieszaj je w wstrząsarce vorteksowej i odwiruj w wirówce stołowej w temperaturze pokojowej przy przeciążeniu od 7 000 do 7 500 ×g. Jeśli planowana jest dalsza analiza insuliny lub innego metabolitu, pobierz za pomocą pipety P 1000 alikwot medium do probówki do mikrocentryfugi. Jeśli medium stymulujące nie jest gromadzone, można je wylać.Za pomocą pipety P 1000 usuń większość roztworu Krebsa z każdej probówki typu micro fuge, pozostawiając około 10 do 15 µL roztworu Krebsa na osadzie z gałek ocznych. Następnie za pomocą pipety P 20 usuń część cieczy znajdującą się najbliżej osadu. Gdy w probówce pozostanie mniej niż 10 do 15 µL roztworu Krebsa, zamroź szybko osady z gałek ocznych w ciekłym azocie.Następnie mrożone szybkim mrożeniem granulkami należy przechowywać w temperaturze -80°C do momentu pomiaru poziomu cyklicznego AMP. Zazwyczaj wpływ danej substancji na produkcję cyklicznego AMP bezpośrednio koreluje z jej wpływem na wydzielanie insuliny. W tym doświadczeniu izolowane wysepki z myszy typu dzikiego lub z myszy z nokautem genu stymulowano 11,1 mM glukozy i wewnątrzkomórkowym cyklicznym.Produkcję cAMP zmierzono i znormalizowano do całkowitej ilości białka komórkowego. Wydzielaną insulinę zmierzono przy użyciu standardowego testu ELISA dla insuliny, a następnie również znormalizowano do całkowitej ilości białka komórkowego. Zgodnie z oczekiwaniami, zmiana produkcji cAMP korelowała bezpośrednio ze zwiększeniem stymulowanego glukozą wydzielania insuliny.Po obejrzeniu tego filmu powinieneś być w stanie wyizolować hodowlę i zmierzyć poziomy cAMP i cGMP w zdrowych wyrostkach oka myszy.

a-method-for-mouse-pancreatic-islet-isolation-intracellular-camp

Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

Metoda izolowania wysepek trzustkowych myszy i oznaczania cAMP wewnątrzkomórkowego

Poniższy protokół przedstawia proces wycinania trzustki do obrazowania wirtualnych przekrojów oraz następującą po nim kwantyfikację wszystkich komórek beta znakowanych GFP w całej trzustce.

Ilościowe oznaczanie masy komórek beta trzustki u myszy in situ

Szczegółowy opis izolacji wysepek trzustkowych myszy został przedstawiony z wykorzystaniem techniki kanulacji przewodu trzustkowego in situ oraz perfuzji mieszaniną oczyszczonej kolagenazy i proteazy neutralnej.

Izolacja wysepek Langerhansa myszy z wykorzystaniem kombinacji oczyszczonej kolagenazy i proteazy neutralnej

Wyspy trzustkowe, zwane również wysepkami Langerhansa, to skupisko komórek endokrynnych, które produkują hormony do regulacji poziomu glukozy i innych ważnych funkcji biologicznych. Ten protokół wyjaśnia metodę izolowania wysp trzustkowych poprzez najpierw perfuzję kolagenazy przez Ampulla Vatera w celu trawienia zewnątrzwydzielniczej tkanki trzustki i uproszczone wirowanie gradientu gęstości w celu oczyszczenia wysp trzustkowych od myszy.

Izolacja wysp trzustkowych poprzez perfuzję kolagenazy: enzymatyczna metoda izolowania komórek wysp trzustkowych

Prezentujemy tutaj protokół izolacji wysp trzustkowych z mysiego modelu cukrzycy typu 2, Leprdb oraz szczegóły testu żywych komórek do pomiaru wydzielania insuliny z nienaruszonych wysp trzustkowych, który wykorzystuje mikroskopię 2-fotonową.

Mysi model cukrzycy typu 2 Leprdb: izolacja wysp trzustkowych i obrazowanie 2-fotonowe żywych komórek nienaruszonych wysp trzustkowych

Ten protokół izolacji wysp opisał nową drogę wstrzykiwania kolagenazy w celu trawienia tkanki zewnątrzwydzielniczej oraz uproszczoną procedurę gradientu do oczyszczania wysp trzustkowych z myszy. Obejmuje trawienie enzymatyczne, gradientową separację/oczyszczanie i ręczne zbieranie wysepek. Udana izolacja może dać 250–350 wysokiej jakości i w pełni funkcjonalnych wysepek na mysz.

Prosty protokół o wysokiej skuteczności izolacji wysp trzustkowych od myszy

Tutaj prezentujemy protokół izolacji komórek wysp trzustkowych myszy w celu badania indukcji ROS przez ksenobiotyki w celu zidentyfikowania potencjalnych cukrzycopochodnych ksenobiotycznych substancji chemicznych.

Badania przesiewowe oparte na komórkach wysp trzustkowych trzustki pod kątem cukrzycopochodnych substancji chemicznych

Opisujemy metodę izolacji komórek endokrynnych z embrionalnej, noworodkowej i postnatalnej trzustki, a następnie sekwencjonowania RNA pojedynczych komórek. Metoda ta pozwala na analizę rozwoju linii endokrynnej trzustki, heterogeniczności komórek i dynamiki transkryptomicznej.

Jednokomórkowe analizy transkryptomiczne komórek endokrynnych trzustki myszy

Tutaj prezentujemy protokół obrazowania i ilościowego oznaczania dynamiki wapnia w heterogenicznych populacjach komórek, takich jak komórki wysp trzustkowych. Reportery fluorescencyjne są dostarczane do obwodowej warstwy komórek w obrębie wyspy trzustkowej, która jest następnie unieruchamiana i obrazowana, a także przeprowadzana jest analiza dynamiki intensywności fluorescencji dla poszczególnych komórek.

Obrazowanie dynamiki wapnia w subpopulacjach komórek wysp trzustkowych myszy

Ten protokół opisuje izolację komórek śródbłonka myszy z całej trzustki.

Izolacja komórek śródbłonka trzustki myszy

To badanie wykorzystuje wielobarwne markery fluorescencji śmierci komórki i apoptozy w połączeniu z mikroskopią konfokalną do oceny apoptozy wywołanej cytokinami i śmierci specyficznej dla komórek β w wyspach trzustkowych. Ujawnia przestrzenne i czasowe zmiany w śmierci komórki i apoptozie w odpowiedzi na bodźce zewnątrzkomórkowe.

Leczenie izolowanych wysp trzustkowych i pomiar apoptozy

Badanie to opracowało uproszczoną metodę efektywnego wyodrębniania funkcjonalnych wysetek pierwotnych i komórek acynarnych z trzustki myszy, co stanowi cenne narzędzie do badania komunikacji międzykomórkowej w patogenezie ostrej cukrzycy indukowanej zapaleniem trzustki.

Prosta i szybka metoda jednoczesnej izolacji pierwotnych wysp i pierwotnych komórek acinowych trzustki od myszy

Naucz się izolować wyspy trzustkowe myszy i oznaczać cAMP wewnątrzkomórkowo. Ta metoda pozwala badać funkcję komórek β i ich odpowiedź na różne zabiegi eksperymentalne w badaniach nad cukrzycą.

Metoda izolacji wysp trzustkowych myszy i wewnątrzkomórkowego oznaczania cAMP

Przeglądaj więcej filmów