Metoda izolacji wysp trzustkowych myszy i wewnątrzkomórkowego oznaczania cAMP

Ogólnym celem niniejszej procedury jest wyizolowanie zdrowych wysepek w celu pomiaru różnic w produkcji cyklicznego AMP w odpowiedzi na różne zabiegi eksperymentalne. Jest to realizowane poprzez najpierw napompowanie, a następnie usunięcie trzustki w drugim kroku. Zdrowe wysepki są izolowane poprzez serię wirowań i przemywań.

Następnie żywe wycinki są przenoszone do świeżej pożywki do hodowli wycinków i inkubowane przez noc. W ostatnim kroku wycinki poddaje się wybranym zabiegom eksperymentalnym, a następnie przeprowadza analizę poziomu cyklicznego AMP. Ostatecznie, w celu pomiaru zmian w produkcji cyklicznego AMP w odpowiedzi na różne zabiegi zastosowane wobec wycinków, wykorzystuje się test immunoenzymatyczny.

Zazwyczaj osoby rozpoczynające pracę z tą metodą napotykają trudności, ponieważ uzyskanie pełnego nadmuchania trzustki wymaga wprawy. Najpierw należy napełnić strzykawkę i kaniulę pięcioma mililitrami roztworu kolagenazy. Na kaniuli należy zamocować stępioną igłę o rozmiarze 30 G, a następnie umieścić zestaw strzykawka z kaniulą w lodzie.

Po przesunięciu jelita cienkiego na prawą stronę myszy, należy zlokalizować zwieracz Oddiego, który znajduje się na końcu wspólnego przewodu żółciowego i rozszerza się na jelicie cienkim, tworząc biały trójkąt. Po zlokalizowaniu zwieracza, należy użyć pęsety Dumont nr 5 i wsunąć jej końcówkę pod wspólny przewód żółciowy, jak najbliżej jelita cienkiego, uważając, aby nie przebić przewodu.

Po przebiciu jelita cienkiego i tkanki łącznej, użyj końcówki pęsety Dumont, aby uchwycić szew i przeciągnąć go pod wspólnym przewodem żółciowym. Podwiąż wspólny przewód żółciowy jak najbliżej zwieracza Oddiego, upewniając się, że węzeł jest mocno zaciśnięty, aby zapobiec wyciekowi. Następnie chwyć oba końce szwu i pociągnij je w stronę ogona, aby napiąć wspólny przewód żółciowy.

Następnie, wolną ręką, za pomocą mikronozyciórek, wykonaj niewielkie nacięcie w przewodzie żółciowym wspólnym tuż nad ostatnim rozwidleniem prowadzącym do wątroby, trzymając oba końce nici tak, aby przewód żółciowy wspólny był napięty. Wyjmij strzykawkę i kaniulę z naczynia z lodem. Odstaw strzykawkę i wprowadź przygotowaną stępioną igłę G30 w miejsce nacięcia.

Przewód żółciowy wspólny. Należy uważać, aby nie przebić ściany przewodu. Najtrudniejszym elementem jest uzyskanie pełnego nadmuchania trzustki.

Używamy igły, która zapewnia szczelne zamknięcie. Jeśli pierwsza igła nie zapewnia odpowiedniej szczelności, należy użyć większej, np. igły o rozmiarze 27 G. Następnie powoli naciskamy tłok strzykawki, uwalniając ciśnienie w sposób pulsacyjny, aż do momentu napompowania pierwszej części trzustki.

Następnie wywieraj delikatny, stały nacisk, aż trzustka przestanie się pompować. W przypadku prawidłowego napompowania tkanka egzokrynna będzie rozłożona równomiernie, a część trzustki znajdująca się na żołądku zostanie napompowana. Aby usunąć trzustkę, użyj pęsety w jednej ręce, by chwycić jelito cienkie w obrębie zwieracza od.

Drugą ręką wprowadź zamkniętą końcówkę zakrzywionych nożyczek, aby oddzielić część trzustki od jelita cienkiego. Przesuń końcówkę wzdłuż jelita cienkiego w stronę różowej tkanki łącznej. Następnie chwyć jelito cienkie w pobliżu miejsca jego przyczepu do żołądka i odetnij trzustkę od pozostałej części jelita cienkiego.

Chwyć jak największą część trzustki i delikatnie ją unieś. Za pomocą zakrzywionych nożyczek odetnij pozostałe połączenia między trzustką a jamą klatki piersiowej.

Aby całkowicie usunąć trzustkę, należy umieścić każdą wyciętą trzustkę w około 2,5 ml roztworu kolagenazy. Przygotuj pojedyncze probówki stożkowe o pojemności 50 ml w lodzie do przemycia trzustek. Następnie przenieś każdą trzustkę do nowej probówki stożkowej o pojemności 50 ml zawierającej 25 ml kolagenazy.

Następnie umieść probówki stożkowe o pojemności 50 ml zawierające trzustkę w pozycji pionowej w shakingowej kąpieli wodnej o temperaturze 37 °C, zdolnej do oscylacji z prędkością 220 do 250 RPM, przy wyłączonym wstrząsaniu. Teraz nasyć każdą probówkę stożkową o pojemności 50 ml mieszaniną 95% oxygen i 5% carbon dioxide przez pięć minut.

Za pomocą pipety Pasteura szczelnie zakręć każdą probówkę, a następnie umieść je poziomo w wstrząsowej łaźni wodnej pod powierzchnią wody. Począwszy od szóstej minuty, wstrząsaj probówkami z prędkością 220 do 250 RPM przez 20 sekund co drugą minutę, przez maksymalnie 16 minut. Po wstrząsaniu odwiruj probówki z prędkością 400 do 500 Gs w temperaturze pokojowej, wyłączając wirówkę natychmiast po osiągnięciu pełnej prędkości.

Następnie, nie naruszając osadu, za pomocą pułapki próżniowej odessaj około 22,5 mililitrów roztworu kolagenazy z każdej probówki. Po tym resuspenduuj osady w 12,5 mililitrach HBSS i delikatnie wymieszaj probówki w wortexie, aby rozbić osady. Po przemyciu i wymieszaniu komórek w dodatkowym HBSS, przelej każdą zawiesinę komórkową przez sito o oczkach 1000 mikronów do nowych, oddzielnych probówek stożkowych o pojemności 50 mililitrów.

Następnie, po ponownym odwirowaniu zawiesin komórkowych, należy za pomocą pułapki próżniowej ostrożnie odessać cały HBSS, tak aby nie naruszyć osadu. Po usunięciu całego HBSS do każdej probówki należy dodać 4,8 milliliters roztworu 25%F. Po wymieszaniu w wortexie w celu rozbicia osadu, należy ostrożnie nalać 2,4 milliliters roztworu 23%20,5% oraz 11%fial wzdłuż ścianki, obracając 50 milliliter conical tube.

Aby zapewnić równomierne warstwowanie po odwirowaniu roztworu FI call, przelej cały roztwór FI call do nowej probówki stożkowej o pojemności 50 mililitrów, uważając, aby nie przenieść osadu tkanki egzokrynowej. Do nowej probówki dolej lodowaty HBSS do poziomu 50 mililitrów. Następnie zamknij probówkę i odwróć ją cztery do sześciu razy.

Aby wymieszać FI call i HBSS. Użyj pułapki próżniowej, aby ostrożnie odessać większość mieszaniny z fiolki HBSS, nie naruszając luźnego osadu. Następnie przenieś osad do nowej probówki.

Za pomocą pipety Pasteura przenieść oczka do szalki Petriego zawierającej pożywkę do hodowli oczek, dbając o to, aby nie przenieść resztek tkanek ASIN. Umieścić szalkę Petriego pod mikroskopem stereoskopowym z oświetleniem dolnym.

Zdrowe oczka będą miały kształt sferyczny i złoto-brązowe lub ciemnobrązowe centrum. Wszystkie oczka połączone z ASIN lub tkanką, które będą wyglądać na matowe i szare, nie powinny być używane i należy je odrzucić. Ponadto należy odrzucić większe oczka, które po inkubacji przez noc rozwiną ciemne, nekrotyczne centrum, ponieważ nie funkcjonują one prawidłowo.

Jeśli preparat z oczkami zawiera dużą ilość zanieczyszczeń, należy dwukrotnie przenieść oczka ręcznie do świeżego medium; do buforu trawiennego należy dodać DNA, aby pomóc ograniczyć zlepianie się oczek. Krok ten należy rozpocząć od zgromadzenia oczek w środkowej części szalki Petriego. Za pomocą pipety P 20 przenieść oczka do nowej polistyrenowej szalki Petriego o wymiarach 15 mm na 60 mm, zawierającej 5 mL roztworu do preinkubacji, aby wypłukać z oczek pożywkę hodowlaną zawierającą glukozę.

Następnie za pomocą pipety P 20 przenieś co najmniej 13 pierścieni do poszczególnych probówek do mikrocentryfugi zawierających jeden mililitr świeżo napowietrzonego buforu Krebsa-Ringera z wodorowęglanami, dbając o spójność wielkości pierścieni pomiędzy probówkami. Po inkubacji próbek w temperaturze 37 °C i 5% CO2 przez 45 minut zakręć probówki, szybko wymieszaj je w wstrząsarce vorteksowej i odwiruj w wirówce stołowej w temperaturze pokojowej przy przeciążeniu od 7 000 do 7 500 ×g. Jeśli planowana jest dalsza analiza insuliny lub innego metabolitu, pobierz za pomocą pipety P 1000 alikwot medium do probówki do mikrocentryfugi. Jeśli medium stymulujące nie jest gromadzone, można je wylać.

Za pomocą pipety P 1000 usuń większość roztworu Krebsa z każdej probówki typu micro fuge, pozostawiając około 10 do 15 µL roztworu Krebsa na osadzie z gałek ocznych. Następnie za pomocą pipety P 20 usuń część cieczy znajdującą się najbliżej osadu. Gdy w probówce pozostanie mniej niż 10 do 15 µL roztworu Krebsa, zamroź szybko osady z gałek ocznych w ciekłym azocie.

Następnie mrożone szybkim mrożeniem granulkami należy przechowywać w temperaturze -80°C do momentu pomiaru poziomu cyklicznego AMP. Zazwyczaj wpływ danej substancji na produkcję cyklicznego AMP bezpośrednio koreluje z jej wpływem na wydzielanie insuliny. W tym doświadczeniu izolowane wysepki z myszy typu dzikiego lub z myszy z nokautem genu stymulowano 11,1 mM glukozy i wewnątrzkomórkowym cyklicznym.

Produkcję cAMP zmierzono i znormalizowano do całkowitej ilości białka komórkowego. Wydzielaną insulinę zmierzono przy użyciu standardowego testu ELISA dla insuliny, a następnie również znormalizowano do całkowitej ilości białka komórkowego. Zgodnie z oczekiwaniami, zmiana produkcji cAMP korelowała bezpośrednio ze zwiększeniem stymulowanego glukozą wydzielania insuliny.

Po obejrzeniu tego filmu powinieneś być w stanie wyizolować hodowlę i zmierzyć poziomy cAMP i cGMP w zdrowych wyrostkach oka myszy.