Wprowadzenie do spektrofotometru

Spektrofotometr jest powszechnie używanym instrumentem w badaniach biologicznych, chemicznych, klinicznych i środowiskowych.

Spektrofotometria to ilościowy pomiar stopnia pochłaniania światła przez substancję chemiczną, przeprowadzany poprzez przepuszczenie wiązki światła przez próbkę za pomocą spektrofotometru.

Dzięki pomiarowi natężenia wykrytego światła metodę tę można wykorzystać do oznaczenia stężenia substancji rozpuszczonej w próbce.

Wiązka światła kierowana na próbkę składa się ze strumienia fotonów.

Gdy fotony napotykają cząsteczki w próbce, cząsteczki te mogą pochłonąć część z nich, co zmniejsza liczbę fotonów w wiązce światła i obniża intensywność wykrywanego sygnału.

Transmitancja to ułamek światła, który przenika przez próbkę, definiowany jako stosunek intensywności światła przechodzącego przez próbkę do intensywności światła padającego. Absorbancja jest odwrotnością logarytmu transmitancji i jest wartością mierzoną przez spektrofotometr.

Na podstawie absorbancji można wyznaczyć stężenie roztworu próbki zgodnie z prawem Beera-Lamberta, które mówi, że między absorbancją a stężeniem próbki zachodzi zależność liniowa. Według prawa Beera-Lamberta absorbancja jest iloczynem współczynnika ekstynkcji (miary tego, jak silnie substancja rozpuszczona pochłania światło przy danej długości fali), drogi optycznej, czyli długości odcinka, przez który światło przechodzi przez próbkę, oraz stężenia substancji rozpuszczonej. Często celem pomiarów absorbancji jest właśnie oznaczenie stężenia próbki.

Każdy spektrofotometr składa się ze źródła światła, kolimatora, który jest soczewką lub urządzeniem skupiającym przesyłającym intensywną, równoległą wiązkę światła, monochromatora służącego do rozszczepienia wiązki światła na poszczególne długości fal oraz selektora długości fali, czyli szczeliny, służącej do wyboru pożądanej długości fali. Długości fal światła wykorzystywane w spektrofotometrach omówionych w tym filmie znajdują się w zakresie ultrafioletu i światła widzialnego. Spektrofotometr zawiera również uchwyt na próbkę, detektor fotoelektryczny, który wykrywa liczbę pochłoniętych fotonów, oraz ekran do wyświetlania wyników z detektora.

Nowsze spektrofotometry są bezpośrednio podłączone do komputera, za pomocą którego można kontrolować parametry eksperymentu i wyświetlać wyniki.

Podczas przeprowadzania spektrofotometrii należy zachować odpowiednie środki ostrożności, takie jak noszenie rękawiczek, w zależności od rodzaju stosowanych roztworów biologicznych lub chemicznych.

Przed pomiarem widma UV-Vis próbki należy włączyć urządzenie i odczekać do rozgrzania się lamp oraz układów elektronicznych.

Należy przygotować próbkę ślepą składającą się z tego samego roztworu, lecz bez analizowanego związku, o tym samym pH i zbliżonej sile jonowej; jest to krok niezbędny, ponieważ kuweta i rozpuszczalnik mogą rozpraszać światło.

Tradycyjne uchwyty na próbki w spektrofotometrach są zaprojektowane do trzymania kuwet plastikowych i kwarcowych. Należy pipetować roztwór ślepy do kuwety.

Po wytarciu odcisków palców i ewentualnych zachlapań z zewnętrznych ścianek kuwety, należy prawidłowo umieścić ją w uchwycie i zamknąć drzwiczki komory pomiarowej.

Nigdy nie zapominaj o zamykaniu drzwiczek, ponieważ promieniowanie UV emitowane przez otwarty spektrofotometr może uszkodzić oczy i skórę.

Ustaw pożądaną długość fali lub zakres długości fal, które mają przejść przez próbkę, co zależy od optymalnej długości fali światła absorbowanej przez analizowany związek. Następnie należy wyzerować instrument, dokonując pomiaru próbki ślepej, co pozwoli odjąć tło buforu próbki od wyniku.

W zależności od rodzaju przeprowadzanego eksperymentu spektrofotometrycznego może być konieczne sporządzenie krzywej wzorcowej przed pomiarem próbki, na podstawie której można będzie ostatecznie określić stężenie analizowanego związku w próbce.

Należy doprowadzić próbkę do odpowiedniej temperatury i delikatnie ją wymieszać, aby nie wprowadzić pęcherzyków powietrza. Próbkę można następnie dodać bezpośrednio do kuwety wewnątrz instrumentu i dokonać pomiaru.

Po przeprowadzeniu pomiaru absorbancji próbki należy przejść do odpowiednich obliczeń dla danego eksperymentu, np. oznaczenia stężenia lub szybkości aktywności enzymatycznej.

Spektrofotometr jest codziennie wykorzystywany w wielu laboratoriach badawczych zajmujących się biologią.

Jednym z powszechnych zastosowań spektrofotometru jest pomiar gęstości komórek. Pomiar gęstości komórek jest przydatny przy tworzeniu krzywych wzrostu logarytmicznego bakterii, na podstawie których można wyznaczyć optymalny czas indukcji białka rekombinowanego.

Spektrofotometr może być również używany do pomiaru szybkości reakcji chemicznych. W tym przykładzie absorbancja służy do monitorowania reakcji enzymatycznej poprzez obserwację zanikania produktu pośredniego reakcji przy 452 nm w czasie. Szybkość tego etapu enzymatycznego można obliczyć, dopasowując dane do odpowiedniego równania.

Wprowadzenie spektrofotometrów mikropojemnościowych wyeliminowało konieczność stosowania uchwytów na próbki. Takie spektrofotometry wykorzystują napięcie powierzchniowe do utrzymania próbki.

Spektrofotometry mikropojemnościowe są optymalne do pomiaru jakości i stężenia cennych próbek o ograniczonej objętości, takich jak biomolekuły, w tym białka i kwasy nukleinowe.

Absorbancja białka przy 280 nm zależy od zawartości aromatycznych łańcuchów bocznych występujących w tryptofanie, tyrozynie i fenyloalaninie, a także od obecności mostków disiarczkowych cystyna-cystyna.

Stężenie białka można wyznaczyć na podstawie jego absorbancji przy 280 nm oraz współczynnika ekstynkcji, który wynika ze składu aminokwasowego.

Zarówno DNA, jak i RNA wykazują maksimum absorbancji przy 260 nm, na podstawie którego można wyznaczyć ich stężenie. Czystość kwasu nukleinowego można również ocenić na podstawie stosunku odczytów absorbancji przy określonych długościach fal.

Właśnie obejrzeli Państwo wprowadzenie JoVE do spektrofotometru.

W tym filmie omówiliśmy podstawowe zasady, w tym pojęcia związane ze spektrofotometrią oraz komponenty spektrofotometru. Przedstawiliśmy również krok po kroku obsługę spektrofotometru i omówiliśmy jego zastosowanie w badaniach biologicznych. Dziękujemy za uwagę.