Wprowadzenie do spektrofotometru

Spektrofotometr jest powszechnie stosowanym instrumentem w badaniach biologicznych, chemicznych, klinicznych i środowiskowych.

Spektrofotometria to ilościowy pomiar stopnia pochłaniania światła przez substancję chemiczną poprzez przepuszczanie wiązki światła przez próbkę za pomocą spektrofotometru.

Mierząc natężenie wykrytego światła, metodę tę można wykorzystać do określenia stężenia substancji rozpuszczonej w próbce.

Wiązka światła, która jest wypromieniowywana w kierunku próbki, składa się ze strumienia fotonów.

Kiedy fotony napotykają cząsteczki w próbce, cząsteczki mogą wchłonąć część z nich, zmniejszając liczbę fotonów w wiązce światła i zmniejszając intensywność wykrywanego sygnału.

Przepuszczalność to ułamek światła, który przechodzi przez próbkę i jest definiowany jako natężenie światła przechodzącego przez próbkę w stosunku do natężenia padającego światła. Absorbancja jest odwrotnym logarytmem transmitancji i jest wielkością, którą zmierzy spektrofotometr.

Na podstawie absorbancji stężenie roztworu próbki można określić na podstawie prawa Beera-Lamberta, które mówi, że istnieje liniowa zależność między absorbancją a stężeniem próbki. Zgodnie z prawem Beera-Lamberta absorbancja jest iloczynem współczynnika ekstynkcji, miary tego, jak silnie substancja rozpuszczona pochłania światło o danej długości fali, długości, na jaką światło przechodzi przez próbkę lub długości ścieżki, oraz stężenia substancji rozpuszczonej. Często celem pomiarów absorbancji jest pomiar stężenia próbki.

Każdy spektrofotometr zawiera źródło światła, kolimator, który jest soczewką lub urządzeniem skupiającym, które przepuszcza intensywną prostą wiązkę światła, monochromator do rozdzielania wiązki światła na składowe długości fal oraz selektor długości fali lub szczelinę do wyboru żądanej długości fali. Długości fal światła używanego w spektrofotometrach omówionych w tym filmie mieszczą się w zakresie ultrafioletu i światła widzialnego. Spektrofotometr zawiera również pewnego rodzaju uchwyt na próbkę, detektor fotoelektryczny, który wykrywa ilość pochłoniętych fotonów, oraz ekran do wyświetlania wyjścia detektora.

Nowsze spektrofotometry są bezpośrednio sprzężone z komputerem, gdzie można kontrolować parametry eksperymentu i wyświetlać wyniki.

Podczas wykonywania spektrofotometrii należy podjąć odpowiednie środki ostrożności, takie jak noszenie rękawiczek, w zależności od rodzaju roztworów biologicznych lub chemicznych, z którymi pracujesz.

Przed pomiarem widma widzialnego UV próbki włącz maszynę i pozwól lampom i elektronice się rozgrzać.

Przygotować ślepą próbę tego samego roztworu, ale bez analitu, o tym samym pH i podobnej sile jonowej; Jest to niezbędny krok, ponieważ ogniwo i rozpuszczalnik mogą rozpraszać trochę światła.

Tradycyjne uchwyty na próbki spektrofotometru są przeznaczone do przechowywania kuwet plastikowych i kwarcowych. Przystąpić do pipetowania ślepej próby roztworu do kuwety.

Po wytarciu wszelkich odcisków palców i rozlanych płynów z zewnętrznej części kuwety, prawidłowo włóż kuwetę do uchwytu próbki i zamknij drzwiczki komory kuwety.

Nigdy nie zapomnij zamknąć drzwi, ponieważ promieniowanie UV emitowane z otwartego spektrofotometru może uszkodzić oczy i skórę.

Ustaw żądaną długość fali lub zakres długości fali, który ma być transmitowany na próbce, który zależy od optymalnej długości fali światła pochłanianego przez analit. Następnie wyzeruj instrument, dokonując odczytu ślepej próby, co spowoduje odjęcie tła od bufora próbki.

W zależności od rodzaju przeprowadzanego eksperymentu spektrofotometrycznego może być konieczne wygenerowanie krzywej wzorcowej przed pomiarem próbki, na podstawie której ostatecznie można określić stężenie analitu próbki.

Pozwól, aby próbka osiągnęła odpowiednią temperaturę i delikatnie ją wymieszaj, aby nie zostały wprowadzone pęcherzyki. Próbkę można dodać bezpośrednio do kuwety, w instrumencie i dokonać odczytu.

Po wykonaniu pomiaru absorbancji na próbce przejdź do odpowiednich obliczeń dla swojego eksperymentu; Na przykład określenie stężenia lub szybkości aktywności enzymu.

Spektrofotometr jest używany na co dzień w wielu biologicznych laboratoriach badawczych.

Jednym z powszechnych zastosowań spektrofotometru jest pomiar gęstości komórek. Pomiar gęstości komórek jest przydatny w generowaniu logarytmicznych krzywych wzrostu bakterii, na podstawie których można określić optymalny czas indukcji rekombinowanego białka.

Spektrofotometr może być również używany do pomiaru szybkości reakcji chemicznych. W tym przykładzie absorbancja jest wykorzystywana do monitorowania reakcji enzymatycznej poprzez zanikanie produktu pośredniego reakcji przy długości fali 452 nm w czasie. Szybkość tego etapu enzymatycznego można obliczyć, dopasowując dane do odpowiedniego równania.

Niedawne wprowadzenie spektrofotometrów mikroobjętościowych wyeliminowało konieczność stosowania uchwytów na próbki. Takie spektrofotometry wykorzystują napięcie powierzchniowe do utrzymywania próbki.

Spektrofometry mikroobjętościowe są optymalne do pomiaru jakości i stężenia drogich próbek o ograniczonej objętości, takich jak biomolekuły, w tym białka i kwasy nukleinowe.

Absorbancja białka przy 280 nm zależy od zawartości aromatycznych łańcuchów bocznych znajdujących się w tryptofanie, tyrozynie i fenyloalaninie, a także od istnienia wiązań cysteina-dwusiarczek cysteiny.

Stężenie białka można określić na podstawie jego absorbancji przy 280 nm i współczynnika ekstynkcji, który opiera się na składzie aminokwasowym.

Zarówno DNA, jak i RNA mają maksimum absorbancji przy 260 nm, na podstawie którego można określić ich stężenie. Czystość kwasu nukleinowego można również ocenić na podstawie stosunku odczytów absorbancji przy określonych długościach fal.

Właśnie obejrzałeś wprowadzenie JoVE do spektrofotometru.

W tym filmie omówiliśmy kilka podstawowych zasad, w tym koncepcje spektrofotometrii i elementy spektrofotometru. Pokazaliśmy również krok po kroku działanie spektrofotometru oraz omówiliśmy jego zastosowanie w badaniach biologicznych. Dzięki za oglądanie.