Ilościowa analiza wielospektralna po przeszczepie tkanki fluorescencyjnej w celu wizualizacji pochodzenia, typów i interakcji komórek

Celem poniższej procedury jest zastosowanie wielospektralnej analizy multipleksowych kompozycji komórkowych lub mimiki w celu określenia wkładu różnych populacji mieszkańców szpiku kostnego w rozwój zrębu nowotworów. Osiąga się to poprzez przeszczepienie transgenicznej myszy biorcy znakowanej GFP z RFP wyrażającymi komórki macierzyste szpiku kostnego. W drugim etapie interesujące komórki nowotworowe są wstrzykiwane temu samemu biorcy, a następnie po wszczepieniu wycięty guz jest cięty, zatapiany w parafinie i znakowany przeciwciałami immunofluorescencyjnymi.

Następnie, po skompletowaniu biblioteki spektralnej, tworzona jest biblioteka spektralna wszystkich długości fal używanych do pozyskiwania obrazów skrawków guza. Szkiełka są obrazowane w ostatnim etapie, przeprowadzana jest analiza danych, aby umożliwić identyfikację i powiązanie wzorców barwienia interesujących markerów komórkowych. Ostatecznie nowe jednostki komórkowe lub fenotypy można zidentyfikować na podstawie multipleksowego znakowania markerów zewnątrzkomórkowych i komórkowych, aby lepiej zrozumieć skład złożonych tkanek, takich jak mikrośrodowisko guza.

Główną przewagą tej techniki nad standardowymi technikami immunofluorescencji jest to, że analiza wielospektralna pozwala na multipleksowanie siedmiu lub więcej czwórek fluorowych na tym samym szkiełku, co pozwala na znacznie bardziej precyzyjne i szczegółowe badanie składu komórkowego mikrośrodowiska guza lub tkanki regeneracyjnej. Chociaż metoda ta może zapewnić wgląd w pochodzenie i skład mikrośrodowiska guza, może być stosowana w innych systemach, takich jak medycyna regeneracyjna, biologia rozwojowa i biologia immunologiczna. Demonstruje tę procedurę wraz z Dr.Spa Chris Booth, asystent naukowy w moim laboratorium Ze względu na ograniczenia IU Cooka w tej instytucji, omówimy, ale nie pokażemy żadnych bezpośrednich manipulacji myszami na myszach.

Te zabiegi szpiku kostnego i nasze techniki wszczepiania guza można znaleźć w naszych wcześniejszych pracach, takich jak kid i inne komórki macierzyste. 2009 rozpocząć po wyizolowaniu komórek szpiku kostnego od lustrzanych kończyn tylnych, resus zawiesza komórki na poziomie 2 milionów komórek na 100 mikrolitrów PBS na mysz. Za pomocą lampy grzewczej należy rozszerzyć naczynia krwionośne napromieniowanej myszy z GFP i umieścić mysz w ograniczniku iniekcji do żyły ogonowej.

Za pomocą igły o rozmiarze 29 należy systematycznie wstrzykiwać zawiesiny komórek do ogona lub żyły zaoczodołowej. Użyj sterylnej gazy, aby lekko uciskać ogon po wstrzyknięciu. Wstrzyknąć jednej myszy 100 mikrolitrów PBS tylko jako kontrolę wszczepienia w dniu wstrzyknięcia.

Ponownie zawiesić komórki nowotworowe będące przedmiotem zainteresowania w PBS na poziomie 1 miliona komórek na 100 mikrolitrów. Po wysterylizowaniu brzucha 70% etanolem. Jedną ręką przytrzymaj mysz za kark i ogon, a następnie drugą ręką przytrzymaj igłę skośnie do góry i wstrzyknij komórki nowotworowe do jamy międzyotrzewnowej myszy biorcy.

Po 15 do 30 dniach poddaj myszy eutanazji i wytnij guz z brzucha. Następnie napraw guzy w 10% forminie na 24 godziny. Następnie pokrój utrwaloną tkankę na plastry o grubości od pięciu do 10 mikrometrów w celu przeprowadzenia kolejnych procedur barwienia.

Po utrwaleniu skrawków tkanek w parafinie należy piec próbki przez godzinę w temperaturze 56 stopni Celsjusza. Następnie umyj szkiełka zgodnie z następującą kolejnością Po ostatnim myciu etanolem płucz szkiełka w wodzie przez dwie minuty. Powoli zanurzaj i podnoś stojak do barwienia do wody 10 razy.

Następnie umieść bufor cytrynianu sodu w kuchence mikrofalowej do podgrzania. Po gotowaniu szkiełek przez 20 minut w buforze cytrynianu sodu, pozostawić próbki do ostygnięcia w buforze przez 30 minut. Następnie myj zjonizowaną wodą przez kolejne pięć minut.

Następnie stuknij w szkiełko, aby duże krople wody spłynęły, uważaj, aby nie wysuszyć części tkanki. Użyj hydrofobowego pisaka barierowego, aby oznaczyć odcinki wokół odcinków guza, a następnie natychmiast umieść bufor blokujący na próbce, aby zapobiec wysychaniu odcinka tkanki. Po godzinie inkubować szkiełka z pierwotnym przeciwciałem będącym przedmiotem zainteresowania w komorze wilgotnościowej na wolno obracającym się wytrząsarce w temperaturze czterech stopni przez noc.

Następnego ranka umyj szkiełka dwa razy w PBST przez 10 minut, za każdym razem delikatnie potrząsając podczas mycia sekcji. Rozcieńczyć przeciwciała drugorzędowe w stosunku jeden do 1000 przeciwciał do buforu blokującego. Następnie inkubować skrawki w odpowiednich przeciwciałach drugorzędowych w komorze wilgotnościowej pokrytej folią aluminiową na wolno obracającym się wytrząsarce w temperaturze pokojowej Po dwóch godzinach.

Umyj szkiełka dwa razy w PBST przez pięć minut, delikatnie potrząsając i chroń je przed światłem. Następnie zabarwij szkiełko tylko dappy, a szkiełki analityczne DPI przez jedną minutę, utrzymując szkiełka przykryte podczas inkubacji. Umieszczając szkiełko nakrywkowe na każdej próbce, uszczelnij krawędzie każdego szkiełka nakrywkowego utwardzaczem do paznokci.

Teraz, aby wykonać obrazowanie wielospektralne, użyj obiektywu olejowego, aby wykonać wstępny obraz szkiełka analitycznego, aby uzyskać odpowiednie czasy ekspozycji dla każdego z zakresów spektralnych w bibliotece spektralnej. Na przykład w tej tabeli przedstawiono sugerowane protokoły biblioteki spektralnej w oparciu o liczbę czwórek na piętrze użytych w eksperymencie. Następnie wyobraź sobie niezabarwiony slajd jako slajd tła w bibliotece spektralnej dla tego eksperymentu.

Następny obraz, niezabarwiony slajd, aby uzyskać obraz tła dla biblioteki spektralnej. Teraz zobrazuj każdy szkiełko kontrolne z pojedynczym piętrem cztery, zapisując obrazy pod nazwą przeciwciała wtórnego użytego dla każdego szkiełka. Po skompletowaniu biblioteki Suspectable zbierz obrazy obszarów zainteresowania na szkiełku analitycznym, aby przeanalizować obrazy tkanek nowotworowych.

Najpierw zaimportuj reprezentatywny asortyment pozyskanych obrazów niuansów za pomocą oprogramowania informuj. Następnie otwórz bezpieczną bibliotekę spektralną zgodnie z zaleceniami programu. Następnie zidentyfikuj obszary tkanek będące przedmiotem zainteresowania, które mają być analizowane.

Zidentyfikuj poszczególne komórki na podstawie barwienia DAPI. Cytoplazma zostanie zidentyfikowana automatycznie na podstawie kształtu jądra. Teraz wybierz odczyt intensywności fluorescencji dla każdego parametru fluorescencji, a następnie dopasuj uzyskane obrazy, pozwalając oprogramowaniu przetworzyć dane przy użyciu proponowanego algorytmu.

Po zakończeniu przetwarzania obrazu scal pliki wynikowe. Następnie, wykorzystując tę technikę obrazowania wielospektralnego do analizy i wykresu guzów w tym transgenicznym modelu myszy do przeszczepu szpiku kostnego, składniki guza podścieliska, które pochodzą ze szpiku kostnego, zostały rozpoznane za pomocą cytometrii przepływowej trzy tygodnie po przeszczepie szpiku kostnego. Następnie, sześć tygodni po początkowym wstrzyknięciu, przeanalizowano skrawki z nieoznakowanych wstrzykniętych guzów jajnika po utworzeniu biblioteki spektralnej z pojedynczymi szkiełkami kontrolnymi kolorów, przeanalizowano obrazy odcinka guza jajnika wybarwionego GFP DPI i przeanalizowano dwa inne markery.

Możliwe jest dodanie większej liczby markerów. Na przykład w tym przypadku biblioteka spektralna i towarzyszący jej obraz wycinka guza z sześcioma markerami oraz plamą jądrową są wyświetlane za pomocą oprogramowania informacyjnego. Obszary tkanki będącej przedmiotem zainteresowania w obrębie przekroju guza można sklasyfikować, jak pokazano na reprezentatywnych obrazach pokazanych tutaj.

Na przykład ten obraz przedstawia klasyfikację segmentów tkanki, po której następuje segmentacja komórek. Na podstawie dpi plamy jądrowej. Kwantyfikacja znaczników fluorescencyjnych może być następnie zmierzona w jądrze i cytoplazmie każdej komórki i wyeksportowana do dalszej analizy.

Algorytm segmentacji tkanek jest w stanie dalej identyfikować podtypy tkanek w oparciu o architekturę tkanki, a nie tylko identyfikację fluorochromu, zapewniając bardziej niezawodne narzędzie analityczne do klasyfikowania barwienia w różnych regionach tkanki. Na tym obrazie komputer został przeszkolony w identyfikowaniu pięciu podregionów na podstawie wzorców architektonicznych w tkance. Tło jest zdefiniowane przez puste miejsce.

Guz hemolityczny jest definiowany przez obfitość czerwonych krwinek w tkance. Guz jest definiowany przez gęsto zaludnione komórki. Tłuszcz jest zdefiniowany przez duże symetryczne puste przedziały komórkowe i mięśnie zdefiniowane przez prążkowany wzór.

Za pomocą tej metody można przeanalizować podwójnie dodatnią populację komórek na podstawie określonego progu intensywności fluorescencji. Na przykład w przypadku komórek GFP dodatnich i alfa mięśni gładkich aktyno-dodatnich, jak pokazano tutaj, w celu uzyskania dodatkowej detekcji spektralnej poza czterema kolorami, zapoznaj się z połączonymi dokumentami z poradami i wskazówkami dotyczącymi multipleksowania pięciu lub więcej sond. Próbując wykonać tę procedurę, należy pamiętać, że jakość obrazów zależy w dużej mierze od odpowiednich użytych slajdów kontrolnych pojedynczego koloru.

Po tej procedurze można przeprowadzić inne metody, takie jak fluorescencyjna hybrydyzacja in situ, aby odpowiedzieć na dodatkowe pytania, takie jak przedziały komórkowe i tkanka mikrośrodowiska guza. Po obejrzeniu tego filmu powinieneś dobrze zrozumieć naszą technikę mimiczną, wielospektralne badanie składników wielokomórkowych, a po zakończeniu tego powinieneś dokładnie zrozumieć, jak zidentyfikować wiele celów komórkowych na jednym slajdzie. Jak zliczyć uniksowe cele komórkowe i dobrze zrozumieć ewolucję zrębu nowotworowego lub tkanki regeneracyjnej, lub tkanki będącej przedmiotem zainteresowania.