Projekt dwuosiowego bioreaktora obciążenia mechanicznego dla inżynierii tkankowej

Ogólnym celem następnego eksperymentu jest wytworzenie funkcjonalnych biokompozytów z inżynierii tkankowej do transplantacji. Osiąga się to poprzez przykładanie precyzyjnego jednowymiarowego lub dwuwymiarowego odkształcenia mechanicznego w celu zapewnienia bodźców biofizycznych dla komórek w trójwymiarowych kompozytach biomateriałowych. W drugim kroku bioreaktor zostaje wyposażony w ogniwo obciążnikowe, które zapewnia sprzężenie zwrotne siły oraz umożliwia testowanie mechaniczne biokompozytów podczas obciążania.

Następnie biokompozyty są hodowane przez okres kilku tygodni w celu wywołania makroskopowych zmian w zawartości biochemicznej konstrukcji; otrzymane wyniki wykazują wpływ różnych rodzajów obciążeń, opierając się na istotnych różnicach w zawartości glikozaminoglikanów i kolagenu, grubości rusztowania oraz module równowagi. Chociaż metoda ta może dostarczyć wiedzy na temat wpływu obciążenia dwuosiowego na inżynieryjną tkankę chrzęstną, można ją również zastosować do innych tkanek o niskim obciążeniu, takich jak kości i ścięgna. Procedurę tę zaprezentują Amy May i Rob Stefani z naszego laboratorium. Aby rozpocząć tę procedurę, należy przygotować dwuosiowy bioreaktor, jak pokazano tutaj.

Podstawa bioreaktora składa się z aluminiowej płyty o wymiarach 25 centymetrów na 30 centymetrów i grubości 12,5 milimetrów. Dostępne zmienne opcje pozycjonowania umożliwiają elastyczny montaż płytek do hodowli tkankowej o różnych kształtach i rozmiarach. Następnie należy upewnić się, że stoliki są zamontowane na podstawie w taki sposób, aby stolik poziomy zapewniał dynamiczne ścinanie poprzez oscylację wyłącznie wzdłuż osi x.

Z kolei platforma pionowa zapewnia dynamiczną kompresję, oscylując wyłącznie wzdłuż osi Z. Kolejnym krokiem jest wykonanie niestandardowej płytki obciążeniowej z polisulfonu. Materiał polisulfonowy jest idealny ze względu na swoją biozgodność, łatwość obróbki oraz łatwość sterylizacji.

Połącz płytkę z dwuosiową platformą ruchomą za pomocą precyzyjnie obrobionego wspornika kątowego. Przytwierdzone do płytki podstawy ograniczniki kinematyczne posiadają śruby regulacyjne, które umożliwiają precyzyjne wyrównanie płytek hodowlanych, niemożliwe do osiągnięcia ręcznie. Następnie do każdej platformy przymocuj siłownik z silnikiem krokowym, który będzie przekazywał informacje zwrotne o położeniu do oprogramowania.

Przedstawione tutaj siłowniki z silnikami krokowymi posiadają dwukierunkową powtarzalność na poziomie 0,1 µm oraz rozdzielczość 20 nm, co przekłada się na dokładność poniżej 3 µm na 50 mm zakresu ruchu; do sterowania ruchami stołów wykorzystuje się oprogramowanie do zaawansowanego pozycjonowania firmy Thor Labs. Oprogramowanie steruje silnikiem krokowym w celu niezależnej i jednoczesnej regulacji parametrów obciążenia, takich jak częstotliwość i amplituda, zarówno dla ścinania, jak i kompresji. Następnie należy umieścić miniaturową ogniwo obciążnikowe o zakresie 5 lb pomiędzy platyną obciążającą a ruchomą platformą, aby zapewnić sprzężenie zwrotne siły niezbędne do wykrycia kontaktu między platyną a konstruktami, a także do oceny odpowiedzi na obciążenie.

Należy upewnić się, że ogniwo obciążnikowe posiada wysoką dokładność w zakresie od 0,15% do 0,25% pełnej skali, a jednostka wyświetlająca dla ogniwa obciążnikowego jest wyposażona w port RS 2 32, co umożliwia gromadzenie danych na komputerze. Aby unieruchomić próbki w dołkach płytki 24-dołkowej, należy przygotować formę dla żelu aros o grubości 1,5 millimeter, korzystając z systemu do odlewania żelu z przekładkami 1,5 millimeter. Po złożeniu układu należy wlać roztwór 4% aros pomiędzy dwie szklane płytki i pozwolić mieszaninie ostygnąć.

Następnie zdejmij górną płytkę i wybij z płyty agro krążek o średnicy 16 mm. W każdym krążku wybij otwór, w którym zostanie umieszczona próbka każdego z odwzorowań. Gotowe krążki umieść w dołkach płytki 24-dołkowej.

Następnie należy docisnąć konstrukty tkankowe o grubości 2,25 mm i średnicy 5 mm do każdego z uchwytów żelowych. Próbka powinna wystawać ponad górną krawędź każdego uchwytu aeros. Następnie do każdej studni należy dodać 1,5 ml pożywki hodowlanej i założyć pokrywę.

Następnie umieść płytkę z powrotem w inkubatorze do czasu załadunku próbek. Aby rozpocząć mechaniczne obciążanie konstruktów tkankowych, przymocuj aluminiową płytkę do ogniwa obciążnikowego i przez cały czas trzymaj sterylną płytkę platynową przymocowaną do etapu pionowego. Inkubator powinien pracować w warunkach niskiej wilgotności, aby zapobiec awarii urządzenia.

Następnie włącz kontroler silnika krokowego oraz komputer. Otwórz program użytkownika technologii zaawansowanego pozycjonowania i przejdź do karty sterowania graficznego na obu ekranach. Naciśnij przycisk home zero, aby przesunąć oba silniki krokowe do pozycji zerowej, która jest zdefiniowana jako pozycja najwyższa i najbardziej wysunięta w prawo.

Przygotuj próbki do załadunku, usuwając część pożywki z każdej studni, aby zapobiec przelaniu podczas załadunku mechanicznego. Następnie umieść płytkę 24-dołkową w bioreaktorze i ostrożnie wyrównaj płytkę z platformą za pomocą czterech regulowanych lokalizatorów kinematycznych, upewniając się, że płytka jest odpowiednio ustawiona. Wyrównaj ją z przodem podstawy bioreaktora w zakładce sterowania graficznego.

Ręcznie dostrój wyrównanie, klikając w pole pozycji, aby przesunąć płytkę w poziomie. Gdy płytka zostanie wyrównana z dołkami płytki, zacznij ją opuszczać, aż po raz pierwszy zetknie się z próbkami.

Po osiągnięciu pozycji startowej przejdź do karty sekwencjonowania ruchów i wczytaj żądaną sekwencję ruchów, naciskając przycisk load, lub utwórz własny program zgodnie z opisem w protokole tekstowym towarzyszącym temu filmowi. Następnie naciśnij run, aby rozpocząć program. Oprogramowanie sterować będzie silnikami w celu zastosowania żądanego reżimu kondycjonowania próbek.

Po zakończeniu programu ręcznie podnieś płytkę tak, aby znalazła się powyżej górnej krawędzi płytki do hodowli tkankowej. Następnie wyjmij 24-dołkową płytkę kołową z bioreaktora i wymień pożywkę. Na koniec ostrożnie zdejmij platformę z ogniwa obciążnikowego, a następnie wyłącz urządzenia.

Zastosowanie bioreaktora dwuosiowego opisanego w tym filmie miało istotny wpływ na ilość glikozaminoglikanów i kolagenu wydzielanych przez komórki w konstrukcjach inżynierii tkankowej. Kondycjonowanie odbywało się pięć dni w tygodniu przez trzy godziny dziennie, przy 10% odkształceniu ściskającym i 5% odkształceniu ścinającym przy częstotliwości jednego herca. Po 30 dniach hodowli ilość glikozaminoglikanów i kolagenu wydzielanych przez chondrocyty poddane obciążeniu dwuosiowemu była znacznie wyższa niż w próbkach kontrolnych. Obciążenie jednoosiowe spowodowało jedynie istotny wzrost ilości glikozaminoglikanów.

Dodatkowo, obciążenie dwuosiowe doprowadziło do powstania grubszych konstruktów, ale nie wpłynęło na ich elastyczność. Stosując ten protokół dawkowania, po 30 dniach kondycjonowania i hodowli, przekroje poprzeczne konstruktów tkankowych barwiono typowymi markerami chrząstki, w tym szafranem niebieskim oraz kolagenem typu II. Trzy różne grupy obejmowały: brak kondycjonowania, obciążenie jednoosiowe oraz obciążenie dwuosiowe.

Podczas gdy we wszystkich grupach widoczne jest pozytywne barwienie alianiniowym błękitem oraz szafranem O, próbki poddane obciążeniu dwuosiowemu wykazują zwiększoną ilość kolagenu typu II w porównaniu z próbkami nieobciążonymi i obciążonymi jednoosiowo. Po obejrzeniu tego filmu powinni Państwo posiadać dobrą wiedzę na temat tego, jak aplikować obciążenia jednoosiowe lub dwuosiowe na rozwijające się konstrukty inżynierii tkankowej.