Name: Projekt dwuosiowego bioreaktora obciążenia mechanicznego dla inżynierii tkankowej (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-04-25T13:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 4 s
Description: Poznaj metodę dwuosiowego obciążenia mechanicznego w inżynierii tkankowej chrząstki stawowej. Bioreaktor z komórką obciążeniową umożliwia precyzyjną kontrolę naprężeń i poprawę właściwości biochemicznych kompozytów.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Ta praca była wspierana przez Biuro Badań i Rozwoju, RR&D Service, Departament ds. Weteranów USA, NIH COBRE 1P20RR024484, NIH K24 AR02128 i Departament Obrony W81XWH-10-1-0643.

1. Projekt bioreaktora do obciążania dwuosiowego
<ol>
 <li>Bioreaktor wykorzystuje dwa stoliki firmy Thor-labs (Newton, MA) przeznaczone do precyzyjnych zastosowań laserowych, służące do nakładania jednowymiarowego lub dwuwymiarowego odkształcenia mechanicznego na inżynierowane tkanki, z dużą precyzją dawki obciążenia (amplituda i częstotliwość) oraz możliwością zastosowania w szerokim zakresie warunków hodowli tkanek, od pojedynczych do 24-dołkowych płytek (Rycina 1).</li>
 <li>Obciążanie dwuosiowe realizowane jest za pomocą dwóch stolików TravelMax (LNR50SE). Stoliki te są zamontowane prostopadle w konfiguracji XZ. Stolik poziomy zapewnia dynamiczne ruchy ścinające poprzez oscylację wzdłuż osi X. Stolik pionowy zapewnia dynamiczne obciążenie ściskające poprzez oscylację wzdłuż osi Z. Stoliki te mają zakres ruchu 50 mm i są napędzane niezależnie przez siłowniki z silnikami krokowymi (DRV014), sterowane przez sterownik silnika krokowego z pętlą sprzężenia zwrotnego (BSC102), który posiada funkcję mikrokroków, umożliwiającą uzyskanie wielkości kroku poniżej 50 nm.</li>
 <li>Urządzenie jest zamontowane na sztywnej aluminiowej płycie podstawy o wymiarach 25 cm x 30 cm x 12,5 mm, która służy jako platforma do montażu komponentów maszyny oraz mocowania płytek do hodowli tkanek. Do blokowania płytek do hodowli tkanek na aluminiowej płycie podstawy stosuje się regulowane ograniczniki kinematyczne. Ograniczniki te posiadają śruby regulacyjne umożliwiające precyzyjne wyrównanie, którego nie można osiągnąć ręcznie. Modułowa konstrukcja płyty podstawy pozwala na elastyczne rozmieszczenie ograniczników kinematycznych w celu dopasowania do płytek o różnych rozmiarach i kształtach (szalki Petriego vs. płytki wielodołkowe).</li>
 <li>Specjalnie wykonana z polisulfonu płyta dociskowa jest połączona z dwuosiową ruchomą platformą za pomocą precyzyjnie obrobionego wspornika kątowego. Materiał polisulfonowy wybrano ze względu na jego biozgodność, łatwość obróbki oraz łatwość sterylizacji.</li>
 <li>Ruchy stolików są sterowane za pomocą oprogramowania Advanced Positioning Technology (APT) firmy Thor-labs. Sterownik silnika krokowego jest używany w połączeniu z oprogramowaniem, które pozwala na niezależne i jednoczesne dostrajanie parametrów obciążenia, takich jak częstotliwość i amplituda zarówno ścinania, jak i ściskania.</li>
 <li>Sprzężenie zwrotne dotyczące pozycji zapewniają liniowe enkodery optyczne przymocowane do każdej ruchomej platformy i zintegrowane z oprogramowaniem. System enkoderów posiada dwukierunkową powtarzalność 0,1 μm i rozdzielczość 20 nm, co przekłada się na dokładność pozycjonowania poniżej 3 μm w całym zakresie ruchu 50 mm. Enkodery te dostarczają niezbędnych informacji o pozycji do elektroniki sterującej, zapewniając rzeczywiste możliwości nanopozycjonowania i bezpośredni odczyt pozycji bezwzględnej.</li>
 <li>W celu zapewnienia sprzężenia zwrotnego siły niezbędnego do wykrywania kontaktu między płytą dociskową a próbkami oraz oceny odpowiedzi na obciążenie, pomiędzy płytą dociskową a ruchomą platformą umieszczono precyzyjny miniaturowy przetwornik siły (Honeywell Model 31) (Rycina 2). Przetwornik siły charakteryzuje się wysoką dokładnością od 0,15% do 0,25% pełnej skali. Jednostka wyświetlająca (SC500) dla przetwornika siły może również dostarczać pomiary obciążenia z dokładnością do 5 miejsc po przecinku. Dodatkowo posiada port RS-232 umożliwiający zbieranie danych na komputerze.</li>
</ol>
2. Konstrukcje agarozowe z zasianymi komórkami
<ol>
 <li>Przygotuj 4% agarozę: dodaj 0,8 g agarozy do 20 ml DMEM (bez dodatków) w kolbie o pojemności 50 ml, zagotuj, a następnie przechowuj w piecu w temperaturze 70 °C do momentu użycia.</li>
 <li>Dostosuj objętość zawiesiny komórkowej tak, aby uzyskać dwukrotność pożądanej gęstości zasiewu komórek. Zawiesinę tę miesza się z równą objętością 4% w/v agarozy, aby stworzyć żel agarozowy o stężeniu 2% przy pożądanej gęstości zasiewu.</li>
 <li>Umieść zarówno zawiesinę komórkową, jak i jedną pipetę 10 ml w inkubatorze.</li>
 <li>Przygotuj system do odlewania żelu. Należy połączyć jedną płytkę dystansową 1,5 mm i jedną 0,75 mm, aby stworzyć żel o grubości 2,25 mm. Do uzyskania innej grubości żelu można użyć płytek dystansowych o innych rozmiarach. System do odlewania żelu nie jest wystarczająco duży, aby utrzymać te płytki razem, dlatego należy je mocno przykleić taśmą, aby zapobiec wyciekom.</li>
 <li>Kolejnym krokiem jest szybkie zmieszanie zawiesiny komórkowej z wcześniej przygotowaną agarozą i wpipetowanie do formy na żel, zanim agaroza zastygnie. Wyjmij płynną agarozę z pieca i umieść w niej sterylny termometr. Agaroza musi schłodzić się do 42-43 °C przed zmieszaniem z komórkami. Podgrzej zawiesinę komórkową do 37 °C. Gdy agaroza osiągnie 43 °C, szybko pobierz pipetą pożądaną ilość, a następnie natychmiast kilkakrotnie pipetuj zawiesinę komórkową w górę i w dół, aby ją wymieszać. Następnie niezwłocznie wpipetuj całą mieszaninę do formy na żel.</li>
 <li>Pozostaw żel do zastygnięcia na 10-15 min, a następnie ostrożnie przechyl go do pozycji poziomej.</li>
 <li>Zdejmij górną szklaną płytkę i wybij krążki za pomocą wycinaka do biopsji. Krążki można pobrać małą sterylną szpatułką. Z naszego doświadczenia wynika, że 9 ml żelu było wystarczającą ilością do przygotowania ponad stu krążków o średnicy 5 mm.</li>
</ol>
3. Inkubacja krążków
<ol>
 <li>Umieść jeden dysk w każdej studzience płytki 24-dołkowej, która nie była poddana obróbce do hodowli tkanek.</li>
 <li>Dodaj 2 ml bezserwatkowego medium do różnicowania chondrogenicznego do każdej studzience.</li>
 <li>Włóż płytki do inkubatora (37 °C, 5% CO2).</li>
 <li>Podczas wymiany pożywki wymieniaj 1 ml na studzienkę co 2-3 dni.</li>
</ol>
4. Immobilizacja próbek do obciążenia mechanicznego
<ol>
 <li>Przygotować 4% agarozę (bez dodatku zawiesiny komórkowej); żel powinien być cieńszy niż same próbki (aby zapobiec zakłóceniom podczas nakładania). Zalecana grubość to 1,5-1,9 mm (dla próbek o grubości 2,25 mm).</li>
 <li>Po zestaleniu żelu wyciąć dyski o średnicy 16 mm do płytek 24-dołkowych. W każdym dysku wyciąć jeden otwór o średnicy 5 mm, w którym zostanie umieszczona próbka. Opcjonalnie można wyciąć drugi otwór o średnicy 5 mm na krawędzi dysku, aby umożliwić umieszczenie pipety podczas wymiany medium.</li>
 <li>Po wykonaniu otworów w agarozie umieścić dyski w płytce 24-dołkowej, jak pokazano na Rysunku 3.</li>
 <li>Gdy otwory agarozowe znajdą się w płytce 24-dołkowej, ciasno wcisnąć próbki w każdy otwór. Próbka powinna wystawać ponad górną krawędź otworu agarozowego.</li>
</ol>
5. Obciążenie mechaniczne
<ol>
 <li>Zesterylizować płytę dociskową (Rysunek 2).</li>
 <li>Przymocować płytę aluminiową do ogniwa obciążeniowego. Przymocować zespół płyty dociskowej/ogniwa obciążeniowego/płyty aluminiowej do stołu.</li>
 <li>Włączyć sterownik silnika krokowego (przełącznik z tyłu).</li>
 <li>Włączyć komputer i otworzyć program „APT User” (Rysunek 4).
 <ol>
 <li>Lewy ekran steruje poziomym silnikiem krokowym. Prawy ekran steruje pionowym silnikiem krokowym. W każdym ekranie karta „Graphical Control” umożliwia ręczne pozycjonowanie, a karta „Move Sequencer” umożliwia automatyzację. Wszystkie jednostki są podane w mm.</li>
 </ol>
 </li>
 <li>Przejść do karty „Graphical Control” na obu ekranach i nacisnąć przycisk „Home/Zero”. Oba silniki krokowe mają zakres 50 mm. Naciśnięcie „Home/Zero” spowoduje przesunięcie obu silników krokowych do pozycji zerowej (najwyższej i najbardziej prawej pozycji).</li>
 <li>Przygotować próbki w płytce 24-dołkowej do obciążania, usuwając część pożywki z każdego dołka. W każdym dołku powinno pozostać nie więcej niż 1 ml pożywki, aby zapobiec przelaniu podczas obciążania. Należy upewnić się, że w dołku pozostało wystarczająco dużo pożywki, aby próbka była przykryta.
 <ol>
 <li>Należy pamiętać, że inkubator jest utrzymywany w warunkach niskiej wilgotności, aby zapobiec awarii urządzenia.</li>
 </ol>
 </li>
 <li>Umieścić płytkę 24-dołkową w bioreaktorze i starannie wyrównać ją z płytą dociskową.
 <ol>
 <li>Płytka jest przymocowana do bioreaktora za pomocą czterech regulowanych lokalizatorów kinematycznych. Aby ułatwić wyrównanie płyty dociskowej, dwa lewe lokalizatory zostały uprzednio ustawione. Dokręcić dwa prawe lokalizatory tak, aby płytka była stabilna. Należy upewnić się, że płytka jest wyrównana z przodem podstawy bioreaktora.</li>
 <li>W karcie „Graphical Control” można ręcznie wprowadzić określoną pozycję silnika krokowego, klikając w pole pozycji. Wykorzystać tę funkcję, aby powoli opuścić płytę dociskową i przesuwać ją poziomo w celu wyrównania z płytką.</li>
 </ol>
 </li>
 <li>Gdy płyta dociskowa znajdzie się blisko próbek, zacząć opuszczać ją w bardzo małych krokach (0,1 mm), aż do osiągnięcia określonej pozycji początkowej (patrz część 6).</li>
 <li>Po osiągnięciu pozycji początkowej przejść do karty „Move Sequencer” i załadować żądaną sekwencję ruchów, naciskając „Load”. Następnie nacisnąć „Run”, aby rozpocząć proces (Rysunek 5). Patrz część 7. Tworzenie protokołu dawkowania.</li>
 <li>Po zakończeniu obciążania ręcznie unieść płytę dociskową. Jeśli jakiekolwiek próbki przywarły do płyty, ostrożnie przenieść je z powrotem do odpowiedniego dołka za pomocą sterylnej szpatułki.</li>
 <li>Wyjąć płytkę 24-dołkową z bioreaktora i wymienić pożywkę.</li>
 <li>Ostrożnie odłączyć płytę dociskową od ogniwa obciążeniowego, a następnie wyłączyć urządzenia.</li>
</ol>
6. Kalibracja płyty obciążeniowej
Aby zapewnić zastosowanie odpowiednich odkształceń w próbkach, każda płyta dociskowa musi zostać dokładnie skalibrowana przed rozpoczęciem eksperymentu.
<ol>
 <li>Wykonaj kroki od 5.1 do 5.8.</li>
 <li>Ręcznie ustaw poziomy silnik krokowy w pozycji 25 mm.</li>
 <li>Ostrożnie opuść płytę dociskową, aż ledwo zetknie się ona z podstawą bioreaktora. W tym momencie przetwornik siły wykaże wzrost obciążenia. Zapisz dokładną pozycję pionowego silnika krokowego (zachowaj maksymalną precyzję, ponieważ od tej wartości będą obliczane wszystkie pomiary odkształceń ściskania).</li>
 <li>Zapisz tę pozycję. Wartość ta zostanie wykorzystana do opracowania protokołu dozowania w oparciu o wymiary próbki i pożądane odkształcenia.</li>
</ol>
7. Opracowanie protokołu dawkowania
<ol>
 <li>Bioreaktor umożliwia przykładanie zarówno odkształcenia ściskającego, jak i ścinającego, albo jednocześnie, albo indywidualnie. Należy określić trzy główne parametry: wstępne odkształcenie ściskające, amplitudę odkształcenia dynamicznego oraz częstotliwość obciążania.</li>
 <li>Nakłada się odkształcenie wstępne, aby zapobiec oderwaniu płyty dociskowej od próbki.</li>
 <li>Wybierane są amplituda odkształcenia dynamicznego oraz częstotliwość obciążania próbki.</li>
</ol>
W niniejszym badaniu odkształcenie ściskające i ścinające definiujemy w następujący sposób: 
<img alt="Wzory na obliczanie odkształcenia przy ściskaniu i ścinaniu w inżynierii materiałowej, przedstawiające równania." fo:content-width="3.26in" fo:src="/files/ftp_upload/50387/50387eq1highres.jpg" src="/files/ftp_upload/50387/50387eq1.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Równanie 1">
Przykładowy protokół dawkowania dwuosiowego 
Grubość próbki: 2,25 mm 
Odkształcenie wstępne (ściskanie): 10% grubości próbki (0,225 mm) 
Amplituda odkształcenia dynamicznego (ściskanie): 10% (+/- 5% grubości próbki) 
Częstotliwość (ściskanie): 1 Hz 
Amplituda odkształcenia dynamicznego (ścinanie): 25% grubości próbki (0,5625 mm): Naprężenie ścinające jest 
przyłożone do próbki poprzez poziomy ruch płyty dociskowej. 
Częstotliwość (ścinanie): 0,5 Hz 
Typowy protokół dawkowania obejmuje 3 h obciążania na dobę.
W tym przykładzie obciążenie dynamiczne i ścinające jest stosowane jednocześnie, a nie sekwencyjnie. Uważamy, że taki schemat lepiej naśladuje złożone środowisko obciążeń w ludzkim kolanie.
<ol start="4">
 <li>Po wyborze protokołu dawkowania należy opracować program sekwencji ruchów kompresyjnych.</li>
 <li>Sekwencja ruchów to, zgodnie z nazwą, lista pozycji, do których silnik krokowy będzie się przemieszczać z określonym przyspieszeniem i prędkością maksymalną.</li>
 <li>Oblicz pożądane pozycje pionowe na podstawie protokołu dawkowania i wartości kalibracji płyty (z części 6).</li>
 <li>Poniżej przedstawiono przykładowe obliczenia dla płyty 1:</li>
</ol>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="always">
 <tbody >
 <tr>
 <td> </td>
 <td>Różnica względem wartości kalibracji</td>
 <td>Pozycja pionowa</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Wartość kalibracji płyty dociskowej (styk z dnem bioreaktora)</td>
 <td>0 mm</td>
 <td>29,7700 mm</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Płyta dociskowa styka się z próbką (próbka 2,25 mm)</td>
 <td>4,4140 mm</td>
 <td>25,3560 mm</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Odkształcenie (5% grubości)</td>
 <td>4,3015 mm</td>
 <td>25,4705 mm</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Odkształcenie (10% grubości)</td>
 <td>4,1890 mm</td>
 <td>25,5810 mm</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Odkształcenie (15% grubości)</td>
 <td>4,0765 mm</td>
 <td>25,6955 mm</td>
 </tr>
 </tbody>
</table>
<ol start="8">
 <li>Po obliczeniu pozycji należy eksperymentować z wartościami przyspieszenia i maksymalnej prędkości, aby uzyskać odpowiednią częstotliwość. Liczbę cykli należy dobrać stosownie (np. 10 800 cykli dla 3 hr przy 1 Hz).</li>
 <li>Przykładowy program sekwencji ruchu dynamicznej kompresji (10% kompresji wstępnej, 10% amplitudy dynamicznego odkształcenia, 1 Hz) (Rysunek 5)</li>
 <li>Program sekwencji ruchu dynamicznego ścinania: liczbę cykli należy dobrać zgodnie z pożądaną częstotliwością i czasem trwania (np. 5 400 cykli dla 3 hr przy 0,5 Hz).</li>
 <li>Przykładowy program sekwencji ruchu dynamicznego ścinania (10% kompresji wstępnej, amplituda dynamicznego odkształcenia ścinającego 0,5625 mm (25% grubości), 0,5 Hz) (Rysunek 5).</li>
</ol>

<ol><li>Drachman, D. B., Sokoloff, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+role+of+movement+in+embryonic+joint+development%5BTitle%5D)+AND+%22Devl.+Biol%22%5BJournal%5D)">The role of movement in embryonic joint development.</a> Devl. Biol. 14, 401-420 (1966).</li>
<li>Buschmann, M. D., Gluzband, Y. A., Grodzinsky, A. J., Hunziker, E. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanical+compression+modulates+matrix+biosynthesis+in+chondrocyte%2Fagarose+culture%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Cell+Sci%22%5BJournal%5D)">Mechanical compression modulates matrix biosynthesis in chondrocyte/agarose culture.</a> J. Cell Sci. 108, 1497-1508 (1995).</li>
<li>Vunjak-Novakovic, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bioreactor+Cultivation+Conditions+Modulate+the+Composition+and+Mechanical+Properties+of+Tissue-Engineered+Cartilage%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Orthopaedic+Research%22%5BJournal%5D)">Bioreactor Cultivation Conditions Modulate the Composition and Mechanical Properties of Tissue-Engineered Cartilage.</a> Journal of Orthopaedic Research. 17, 130-138 (1999).</li>
<li>Gooch, K. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effects+of+Mixing+Intensity+on+Tissue-Engineered+Cartilage%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechnology+and+Bioengineering%22%5BJournal%5D)">Effects of Mixing Intensity on Tissue-Engineered Cartilage.</a> Biotechnology and Bioengineering. 72, 402-407 (2001).</li>
<li>Carver, S. E., Heath, C. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Increasing+extracellular+matrix+production+in+regenerating+cartilage+with+intermittent+physiological+pressure%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechnology+and+Bioengineering%22%5BJournal%5D)">Increasing extracellular matrix production in regenerating cartilage with intermittent physiological pressure.</a> Biotechnology and Bioengineering. 62, 166-174 (1999).</li>
<li>Frank, E. H., Jin, M., Loening, A. M., Levenston, M. E., Grodzinsky, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+versatile+shear+and+compression+apparatus+for+mechanical+stimulation+of+tissue+culture+explants%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biomech%22%5BJournal%5D)">A versatile shear and compression apparatus for mechanical stimulation of tissue culture explants.</a> J. Biomech. 33, 1523-1527 (2000).</li>
<li>Wagner, D. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hydrostatic+pressure+enhances+chondrogenic+differentiation+of+human+bone+marrow+stromal+cells+in+osteochondrogenic+medium%5BTitle%5D)+AND+%22Ann.+Biomed.+Eng%22%5BJournal%5D)">Hydrostatic pressure enhances chondrogenic differentiation of human bone marrow stromal cells in osteochondrogenic medium.</a> Ann. Biomed. Eng. 36, 813-820 (2008).</li>
<li>Butler, D. L., Goldstein, S. A., Guilak, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functional+Tissue+Engineering%3A+The+Role+of+Biomechanics%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biomech.+Eng%22%5BJournal%5D)">Functional Tissue Engineering: The Role of Biomechanics.</a> J. Biomech. Eng. 122, 570-575 (2000).</li>
<li>Guilak, F., Butler, D. L., Goldstein, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functional+Tissue+Engineering.+The+role+of+biomechanics+in+articular+cartilage+repair%5BTitle%5D)+AND+%22Clin.+Orthop%22%5BJournal%5D)">Functional Tissue Engineering. The role of biomechanics in articular cartilage repair.</a> Clin. Orthop. 391S, S295-S305 (2001).</li>
<li>Mauck, R. L., Byers, B. A., Yuan, X., Tuan, R. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulation+of+cartilaginous+ECM+gene+transcription+by+chondrocytes+and+MSCs+in+3D+culture+in+response+to+dynamic+loading%5BTitle%5D)+AND+%22Biomech.+Model+Mechanobiol%22%5BJournal%5D)">Regulation of cartilaginous ECM gene transcription by chondrocytes and MSCs in 3D culture in response to dynamic loading.</a> Biomech. Model Mechanobiol. 6, 113-125 (2007).</li>
<li>Rubin, C., Xu, G., Judex, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+anabolic+activity+of+bone+tissue%2C+suppressed+by+disuse%2C+is+normalized+by+brief+exposure+to+extremely+low-magnitude+mechanical+stimuli%5BTitle%5D)+AND+%22FASEB+J%22%5BJournal%5D)">The anabolic activity of bone tissue, suppressed by disuse, is normalized by brief exposure to extremely low-magnitude mechanical stimuli.</a> FASEB J. 15, 2225-2229 (2001).</li>
<li>Wimmer, M. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tribology+approach+to+the+engineering+and+study+of+articular+cartilage%5BTitle%5D)+AND+%22Tissue+Eng%22%5BJournal%5D)">Tribology approach to the engineering and study of articular cartilage.</a> Tissue Eng. 10, 1436-1445 (2004).</li>
<li>Miyata, S., Tateishi, T., Ushida, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Influence+of+cartilaginous+matrix+accumulation+on+viscoelastic+response+of+chondrocyte%2Fagarose+constructs+under+dynamic+compressive+and+shear+loading%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biomech.+Eng%22%5BJournal%5D)">Influence of cartilaginous matrix accumulation on viscoelastic response of chondrocyte/agarose constructs under dynamic compressive and shear loading.</a> J. Biomech. Eng. 130, 051016(2008).</li>
<li>Heiner, A. D., Martin, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cartilage+responses+to+a+novel+triaxial+mechanostimulatory+culture+system%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biomech%22%5BJournal%5D)">Cartilage responses to a novel triaxial mechanostimulatory culture system.</a> J. Biomech. 37, 689-695 (2004).</li>
<li>Waldman, S. D., Couto, D. C., Grynpas, M. D., Pilliar, R. M., Kandel, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multi-axial+mechanical+stimulation+of+tissue+engineered+cartilage%3A+review%5BTitle%5D)+AND+%22Eur.+Cell+Mater%22%5BJournal%5D)">Multi-axial mechanical stimulation of tissue engineered cartilage: review.</a> Eur. Cell Mater. 13, 66-73 (2007).</li>
<li>Wartella, K. A., Wayne, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bioreactor+for+biaxial+mechanical+stimulation+to+tissue+engineered+constructs%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biomech.+Eng%22%5BJournal%5D)">Bioreactor for biaxial mechanical stimulation to tissue engineered constructs.</a> J. Biomech. Eng. 131, 044501(2009).</li>
<li>Bian, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dynamic+mechanical+loading+enhances+functional+properties+of+tissue-engineered+cartilage+using+mature+canine+chondrocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Tissue+Eng.+Part+A%22%5BJournal%5D)">Dynamic mechanical loading enhances functional properties of tissue-engineered cartilage using mature canine chondrocytes.</a> Tissue Eng. Part A. 16, 1781-1790 (2010).</li>
<li>Design of a Biaxial Loading Device for Cartilage Tissue Engineering. Bilgen, B., et al. 57th Annual Meeting of the Orthopaedic Research Society (ORS), , 1815(2011).</li>
<li>Mauck, R. L., Wang, C. C., Oswald, E. S., Ateshian, G. A., Hung, C. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+role+of+cell+seeding+density+and+nutrient+supply+for+articular+cartilage+tissue+engineering+with+deformational+loading%5BTitle%5D)+AND+%22Osteoarthritis+Cartilage%22%5BJournal%5D)">The role of cell seeding density and nutrient supply for articular cartilage tissue engineering with deformational loading.</a> Osteoarthritis Cartilage. 11, 879-890 (2003).</li>
<li>Mauck, R. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functional+tissue+engineering+of+articular+cartilage+through+dynamic+loading+of+chondrocyte-seeded+agarose+gels%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biomech.+Eng%22%5BJournal%5D)">Functional tissue engineering of articular cartilage through dynamic loading of chondrocyte-seeded agarose gels.</a> J. Biomech. Eng. 122, 252-260 (2000).</li>
<li>Demarteau, O., Jakob, M., Schafer, D., Heberer, M., Martin, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+and+validation+of+a+bioreactor+for+physical+stimulation+of+engineered+cartilage%5BTitle%5D)+AND+%22Biorheology%22%5BJournal%5D)">Development and validation of a bioreactor for physical stimulation of engineered cartilage.</a> Biorheology. 40, 331-336 (2003).</li>
<li>Grad, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Surface+motion+upregulates+superficial+zone+protein+and+hyaluronan+production+in+chondrocyte-seeded+three-dimensional+scaffolds%5BTitle%5D)+AND+%22Tissue+Eng%22%5BJournal%5D)">Surface motion upregulates superficial zone protein and hyaluronan production in chondrocyte-seeded three-dimensional scaffolds.</a> Tissue Eng. 11, 249-256 (2005).</li>
<li>Schatti, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+combination+of+shear+and+dynamic+compression+leads+to+mechanically+induced+chondrogenesis+of+human+mesenchymal+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Eur.+Cell+Mater%22%5BJournal%5D)">A combination of shear and dynamic compression leads to mechanically induced chondrogenesis of human mesenchymal stem cells.</a> Eur. Cell Mater. 22, 214-225 (2011).</li>
</ol>

Autorzy oświadczają, że nie mają konkurencyjnych interesów finansowych.

Zaprojektowaliśmy urządzenie ładujące, które jest w stanie zastosować jednoosiowe lub dwuosiowe naprężenie mechaniczne do konstruktów inżynierii tkankowej wytwarzanych do przeszczepu. Urządzenie może być używane jako bioreaktor do hodowli in vitro zmodyfikowanych biokompozytów lub jako urządzenie testowe do opisywania właściwości mechanicznych tkanki natywnej lub po innych zabiegach przed. Urządzenie poddaje zmodyfikowane konstrukcje tkankowe dwuosiowemu obciążeniu mechanicznemu z dużą precyzją dawki ładowania (...

Zaprojektowaliśmy bioreaktor ładujący, który jest w stanie zastosować jednoosiowe lub dwuosiowe naprężenia mechaniczne do biokompozytów inżynierii tkankowej wyprodukowanej do przeszczepu. To urządzenie zostało zaprojektowane przede wszystkim jako bioreaktor do inżynieryjnych zamienników chrząstki stawowej; Może być również stosowany do innych tkanek nośnych w ludzkim ciele. Nasza motywacja do stworzenia tego bioreaktora wywodzi się od Drachmana i Sokoloffa 1, którzy dokonali przełomowej obserwacji nieprawidłowego tworzenia się chrząstki stawowej u sparaliżowanych zarodków piskląt z powodu braku ruchu. Podobnie, ćwiczenia fizyczne są niezbędne do rozwoju prawidłowych mięśni i kości. Zgodnie z tą koncepcją, wiele grup badawczych badało, w jaki sposób różne sposoby bodźców fizycznych podczas hodowli in vitro modulują właściwości biochemiczne i mechaniczne biokompozytów komórkowo-biomateriałowych i eksplantatów tkankowych 2-7. Koncepcja funkcjonalnej inżynierii tkankowej zakłada wykorzystanie in vitro bodźców mechanicznych w celu poprawy właściwości funkcjonalnych tkanek, tj. właściwości mechanicznych, które umożliwiają tkance wytrzymanie oczekiwanych naprężeń i odkształceń in vivo 8,9. Liczne badania donoszą o wykorzystaniu obciążenia mechanicznego w zakresie ścinania i ściskania w celu stymulacji inżynieryjnych konstrukcji chrząstki dla stawów stawowych. Mauck i wsp. 10 sugerują, że samo obciążenie mechaniczne może indukować chondrogenezę mezenchymalnych komórek macierzystych nawet przy braku czynników wzrostu, które są uważane za niezbędne. Wykazano, że stosowanie przerywanych obciążeń mechanicznych, takich jak ściskanie lub ścinanie, podczas hodowli tkanek moduluje tworzenie chrząstki i kości, jednak optymalna dozymetria obciążenia różni się w zależności od właściwości komórek i tkanek 11.
	Najważniejszą funkcją chrząstki stawowej jest zdolność do wytrzymywania sił ściskających i ścinających w stawie, dlatego musi mieć wysokie moduły ściskania i ścinania. Brak funkcjonalnej wytrzymałości mechanicznej i fizjologicznej ultrastruktury w zmodyfikowanej chrząstce doprowadził do załamania się chrząstki nowej in vivo i niepowodzenia strategii wymiany chrząstki w stawach. Chociaż powszechnie wykazano, że kompresja i ścinanie modulują i poprawiają wytrzymałość mechaniczną biokompozytów chrząstki stawowej, podejście skojarzone jest rzadkie 6,12-15. Wartella i Wayne 16 zaprojektowali bioreaktor, który stosował naprężenie i kompresję w celu wytworzenia zamienników chrząstki łąkotki. Waldman i wsp. 15 zaprojektowano urządzenie do stosowania kompresji i ścinania chondrocytów hodowanych w porowatym podłożu z polifosforanu wapnia. Bian i wsp. 17 wykazano właściwości mechaniczne dopasowujące chrząstkę natywną do hodowli in vitro dorosłych chondrocytów psów w żelach i zastosowaniu dwuosiowego obciążenia mechanicznego (ściskające obciążenie odkształcające i obciążenie ślizgowe). 
	Dwuosiowy bioreaktor z obciążeniem mechanicznym został pierwotnie zaprojektowany przez Danielle Chu w naszym laboratorium z ogólnym celem wywołania adaptacji morfologicznych w strukturach chrząstek inżynierii tkankowej, co skutkuje wyższymi modułami ściskania i ścinania niż obecnie dostępne 18. Wierzymy, że te badania znacznie poszerzą naszą szerszą wiedzę na temat tego, w jaki sposób mechanotransdukcja może być modulowana w celu inżynierii klinicznie istotnych tkanek.

<table><tbody><tr><td colspan="4"><silne>ODCZYNNIKI</td></tr><tr><td>DMEM, Wysoki poziom glukozy, pirogronian</td><td>Invitrogen</td><td>11995</td><td></td></tr><tr><td>Agaroza Typ II</td><td>Sigma</td><td>CAS 39346-81-1</td><td></td></tr><tr><td>Penicylina Streptomycyna Glutamina 100X</td><td>Invitrogen</td><td>10378-016</td><td></td></tr><tr><td>ITS+ Premix</td><td>BD Biosciences</td><td>354352</td><td></td></tr><tr><td>Pen Strep Glutamina</td><td>Invitrogen</td><td>10378-016</td><td></td></tr><tr><td>Amfoterycyna B</td><td>Invitrogen</td><td>041-95780</td><td></td></tr><tr><td>Kwas askorbinowy</td><td>Sigma</td><td>A-2218</td><td></td></tr><tr><td>Nieistotny roztwór aminokwasów 100x</td><td>Sigma</td><td>M-7145</td><td></td></tr><tr><td>L-prolina</td><td>Sigma</td><td>P-5607</td><td></td></tr><tr><td>Deksametazon</td><td>Sigma</td><td>D-2915</td><td></td></tr><tr><td>Rekombinowany człowiek Transformujący Czynnik Wzrostu &#946; 1</td><td>R& D Systems</td><td>240-B-010</td><td></td></tr><tr><td colspan="4">EQUIPMENT</td></tr><tr><td>Model 31 Sensor Cell (1000 g)</td><td>Honeywell</td><td>AL311</td><td></td></tr><tr><td>Model 31 Sensor Cell (1000 g)</td><td>Jednokanałowy</td> wyświetlacz <td>Honeywell AL311</td><td></td></tr><tr><td></td><td>Honeywell</td><td>SC500</td><td></td></tr><tr><td>50 mm Liniowo kodowany stolik Travelmax z siłownikiem</td><td>krokowym Thorlabs</td><td>LNR50SE/M</td><td></td></tr><tr><td>Dwukanałowy sterownik silnika krokowego</td><td>Thorlabs</td><td>BSC102</td><td></td></tr><tr><td>50 mm Trapezowy napęd silnika krokowego (2)</td><td>Thorlabs</td><td>DRV014</td><td></td></tr><tr><td>Regulowany lokalizator kinematyczny (4)</td><td>Thorlabs</td><td>KL02</td><td></td></tr><tr><td>Precyzyjna płyta kątowa</td><td>Thorlabs</td><td>AP90/M</td><td></td></tr><tr><td>Pionowy wspornik</td><td>montażowy Thorlabs</td><td>LNR50P2/M</td><td></td></tr><tr><td>Solidna aluminiowa płytka stykowa</td><td>Thorlabs</td><td>MB3030/M</td><td></td></tr><tr><td>System odlewania żelowego z płytkami dystansowymi 1,5 mm i 0,75 mm BioRad</td><td></td><td>#1653312 i #1653310</td><td></td></tr><tr><td>Jednorazowy dziurkacz do biopsji, 5 mm</td><td>Miltex, Inc.</td><td>33-35</td><td></td></tr><tr><td>Pusty dziurkacz 16 mm</td><td>Neiko Tools</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Non-Tissue Culture Treated Plates, 24-dołkowe, płaskie dno</td><td>BD Biosciences</td><td>351147</td><td></td></tr><tr><td>Ultra-odporny na wilgoć arkusz polisulfonu do ładowania płyt</td><td>McMaster-Carr</td><td>86735k19</td><td>Obrabiany na zamówienie</td></tr></tbody></table>

projekt dwuosiowego bioreaktora obciążenia mechanicznego dla inżynierii tkankowej

Design of a Biaxial Mechanical Loading Bioreactor for Tissue Engineering

Zaprojektowaliśmy urządzenie ładujące, które jest w stanie zastosować jednoosiowe lub dwuosiowe naprężenia mechaniczne do biokompozytów inżynierii tkankowej wyprodukowanej do przeszczepu. Chociaż urządzenie działa przede wszystkim jako bioreaktor, który naśladuje rodzime naprężenia mechaniczne, jest również wyposażone w ogniwo obciążnikowe do dostarczania sprzężenia zwrotnego siły lub testowania mechanicznego konstrukcji. Urządzenie poddaje zmodyfikowane konstrukcje chrząstki dwuosiowemu obciążeniu mechanicznemu z dużą precyzją dawki obciążającej (amplitudy i częstotliwości) i jest wystarczająco kompaktowe, aby zmieścić się w standardowym inkubatorze do hodowli tkankowych. Ładuje próbki bezpośrednio do płytki do hodowli tkankowej, a wiele rozmiarów płytek jest kompatybilnych z systemem. Urządzenie zostało zaprojektowane przy użyciu komponentów wyprodukowanych do precyzyjnie naprowadzanych aplikacji laserowych. Obciążenie dwuosiowe odbywa się w dwóch prostopadłych etapach. Stopnie mają zakres przesuwu 50 mm i są napędzane niezależnie przez siłowniki silników krokowych, sterowane przez sterownik silnika krokowego w pętli zamkniętej, który posiada funkcję mikrokroków, umożliwiając rozmiary kroków mniejsze niż 50 nm. Polisulfonowa płyta ładująca jest połączona z dwuosiową ruchomą platformą. Ruchy stopni są kontrolowane przez oprogramowanie Thor-labs Advanced Positioning Technology (APT). Sterownik silnika krokowego służy wraz z oprogramowaniem do niezależnej i jednoczesnej regulacji parametrów obciążenia częstotliwością i amplitudą zarówno ścinania, jak i ściskania. Pozycyjne sprzężenie zwrotne jest zapewniane przez liniowe enkodery optyczne, które charakteryzują się dwukierunkową powtarzalnością 0,1 μm i rozdzielczością 20 nm, co przekłada się na dokładność pozycjonowania mniejszą niż 3 μm na pełnych 50 mm przesuwu. Enkodery te zapewniają niezbędne sprzężenie zwrotne położenia do elektroniki napędu, aby zapewnić prawdziwe możliwości nanopozycjonowania. Aby zapewnić sprzężenie zwrotne siły w celu wykrycia kontaktu i oceny reakcji na obciążenie, między płytą ładunkową a ruchomą platformą umieszczono precyzyjny miniaturowy czujnik wagowy. Czujnik wagowy charakteryzuje się wysoką dokładnością od 0,15% do 0,25% w pełnej skali.

Urządzenie przetestowano przy użyciu żeli agarozowych z zasiańmi chondrocytów w zagęszczeniu 20 milionów komórek/ml, hodowanych w warunkach jednoosiowego (ściskanie) lub dwuosiowego (ściskanie i ścinanie) obciążenia mechanicznego. Pierwotne chondrocyty świńskie wyizolowano z chrząstki stawowej świń w wieku 2-4 miesięcy. Próbki o średnicy 5 mm i grubości 1,5 mm hodowano w 2 ml zdefiniowanego chondrogennego medium hodowlanego (High glucose DMEM, 1% ITS+ Premix, 100 U/ml penicyliny, 100 μg/ml streptomycyny, 2 mM L-glutaminy...

Zaprojektowaliśmy nowatorski bioreaktor obciążenia mechanicznego, który może zastosować jednoosiowe lub dwuosiowe naprężenie mechaniczne do biokompozytu chrząstki przed przeszczepem do ubytku chrząstki stawowej.

Projekt dwuosiowego bioreaktora obciążenia mechanicznego dla inżynierii tkankowej

We  designed a loading device that is capable of applying uniaxial or biaxial  mechanical strain to a tissue engineered biocomposites fabricated for  ...

Ogólnym celem następnego eksperymentu jest wytworzenie funkcjonalnych biokompozytów z inżynierii tkankowej do transplantacji. Osiąga się to poprzez przykładanie precyzyjnego jednowymiarowego lub dwuwymiarowego odkształcenia mechanicznego w celu zapewnienia bodźców biofizycznych dla komórek w trójwymiarowych kompozytach biomateriałowych. W drugim kroku bioreaktor zostaje wyposażony w ogniwo obciążnikowe, które zapewnia sprzężenie zwrotne siły oraz umożliwia testowanie mechaniczne biokompozytów podczas obciążania.Następnie biokompozyty są hodowane przez okres kilku tygodni w celu wywołania makroskopowych zmian w zawartości biochemicznej konstrukcji; otrzymane wyniki wykazują wpływ różnych rodzajów obciążeń, opierając się na istotnych różnicach w zawartości glikozaminoglikanów i kolagenu, grubości rusztowania oraz module równowagi. Chociaż metoda ta może dostarczyć wiedzy na temat wpływu obciążenia dwuosiowego na inżynieryjną tkankę chrzęstną, można ją również zastosować do innych tkanek o niskim obciążeniu, takich jak kości i ścięgna. Procedurę tę zaprezentują Amy May i Rob Stefani z naszego laboratorium. Aby rozpocząć tę procedurę, należy przygotować dwuosiowy bioreaktor, jak pokaza

design-biaxial-mechanical-loading-bioreactor-for-tissue

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Bioinżynieria

Projekt bioreaktora z dwuosiowymi mechanicznymi obciążeniami dla inżynierii tkankowej

Nasz zespół opracował system hodowli w bioreaktorze, który naśladuje fizjologiczne naprężenia pulsacyjne układu sercowo-naczyniowego w celu regeneracji wszczepialnych zastążek naczyniowych o małej średnicy.

Projektowanie biologicznych przeszczepów naczyniowych z wykorzystaniem bioreaktora pulsacyjnego

Zaprojektowano cykliczny bioreaktor ciśnieniowy, który umożliwia poddawanie tkanki zastawek serca fizjologicznym oraz patologicznym warunkom ciśnieniowym. Program LabVIEW pozwala użytkownikom na kontrolowanie wartości, amplitudy oraz częstotliwości ciśnienia. Urządzenie to może być wykorzystywane do badania mechanobiologii tkanki zastawek serca lub izolowanych komórek.

Projekt cyklicznego bioreaktora ciśnieniowego do badań ex vivo zastawek tętniczych serca

Rusztowania otrzymane metodą elektroprzędzenia mogą być poddawane obróbce po produkcji w celu zastosowania ich w inżynierii tkankowej. W niniejszym opracowaniu opisujemy metody przędzenia złożonych rusztowań (poprzez przędzenie sekwencyjne), tworzenia rusztowań o większej grubości (poprzez nakładanie wielu warstw z wykorzystaniem wyżarzania termicznego lub parowego), zapewniania sterylności (produkcja aseptyczna lub sterylizacja po produkcji) oraz uzyskiwania odpowiednich właściwości...

Obróbka potransprodukcyjna włókien otrzymywanych metodą elektroprzędzenia do inżynierii tkankowej

Prezentujemy w tym artykule nowatorską platformę rozciągającą, która może być wykorzystana do badania reakcji pojedynczych komórek na złożone anizotropowe dwuosiowe deformacje mechaniczne i ilościowego określania właściwości mechanicznych tkanek biologicznych.

Nowatorska platforma do rozciągania do zastosowań w mechanobiologii komórek i tkanek

W tej pracy prezentujemy technikę szybkiego wytwarzania żywych tkanek naczyniowych poprzez bezpośrednią hodowlę kolagenu, komórek mięśni gładkich i komórek śródbłonka. Ponadto opisano nowy protokół charakterystyki mechanicznej zmodyfikowanych tkanek naczyniowych.

Inżynieria 3D cellularnych żeli kolagenowych do regeneracji tkanki naczyniowej

Tutaj prezentujemy protokół do opracowania czysto jednoosiowej maszyny ładującej. Zastosowano krytyczne aspekty projektowe w celu zapewnienia dokładnych i powtarzalnych wyników testów.

Zastosowanie aspektów projektowych w rozwoju jednoosiowych maszyn załadowczych

Trójwymiarowy jednoosiowy system bioreaktora do stymulacji mechanicznej jest idealnym bioreaktorem do specyficznego dla tenogenicznego różnicowania komórek macierzystych pochodzących ze ścięgien i tworzenia neościęgien.

Zastosowanie trójwymiarowego, jednoosiowego bioreaktora do stymulacji mechanicznej w celu indukowania różnicowania tenogennego komórek macierzystych pochodzących ze ścięgien

Celem tego protokołu jest przeprowadzenie dynamicznej ko-hodowli ludzkich makrofagów i miofibroblastów w rurowych rusztowaniach elektroprzędzonych w celu zbadania regeneracji tkanek sterowanej materiałem, przy użyciu bioreaktora, który umożliwia oddzielenie naprężeń ścinających od cyklicznego rozciągania.

Bioreaktor z wieloma wskazówkami do oceny zdolności zapalnej i regeneracyjnej biomateriałów poddanych przepływowi i rozciąganiu

Trójwymiarowe tkanki serca bioinżynieryjne wykorzystujące kardiomiocyty pochodzące z komórek macierzystych okazały się obiecującymi modelami do badania zdrowego i chorego ludzkiego mięśnia sercowego in vitro, jednocześnie podsumowując kluczowe aspekty rodzimej niszy sercowej. Manuskrypt ten opisuje protokół wytwarzania i analizy zmodyfikowanych tkanek serca o wysokiej zawartości wygenerowanych z ludzkich pluripotencjalnych kardiomiocytów pochodzących z komórek macierzystych.

Projektowanie bioreaktora w celu usprawnienia pozyskiwania danych i modelowania przepustowości zmodyfikowanych tkanek serca

Ten protokół przedstawia konfigurację i działanie nowo opracowanego, wydrukowanego w 3D bioreaktora do hodowli ex vivo naczyń krwionośnych w trakcie perfuzji. System został zaprojektowany tak, aby mógł być łatwo przyjęty przez innych użytkowników, praktyczny, niedrogi i możliwy do dostosowania do różnych zastosowań eksperymentalnych, takich jak podstawowa biologia i badania farmakologiczne.

Ex vivo Kultura perfuzyjna dużych naczyń krwionośnych w bioreaktorze wydrukowanym w 3D

Protokół ten określa generowanie organoidów z komórek nabłonka pęcherzykowego A549 oraz fibroblastów płuc MRC-5 na rusztowaniu hydrożelowym z macierzy zewnątrzkomórkowej, a następnie osadzenie w żelach kolagenowych 3D oraz ekspozycję na mechaniczne obciążenia za pomocą bioreaktora rozciągającego komórki do badania mechanobiologii pęcherzykowej.

Generowanie trójwymiarowych organoidów pęcherzykowych A549/MRC-5 z wykorzystaniem mechanicznego bioreaktora rozciągającego komórki

Poznaj metodę dwuosiowego obciążenia mechanicznego w inżynierii tkankowej chrząstki stawowej. Bioreaktor z komórką obciążeniową umożliwia precyzyjną kontrolę naprężeń i poprawę właściwości biochemicznych kompozytów.

Projekt dwuosiowego bioreaktora obciążenia mechanicznego dla inżynierii tkankowej

Przeglądaj więcej filmów