Izolacja, przetwarzanie i analiza mysich komórek dziąseł

Ogólnym celem niniejszej procedury jest precyzyjna izolacja i opracowanie dziąsła mirin do dalszej analizy metodą cytometrii przepływowej. Osiąga się to poprzez najpierw skrupulatną chirurgiczną izolację dziąsła. Następnie wycięta tkanka jest przetwarzana w celu przygotowania zawiesiny pojedynczych komórek.

Następnie przeprowadza się barwienie zewnątrzkomórkowe i wewnątrzkomórkowe przeciwciałami. Na koniec próbka jest analizowana za pomocą cytometrii przepływowej. W rezultacie, dzięki analizie cytometrycznej, można uzyskać wyniki obrazujące różne populacje komórek w dziąsłach oraz zmiany komórkowe zachodzące w tkance po narażeniu na bodziec immunologiczny.

Główną zaletą tej techniki w porównaniu do innych metod, takich jak w chemii OC czy w fluorescencji mono, jest to, że stanowi ona szybką i prostą metodę analizy dużej liczby komórek, umożliwiając jednoczesną analizę kilku zmiennych, a także sortowanie różnych typów komórek do dalszych eksperymentów. Metoda ta może pomóc w udzieleniu odpowiedzi na kluczowe pytania z dziedziny immunologii, takie jak wpływ mikroorganizmów na homeostazę dziąseł oraz związek tego procesu z indukowaną stanem zapalnym utratą kości w eksperymentalnym modelu paradontozy. Pomysł zastosowania tej metody pojawił się, gdy zaczęliśmy badać rolę komórek RI podczas paradontozy. Wizualna prezentacja tej metody jest kluczowa, ponieważ technika przyspieszania genu GVA jest trudna do opanowania ze względu na niewielki rozmiar i stosunkowo utrudniony dostęp do MU one J gva.

Aby rozpocząć, należy przygotować roztwory pożywek oraz wysterylizowane narzędzia chirurgiczne zgodnie z protokołem tekstowym. Po uśmierceniu myszy, zgodnie z metodami zatwierdzonymi przez komisję ds. opieki i użytkowania zwierząt w danej instytucji, należy użyć ostrych, tępych nożyczek prostych, aby naciąć obie strony jamy ustnej, w tym policzki i gałąź żuchwy, a następnie odsunąć żuchwę, prowadząc standardowe nożyczki prostopadle do płaszczyzny kości podniebienia. Należy przeciąć tkanki miękkie i twarde wzdłuż linii wyobrażonej, 1 mm za trzecimi trzonowcami.

Następnie wykonaj nacięcie w tkankach miękkich i twardych, dwa milimetry za siekaczami. Następnie odciągnij przednią część jamy ustnej, aby odsłonić jamę nosową, prowadząc nożyczki równolegle do podniebienia. Umieść jeden zacisk hemostatyczny w jamie nosowej, a za pomocą drugiego wykonaj nacięcie w przedsionku, przecinając tkankę aż do tylnego nacięcia.

Powtórz nacięcie po drugiej stronie szczęki, aby oddzielić ją od czaszki. Następnie przetnij ją przez środek i za pomocą nożyczek i pęsety wytnij tkankę podniebienną z każdej połowy szczęki, aby odsłonić kość jamistą. Oddziel tkanki dziąsłowe od przedniego brzegu i umieść je na płytce z PBS i 2% płodową surowicą cielęcą lub FCS; aby przetworzyć dziąsła, przenieś je do naczynia hodowlanego z 1 ml PBS, 2 mg/ml kolagenazy typu II oraz 1 mg/ml DNazy.

Rozdrobnij tkankę za pomocą sterylnego skalpela z ostrzem nr 15. Dokładnie posiekaj tkankę przed przeniesieniem jej do stożkowatej probówki o pojemności 15 ml. Przemyj płytkę jednym mililitrem PBS/ FCS, aby zebrać pozostałe komórki tkankowe, i przenieś zawiesinę do probówki.

Inkubować tkankę w wstępnie podgrzanym inkubatorze z wytrząsaniem w temperaturze 37 °C i 200 RPM przez 20 minut. Następnie dodać 20 µL 0,5 M EDTA i inkubować przez kolejne 10 minut. Następnie uzupełnić objętość do 12 mL za pomocą P-B-S-F-C-S i odwirować próbkę w temperaturze 4 °C, 400 ×g przez osiem minut.

Po usunięciu nadsączu, resuspensuj komórki w 2 mL PBS-FCS. Przefiltruj próbkę przez sitko komórkowe o oczkach 70 µm, a następnie odwirowuj odciek w temperaturze 4 °C przy 320 ×g przez 5 minut. Ponownie resuspenduj komórki w 300 µL PBS-FCS.

Na koniec, pracując w komorze z laminarnym przepływem powietrza w niskiej temperaturze i przy wyłączonym oświetleniu, należy policzyć komórki w całkowitej objętości 100 µL, dodać od 0,2 do 0,5 µg każdego wybranego przeciwciała na 1×10⁶ komórek i krótko wymieszać na wirówce vortex. Po inkubacji próbek w temperaturze 4 °C przez 15 minut w ciemności, należy dodać 2 mL PBS-FCS i wirować przy 320 ×g w temperaturze 4 °C przez 5 minut. Aby utrwalić komórki, należy odessać nadsącz, a następnie, podczas mieszania na wirówce vortex, resuspender je, dodając kroplami 500 µL zimnego BD CytoPerms.

W celu oceny efektów cytologicznych inkubować probówki w temperaturze 4°C w ciemności przez 40 minut, a następnie poddać wirowaniu w mieszadle vortex. Następnie dodać 1 mL buforu piorącego BD perm wash i wirować przy 800 ×g w temperaturze 4°C przez 7 minut. Po powtórzeniu etapu płukania odessać cały bufor, pozostawiając 300 µL.

Następnie, aby przeprowadzić barwienie wewnątrzkomórkowe w całkowitej objętości 100 µL, należy dodać po 1 µg wybranego przeciwciała na 1×10⁶ komórek. Krótko wymieszać w wirówce typu vortex i inkubować w ciemności przez 30 minut. Po dwukrotnym przemyciu komórek w sposób opisany wcześniej i usunięciu całego supernatantu, komórki należy resuspendować w 300 µL świeżego, zimnego buforu BD perm wash.

Po krótkim wymieszaniu w wirówce vortex, przefiltruj zawiesinę do probówek fax. Przechowuj probówki w lodzie lub w lodówce w ciemności do momentu przeprowadzenia analizy fax. Komórki dziąseł połączone z dwóch myszy naiwnych.

Analizy przeprowadzono na cytometrze przepływowym LSR two, a uzyskane dane analizowano przy użyciu oprogramowania FlowJo. Przedstawione tutaj wykresy rozproszenia bocznego (side scatter) i przedniego (forward scatter) obrazują rozkład komórek. W celach porównawczych wskazano strategię bramkowania służącą do identyfikacji limfocytów, monocytów, komórek dendrytycznych oraz granulocytów.

Rysunek ten przedstawia wykres FACS ilustrujący komórki dziąseł oczyszczone z myszy zainfekowanych P gingivalis 21 dni po podaniu doustnym w modelu eksperymentalnego zapalenia przyzębia. U zainfekowanych myszy, w porównaniu z przedstawionymi tutaj myszami naiwnymi, można łatwo wykryć wzrost liczebności różnych populacji komórek odpornościowych. Komórki odpornościowe w przetworzonej tkance dziąsła są identyfikowane poprzez bramkowanie komórek wykazujących ekspresję markera hematopoetycznego CD 45.

Komórki te zostały następnie wyodrębnione w postaci limfocytów T CD3+, przedstawionych na tej rycinie. Neutrofile zidentyfikowano na podstawie ekspresji cząsteczek Ly6G i CD11b. Na koniec, komórki Langerhansa oraz epiteliatny podtyp komórek dendrytycznych zidentyfikowano poprzez bramkowanie komórek MHC klasy II+ CD11c+ oraz analizę ekspresji EPCAM i CD207. Po opanowaniu tej techniki, przy prawidłowym postępowaniu zgodnie z opisaną procedurą, można ją przeprowadzić w czasie od trzech i pół do pięciu godzin.

W celu udzielenia odpowiedzi na dodatkowe pytania, takie jak ekspresja genów w pojedynczych komórkach, można przeprowadzić inne metody, np. RT-PCR. Technika ta utorowała drogę badaczom w dziedzinie immunologii do zbadania lokalnej odpowiedzi GVA dziąseł na wszelkie bodźce szkodliwe w badaniach nad chorobami przyzębia. Metoda ta pozwoliła nam wyjaśnić rolę komórek odpornościowych i nieodpornościowych GVA dziąseł w patogenezie eksperymentalnego zapalenia przyzębia.

Po obejrzeniu tego filmu powinni Państwo posiadać solidną wiedzę na temat izolacji i przetwarzania GVA z moczu w celu uzyskania zawiesiny pojedynczych komórek, która następnie zostanie poddana barwieniu zewnątrz- i wewnątrzkomórkowemu na obecność wirusów w celu analizy cytometrycznej.