Name: Izolacja, przetwarzanie i analiza mysich komórek dziąseł (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-07-02T14:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 47 s
Description: Naucz się izolować i przetwarzać mysie dziąsła w celu uzyskania jednokomórkowej zawiesiny do analizy cytometrii przepływowej. Ta technika umożliwia badanie populacji komórkowych i odpowiedzi immunologicznych w tkance dziąsłowej.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Te badania były wspierane przez granty z Izraelskiej Fundacji Naukowej (nr 1418/11) dla AHH i (nr 1933/12) dla AW, Niemiecko-Izraelskiej Fundacji dla młodych badaczy (GIF Young) dla AHH, oraz Dr. I. Cabakoff Research Endowment Fund na Uniwersytecie Hebrajskim-Hadassah School of Dental Medicine dla AHH i AW.

Przygotuj się z wyprzedzeniem:
<ul>
	<li>PBS + 2% FCS</li>
	<li>PBS + 2% FCS z 2 mg/ml kolagenazy typu II i 1 mg/ml DNAzy typu I (1 ml na próbkę)</li>
	<li>Sterylizowane narzędzia chirurgiczne</li>
	<li>0,5 M roztwór EDTA</li>
</ul>
1. Technika wycięcia górnego dziąsła
<ol>
	<li>Poddaj myszy eutanazji zgodnie z zatwierdzonymi wytycznymi IACUC.</li>
	<li>Przetnij obie strony jamy ustnej, w tym policzki i ramus żuchwy, ostrymi/prostymi nożyczkami.</li>
	<li>Pociągnij żuchwę w dół.</li>
	<li>Przetnij miękkie i twarde tkanki w wyimaginowaną linię 1 mm za trzecimi zębami trzonowymi za trzecimi zębami trzonowymi. Skieruj nożyczki prostopadle do płaszczyzny kości podniebiennej (ryc. 2A, niebieskie linie).</li>
	<li>Naciąć tkanki miękkie i twarde 2 mm za siekaczami (ryc. 2A, niebieskie linie).</li>
	<li>Pociągnij w dół przednią część ust. Jama nosowa jest widoczna po tym kroku.</li>
	<li>Umieść nożyczki równolegle do podniebienia, włóż jedno ostrze do jamy nosowej, drugie ostrze powinno naciąć w przedsionku. Ciąć aż do tylnego nacięcia (ryc. 2A, zielone linie). Powtórz ten krok po obu stronach szczęki. Na końcu szczęka jest odłączona od reszty czaszki (ryc. 2B).</li>
	<li>Usuń szczękę, przetnij ją w środkowym szwie (ryc. 2, przerywana linia) i przytnij tkankę podniebienną każdej półszczęki, aż dotrze do kości wyrostka zębodołowego.</li>
	<li>Oderwij tkanki dziąseł (obie półszczęki) od ich przedniej granicy za pomocą kleszczy Adson (bez zębów).</li>
	<li>Umieść wycięte dziąsło w talerzu z PBS + 2% FCS.</li>
</ol>
2. Przetwarzanie dziąseł
<ol>
	<li>Wycięte dziąsło umieścić w naczyniu do hodowli tkankowej (35 x 10 mm) z 1 ml PBS + 2% FCS, 2 mg/ml kolagenazy typu II i 1 mg/ml DNAzy typu I.</li>
	<li>Dokładnie zmiel tkankę za pomocą sterylnego ostrza chirurgicznego N°15.</li>
	<li>Przenieść tkankę z płytki do stożkowej probówki o pojemności 15 ml.</li>
	<li>Tkankę/komórki pozostałe na płytce przemyć 1 ml PBS + 2% FCS i przenieść do tej samej probówki.</li>
	<li>Inkubować w inkubatorze z wytrząsarką przez 20 minut w temperaturze 37 °C, 200 obr./min (zalecenie: podgrzać inkubator).</li>
	<li>Dodać 20 μl EDTA 0,5 M i inkubować przez kolejne 10 minut w temperaturze 37 °C, 200 obr./min.</li>
	<li>Napełnij probówkę do 12 ml PBS + 2% FCS i odwiruj w temperaturze 4 °C, 400 x g przez 8 minut (zalecenie: wstępne schłodzenie wirówki).</li>
	<li>Usunąć supernatant i ponownie zawiesić komórki za pomocą 2 ml PBS + 2% FCS.</li>
	<li>Przefiltruj próbkę za pomocą sitka komórkowego o wielkości 70 μm i zaoszczędź przepływ.</li>
	<li>Wirować w temperaturze 4 °C, 320 x g przez 5 min.</li>
	<li>Usunąć supernatant i ponownie zawiesić komórki za pomocą 300 μl PBS + 2% FCS.</li>
	<li>Policz komórki (oczekuje się, że z pojedynczej szczęki będzie około 5-10 x10 5 komórek).</li>
</ol>
3. Barwienie przeciwciał zewnątrzkomórkowych i wewnątrzkomórkowych do analizy cytometrii przepływowej
Zaleca się pracę wewnątrz okapu, przy wyłączonym świetle. Bardzo ważne jest, aby ogniwa były utrzymywane w stałym chłodnym środowisku, a także wszystkie potrzebne materiały.
<ol>
	<li>Wybarwić komórki przeciwko cząsteczkom zewnątrzkomórkowym, dodając 0,2-0,5 μg każdego wybranego przeciwciała na 1 x 106 komórek w łącznej objętości 100 μl.</li>
	<li>Wiruj krótko.</li>
	<li>Inkubować probówki przez 15 minut w ciemności w temperaturze 4 °C.</li>
	<li>Umyj komórki 2 ml PBS + 2% FCS.</li>
	<li>Wirować w temperaturze 4 °C, 320 x g przez 5 min.</li>
	<li>Odessać supernatant i ponownie zawiesić komórki, dodając kroplami 500 μl zimnego BD Cytoperm/Cytofix podczas wirowania.</li>
	<li>Inkubować probówki przez 40 minut w temperaturze 4 °C w ciemności.</li>
	<li>Wiruj krótko.</li>
	<li>Przemyć komórki dwukrotnie 1 ml zimnego buforu do trwałej ondulacji/przemywania BD i wirować w temperaturze 800 x g przez 7 minut w temperaturze 4 °C.</li>
	<li>Odsysać supernatant z wyjątkiem 300 μl.</li>
	<li>Wybarwiaj komórki wewnątrzkomórkowo, dodając 1 μg każdego wybranego przeciwciała na 1 x 106 komórek w łącznej objętości 100 μl.</li>
	<li>Wiruj krótko.</li>
	<li>Inkubować przez 30 minut w ciemności w temperaturze 4 °C.</li>
	<li>Przemyć komórki dwukrotnie 1 ml zimnego buforu do trwałej ondulacji/przemywania BD i wirować w temperaturze 800 x g przez 7 minut w temperaturze 4 °C.</li>
	<li>Odessać supernatant i ponownie zawiesić komórki, dodając 300 μl zimnego buforu BD Perm/Wash.</li>
	<li>Wiruj krótko.</li>
	<li>Przenieść zawiesinę podczas filtrowania do probówek FACS.</li>
	<li>Trzymaj probówki w ciemnym i zimnym miejscu do czasu analizy.</li>
</ol>

<ol><li>Arizon, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Langerhans+cells+down-regulate+inflammation-driven+alveolar+bone+loss%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Langerhans cells down-regulate inflammation-driven alveolar bone loss.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 109, 7043-7048 (2012).</li>
<li>Listgarten, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pathogenesis+of+periodontitis%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Clin.+Periodontol%22%5BJournal%5D)">Pathogenesis of periodontitis.</a> J. Clin. Periodontol. 13, 418-430 (1986).</li>
<li>Kinane, D. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Causation+and+pathogenesis+of+periodontal+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Periodontol%22%5BJournal%5D)">Causation and pathogenesis of periodontal disease.</a> Periodontol. 25, 8-20 (2000).</li>
<li>Jotwani, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mature+dendritic+cells+infiltrate+the+T+cell-rich+region+of+oral+mucosa+in+chronic+periodontitis%3A+in+situ%2C+in+vivo%2C+and+in+vitro+studies%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Immunol%22%5BJournal%5D)">Mature dendritic cells infiltrate the T cell-rich region of oral mucosa in chronic periodontitis: in situ, in vivo, and in vitro studies.</a> J. Immunol. 167, 4693-4700 (2001).</li>
<li>Graves, D. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Interleukin-1+and+tumor+necrosis+factor+antagonists+inhibit+the+progression+of+inflammatory+cell+infiltration+toward+alveolar+bone+in+experimental+periodontitis%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Periodontol%22%5BJournal%5D)">Interleukin-1 and tumor necrosis factor antagonists inhibit the progression of inflammatory cell infiltration toward alveolar bone in experimental periodontitis.</a> J. Periodontol. 69, 1419-1425 (1998).</li>
<li>Kabashima, H., Yoneda, M., Nagata, K., Hirofuji, T., Maeda, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+presence+of+chemokine+%28MCP-1%2C+MIP-1alpha%2C+MIP-1beta%2C+IP-10%2C+RANTES%29-positive+cells+and+chemokine+receptor+%28CCR5%2C+CXCR3%29-positive+cells+in+inflamed+human+gingival+tissues%5BTitle%5D)+AND+%22Cytokine%22%5BJournal%5D)">The presence of chemokine (MCP-1, MIP-1alpha, MIP-1beta, IP-10, RANTES)-positive cells and chemokine receptor (CCR5, CXCR3)-positive cells in inflamed human gingival tissues.</a> Cytokine. 20, 70-77 (2002).</li>
<li>Moughal, N. A., Adonogianaki, E., Kinane, D. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Langerhans+cell+dynamics+in+human+gingiva+during+experimentally+induced+inflammation%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biol.+Buccale%22%5BJournal%5D)">Langerhans cell dynamics in human gingiva during experimentally induced inflammation.</a> J. Biol. Buccale. 20, 163-167 (1992).</li>
<li>Cochran, D. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inflammation+and+bone+loss+in+periodontal+disease%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Periodontol%22%5BJournal%5D)">Inflammation and bone loss in periodontal disease.</a> J. Periodontol. 79, 1569-1576 (2008).</li>
<li>Taubman, M. A., Valverde, P., Han, X., Kawai, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Immune+response%3A+the+key+to+bone+resorption+in+periodontal+disease%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Periodontol%22%5BJournal%5D)">Immune response: the key to bone resorption in periodontal disease.</a> J. Periodontol. 76, 2033-2041 (2005).</li>
<li>Graves, D. T., Kang, J., Andriankaja, O., Wada, K., Rossa, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Animal+models+to+study+host-bacteria+interactions+involved+in+periodontitis%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Oral+Biol%22%5BJournal%5D)">Animal models to study host-bacteria interactions involved in periodontitis.</a> Front Oral Biol. 15, 117-132 (2012).</li>
</ol>

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Tkanki dziąsła szczęki uzyskane od pojedynczej myszy są wystarczające do analizy subpopulacji limfocytów T i B, a także ich zdolności do ekspresji cząsteczek zewnątrzkomórkowych i wewnątrzkomórkowych, jak opisaliśmy wcześniej 1. Niemniej jednak, jeśli interesujące są rzadkie populacje komórek (na przykład DC), zaleca się pobranie tkanek od 2-3 myszy. Warto zauważyć, że jeśli jest to preferowane, możliwe jest obranie zarówno tkanek podniebiennych, jak i dziąseł, a następnie wycięcie dziąsła (modyfikacja kroku 1...

Dziąsło to miękka tkanka otaczająca szyjkową część zębów i pokrywająca wyrostek zębodołowy (Rysunek 1). Dziąsło jest rodzajem błony śluzowej żucia, którą można dalej podzielić na nabłonek błony śluzowej i tkankę łączną (znaną również jako błona podśluzowa lub blaszka właściwa). Anatomiczna budowa dziąsła i sąsiednich zębów pozwala bakteriom na przebywanie i rozwój płytki nazębnej (biofilmu), która stale stanowi wyzwanie dla miejscowego układu odpornościowego. W rezultacie w dziąśle rozwija się reakcja zapalna, która w pewnych okolicznościach staje się destrukcyjna - stan określany jako choroby przyzębia 2. Zasadniczo patologie przyzębia wywołane blaszką miażdżycową można podzielić na zapalenie dziąseł i zapalenie przyzębia. Zapalenie dziąseł stanowi odwracalny stan miejscowej reakcji zapalnej, który jest ograniczony do dziąsła. Z drugiej strony zapalenie przyzębia jest nieodwracalnym procesem destrukcyjnym, w którym dochodzi do zniszczenia aparatu mocującego (kości wyrostka zębodołowego, więzadła przyzębia, cementu i dziąseł) 3.
Zaproponowano, aby dziąsło służyło zarówno jako miejsce efektorowe, jak i indukcyjne podczas chorób przyzębia 4. Badania na ludziach sugerują, że w odpowiedzi na płytkę nazębną, komórki i cząsteczki efektorowe układu odpornościowego dynamicznie infiltrują lub opuszczają dziąsło 5-7. Wykazano, że aktywność ta odgrywa główną rolę w niszczeniu przyzębia 8,9. Podczas gdy dane uzyskane w wyniku tych badań dostarczyły cennych informacji na temat tego patologicznego procesu, praca z tkankami ludzkimi ma poważne ograniczenia etyczne, techniczne i eksperymentalne. Opracowanie modeli eksperymentalnych umożliwiło przeprowadzenie eksperymentów przyczynowo-skutkowych z wykorzystaniem myszy transgenicznych i interwencji in vivo 10. W rezultacie w ciągu ostatnich dwóch dekad nasza wiedza na temat mechanizmów związanych z chorobami przyzębia znacznie wzrosła. Mimo to, ze względu na złożoność chorób przyzębia, toczy się debata na temat charakteru miejscowej odpowiedzi immunologicznej ułatwiającej niszczenie tkanek. Brakuje również naszej wiedzy na temat funkcji ośrodkowych komórek odpornościowych w dziąśle podczas chorób przyzębia. Dlatego tak ważne jest zbadanie patologicznych zdarzeń zapalnych występujących w tkance docelowej choroby, czyli dziąśle.

<table><tbody><tr><td>Kolagenaza typu II</td><td>Worthington Biochemical Corp.</td><td>CLS-2</td><td></td></tr><tr><td>DNAse I</td><td>SIGMA</td><td>DN25-1G</td><td></td></tr><tr><td>EDTA</td><td>SIGMA</td><td>E6758-100G</td><td></td></tr><tr><td>Dulbecco's PBS</td><td>SIGMA</td><td>D8537</td><td></td></tr><tr><td>Surowica bydlęca </td> płodu <td>Przemysł biologiczny</td><td>04-121-1</td><td>Inaktywowany termicznie</td></tr><tr><td>filtr próżniowy</td><td>Jet Biofil</td><td>FPE-204-500</td><td></td></tr><tr><td>5 ml Polistyren okrągłodenny Rurka</td><td>BD Falcon</td><td>352052</td><td></td></tr><tr><td>sitko do komórek 70 &mu; m</td><td>SPL Lifesciences</td><td>93070</td><td></td></tr><tr><td>Naczynie do hodowli tkankowych 35&#215; 10 mm</td><td>NUNC</td><td>153066</td><td></td></tr><tr><td>BD Cytofix/Cytoperm Przeciwciało</td><td>przeciw</td><td></td> mysim CD11c 554714 <td></td></tr><tr><td></td><td>Klon Biolegend</td><td>117305</td><td>Przeciwciało</td></tr><tr><td>przeciw myszym CD45.2</td><td>Biolegend</td><td>109819</td><td>Klon 104</td></tr><tr><td>Przeciwciało anty-mysie CD4</td><td>Biolegend</td><td>100413</td><td>Klon GK1.5</td></tr><tr><td>Przeciwciało anty-mysie CD8a</td><td>Biolegend</td><td>100733</td><td>Klon 53-6.7</td></tr><tr><td>Przeciwciało anty-mysie CD3</td><td>Klon Biolegend</td><td>100214</td><td>17A2</td></tr><tr><td>Przeciwciało anty-mysie CD326 (Ep-CAM)</td> Klon <td>Biolegend</td><td>118219</td><td>G8.8</td></tr><tr><td>Przeciwciało przeciw myszom CD207 (Langerin)</td><td>Imgenex</td><td>DDX0362D</td><td>Clone 929F3.01</td></tr><tr><td>Anty-mysie I-Ad (MHC-II) antobody</td><td>Biolegend</td><td>115010</td><td>Klon 39-10-8</td></tr><tr><td>Cytometr przepływowy LSR II</td><td>BD Biosciences</td><td></td><td></td></tr><tr><td>FlowJo Software v 7.6.5</td><td>Tree Star</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

izolacja, przetwarzanie i analiza mysich komórek dziąseł

Isolation, Processing and Analysis of Murine Gingival Cells

Opracowaliśmy technikę precyzyjnego izolowania i przetwarzania mysiej tkanki dziąseł do cytometrii przepływowej i badań molekularnych. Dziąsło jest unikalną i ważną tkanką do badania mechanizmów immunologicznych, ponieważ bierze udział w odpowiedzi immunologicznej gospodarza na biofilm jamy ustnej, który może powodować choroby przyzębia. Co więcej, bliskie sąsiedztwo dziąsła z tkanką kostną wyrostka zębodołowego umożliwia również badanie przebudowy kości w stanach zapalnych. Nasza metoda daje dużą liczbę komórek odpornościowych, co pozwala na analizę nawet rzadkich populacji komórek, takich jak komórki Langerhansa i limfocyty regulatorowe T, jak wykazaliśmy wcześniej 1. Wykorzystanie myszy do badania lokalnych odpowiedzi immunologicznych zaangażowanych w utratę kości wyrostka zębodołowego podczas chorób przyzębia jest korzystne ze względu na dostępność różnych narzędzi immunologicznych i eksperymentalnych. Niemniej jednak, ze względu na ich niewielkie rozmiary i stosunkowo niewygodny dostęp do mysiego dziąsła, w wielu badaniach unikano badania tej krytycznej tkanki. Metoda opisana w tej pracy może ułatwić analizę dziąseł, co, miejmy nadzieję, zwiększy nasze zrozumienie na temat układu odpornościowego jamy ustnej i jego roli podczas chorób przyzębia.

Przedstawiono przykłady analizy cytometrii przepływowej komórek dziąseł. Komórki dziąseł zebrane z 2 myszy przeanalizowano za pomocą cytometru przepływowego LSR II oraz oprogramowania FlowJo. Rysunek 3A obrazuje rozkład komórek dziąseł z myszy naiwnych na wykresie rozproszenia bocznego (SSC) względem rozproszenia przedniego (FSC). Wskazano strategię bramkowania w celu identyfikacji (i) limfocytów, (ii) monocytów / komórek dendrytycznych oraz (iii) granulocytów. W celu porównania przedstawiono również wyk...

To badanie opisuje skuteczną technikę izolowania i przetwarzania tkanek dziąseł z jamy ustnej myszy w celu wytworzenia hodowli jednokomórkowej. Uzyskane w ten sposób komórki mogą być dalej wykorzystywane do analizy cytometrii przepływowej i badań molekularnych.

Izolacja, przetwarzanie i analiza mysich komórek dziąseł

We have developed a technique to precisely isolate and process murine gingival tissue for flow cytometry and molecular studies. The gingiva is a unique ...

Ogólnym celem niniejszej procedury jest precyzyjna izolacja i opracowanie dziąsła mirin do dalszej analizy metodą cytometrii przepływowej. Osiąga się to poprzez najpierw skrupulatną chirurgiczną izolację dziąsła. Następnie wycięta tkanka jest przetwarzana w celu przygotowania zawiesiny pojedynczych komórek.Następnie przeprowadza się barwienie zewnątrzkomórkowe i wewnątrzkomórkowe przeciwciałami. Na koniec próbka jest analizowana za pomocą cytometrii przepływowej. W rezultacie, dzięki analizie cytometrycznej, można uzyskać wyniki obrazujące różne populacje komórek w dziąsłach oraz zmiany komórkowe zachodzące w tkance po narażeniu na bodziec immunologiczny.Główną zaletą tej techniki w porównaniu do innych metod, takich jak w chemii OC czy w fluorescencji mono, jest to, że stanowi ona szybką i prostą metodę analizy dużej liczby komórek, umożliwiając jednoczesną analizę kilku zmiennych, a także sortowanie różnych typów komórek do dalszych eksperymentów. Metoda ta może pomóc w udzieleniu odpowiedzi na kluczowe pytania z dziedziny immunologii, takie jak wpływ mikroorganizmów na homeostazę dziąseł oraz związek tego procesu z indukowaną stanem zapalnym utratą kości w eksperymentalnym modelu paradontozy. Pomysł zastosowania tej metody pojawił się, gdy zaczęliśmy badać rolę komórek RI podczas paradontozy. Wizualna prezentacja tej metody jest kluczowa, ponieważ technika przyspieszania genu GVA jest trudna do opanowania ze względu na niewielki rozmiar i stosunkowo utrudniony dostęp do MU one J gva.Aby rozpocząć, należy przygotować roztwory pożywek oraz wysterylizowane narzędzia chirurgiczne zgodnie z protokołem tekstowym. Po uśmierceniu myszy, zgodnie z metodami zatwierdzonymi przez komisję ds. opieki i użytkowania zwierząt w danej instytucji, należy użyć ostrych, tępych nożyczek prostych, aby naciąć obie strony jamy ustnej, w tym policzki i gałąź żuchwy, a następnie odsunąć żuchwę, prowadząc standardowe nożyczki prostopadle do płaszczyzny kości podniebienia. Należy przeciąć tkanki miękkie i twarde wzdłuż linii wyobrażonej, 1 mm za trzecimi trzonowcami.Następnie wykonaj nacięcie w tkankach miękkich i twardych, dwa milimetry za siekaczami. Następnie odciągnij przednią część jamy ustnej, aby odsłonić jamę nosową, prowadząc nożyczki równolegle do podniebienia. Umieść jeden zacisk hemostatyczny w jamie nosowej, a za pomocą drugiego wykonaj nacięcie w przedsionku, przecinając tkankę aż do tylnego nacięcia.Powtórz nacięcie po drugiej stronie szczęki, aby oddzielić ją od czaszki. Następnie przetnij ją przez środek i za pomocą nożyczek i pęsety wytnij tkankę podniebienną z każdej połowy szczęki, aby odsłonić kość jamistą. Oddziel tkanki dziąsłowe od przedniego brzegu i umieść je na płytce z PBS i 2% płodową surowicą cielęcą lub FCS; aby przetworzyć dziąsła, przenieś je do naczynia hodowlanego z 1 ml PBS, 2 mg/ml kolagenazy typu II oraz 1 mg/ml DNazy.Rozdrobnij tkankę za pomocą sterylnego skalpela z ostrzem nr 15. Dokładnie posiekaj tkankę przed przeniesieniem jej do stożkowatej probówki o pojemności 15 ml. Przemyj płytkę jednym mililitrem PBS/ FCS, aby zebrać pozostałe komórki tkankowe, i przenieś zawiesinę do probówki.Inkubować tkankę w wstępnie podgrzanym inkubatorze z wytrząsaniem w temperaturze 37 °C i 200 RPM przez 20 minut. Następnie dodać 20 µL 0,5 M EDTA i inkubować przez kolejne 10 minut. Następnie uzupełnić objętość do 12 mL za pomocą P-B-S-F-C-S i odwirować próbkę w temperaturze 4 °C, 400 ×g przez osiem minut.Po usunięciu nadsączu, resuspensuj komórki w 2 mL PBS-FCS. Przefiltruj próbkę przez sitko komórkowe o oczkach 70 µm, a następnie odwirowuj odciek w temperaturze 4 °C przy 320 ×g przez 5 minut. Ponownie resuspenduj komórki w 300 µL PBS-FCS.Na koniec, pracując w komorze z laminarnym przepływem powietrza w niskiej temperaturze i przy wyłączonym oświetleniu, należy policzyć komórki w całkowitej objętości 100 µL, dodać od 0,2 do 0,5 µg każdego wybranego przeciwciała na 1×10⁶ komórek i krótko wymieszać na wirówce vortex. Po inkubacji próbek w temperaturze 4 °C przez 15 minut w ciemności, należy dodać 2 mL PBS-FCS i wirować przy 320 ×g w temperaturze 4 °C przez 5 minut. Aby utrwalić komórki, należy odessać nadsącz, a następnie, podczas mieszania na wirówce vortex, resuspender je, dodając kroplami 500 µL zimnego BD CytoPerms.W celu oceny efektów cytologicznych inkubować probówki w temperaturze 4°C w ciemności przez 40 minut, a następnie poddać wirowaniu w mieszadle vortex. Następnie dodać 1 mL buforu piorącego BD perm wash i wirować przy 800 ×g w temperaturze 4°C przez 7 minut. Po powtórzeniu etapu płukania odessać cały bufor, pozostawiając 300 µL.Następnie, aby przeprowadzić barwienie wewnątrzkomórkowe w całkowitej objętości 100 µL, należy dodać po 1 µg wybranego przeciwciała na 1×10⁶ komórek. Krótko wymieszać w wirówce typu vortex i inkubować w ciemności przez 30 minut. Po dwukrotnym przemyciu komórek w sposób opisany wcześniej i usunięciu całego supernatantu, komórki należy resuspendować w 300 µL świeżego, zimnego buforu BD perm wash.Po krótkim wymieszaniu w wirówce vortex, przefiltruj zawiesinę do probówek fax. Przechowuj probówki w lodzie lub w lodówce w ciemności do momentu przeprowadzenia analizy fax. Komórki dziąseł połączone z dwóch myszy naiwnych.Analizy przeprowadzono na cytometrze przepływowym LSR two, a uzyskane dane analizowano przy użyciu oprogramowania FlowJo. Przedstawione tutaj wykresy rozproszenia bocznego (side scatter) i przedniego (forward scatter) obrazują rozkład komórek. W celach porównawczych wskazano strategię bramkowania służącą do identyfikacji limfocytów, monocytów, komórek dendrytycznych oraz granulocytów.Rysunek ten przedstawia wykres FACS ilustrujący komórki dziąseł oczyszczone z myszy zainfekowanych P gingivalis 21 dni po podaniu doustnym w modelu eksperymentalnego zapalenia przyzębia. U zainfekowanych myszy, w porównaniu z przedstawionymi tutaj myszami naiwnymi, można łatwo wykryć wzrost liczebności różnych populacji komórek odpornościowych. Komórki odpornościowe w przetworzonej tkance dziąsła są identyfikowane poprzez bramkowanie komórek wykazujących ekspresję markera hematopoetycznego CD 45.Komórki te zostały następnie wyodrębnione w postaci limfocytów T CD3+, przedstawionych na tej rycinie. Neutrofile zidentyfikowano na podstawie ekspresji cząsteczek Ly6G i CD11b. Na koniec, komórki Langerhansa oraz epiteliatny podtyp komórek dendrytycznych zidentyfikowano poprzez bramkowanie komórek MHC klasy II+ CD11c+ oraz analizę ekspresji EPCAM i CD207. Po opanowaniu tej techniki, przy prawidłowym postępowaniu zgodnie z opisaną procedurą, można ją przeprowadzić w czasie od trzech i pół do pięciu godzin.W celu udzielenia odpowiedzi na dodatkowe pytania, takie jak ekspresja genów w pojedynczych komórkach, można przeprowadzić inne metody, np. RT-PCR. Technika ta utorowała drogę badaczom w dziedzinie immunologii do zbadania lokalnej odpowiedzi GVA dziąseł na wszelkie bodźce szkodliwe w badaniach nad chorobami przyzębia. Metoda ta pozwoliła nam wyjaśnić rolę komórek odpornościowych i nieodpornościowych GVA dziąseł w patogenezie eksperymentalnego zapalenia przyzębia.Po obejrzeniu tego filmu powinni Państwo posiadać solidną wiedzę na temat izolacji i przetwarzania GVA z moczu w celu uzyskania zawiesiny pojedynczych komórek, która następnie zostanie poddana barwieniu zewnątrz- i wewnątrzkomórkowemu na obecność wirusów w celu analizy cytometrycznej.

isolation-processing-and-analysis-of-murine-gingival-cells

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Immunologia i infekcje

Izolacja, przetwarzanie i analiza komórek dziąseł mysich

Opisano zoptymalizowany protokół izolacji komórek macierzystych z gruczołu ślinowego myszy. Metoda ta wykorzystuje trawienie enzymatyczne i mechaniczne oraz umożliwia izolację salisfer zawierających komórki o charakterystyce komórek macierzystych.

Izolacja komórek macierzystych gruczołów ślinowych myszy

Ten film pokazuje procedurę izolacji sieci komórek odpornościowych dziąseł od modelu mysiego. Trawienie enzymatyczne uwalnia tkankę dziąsła z przyczepionych zębów i kości, która jest dalej trawiona mechanicznie, uwalniając komórki odpornościowe z dziąsła. Wyizolowane komórki są gotowe do eksperymentów immunologicznych.

Izolacja sieci komórek odpornościowych dziąseł z bloków zębów myszy

Ustaliliśmy technikę izolacji, charakterystyki fenotypowej i analizy funkcjonalnej komórek odpornościowych z mysiego dziąsła.

Izolacja, charakterystyka i badanie funkcjonalne sieci komórek odpornościowych dziąseł

Przedstawiono protokół izolacji pierwotnego mikrogleju z mysich mózgów. Technika ta pomaga w pogłębieniu obecnego zrozumienia schorzeń neurologicznych. Wirowanie w gradiencie gęstości i separacja magnetyczna są połączone w celu uzyskania wystarczającej wydajności próbki o wysokiej czystości. Ponadto przedstawiamy etapy charakterystyki mikrogleju.

Charakterystyka i izolacja pierwotnego mikrogleju myszy za pomocą wirowania w gradifikacji gęstości

Wysiłki zmierzające do szczegółowego zrozumienia funkcji mikrogleju zostały utrudnione przez brak modeli hodowli mikrogleju, które podsumowują właściwości dojrzałego mikrogleju in vivo. Protokół ten opisuje podejście oparte na izolacji i hodowli, mające na celu utrzymanie solidnego przetrwania wysoce rozgałęzionego dojrzałego mikrogleju szczurów w warunkach o zdefiniowanej pożywce.

Izolacja i hodowla mikrogleju gryzoni w celu promowania dynamicznej, rozgałęzionej morfologii w pożywce wolnej od surowicy

Ten protokół opisuje przejściową inżynierię genetyczną komórek macierzystych zębów pobranych z ludzkiego mieszków zębowych. Zastosowana strategia modyfikacji niewirusowej może stać się podstawą do udoskonalenia terapeutycznych produktów z wykorzystaniem komórek macierzystych.

Izolacja, charakterystyka i modyfikacja genetyczna ludzkich komórek pęcherzyków zębowych w oparciu o mikroRNA

Gruczoł łzowy (LG) ma dwa typy komórek wyrażających aktynę α mięśni gładkich (αSMA): komórki mioepitelialne (MEC) i perycyty. MEC są pochodzenia ektodermalnego, znajdują się w wielu tkankach gruczołowych, podczas gdy perycyty to komórki mięśni gładkich naczyń krwionośnych pochodzenia endodermalnego. Protokół ten izoluje MEC i perycyty od mysich LG.

Izolacja komórek mioepitelialnych z dorosłych mysich gruczołów łzowych i podżuchwowych

Tutaj prezentujemy protokół izolacji in vitro wielu populacji komórek glejowych z ośrodkowego układu nerwowego myszy. Metoda ta pozwala na segregację regionalnego mikrogleju, komórek prekursorowych oligodendrocytów i astrocytów w celu zbadania fenotypów każdego z nich w różnych systemach hodowli.

Rozwarstwienie i izolacja mysiego gleju z wielu regionów ośrodkowego układu nerwowego

Tutaj prezentujemy zmodyfikowaną metodę izolacji i hodowli ludzkich komórek nabłonka dziąseł poprzez dodanie inhibitora Rocka, Y-27632, do metody tradycyjnej. Metoda ta jest łatwiejsza, mniej czasochłonna, poprawia właściwości komórek macierzystych i wytwarza większą liczbę komórek nabłonkowych o wysokim potencjale zarówno do zastosowań laboratoryjnych, jak i klinicznych.

Izolacja i hodowla pierwotnych ludzkich komórek nabłonka dziąseł przy użyciu Y-27632

Obecny protokół przedstawia szybką, efektywną i delikatną metodę izolowania pojedynczych komórek odpowiednich do analizy sekwencyjnego RNA pojedynczej komórki z ciągle rosnących siekaczy, mysich zębów trzonowych i ludzkich zębów.

Szybka izolacja pojedynczych komórek z zębów myszy i ludzi

Naucz się izolować i przetwarzać mysie dziąsła w celu uzyskania jednokomórkowej zawiesiny do analizy cytometrii przepływowej. Ta technika umożliwia badanie populacji komórkowych i odpowiedzi immunologicznych w tkance dziąsłowej.

Izolacja, przetwarzanie i analiza mysich komórek dziąseł

Przeglądaj więcej filmów