Przyspieszona indukcja cukrzycy typu 1 u myszy przez adoptywny transfer cukrzycowych limfocytów T CD4 +

Ogólnym celem tej procedury jest szybkie wywołanie cukrzycy typu pierwszego u myszy poprzez przeniesienie cukrzycowych limfocytów T z myszy transgenicznych do myszy, które nie mają endogennych limfocytów T i B. Zacznij od pobrania śledziony i węzłów chłonnych od myszy dawcy i oczyszczenia czterech dodatnich limfocytów T CD. Następnie adoptywnie przenieś oczyszczone limfocyty T dawcy do antypoślizgowych myszy biorców.

Następnie monitoruj myszy biorców pod kątem rozwoju cukrzycy typu pierwszego. Ostatecznie protokół ten może być wykorzystany do badania patogenezy cukrzycy i badania interwencji terapeutycznych w porównaniu z innymi metodami. Główną zaletą tej techniki przenoszenia BDC 2,5, CD czterech dodatnich limfocytów T do biorców antypoślizgowych jest szybki i powtarzalny rozwój cukrzycy typu pierwszego.

W przypadku dawców cukrzycowej CD cztery dodatnie limfocyty T wykorzystują sześciotygodniowe samice myszy BDC 2,5 w stanie przedcukrzycowym, które zostały uznane za wolne od cukrzycy na podstawie pomiaru stężenia glukozy w moczu. Aby usunąć śledzionę i węzły chłonne, namocz sierść 70% etanolem, a następnie przetnij skórę, cofnij skórę, aż mięśnie przednich kończyn zostaną odsłonięte. W pobliżu podstawy przednich kończyn powinny być widoczne dwa węzły chłonne z każdej strony Ostrożnie chwyć każdy węzeł chłonny małą pęsetą i usuń go, przycinając tkankę łączną.

Następnie wykonaj jednocalowe nacięcie w otrzewnej za pomocą małych nożyczek. Teraz delikatnie chwyć śledzionę pośrodku. Ostrożnie odetnij tkankę łączną i przyczepiony tłuszcz

Następnie usuń śledzionę, koronkę, śledzionę i węzły chłonne w 10 mililitrach DMEM na lodzie. Końcem sterylnego tłoka strzykawki o pojemności 10 mililitrów delikatnie przeciśnij narządy limfatyczne przez sitko do komórek o średnicy 70 mikrometrów. Aby uzyskać zawiesinę jednokomórkową.

Przepłucz każde sitko jednym mililitrem DMEM kilka razy, aby zmaksymalizować odzysk komórek. Następnie przenieś zebrane komórki do 15-mililitrowej stożkowej probówki i odwiruj w temperaturze 400 G przez siedem minut. W temperaturze pokojowej ponownie zawiesić osad komórkowy w trzech mililitrach buforu CK.

Teraz inkubuj każdą temperaturę pokojową przez pięć minut. Aby ługować czerwone krwinki, dodaj teraz 12 mililitrów DMEM i osadzaj komórki przez wirowanie. Umyj osad komórkowy raz na 10 mililitrów DMEM.

Następnie zawieszamy komórki w pięciu mililitrach buforu do barwienia faktów i używamy mikroskopu kontrastu fazowego i hemocytometru, aby policzyć liczbę żywych komórek. Teraz usuń około 10 razy z sześciu komórek na kontrolę barwienia. Wybarwić również komórki mysimi przeciwciałami monoklonalnymi, aby posortować pod kątem nieaktywowanych transgenicznych limfocytów T CD 4-dodatnich.

Inkubować wszystkie te próbki w temperaturze czterech stopni Celsjusza w ciemności przez 30 minut. Teraz umyj komórki trzykrotnie większą objętością barwienia niż bufor faksowy i ponownie zawieś komórki w buforze faksu od 10 do dwóch razy od 10 do siedmiu komórek na mililitr do sortowania próbki i 300 mikrolitrów do kontroli pojedynczego barwienia. Następnie przepuść próbkę komórki przez rurkę z nasadką sitka o grubości 35 mikrometrów.

Aby usunąć grudki komórek, przetwórz próbki do sortera komórek z przeszkolonym operatorem Odczekaj około trzech godzin, w tym czas konfiguracji, na sortowanie około 1,5 razy 10 do ósmej sumy Transgeniczne naiwne CD cztery dodatnie limfocyty T. Możesz spodziewać się około 2,5 razy 10 z sześciu komórek na mysz, a szybkość sortowania będzie wynosić około dwa razy 10 czwartych zdarzeń na sekundę na instrumencie takim jak BD Fox Aria. Zbierz posortowane komórki do trzech mililitrów DMEM.

Zapisać bezwzględną liczbę posortowanych komórek i odwirować je przez siedem minut. Przy 400 gs zawieszamy granulki komórkowe w sterylnym roztworze soli fizjologicznej buforowanej fosforanami w celu adoptywnego transferu komórek T. Używając jednomililitrowej strzykawki w igle o rozmiarze 18, delikatnie ponownie zawiesić oczyszczoną przez faks płytę CD z czterema dodatnimi limfocytami T.

Załadować strzykawkę o pojemności jednego mililitra, a następnie, przygotowując się do wstrzyknięcia, przymocować do strzykawki igłę o rozmiarze 27 punktów i połowie rozmiaru. Unieruchomić myszy biorcze z węzłem i przetrzeć ich ogon 70% etanolem, aby zdezynfekować miejsce wstrzyknięcia. Następnie wstrzyknij jedną dziesiątą z sześciu oczyszczonych CD cztery dodatnie limfocyty T na mysz do jednej z bocznych żył ogonowych.

Podczas wykonywania iniekcji do żyły ogonowej upewnij się, że nie naciskasz tłoka na siłę. Jeśli igła faktycznie znajduje się w żyle, wstrzyknięcie powinno nastąpić prawie bez oporu Począwszy od pięciu dni po transferze limfocytów T. Codziennie monitoruj myszy biorców skików głowy pod kątem rozwoju cukrzycy typu pierwszego.

Zmierz poziom glukozy w moczu za pomocą pasków odczynników zgodnie z producentami i instrukcjami. Należy pamiętać, że myszy z dwoma kolejnymi odczytami stężenia glukozy w moczu większymi niż 250 miligramów na decylitr są uważane za cukrzycę. W typowym eksperymencie każda mysz dawca BDC 2,5 daje około dwa i pół razy 10 z sześciu naiwnych transgenicznych CD czterech dodatnich limfocytów T po sortowaniu komórek po adoptywnym transferze cukrzycowych limfocytów T CD cztery dodatnie, myszy były monitorowane pod kątem stężenia glukozy w moczu.

Adoptywny transfer niewielkiej liczby komórek od myszy dawcy BDC 2,5 wywołał cukrzycę typu pierwszego u wszystkich biorców niepoślizgowych do 11 dnia. Przy prawidłowym wykonaniu technikę tę można wykonać w ciągu około ośmiu godzin od pobrania narządów do transferu komórek T.