Name: Przyspieszona indukcja cukrzycy typu 1 u myszy przez adoptywny transfer cukrzycowych limfocytów T CD4 + (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-05-06T13:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 27 s
Description: Poznaj metodę adoptywnego transferu limfocytów T CD4+ do szybkiej indukcji cukrzycy typu 1 u myszy. Protokół ten umożliwia badanie patogenezy choroby i testowanie interwencji terapeutycznych w modelu zwierzęcym.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Dziękujemy doktorom Robertowi Bonneau i Neilowi Christensenowi za pomocne komentarze.	
Ta praca była wspierana przez fundusze Pennsylvania State University College of Medicine.

1. Izolacja limfocytów T ze śledziony i węzłów chłonnych myszy BDC2.5
<ol>
	<li>Użyj 6-tygodniowych samic myszy BDC2.5 ze stanem przedcukrzycowym jako dawców cukrzycowych limfocytów T CD4 +. Myszy powinny być wolne od cukrzycy, co określono na podstawie pomiaru stężenia glukozy w moczu (patrz poniżej).</li>
	<li>Poddaj każdą mysz eutanazji za pomocą uduszenia CO2 i usuń śledzionę, węzły chłonne pachowe i ramienne w sterylnych warunkach. Aby usunąć śledzionę, namocz futro 70% etanolem, a następnie przetnij i wycofaj skórę. Śledziona będzie widoczna jako ciemnoczerwony narząd po lewej stronie myszy. Wykonaj 1-calowe nacięcie w otrzewnej za pomocą małych nożyczek i delikatnie chwyć śledzionę pośrodku za pomocą małej pęsety. Ostrożnie przyciąć tkankę łączną i przyczepiony tłuszcz tak bardzo, jak to możliwe, i usunąć śledzionę.</li>
	<li>Zebrać śledziony i węzły chłonne w 10 ml Dulbecco's Modified Eagle's Medium (DMEM) w stożkowej probówce o pojemności 15 ml na lodzie.</li>
	<li>Przygotować zawiesinę jednokomórkową, używając końcówki sterylnego tłoka strzykawki o pojemności 10 ml, aby delikatnie przecisnąć narządy limfatyczne przez sitka o wielkości 70 μm (jedna śledziona na sitko i 4-6 węzłów chłonnych na sitko) do tej samej stożkowej probówki o pojemności 50 ml.</li>
</ol>
Podczas procesu, przepłucz każde sitko 1 ml DMEM kilka razy, aby zmaksymalizować odzysk komórek z sitka.
<ol start="5">
	<li>Przenieść zebrane komórki z probówki stożkowej o pojemności 50 ml do probówki stożkowej o pojemności 15 ml i odwirować przy 300-400 x g przez 7 minut w temperaturze pokojowej.</li>
	<li>Aby dokonać lizy czerwonych krwinek, należy odrzucić supernatant, ponownie zawiesić komórki w 5 ml buforu amonowo-chlorkowo-potasowego (ACK) (pH 7,2) i inkubować zawiesinę komórek ACK w temperaturze pokojowej przez 5 minut.</li>
	<li>Dodać 10 ml DMEM do zawiesiny komórek ACK i odwirować probówkę jak powyżej. Umyj osad komórkowy raz w 10 ml DMEM.</li>
</ol>
2. Aktywowane fluorescencją sortowanie komórek cukrzycopochodnych limfocytów T CD4+ od myszy BDC2.5
<ol>
	<li>Ponownie zawiesić komórki w 5 ml buforze barwiącym FACS i policzyć liczbę żywotnych komórek (za pomocą mikroskopu kontrastu fazowego i hemocytometru) przez wykluczenie barwnika błękitu trypanowego.</li>
	<li>Używając bufora FACS, dostosuj objętość zawiesiny komórek do 5 x 107 komórek/ml. Usuń ~1 x 106 komórek na kontrolę barwienia (1 bez plamy, 3 pojedyncze plamy). Wybarwić próbkę pod kątem nieaktywowanych transgenicznych limfocytów T CD4 + przeciwciałami monoklonalnymi anty-CD4 (APC), anty-TCR Vβ4 (FITC) i anty-CD62L (PE) (mAb) w probówce o pojemności 15 ml. Barwienie komórek należy wykonywać przy użyciu stężeń mAb sugerowanych przez producenta przez 20-30 minut w temperaturze 4 °C w ciemności.</li>
	<li>Przemyć próbkę i kontrole pojedynczego barwienia buforem FACS przy >3 razy większej objętości reakcji barwienia. Odwirować probówkę o sile 300-400 x g, usunąć supernatant i ponownie zawiesić komórki w buforze FACS (1-2 x 107 komórek/ml do sortowania próbki i 300 μl do kontroli pojedynczego barwienia) i przechowywać na lodzie do następnego etapu.</li>
	<li>Przepuść próbkę komórek przez rurkę z nakrętką sitka o średnicy 35 μm, aby usunąć grudki komórek. Posortuj próbki pod kątem komórek CD4+TCR Vβ4+CD62L+ na sortowniku komórek z przeszkolonym operatorem. Zebrać posortowane komórki do 3 ml DMEM w probówce o pojemności 15 ml. Odczekaj 2,5-3 godziny, w tym konfigurację, na posortowanie 1,5 x 108 komórek (przybliżona liczba komórek uzyskanych od 3 myszy dawców) z szybkością sortowania 2 x 104 całkowitych zdarzeń / s. Spodziewaj się ~ 2,5 x 106 nieaktywowanych transgenicznych limfocytów T CD4 + na mysz po sortowaniu komórek.</li>
	<li>Zapisać bezwzględną liczbę posortowanych komórek na końcu sortowania i odwirować je przez 7 minut przy 300-400 x g. Odrzucić supernatant i ponownie zawiesić komórki (2 x 10,6 komórek/ml) w sterylnym roztworze soli fizjologicznej buforowanym fosforanami (PBS) (wolne od Mg2 + / Ca2+) w celu adoptywnego transferu limfocytów T.</li>
</ol>
3. Adoptywny transfer cukrzycowych limfocytów T CD4+ od myszy BDC2.5
<ol>
	<li>Za pomocą strzykawki o pojemności 1 ml i igły o rozmiarze 18-11/2 delikatnie ponownie zawiesić oczyszczone przez FACS limfocyty T CD4+ i załadować strzykawkę o pojemności 1 ml. W ramach przygotowań do wstrzyknięcia należy wymienić igłę o rozmiarze 18-11/2 na igłę o rozmiarze 271/2.</li>
	<li>Wystaw 6-8 tygodniową samicę NOD. Myszy biorcy SCID są umieszczane w lampie grzewczej, dopóki nie wykażą zachowań pielęgnacyjnych.</li>
	<li>Unieruchomić myszy biorców w unieruchomieniu i przetrzeć ich ogon 70% (v/v) etanolem, aby zdezynfekować miejsce wstrzyknięcia.</li>
	<li>Wstrzyknąć 1-2 x 106 posortowanych komórek FACS/mysz (w ilości do 500 μl PBS) do jednej z bocznych żył ogonowych.</li>
</ol>
Nie naciskaj na tłok. Jeśli igła jest prawidłowo umieszczona w żyle, wstrzyknięcie odbędzie się prawie bez oporu.
4. Monitorowanie myszy biorców pod kątem hiperglikemii i cukrzycy typu 1
<ol>
	<li>Rozpoczynając pięć dni po transferze limfocytów T, NOD. Myszy z biorcą SCID są codziennie monitorowane pod kątem podwyższonego stężenia glukozy w moczu za pomocą pasków odczynników (Bayer Diastix) zgodnie z instrukcjami producenta. Myszy z dwoma kolejnymi odczytami stężenia glukozy w moczu >250 mg/dl są uważane za cukrzyce.</li>
</ol>

<ol><li>Makino, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Breeding+of+a+non-obese%2C+diabetic+strain+of+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Jikken+Dobutsu%22%5BJournal%5D)">Breeding of a non-obese, diabetic strain of mice.</a> Jikken Dobutsu. 29, 1-13 (1980).</li>
<li>van Belle, T. L., Coppieters, K. T., von Herrath, M. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Type+1+diabetes%3A+etiology%2C+immunology%2C+and+therapeutic+strategies%5BTitle%5D)+AND+%22Physiol.+Rev%22%5BJournal%5D)">Type 1 diabetes: etiology, immunology, and therapeutic strategies.</a> Physiol. Rev. 91, 79-118 (2011).</li>
<li>Delovitch, T. L., Singh, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+nonobese+diabetic+mouse+as+a+model+of+autoimmune+diabetes%3A+immune+dysregulation+gets+the+NOD%5BTitle%5D)+AND+%22Immunity%22%5BJournal%5D)">The nonobese diabetic mouse as a model of autoimmune diabetes: immune dysregulation gets the NOD.</a> Immunity. 7, 727-738 (1997).</li>
<li>Wicker, L. S., Miller, B. J., Mullen, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transfer+of+autoimmune+diabetes+mellitus+with+splenocytes+from+nonobese+diabetic+%28NOD%29+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Diabetes%22%5BJournal%5D)">Transfer of autoimmune diabetes mellitus with splenocytes from nonobese diabetic (NOD) mice.</a> Diabetes. 35, 855-860 (1986).</li>
<li>Bendelac, A., Carnaud, C., Boitard, C., Bach, J. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Syngeneic+transfer+of+autoimmune+diabetes+from+diabetic+NOD+mice+to+healthy+neonates.+Requirement+for+both+L3T4%2B+and+Lyt-2%2B+T+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Exp.+Med%22%5BJournal%5D)">Syngeneic transfer of autoimmune diabetes from diabetic NOD mice to healthy neonates. Requirement for both L3T4+ and Lyt-2+ T cells.</a> J. Exp. Med. 166, 823-833 (1987).</li>
<li>Haskins, K., McDuffie, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Acceleration+of+diabetes+in+young+NOD+mice+with+a+CD4%2B+islet-specific+T+cell+clone%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Acceleration of diabetes in young NOD mice with a CD4+ islet-specific T cell clone.</a> Science. 249, 1433-1436 (1990).</li>
<li>Christianson, S. W., Shultz, L. D., Leiter, E. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Adoptive+transfer+of+diabetes+into+immunodeficient+NOD-scid%2Fscid+mice.+Relative+contributions+of+CD4%2B+and+CD8%2B+T-cells+from+diabetic+versus+prediabetic+NOD.NON-Thy-1a+donors%5BTitle%5D)+AND+%22Diabetes%22%5BJournal%5D)">Adoptive transfer of diabetes into immunodeficient NOD-scid/scid mice. Relative contributions of CD4+ and CD8+ T-cells from diabetic versus prediabetic NOD.NON-Thy-1a donors.</a> Diabetes. 42, 44-55 (1993).</li>
<li>Wicker, L. S., Todd, J. A., Peterson, L. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genetic+control+of+autoimmune+diabetes+in+the+NOD+mouse%5BTitle%5D)+AND+%22Annual+Reviews+in+Immunology%22%5BJournal%5D)">Genetic control of autoimmune diabetes in the NOD mouse.</a> Annual Reviews in Immunology. 13, 179-200 (1995).</li>
<li>Serreze, D. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MHC+class+I-mediated+antigen+presentation+and+induction+of+CD8%2B+cytotoxic+T-cell+responses+in+autoimmune+diabetes-prone+NOD+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Diabetes%22%5BJournal%5D)">MHC class I-mediated antigen presentation and induction of CD8+ cytotoxic T-cell responses in autoimmune diabetes-prone NOD mice.</a> Diabetes. 45, 902-908 (1996).</li>
<li>Milton, M. J., Poulin, M., Mathews, C., Piganelli, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generation%2C+maintenance%2C+and+adoptive+transfer+of+diabetogenic+T-cell+lines%2Fclones+from+the+nonobese+diabetic+mouse%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol.+Med%22%5BJournal%5D)">Generation, maintenance, and adoptive transfer of diabetogenic T-cell lines/clones from the nonobese diabetic mouse.</a> Methods Mol. Med. 102, 213-225 (2004).</li>
<li>Kurrer, M. O., Pakala, S. V., Hanson, H. L., Katz, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Beta+cell+apoptosis+in+T+cell-mediated+autoimmune+diabetes%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Beta cell apoptosis in T cell-mediated autoimmune diabetes.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 94, 213-218 (1997).</li>
<li>Amrani, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Perforin-independent+beta-cell+destruction+by+diabetogenic+CD8%28%2B%29+T+lymphocytes+in+transgenic+nonobese+diabetic+mice%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Clin.+Invest%22%5BJournal%5D)">Perforin-independent beta-cell destruction by diabetogenic CD8(+) T lymphocytes in transgenic nonobese diabetic mice.</a> J. Clin. Invest. 103, 1201-1209 (1999).</li>
<li>Dobbs, C., Haskins, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparison+of+a+T+cell+clone+and+of+T+cells+from+a+TCR+transgenic+mouse%3A+TCR+transgenic+T+cells+specific+for+self-antigen+are+atypical%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Immunol%22%5BJournal%5D)">Comparison of a T cell clone and of T cells from a TCR transgenic mouse: TCR transgenic T cells specific for self-antigen are atypical.</a> J. Immunol. 166, 2495-2504 (2001).</li>
<li>Haskins, K., Portas, M., Bradley, B., Wegmann, D., Lafferty, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((T-lymphocyte+clone+specific+for+pancreatic+islet+antigen%5BTitle%5D)+AND+%22Diabetes%22%5BJournal%5D)">T-lymphocyte clone specific for pancreatic islet antigen.</a> Diabetes. 37, 1444-1448 (1988).</li>
<li>Katz, J. D., Wang, B., Haskins, K., Benoist, C., Mathis, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Following+a+diabetogenic+T+cell+from+genesis+through+pathogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Following a diabetogenic T cell from genesis through pathogenesis.</a> Cell. 74, 1089-1100 (1993).</li>
<li>Stadinski, B. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chromogranin+A+is+an+autoantigen+in+type+1+diabetes%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Immunol%22%5BJournal%5D)">Chromogranin A is an autoantigen in type 1 diabetes.</a> Nat. Immunol. 11, 225-231 (2010).</li>
<li>Luhder, F., Chambers, C., Allison, J. P., Benoist, C., Mathis, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pinpointing+when+T+cell+costimulatory+receptor+CTLA-4+must+be+engaged+to+dampen+diabetogenic+T+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Pinpointing when T cell costimulatory receptor CTLA-4 must be engaged to dampen diabetogenic T cells.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 97, 12204-12209 (2000).</li>
<li>Tang, Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vitro-expanded+antigen-specific+regulatory+T+cells+suppress+autoimmune+diabetes%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Exp.+Med%22%5BJournal%5D)">In vitro-expanded antigen-specific regulatory T cells suppress autoimmune diabetes.</a> J. Exp. Med. 199, 1455-1465 (2004).</li>
<li>Calderon, B., Suri, A., Pan, X. O., Mills, J. C., Unanue, E. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((IFN-gamma-dependent+regulatory+circuits+in+immune+inflammation+highlighted+in+diabetes%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Immunol%22%5BJournal%5D)">IFN-gamma-dependent regulatory circuits in immune inflammation highlighted in diabetes.</a> J. Immunol. 181, 6964-6974 (2008).</li>
<li>Shultz, L. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multiple+defects+in+innate+and+adaptive+immunologic+function+in+NOD%2FLtSz-scid+mice%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Immunol%22%5BJournal%5D)">Multiple defects in innate and adaptive immunologic function in NOD/LtSz-scid mice.</a> J. Immunol. 154, 180-191 (1995).</li>
<li>Waldner, H., Sobel, R. A., Price, N., Kuchroo, V. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+autoimmune+diabetes+locus+Idd9+regulates+development+of+type+1+diabetes+by+affecting+the+homing+of+islet-specific+T+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Immunol%22%5BJournal%5D)">The autoimmune diabetes locus Idd9 regulates development of type 1 diabetes by affecting the homing of islet-specific T cells.</a> J. Immunol. 176, 5455-5462 (2006).</li>
<li>Verdaguer, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Spontaneous+autoimmune+diabetes+in+monoclonal+T+cell+nonobese+diabetic+mice%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Exp.+Med%22%5BJournal%5D)">Spontaneous autoimmune diabetes in monoclonal T cell nonobese diabetic mice.</a> J. Exp. Med. 186, 1663-1676 (1997).</li>
<li>Thomas, D. C., Mellanby, R. J., Phillips, J. M., Cooke, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+early+age-related+increase+in+the+frequency+of+CD4%2B+Foxp3%2B+cells+in+BDC2.5NOD+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Immunology%22%5BJournal%5D)">An early age-related increase in the frequency of CD4+ Foxp3+ cells in BDC2.5NOD mice.</a> Immunology. 121, 565-576 (2007).</li>
<li>Prochazka, M., Gaskins, H. R., Shultz, L. D., Leiter, E. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+nonobese+diabetic+scid+mouse%3A+model+for+spontaneous+thymomagenesis+associated+with+immunodeficiency%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">The nonobese diabetic scid mouse: model for spontaneous thymomagenesis associated with immunodeficiency.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 89, 3290-3294 (1992).</li>
</ol>

Wszystkie myszy były trzymane w placówce Penn State College of Medicine wolnej od specyficznych patogenów (SPF) zgodnie z wytycznymi Penn State Institutional Animal Care and Use Committee.	
Autorzy oświadczają, że nie mają konkurencyjnych interesów finansowych.

T1D może być indukowana u myszy biorców z różną skutecznością poprzez adoptywny transfer całych komórek śledziony lub podzbiorów limfocytów T od myszy NOD z cukrzycą lub myszy transgenicznych dla TCR pochodzących z klonów limfocytów T cukrzycowych. W niniejszym artykule przedstawiamy powtarzalną metodę indukowania cukrzycy typu 1 u myszy biorców w ciągu dwóch tygodni przy 100% częstości występowania poprzez przeniesienie transgenicznych limfocytów T CD4 + CD4 + oczyszczonych przez FACS CD62L + + BDC2.5 do NOD. Myszy SCID...

Mysz NOD spontanicznie rozwija autoimmunologiczną cukrzycę i jest szeroko stosowana jako model zwierzęcy dla ludzkiej cukrzycy typu1,2. Patogeneza cukrzycy typu 1 u myszy NOD charakteryzuje się infiltracją, począwszy od 3-4 tygodnia życia, wysp trzustkowych Langerhansa przez komórki dendrytyczne i makrofagi, a następnie przez limfocyty T i B. Ta faza nieniszczącego zapalenia okołowyspowego prowadzi do powolnego, postępującego niszczenia komórek β trzustki produkujących insulinę, co prowadzi do jawnej cukrzycy w wieku 4-6 miesięcy3. Wykazano, że transfer limfocytów Tsplenocytów 4,5, CD4 + 6,7 lub CD8 + 8,9 z cukrzycą myszy NOD pośredniczy w cukrzycy u myszy NOD z obniżoną odpornością, co wskazuje, że limfocyty T reagujące na wyspy trzustkowe odgrywają kluczową rolę w patogenezie T1D. W zależności od warunków eksperymentalnych, cukrzyca rozwijała się u myszy biorców powoli, przez kilka tygodni w tych badaniach. Podobnie, doniesiono, że różne klony limfocytów T, uzyskane w wyniku czasochłonnej i kosztownej hodowli cukrzycopochodnych limfocytów T, pośredniczą w cukrzycy kilka tygodni po przeniesieniu do myszy biorców7,10. Wraz z dostępnością transgenicznych myszy wykazujących ekspresję TCR pochodzących z klonów cukrzycowych limfocytów T ograniczonych CD4 lub CD8, kilka laboratoriów wykazało następnie, że limfocyty T śledziony od takich myszy były w stanie przenieść cukrzycę na biorców11-13. W szczególności myszy BDC2.5 NOD są transgeniczne dla BDC2.5 TCR, który jest specyficzny dla chromograniny A, białka w komórkach beta trzustki14-16. Transfer aktywowanych lub nieaktywowanych lub nieaktywowanych całych lub frakcjonowanych komórek śledziony in vitro od myszy BDC2.5 z jawną cukrzycą lub stanem przedcukrzycowym przeniósł cukrzycę na noworodki lub myszy NOD z niedoborem odporności z różną skutecznością11,17-19.
Opisujemy prostą metodę, która wykorzystuje oczyszczone transgeniczne limfocyty T CD4+ od myszy BDC2.5 z precukrzycą do indukowania T1D u myszy biorców z wysoką wydajnością i spójnością. Duża liczba naiwnych, specyficznych dla antygenu wysp trzustkowych limfocytów T CD4 + jest izolowana od tych myszy przez sortowanie komórek aktywowane fluorescencją (FACS) dla limfocytów T CD4 + CD62L + eksprymujących transgeniczny łańcuch TCR Vβ4. Oczyszczone transgeniczne limfocyty T są następnie przenoszone bez aktywacji do NOD. Myszy SCID, które nie mają funkcjonalnych limfocytów T i B i są wolne od zapalenia wysp i cukrzycy20. Myszy biorcy są monitorowane pod kątem podwyższonego stężenia glukozy w moczu wskazującego na cukrzycę typu 1, która rozwija się szybko w ciągu dwóch tygodni po przeniesieniu limfocytów T.
W przeciwieństwie do innych metod, które przenoszą cukrzycotwórcze limfocyty T o heterogenicznej specyficzności, nasz protokół wykorzystuje sortowane przez FACS limfocyty T CD4+, które prawie wyłącznie wyrażają cukrzycogenny BDC2.5 TCR. Ze względu na ich jednorodność, tylko niewielka liczba przeniesionych limfocytów T (~1x106 komórek/mysz) jest wymagana do szybkiego rozwoju T1D w ciągu 2 tygodni przy 100% częstości występowania. Kolejną zaletą naszego protokołu jest to, że napromienianie myszy biorców nie jest konieczne, jak ma to miejsce w przypadku niektórych innych metod. Potencjalnym ograniczeniem tej metody jest to, że nie pozwala ona na badanie udziału zarówno podzbiorów limfocytów T CD4, jak i CD8, a konkretnie limfocytów T CD8 w cukrzycy.
Opisany protokół będzie przydatny do badania szybkiego rozwoju T1D, w którym pośredniczą naiwne, monospecyficzne limfocyty T CD4+, a także strategii terapeutycznych mających na celu interwencję w naprowadzanie komórek Th specyficznych dla antygenu wysp trzustkowych do narządu docelowego.

<table><tbody><tr><td>Transgeniczne myszy NOD BDC 2.5 TCR (NOD. Cg-Tg(Tcr&alfa; BDC 2.5, Tcr&#946; BDC 2.5)</td><td>JAX</td><td>004460</td><td></td></tr><tr><td>NOD. Myszy SCID (NOD. CB17-Prkdcscid/J)</td><td>JAX</td><td>001303</td><td></td></tr><tr><td>Dulbecco's Modified Eagle's Medium (DMEM)</td><td>Themo Scientific</td><td>SH30022.01</td><td></td></tr><tr><td>Bayer Diastix</td><td>Fisher Scientific</td><td>AM2803</td><td></td></tr><tr><td>15 ml probówki stożkowe</td><td>Falcon</td><td>352095</td><td></td></tr><tr><td>50 ml Falcon</td><td></td><td>352070</td><td></td></tr><tr><td>Sterylne pęsety</td><td></td><td></td><td></td>chirurgiczne</tr><tr><td>Sterylne nożyczki</td><td></td><td></td><td></td>do małych par</tr><tr><td>Sterylne nożyczki</td><td></td><td></td><td></td>do dużych par</tr><tr><td>70 &mu; m sitka komórkowe</td><td>Fisher Scientific</td><td>22363548</td><td></td></tr><tr><td>35 &mu; m rurki z nasadką sitową do komórek</td><td>BD Biosciences</td><td>352235</td><td></td></tr><tr><td>Bufor</td><td></td><td></td> chlorkowo-potasowy amonu (ACK) <td>0,15 M NH4Cl, 1 mM KHCO3, 0,1 mM Na2EDTA, pH 7,2 w dH2O</td></tr><tr><td>BD FACSFlowTM płyn do</td> barwienia BD <td>Biosciences</td><td>342003</td><td></td></tr><tr><td>bufor</td><td></td><td></td> <td>barwiący FACSPBS, 0,2 mM EDTA, 0,5% BSA/FCS, sterylizowany filtrem</td></tr><tr>Mikroskop <td></td><td></td><td></td><td>z kontrastem fazowym</td></tr><tr><td>Trypan niebieski</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Hemocytometr</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Anty-CD4 (APC) mAb</td><td>Biolegend</td><td>1005616</td><td>klon RM4-5</td></tr><tr><td>Anti-TCR V&#946; 4 (FITC) mAb</td><td>BD Biosciences</td><td>553365</td><td>klon KT4</td></tr><tr><td>Anty-CD62L (PE) mAb</td><td>BD Biosciences</td><td>553151</td><td>klon MEL-14</td></tr><tr><td>Sortownik komórek</td><td>BD Biosciences</td><td></td><td>np. BD FACSAria III Lampa</td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td>grzewcza</td></tr> Strzykawka <tr><td>przytrzymująca</td><td></td><td></td><td></td>dla myszy</tr><tr><td>1 ml</td><td>Becton Dickinson</td><td>309602</td><td></td></tr><tr><td>Igły pomiarowe 18-1&frac12 (sterylne)Igły pomiarowe</td> <td>Becton Dickinson</td><td>305196</td><td></td></tr><tr><td>27&frac12 (sterylne)Druty pomiarowe</td> <td>Becton Dickinson</td><td>305109</td><td></td></tr></tbody></table>

przyspieszona indukcja cukrzycy typu 1 u myszy przez adoptywny transfer cukrzycowych limfocytów t cd4 +

Accelerated Type 1 Diabetes Induction in Mice by Adoptive Transfer of Diabetogenic CD4+ T Cells

Mysz bez otyłości z cukrzycą (NOD) spontanicznie rozwija autoimmunologiczną cukrzycę po 12 tygodniu życia i jest najdokładniej zbadanym zwierzęcym modelem ludzkiej cukrzycy typu 1 (T1D). Badania transferu komórek u napromieniowanych myszy biorców wykazały, że limfocyty T odgrywają kluczową rolę w patogenezie T1D w tym modelu. Opisujemy tutaj prostą metodę szybkiej indukcji T1D poprzez adoptywny transfer oczyszczonych, pierwotnych limfocytów T CD4 + od myszy NOD z precukrzycą transgenicznych dla receptora komórek T specyficznych dla wysp trzustkowych (TCR) BDC2.5 do NOD. Myszy biorcy SCID. Głównymi zaletami tej techniki jest to, że izolacja i adoptywny transfer limfocytów T cukrzycowych może zostać zakończony w ciągu tego samego dnia, napromienianie biorców nie jest wymagane, a wysoka częstość występowania cukrzycy typu 1 jest wywoływana w ciągu 2 tygodni po transferze limfocytów T. W związku z tym badania nad patogenezą i interwencjami terapeutycznymi w cukrzycy typu 1 mogą przebiegać szybciej niż w przypadku metod opierających się na heterogenicznych populacjach limfocytów T lub klonach pochodzących od myszy NOD z cukrzycą.

Nasze wyniki pokazują izolację transgenicznych komórek BDC2.5 wykazujących ekspresję CD62L, która jest kluczowa dla homingu limfocytów T do wtórnych narządów limfatycznych, takich jak węzły chłonne trzustki. Nasze ustalenia dodatkowo demonstrują silną zdolność tej monospecyficznej populacji limfocytów T do szybkiego i efektywnego transferu T1D do myszy biorców NOD.SCID.
Izolacja diabetogennych limfocytów T CD4+ od myszy BDC2.5 została przedstawiona w Rysunek 2Około 5 x 10...

Zapewniamy powtarzalną metodę wywoływania cukrzycy typu 1 (T1D) u myszy w ciągu dwóch tygodni poprzez adopcyjny transfer pierwotnych limfocytów T CD4+ specyficznych dla antygenu wysp trzustkowych.

Przyspieszona indukcja cukrzycy typu 1 u myszy przez adoptywny transfer cukrzycowych limfocytów T CD4 +

The nonobese diabetic (NOD) mouse spontaneously develops autoimmune diabetes after 12 weeks of age and is the most extensively studied animal model of ...

Ogólnym celem niniejszej procedury jest szybka indukcja cukrzycy typu pierwszego u myszy poprzez transfer diabetogennych limfocytów T z myszy transgenicznych do myszy pozbawionych endogennych limfocytów T i B. Należy rozpocząć od pobrania śledzion i węzłów chłonnych od myszy dawców oraz oczyszczenia CD4+ limfocytów T. Następnie oczyszczone limfocyty T od dawcy należy przenieść drogą adoptywną do myszy biorców typu nude.Następnie monitoruj myszy biorcze pod kątem rozwoju cukrzycy typu pierwszego. Ostatecznie protokół ten może być wykorzystany do badania patogenezy cukrzycy oraz do badania interwencji terapeutycznych w porównaniu z innymi metodami. Główną zaletą tej techniki transferu limfocytów T BDC 2.5 CD4+ do biorców nie-SCID jest szybki i powtarzalny rozwój cukrzycy typu pierwszego.Dla dawców CD diabetogennego czterech pozytywnych limfocytów T należy użyć sześciotygodniowych przedcukrzycowych myszy samic BDC 2.5, u których stwierdzono brak cukrzycy poprzez pomiar glukozy w moczu. Aby usunąć śledzionę i węzły chłonne, namocz futro 70% etanolem, a następnie rozetnij skórę i odsunięcie ją, aż do odsłonięcia mięśni przednich kończyn. W pobliżu podstawy przednich kończyn powinny być widoczne dwa węzły chłonne po każdej stronie. Ostrożnie chwyć każdy węzeł chłonny małymi pęsetą i usuń go, odcinając tkankę łączną.Następnie, za pomocą małych nożyczek, wykonaj nacięcie otrzewnej o długości jednej uncji. Teraz delikatnie chwyć śledzionę w jej centralnej części. Ostrożnie wytnij tkankę łączną oraz przylegający tłuszcz.Następnie należy wyciąć śledzionę, a następnie umieścić śledziony i węzły chłonne w 10 mililitrach DMEM na lodzie. Za pomocą końcówki tłoka sterylnej strzykawki 10 mililitrów należy delikatnie przecisnąć organy limfatyczne przez sito komórkowe o oczkach 70 mikrometrów, aby uzyskać zawiesinę pojedynczych komórek.Każde sitko należy kilkakrotnie przepłukać 1 ml DMEM, aby zmaksymalizować odzysk komórek. Następnie zebrane komórki przenosi się do stożkowatej probówki o objętości 15 ml i wiruje przy 400 Gs przez siedem minut. W temperaturze pokojowej osad komórkowy resuspendsuje się w 3 ml buforu CK.Następnie inkubuj w temperaturze pokojowej przez pięć minut. Aby zlizować erytrocyty, dodaj 12 ml DMEM, a następnie odwiruj komórki przez centryfugację. Przemyj osad komórkowy raz w 10 ml DMEM.Następnie zawieszamy komórki w pięciu mililitrach buforu do barwienia FACS, a za pomocą mikroskopu fazowego i komory Heberna (hemocytometru) liczymy liczbę żywych komórek. Teraz odpompowujemy około 1 × 10⁶ komórek na każdą kontrolę barwienia. Komórki barwimy również mysimi przeciwciałami monoklonalnymi, aby wyselekcjonować nieaktywowane transgeniczne limfocyty T CD4+.Inkubuj wszystkie te próbki w temperaturze 4 °C w ciemności przez 30 minut. Następnie przemyj komórki trzykrotnością objętości barwnika buforem FACS, a następnie resuspenduj komórki w buforze FACS w stężeniu od 1 do 2 × 10⁷ komórek/ml dla próbek do sortowania oraz w objętości 300 µL dla pojedynczych kontrol barwień. Następnie przepuść próbkę komórkową przez nakrętkę z sitkiem do komórek o rozmiarze oczek 35 µm.Aby usunąć skupiska komórek, należy poddać próbki sortowaniu komórkowemu z pomocą przeszkolonego operatora. Należy zarezerwować około trzech godzin, wliczając czas konfiguracji, aby posortować około 1,5 × 10⁸ łącznie transgenicznych naiwnych komórek T CD4+. Można oczekiwać uzyskania około 2,5 × 10⁶ komórek na mysz, a szybkość sortowania wyniesie około 2 × 10⁴ zdarzeń na sekundę na urządzeniu takim jak BD FACSAria. Posortowane komórki należy zebrać do 3 ml DMEM.Zapisz bezwzględną liczbę posortowanych komórek, a następnie odwiruj je przez siedem minut. Przy 400 Gs zawiesamy osady komórkowe w sterylnym roztworze soli fizjologicznej z buforem fosforanowym w celu adoptywnego transferu limfocytów T. Używając strzykawki o pojemności jednego mililitra z igłą o rozmiarze 18 G, delikatnie resuspenduj oczyszczone metodą FACS limfocyty T CD4+.Napełnić strzykawkę o pojemności 1 mL, a następnie, w ramach przygotowania do iniekcji, przymocować do niej igłę o rozmiarze 27,5 G. Unieruchomić myszy biorców typu knot skid i przetrzeć ich ogony 70% etanolem w celu dezynfekcji miejsca wstrzyknięcia. Następnie wstrzyknąć 1 × 10⁶ oczyszczonych limfocytów T CD4+ na mysz do jednej z bocznych żył ogonowych.Podczas wykonywania wstrzyknięć do żyły ogonowej należy upewnić się, że tłok nie jest pchany na siłę. Jeśli igła znajduje się w żyle, wstrzykiwanie powinno odbywać się niemal bez oporu. Pięć dni po transferze limfocytów T należy codziennie monitorować myszy biorcy nod skid pod kątem rozwoju cukrzycy typu pierwszego.Zmierz poziom glukozy w moczu za pomocą pasków odczynnikowych zgodnie z instrukcjami producenta. Należy przyjąć, że myszy z dwoma kolejnymi odczytami glukozy w moczu przekraczającymi 250 mg/dL są uznawane za cukrzycowe. W typowym eksperymencie każda mysz dawca BDC 2.5 dostarcza około 2,5 × 10⁶ naiwnych transgenicznych limfocytów T CD4+ po sortowaniu komórek. Po adoptywnym transferze diabetogennych limfocytów T CD4+ monitorowano stężenia glukozy w moczu myszy.Adoptywny transfer niewielkiej liczby komórek od myszy dawców BDC 2.5 wywołał cukrzycę typu pierwszego u wszystkich biorców non-skid do 11. dnia. Przy prawidłowym wykonaniu technika ta może zostać przeprowadzona w ciągu około ośmiu godzin, od pobrania organów do transferu limfocytów T.

accelerated-type-1-diabetes-induction-mice-adoptive-transfer

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Immunologia i infekcje

Przyspieszone wywołanie cukrzycy typu 1 u myszy przez transferadopcyjny diabetogenicznych komórek CD4+ T

Nasz protokół został opracowany w celu czystego i łatwego wprowadzania wysepek lub komórek pod torebkę nerkową myszy. Komórki są zagęszczane w postaci pelletów w końcowej części cewki używanej do transplantacji komórek pod torebkę nerkową. Prostota tej techniki zmniejsza stres dla komórek oraz myszy.

Transplantacja wysepek trzustkowych do torebki nerki u myszy z cukrzycą

Opisujemy tworzenie wątrobowych neo-wysepek u myszy z cukrzycą indukowaną STZ (streptozotocyną) poprzez transfer genów Neurogenin3 (Ngn3) i Betacellulin (Btc) z wykorzystaniem zależnego od helpera wektora adenowirusowego (HDAd) oraz odwrócenie hiperglikemii. Nasza metoda wykorzystuje zależne od helpera wektory adenowirusowe, które charakteryzują się wysoką wydajnością transdukcji in vivo oraz długotrwałą ekspresją genów.

Tworzenie neo-wysepek w wątrobie myszy z cukrzycą za pomocą transferu genów za pośrednictwem adenowirusowego wektora zależnego od pomocnika

Ten film demonstruje metodę opartą na obrazowaniu, aby zwizualizować przeszczepione komórki beta z ekspresją lucyferazy do nieotyłej myszy z cukrzycą z niedoborem odporności. Wprowadzenie splenocytów od myszy z cukrzycą prowadzi do postępującego niszczenia komórek beta, co jest wizualnie potwierdzone spadkiem luminescencji po wprowadzeniu substratu.

Obrazowanie transgenicznych komórek beta u myszy z niedoborem odporności i prowokacją ze splenocytami cukrzycowymi

Tutaj prezentujemy protokół indukowania zapalenia jelita grubego u myszy poprzez adoptywny transfer syngenicznych limfocytów T CD4+CD45RB do biorców z niedoborem limfocytów T i B. Cechy kliniczne i histopatologiczne naśladują choroby zapalne jelit u ludzi. Metoda ta pozwala na badanie inicjacji zapalenia jelita grubego i postępu choroby.

Indukcja zapalenia jelit myszy przez adoptywny transfer efektorowych limfocytów T CD4 + CD45RB do myszy z niedoborem odporności

Ten artykuł opisuje protokół generowania specyficznych dla antygenu limfocytów T CD8 i ich ekspansji in vitro, w celu uzyskania dużej liczby funkcjonalnych limfocytów T do użycia in vitro i in vivo.

Wysokowydajne wytwarzanie pierwotnych cytotoksycznych limfocytów T myszy specyficznych dla antygenu do testów funkcjonalnych w autoimmunologicznym modelu cukrzycy

W tym protokole opisany jest model adoptywnego transferowego zapalenia jelita grubego dla antygenu mikrobioty jelitowej z limfocytów T. Limfocyty T CD4 + izoluje się od myszy transgenicznych CBir1 TCR. Są one specyficzne dla immunodominującego antygenu mikrobioty jelitowej CBir1 flageliny, który jest przenoszony do myszy biorcy Rag1-/-, prowadząc do zapalenia jelit.

Indukcja zapalenia jelit przez adoptywny transfer transgenicznych limfocytów T CD4 + CBir1 TCR do myszy z niedoborem odporności

Ten protokół opisuje prostą i minimalnie inwazyjną metodę przeszczepiania i obrazowania komórek NIT-1 u myszy z nieotyłym cukrzycą (NOD) z ciężkim niedoborem odporności, którym podano splenocyty oczyszczone z myszy NOD z spontaniczną cukrzycą.

Bioluminescencyjne monitorowanie przeżywalności przeszczepu w adoptywnym modelu transferowym cukrzycy autoimmunologicznej u myszy

Oferujemy minimalnie inwazyny protokół do domięśniowej transplantacji wyspików komórek macierzystych trzustki pochodzących z ludzkich komórek macierzystych do szczurów immunodeficytarnych w celu in vivo implantacji i dalszej analizy.

Przeszczep domięśniowy ludzkich pluripotentnych komórek macierzystych pochodzenia trzustkowego do szczurów

Testy cytotoksyczności służące do pomiaru odpowiedzi litycznej komórek natural killer na komórki zakażone HIV są ograniczone przez czystość komórek docelowych. Prezentujemy tutaj izolację wysoce oczyszczonej populacji zakażonych HIV-1 pierwotnych blastów limfocytów T, wykorzystując zdolność HIV-1 do down-modulacji CD4.

Przygotowanie i zastosowanie pierwotnych limfocytów T CD4+ zainfekowanych HIV-1 jako komórek docelowych w testach cytotoksyczności komórek NK

Niektóre szczepy myszy są odporne na indukcję eksperymentalnego autoimmunologicznego zapalenia mielnowodnego (EAE) za pomocą podstawowego białka mieliny. Opisano tutaj prosty protokół immunizacji, który przełamuje tę brak reakcji i indukuje chorobę porażenną u kilku typowych szczepów myszy odpornych na EAE.

Przełamanie braku reakcji u szczepów myszy odpornych na eksperymentalne autoimmunologiczne zapalenie mózgu i rdzenia (EAE) poprzez transfer adopcyjny i stymulację antygenową

Poznaj metodę adoptywnego transferu limfocytów T CD4+ do szybkiej indukcji cukrzycy typu 1 u myszy. Protokół ten umożliwia badanie patogenezy choroby i testowanie interwencji terapeutycznych w modelu zwierzęcym.

Przyspieszona indukcja cukrzycy typu 1 u myszy przez adoptywny transfer cukrzycowych limfocytów T CD4 +

Przeglądaj więcej filmów