Name: Oznaczanie mikrobiologicznej aktywności enzymów zewnątrzkomórkowych w wodach, glebach i osadach za pomocą wysokoprzepustowych testów mikropłytek (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-10-01T09:00:00.000+00:00
Duration: 15 min 23 s
Description: Naucz się oznaczać mikrobiologiczną aktywność enzymów zewnątrzkomórkowych w wodach, glebach i osadach za pomocą wysokoprzepustowych testów mikropłytek. Ta metoda umożliwia szybką analizę aktywności enzymatycznej w różnych środowiskach naturalnych.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Finansowanie niektórych aspektów tej pracy zostało zapewnione przez różne źródła, w tym przez Departament Rolnictwa Stanów Zjednoczonych (United States Department of Agriculture Specific Cooperative Agreement) 58-6408-1-595 oraz National Science Foundation (nagroda 1049911).

Kolorymetryczna analiza aktywności enzymów zewnątrzkomórkowych w glebach i osadach
1. Przygotowanie substratów i roztworów buforowych do kolorymetrycznych analiz aktywności enzymów
<ol>
	<li>Przygotować 50 mM bufor octanowy (pH 5,0-5,5), mieszając 50 ml 0,1 M kwasu octowego (2,87 ml lodowatego kwasu octowego w 500 ml wody), 150 ml 0,1 M octanu sodu i 200 ml destylowanegoH2O. W razie potrzeby dostosować pH do 5,0-5,5 z 0,1 M kwasem octowym.</li>
	<li>Przygotować roztwór 1 M wodorotlenku sodu (NaOH) w destylowanymH2O.</li>
	<li>Przygotować roztwory substratów połączonych zp NP w buforze octanowym 50 mM. Do oznaczania fosfatazy przygotować 5 mM pNP-fosforanu w 50 mM buforze octanowym ; do oznaczania β-glukozydazy należy przygotować 5 mM pNP-β-glukopiranozyd; do oznaczania NAGazy należy przygotować 2 mM pNP-β-N-acetyloglukozaminid. Przygotować wszystkie roztwory substratów w sterylnych probówkach wirówkowych o pojemności 15 ml lub 50 ml. Roztwory można przechowywać w temperaturze 4 °C przez 2-3 tygodnie.</li>
</ol>
2. Wyznaczanie wzorca do przeliczania absorbancji na stężenie pNP
<ol>
	<li>Przygotować wzorcowe roztwory p-nitrofenolu w buforze octanowym 50 mM. Stężenia powinny wynosić od 0,025-1 mM.</li>
	<li>Przenieść trzy powtórzenia po 100 μl każdego stężenia na klarowną 96-dołkową mikropłytkę. Dodać 10 μl 1 M NaOH i 190 μl destylowanego H2O do każdej studzienki.</li>
	<li>Zapisać absorbancję przy długości fali 410 nm za pomocą czytnika mikropłytek.</li>
	<li>Pomnóż stężenia w krzywej wzorcowej przez 0,3, aby uzyskać μmole pNP na 300 μl objętości reakcji. Wykreślić krzywą absorbancji w funkcji μmol pNP. Nachylenie krzywej służy jako współczynnik konwersji (C), który będzie odnosił absorbancję do μmola pNP w każdej reakcji enzymatycznej.</li>
</ol>
3. Przeprowadzanie testu enzymatycznego
<ol>
	<li>W przypadku gleby należy przygotować zawiesinę z każdej próbki, która ma być oznaczona w sterylnej probówce wirówkowej o pojemności 15 ml w stężeniu około 1 g/ml-1 przy użyciu 50 mM buforu octanowego. W przypadku osadów należy dodać wystarczającą ilość buforu octanowego, aby zawiesina mogła być łatwo pipetowana. Dokładna potrzebna objętość gnojowicy będzie się różnić w zależności od liczby badanych enzymów, ale zalecane jest co najmniej 5 ml. Wiruj każdą zawiesinę, aż wszystkie grudki gleby lub osadu rozproszą się i zanotuj ostateczną objętość.</li>
	<li>Ponownie zwirować każdą zawiesinę i natychmiast odpipetować 150 μl do każdej z sześciu studzienek na 96-dołkowym bloku studni głębinowej (rysunek 1). Ważne jest, aby dokładnie i często wirować, aby utrzymać cząstki gleby w zawiesinie. Pozostaw co najmniej dwie studzienki na blok puste, aby służyły jako kontrola substratu. Uwaga: przed pipetowaniem przytnij końcówki pipet nożyczkami, ponieważ zawiesiny glebowe mają tendencję do zatykania końcówek. Przygotuj jeden 96-dołkowy blok dla każdego enzymu, który ma być oznaczony.</li>
	<li>Wlać około 5 ml buforu octanowego do zbiornika pipety i za pomocą pipety 8-kanałowej dodać 150 μl buforu do dwóch ostatnich dołków każdej próbki (będą to kontrolne próbki) i dwóch studzienek kontrolnych substratu (rysunek 1)</li>
	<li>Wlać około 10 ml odpowiedniego roztworu substratu pNP do zbiornika pipety i za pomocą pipety 8-kanałowej dodać 150 μl roztworu substratu do pierwszych czterech dołków każdej próbki i dwóch studzienek kontrolnych substratu (rysunek 1). Zwróć uwagę na czas, w którym reakcja rozpoczyna się od momentu dodania roztworu substratu.</li>
	<li>Inkubować płytki w temperaturze pokojowej (22 °C) przez 0,5-4 godziny. Dokładny czas inkubacji będzie się różnić w zależności od poziomu aktywności w próbkach i enzymu, który ma być oznaczony. W przypadku większości gleb i osadów fosfataza i β-glukozydaza wymagają czasu inkubacji 0,5-1,5 godziny, podczas gdy NAGaza i inne enzymy wymagają czasu inkubacji >2 godziny.</li>
	<li>Podczas inkubacji testów przygotuj przezroczyste 96-dołkowe mikropłytki do odczytu absorbancji. Przygotować jedną mikropłytkę dla każdego bloku studni głębinowej (tj. dla każdego badanego enzymu). Odpipetować 10 μl 1 M NaOH i 190 μl wody destylowanej do każdego dołka mikropłytki. Uwaga: NaOH spowalnia reakcję enzymatyczną i podnosi pH, co wzmacnia kolor pNP uwalnianego podczas reakcji.</li>
	<li>Po inkubacji odwirować 96-dołkowe bloki o stężeniu 2,000-5,000 x g przez 5 minut, aby osadzać cząstki gleby.</li>
	<li>Za pomocą pipety wielokanałowej pobrać 100 μl z każdej studzienki, uważając, aby uniknąć osadu, i przenieść go do odpowiedniego dołka na przygotowanej przezroczystej 96-dołkowej mikropłytce.</li>
	<li>Włącz czytnik mikropłytek i zainstaluj niezbędne oprogramowanie. Rekordowa absorbancja przy 410 nm. Jeśli absorbancja danego dołka przekracza liniową granicę wykrywalności czytnika płytek, rozcieńczyć tę studzienkę w stosunku 1:1 wodą i ponownie zmierzyć. Jeżeli absorbancja jest nadal zbyt wysoka, test należy powtórzyć z krótszym czasem inkubacji.</li>
</ol>
4. Oznaczanie suchej masy próbek
<ol>
	<li>Odpipetować 1 ml zawiesiny każdej próbki do wstępnie zważonej aluminiowej szalki.</li>
	<li>Suszyć w suszarce w temperaturze 75 °C przez 48 godzin i zważyć. Od tej wartości należy odjąć masę garnka, aby uzyskać suchą masę gleby lub osadu w 1 ml gnojowicy. Pomnożyć przez współczynnik 0,15 w celu oznaczenia suchej masy próbki w 150 μl dodanej do każdego dołka w teście enzymatycznym.</li>
</ol>
5. Obliczanie aktywności enzymu na suchą masę gleby lub osadu
<ol>
	<li>Obliczyć końcową absorbancję każdej próbki, odejmując absorbancję kontrolną próbki od absorbancji próbki testowej. Jeśli kontrole substratu mają wysoką absorbancję (około >0,060), należy je również odjąć.</li>
	<li>Obliczyć aktywność enzymatyczną w μmolach hr-1 g suchej masy-1 z równania:</li>
</ol>
Aktywność enzymu = Końcowa absorbancja / (C x czas inkubacji x sucha masa próbki)
Analiza fluorescencyjna aktywności enzymów zewnątrzkomórkowych w wodach naturalnych
1. Przygotowanie roztworów substratowych, wzorcowych i buforowych do analiz fluorometrycznych aktywności enzymów
<ol>
	<li>Przygotować 200 μM roztwory substratów połączonych MUB (np. 4-MUB-β-glukopiranozyd, 4-MUB-fosforan, 4-MUB-N-acetylo-β-D-glukozaminid) przez rozpuszczenie odpowiedniego substratu w sterylnym (autoklawowanym) destylowanymH2Ow sterylnych probówkach wirówkowych o pojemności 15 ml lub 50 ml. Zawiń probówki w folię aluminiową, aby wykluczyć światło i przechowuj w lodówce przed użyciem. Podłoża powinny być stabilne przez co najmniej 1 tydzień, jeśli są przechowywane w ten sposób.</li>
	<li>Przygotować wzorzec MUB, sporządzając roztwór podstawowy 100 μM 4-metylolumbelliferonu w sterylnym destylowanymH2O. Przechowywać w lodówce w butelce owiniętej w bursztyn lub folię. Bezpośrednio przed użyciem rozcieńczyć roztwór podstawowy 100 μM w stosunku 1/10 do sterylnegoH2O, aby uzyskać roztwór roboczy 10 μM do oznaczania enzymów.</li>
	<li>Przygotować roztwór podstawowy 100 mM buforu wodorowęglanowego, rozpuszczając 8,4 gNaHCO3 w 1 LH2O i sterylizując w autoklawie. Rozcieńczyć ten roztwór podstawowy w stosunku 1:20 do sterylnegoH2Ow razie potrzeby, aby uzyskać roztwór roboczy o stężeniu 5 mM do oznaczania enzymów.</li>
</ol>
2. Porządkowanie próbek wody na 96-dołkowej czarnej mikropłytce
<ol>
	<li>Zorganizuj mikropłytkę dla każdego enzymu zgodnie z przykładem pokazanym na rysunku 2. Należy pamiętać, że pozwalając na odpowiednią replikację, standardy i kontrole, procedura ta może oznaczać aktywność pojedynczego enzymu dla maksymalnie dziewięciu próbek wody na jednej 96-dołkowej czarnej mikropłytce.</li>
	<li>Wlać około 5 ml pierwszej próbki do zbiornika pipety i za pomocą pipety 8-kanałowej pipetować pipetami 200 μl do wszystkich studzienek w kolumnie 1 mikropłytki. Wyrzuć zużyte końcówki do pipet i powtórz w razie potrzeby dla każdej próbki wody, aby wypełnić kolumny 1-9.</li>
</ol>
3. Ustawianie kontroli próbki, standardu, hartowania i podłoża
<ol>
	<li>Skonfiguruj kontrole, aby uwzględnić próbki, wzorce, podłoże i hartowanie na tej samej czarnej mikropłytce, co próbki (rysunek 2).</li>
	<li>Próbki kontrolne zawierają próbkę wody i bufor wodorowęglanowy i nie są wykorzystywane w obliczeniach aktywności, ale będą wykazywać spójność odczytu przez cały czas trwania eksperymentu. Kontrole hartowania składają się z próbki wody i standardowej ilości znacznika fluorescencyjnego i służą do pomiaru dyfrakcji fluorescencji w próbce wody. Kontrole substratowe i standardowe składają się odpowiednio z połączonego z substratem lub standardowego znacznika fluorescencyjnego oraz buforu wodorowęglanowego.</li>
	<li>Wlać około 5 ml 5 mM buforu wodorowęglanowego do czystego zbiornika na pipety. Odpipetować 50 μl buforu do dołków mikropłytki od 1 do 9 w rzędach D i E, aby utworzyć dwie duplikaty próbek kontrolnych na próbkę. Wymień końcówki pipet, a następnie przenieś 200 μl buforu wodorowęglanowego do studzienek od 10 do 12 w rzędach A i H.</li>
	<li>Zmniejsz oświetlenie otoczenia, lub wyłączając światła, ponieważ standard fluorescencyjny jest wrażliwy na światło.</li>
	<li>Wlać około 5 ml 10 μM 4-metylolumbelliferonu do czystego zbiornika na pipety. Odpipetować 50 μl do studzienek mikropłytki od 1 do 12 w rzędzie H, a do studzienek od 1 do 9 do rzędów G i F, aby utworzyć trzy powtórzenia kontroli hartowania na próbkę i ogólne kontrole standardowe. Umieść mikropłytkę w ciemności lub przykryj nieprzezroczystą pokrywką, aby zmniejszyć degradację MUB przez światło.</li>
	<li>Włącz fluorometr i skonfiguruj niezbędne oprogramowanie, aby być gotowym do odczytu przed dodaniem substratu. Uwaga: niektóre żarówki fluorometryczne mogą wymagać czasu nagrzewania wynoszącego 3 minuty lub więcej.</li>
	<li>Wlać około 5 ml odpowiedniego substratu połączonego z MUB (np. fosforanu 4-MUB) do czystego zbiornika na pipety. Za pomocą 12-kanałowego pipetora pipetować 50 μl do dołków mikropłytek od 1 do 12 w rzędzie A oraz do dołków od 1 do 9 w rzędach B i C, aby utworzyć trzy powtórzone testy dla każdej próbki i trzy kontrolne substraty. Natychmiast przejdź do kroku 4.1, rejestrując fluorescencję.</li>
</ol>
4. Rejestracja fluorescencji
<ol>
	<li>Odczytać wstępną fluorescencję natychmiast po dodaniu substratu do mikropłytki. Po odczytaniu fluorescencji należy inkubować mikropłytkę w temperaturze pokojowej (22 °C) w ciemności lub przykryć nieprzezroczystą pokrywką w celu zmniejszenia degradacji MUB przez światło.</li>
	<li>Czas inkubacji wymagany do zmierzenia maksymalnej potencjalnej aktywności enzymu w próbce wody będzie zależał od stężenia enzymu w próbce. Ponieważ nie jest to znane przed zakończeniem testu, mikropłytka będzie musiała zostać odczytana w wielu krokach czasowych. Zazwyczaj odczyt w odstępach 10-15 minut w ciągu 1 godziny jest dopuszczalny dla wielu enzymów, chociaż próbki o bardzo wysokiej aktywności niektórych enzymów mogą osiągnąć szczyt przed 10 minutami.</li>
	<li>Kontynuuj czytanie fluorescencji w mikropłytce w wyznaczonych odstępach czasu przez co najmniej 1 godzinę. Upewnij się, że mikropłytka jest zakryta lub w ciemności między odczytami.</li>
</ol>
5. Obliczanie aktywności enzymu na objętość wody
<ol>
	<li>Dla każdej próbki w każdym przedziale czasowym obliczyć: średnią początkową fluorescencję próbki (studzienki D i E), średnią fluorescencję próbki końcowej (studzienki A-C), średnią fluorescencję wzorcową (studzienki H10-11) i średnią fluorescencję kontrolną tłumienia (studzienki F-G).</li>
	<li>Dla każdego przedziału czasowego oblicz aktywność enzymu w nmolach hr-1 ml-1 z równania:</li>
</ol>
Aktywność enzymu = (średnia fluorescencja próbki - średnia początkowa fluorescencja próbki) / ((średnia fluorescencja wzorcowa / 0,5 mola) x (średnia fluorescencja kontrolna tłumienia / średnia fluorescencja standardowa) x (0,2 ml) x (czas w godz.))
<ol start="3">
	<li>Sprawdź wartości aktywności obliczone dla każdego kroku czasowego. Określ ostateczną potencjalną aktywność na podstawie kroku czasowego z najwyższą aktywnością. Jeśli wartości aktywności będą nadal rosły, mogą być wymagane późniejsze kroki czasowe; Jeśli wartości aktywności spadną w trakcie biegu, uruchom ponownie z krótszymi krokami czasowymi. Końcowa aktywność jest w nmolach zużytego substratu hr-1 ml-1, ale może być skalowana w górę do ekspresji jako μmole hr-1 L-1.</li>
</ol>

<ol><li>Ljungdahl, L. G., Eriksson, K. -E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ecology+of+microbial+cellulose+degradation%5BTitle%5D)+AND+%22Advances+in+microbial+ecology%22%5BJournal%5D)">Ecology of microbial cellulose degradation.</a> Advances in microbial ecology. 8, 237-299 (1985).</li>
<li>Sinsabaugh, R. L., Antibus, R. K., Linkins, A. E., Mclaugherty, C. A., Rayburn, L., Repert, D., Weiland, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Wood+decomposition+over+a+first-order+watershed%3A+mass+loss+as+a+function+of+lignocellulase+activity%5BTitle%5D)+AND+%22Soil+biology+and+biochemistry%22%5BJournal%5D)">Wood decomposition over a first-order watershed: mass loss as a function of lignocellulase activity.</a> Soil biology and biochemistry. 24, 743-749 (1992).</li>
<li>Dalal, R. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Soil+organic+phosphorus%5BTitle%5D)+AND+%22Advances+in+agronomy%22%5BJournal%5D)">Soil organic phosphorus.</a> Advances in agronomy. 29, 83-113 (1977).</li>
<li>Sinsabaugh, R. L., Moorhead, D. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Resource+allocation+to+extracellular+enzyme+production%3A+a+model+for+nitrogen+and+phosphorus+control+of+litter+decomposition%5BTitle%5D)+AND+%22Soil+biology+and+biochemistry%22%5BJournal%5D)">Resource allocation to extracellular enzyme production: a model for nitrogen and phosphorus control of litter decomposition.</a> Soil biology and biochemistry. 26, 1305-1311 (1995).</li>
<li>Tabatabai, M. A., Bremner, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Use+of+p-nitrophenyl+phosphate+for+assay+of+soil+phosphatase+activity%5BTitle%5D)+AND+%22Soil+biology+and+biochemistry%22%5BJournal%5D)">Use of p-nitrophenyl phosphate for assay of soil phosphatase activity.</a> Soil biology and biochemistry. 1, 301-307 (1969).</li>
<li>Parham, J. A., Deng, S. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Detection%2C+quantification+and+characterization+of+%CE%B2-glucosaminidase+activity+in+soil%5BTitle%5D)+AND+%22Soil+biology+and+biochemistry%22%5BJournal%5D)">Detection, quantification and characterization of β-glucosaminidase activity in soil.</a> Soil biology and biochemistry. 32, 1183-1190 (2000).</li>
<li>Kuperman, R. G., Carreiro, M. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Soil+heavy+metal+concentrations%2C+microbial+biomass+and+enzyme+activities+in+a+contaminated+grassland+ecosystem%5BTitle%5D)+AND+%22Soil+biology+and+biochemistry%22%5BJournal%5D)">Soil heavy metal concentrations, microbial biomass and enzyme activities in a contaminated grassland ecosystem.</a> Soil biology and biochemistry. 29, 179-190 (1997).</li>
<li>Olander, L. P., Vitousek, P. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulation+of+soil+phosphatase+and+chitinase+activity+by+N+and+P+availability%5BTitle%5D)+AND+%22Biogeochemistry%22%5BJournal%5D)">Regulation of soil phosphatase and chitinase activity by N and P availability.</a> Biogeochemistry. 49, 175-190 (2000).</li>
<li>Jackson, C. R., Vallaire, S. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effects+of+salinity+and+nutrient+enrichment+on+microbial+assemblages+in+Louisiana+wetland+sediments%5BTitle%5D)+AND+%22Wetlands%22%5BJournal%5D)">Effects of salinity and nutrient enrichment on microbial assemblages in Louisiana wetland sediments.</a> Wetlands. 29, 277-287 (2009).</li>
<li>Hoppe, H. -G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Significance+of+exoenzymatic+activities+in+the+ecology+of+brackish+water%3A+measurements+by+means+of+methylumbelliferyl-substrates%5BTitle%5D)+AND+%22Marine+ecology+progress+series%22%5BJournal%5D)">Significance of exoenzymatic activities in the ecology of brackish water: measurements by means of methylumbelliferyl-substrates.</a> Marine ecology progress series. 11, 299-308 (1983).</li>
<li>Somville, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Measurement+and+study+of+substrate+specificity+of+exoglucosidase+activity+in+eutrophic+water%5BTitle%5D)+AND+%22Applied+and+environmental+microbiology%22%5BJournal%5D)">Measurement and study of substrate specificity of exoglucosidase activity in eutrophic water.</a> Applied and environmental microbiology. 48, 1181-1185 (1984).</li>
<li>Freeman, C., Liska, G., Ostle, N. J., Jones, S. E., Lock, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+use+of+fluorogenic+substrates+for+measuring+enzyme+activity+in+peatlands%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+and+soil%22%5BJournal%5D)">The use of fluorogenic substrates for measuring enzyme activity in peatlands.</a> Plant and soil. 175, 147-152 (1995).</li>
<li>Sinsabaugh, R. L., Findlay, S., Franchini, P., Fischer, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Enzymatic+analysis+of+riverine+bacterioplankton+production%5BTitle%5D)+AND+%22Limnology+and+oceanography%22%5BJournal%5D)">Enzymatic analysis of riverine bacterioplankton production.</a> Limnology and oceanography. 42, 29-38 (1997).</li>
<li>Marx, M. -C., Wood, M., Jarvis, S. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+microplate+fluorometric+assay+for+the+study+of+enzyme+diversity+in+soils%5BTitle%5D)+AND+%22Soil+biology+and+biochemistry%22%5BJournal%5D)">A microplate fluorometric assay for the study of enzyme diversity in soils.</a> Soil biology and biochemistry. 33, 1633-1640 (2001).</li>
<li>Jackson, C. R., Weeks, A. Q. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Influence+of+particle+size+on+bacterial+community+structure+in+aquatic+sediments+as+revealed+by+16S+rRNA+gene+sequence+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Applied+and+environmental+microbiology%22%5BJournal%5D)">Influence of particle size on bacterial community structure in aquatic sediments as revealed by 16S rRNA gene sequence analysis.</a> Applied and environmental microbiology. 74, 5237-5240 (2008).</li>
<li>Canion, A. K., Ochs, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+population+dynamics+of+freshwater+armored+dinoflagellates+in+a+small+lake+in+Mississippi%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+freshwater+ecology%22%5BJournal%5D)">The population dynamics of freshwater armored dinoflagellates in a small lake in Mississippi.</a> Journal of freshwater ecology. 20, 617-626 (2005).</li>
<li>Sinsabaugh, R. L., Lauber, C. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stoichiometry+of+soil+enzyme+activity+at+global+scale%5BTitle%5D)+AND+%22Ecology+letters%22%5BJournal%5D)">Stoichiometry of soil enzyme activity at global scale.</a> Ecology letters. 11, 1252-1264 (2008).</li>
<li>Jackson, C. R., Foreman, C. M., Sinsabaugh, R. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microbial+enzyme+activities+as+indicators+of+organic+matter+processing+rates+in+a+Lake+Erie+coastal+wetland%5BTitle%5D)+AND+%22Freshwater+biology%22%5BJournal%5D)">Microbial enzyme activities as indicators of organic matter processing rates in a Lake Erie coastal wetland.</a> Freshwater biology. 34, 329-342 (1995).</li>
<li>Jackson, C. R., Vallaire, S. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microbial+activity+and+decomposition+of+fine+particulate+organic+matter+in+a+Louisiana+cypress+swamp%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+the+north+american+benthological+society%22%5BJournal%5D)">Microbial activity and decomposition of fine particulate organic matter in a Louisiana cypress swamp.</a> Journal of the north american benthological society. 26, 743-753 (2007).</li>
<li>Jackson, C. R., Liew, K. C., Yule, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structural+and+functional+changes+with+depth+in+microbial+communities+in+a+tropical+Malaysian+peat+swamp+forest%5BTitle%5D)+AND+%22Microbial+ecology%22%5BJournal%5D)">Structural and functional changes with depth in microbial communities in a tropical Malaysian peat swamp forest.</a> Microbial ecology. 57, 402-412 (2009).</li>
<li>Rietl, A. J., Jackson, C. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effects+of+the+ecological+restoration+practices+of+prescribed+burning+and+mechanical+thinning+on+soil+microbial+enzyme+activities+and+leaf+litter+decomposition%5BTitle%5D)+AND+%22Soil+biology+and+biochemistry%22%5BJournal%5D)">Effects of the ecological restoration practices of prescribed burning and mechanical thinning on soil microbial enzyme activities and leaf litter decomposition.</a> Soil biology and biochemistry. 50, 47-57 (2012).</li>
<li>Smart, K. A., Jackson, C. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fine+scale+patterns+in+microbial+extracellular+enzyme+activity+during+leaf+litter+decomposition+in+a+stream+and+its+floodplain%5BTitle%5D)+AND+%22Microbial+ecology%22%5BJournal%5D)">Fine scale patterns in microbial extracellular enzyme activity during leaf litter decomposition in a stream and its floodplain.</a> Microbial ecology. 58, 591-598 (2009).</li>
</ol>

Autorzy oświadczają, że nie mają konkurencyjnych interesów finansowych.

Określenie aktywności różnych mikrobiologicznych enzymów zewnątrzkomórkowych w glebie i osadach może dostarczyć użytecznych informacji na temat tempa mineralizacji składników odżywczych i przetwarzania materii organicznej17. Jednak gleby mogą różnić się poziomem wilgotności, dlatego ważne jest, aby ustandaryzować aktywność do suchej masy gleby. Wymaga to dodatkowego etapu suszenia (zwykle trwającego dwa dni) poza samym pomiarem aktywności enzymów. Tak więc, w przeciwieństwie do testów aktywności enzymów w prób...

Mikroorganizmy, takie jak bakterie i grzyby, pozyskują składniki odżywcze i węgiel ze złożonych związków organicznych poprzez produkcję enzymów zewnątrzkomórkowych. Enzymy te zazwyczaj hydrolizują polimery na mniejsze podjednostki, które mogą zostać wprowadzone do komórki. Dlatego na poziomie ekologicznym te mikrobiologiczne enzymy zewnątrzkomórkowe są odpowiedzialne za znaczną część mineralizacji składników odżywczych i rozkładu materii organicznej, które zachodzą w środowisku naturalnym. Enzymy, takie jak celobiohydrolaza (CBH) i β-glukozydaza, są ważne dla degradacji celulozy i działają zgodnie, katalizując hydrolizę celulozy doglukozy 1,2, która zapewnia użyteczny substrat węglowy do wychwytu i asymilacji drobnoustrojów. Enzym fosfataza uwalnia rozpuszczalne nieorganiczne grupy fosforanowe z fosforanów organicznych, zasadniczo mineralizując fosforan i udostępniając go do wykorzystania przez większość organizmów3. Inne enzymy, takie jak N-acetyloglukozaminidaza (NAGaza), odgrywają ważną rolę w degradacji chityny i mogą udostępniać zarówno węgiel, jak i azot do pozyskiwania przez mikroorganizmy4.
Jedną z procedur badania aktywności mikrobiologicznej enzymów zewnątrzkomórkowych w naturalnym środowisku jest użycie sztucznych substratów połączonych z p-nitrofenylem (pNP), podejście, które pierwotnie zostało opracowane do wykrywania aktywności fosfatazy glebowej5. Podejście to opiera się na wykrywaniu kolorowego produktu końcowego, p-nitrofenolu, który jest uwalniany, gdy sztuczny substrat jest hydrolizowany przez odpowiedni enzym. P-nitrofenol można następnie określić ilościowo kolorymetrycznie, mierząc jego absorbancję przy około 400-410 nm. Od tego czasu metoda ta została zastosowana do wykrywania innych enzymów, takich jak NAGaza6, i była stosowana w różnych badaniach dotyczących aktywności mikrobiologicznych enzymów zewnątrzkomórkowych w glebach i osadach7-9.
Alternatywne podejście, które pierwotnie zostało opracowane do oceny aktywności zewnątrzkomórkowej glukozydazy w środowisku wodnym10,11 wykorzystuje substraty połączone z 4-metylolumbelliferonem (MUB). Uwolniony produkt końcowy (4-metyloumbelliloron) jest wysoce fluorescencyjny i można go wykryć za pomocą fluorometru z ustawieniem wzbudzenia/emisji około 360/460 nm. Dostępnych jest wiele rodzajów sztucznych substratów połączonych z MUB, co pozwala na fluorometryczny pomiar aktywności co najmniej tylu enzymów (np. β-glukozydazy, celulobiohydrolazy, NAGazy, fosfatazy), ile można oznaczyć za pomocą procedury kolorymetrycznej pNP-substrate. Inne mikrobiologiczne enzymy zewnątrzkomórkowe, takie jak rozkładająca białko aminopeptydaza leucynowa, można oznaczyć fluorometrycznie przy użyciu substratów połączonych z 7-amino-4-metylokoumaryną (COU). Zarówno substraty połączone z MUB, jak i COU wykorzystano do określenia aktywności enzymatycznej w różnych próbkach lądowych i wodnych12,13.
Podczas gdy poprzednie badania opisywały metody mikropłytek fluorometrycznych lub kolorymetrycznych do określania aktywności enzymów zewnątrzkomórkowych14; istnieje potrzeba jasnej prezentacji, jak przeprowadzać takie testy. W tym miejscu przedstawiono procedury przeprowadzania wysokoprzepustowych technik mikropłytek do analizy aktywności enzymów zewnątrzkomórkowych w glebach i osadach przy użyciu podejścia kolorymetrycznego p-NP-linked substrates oraz w wodach naturalnych przy użyciu techniki fluorescencyjnych podłoży połączonych MUB. Koncentrujemy się na pomiarze aktywności β-glukozydazy, NAGazy i fosfatazy, ponieważ enzymy te mogą być powiązane odpowiednio z obiegiem węgla, azotu i fosforu. Jednak opisane tutaj procedury można zastosować do pomiaru innych enzymów zewnątrzkomórkowych przy użyciu różnych sztucznych substratów.

<table><tbody><tr><td colspan="4">ODCZYNNIKI I MATERIAŁY</td></tr><tr><td>Glacial acetic acid</td><td></td><td></td><td>Różni dostawcy</td></tr><tr><td>Octan sodu</td><td>Różni dostawcy</td>Wodorotlenek <td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td>sodu</td><td>Różni dostawcy</td></tr><tr><td>p-Nitrophenol</td><td>Fisher</td><td>BP612-1</td><td>Dostępne zamienniki</td></tr><tr><td>p-nitrofenyl (pNP)-fosforan</td><td>Sigma</td><td>N3234</td><td>pNP-substrate</td></tr><tr><td>pNP-&#946;-glukopiranozyd</td><td>Sigma</td><td>N7006</td><td>pNP-substrate</td></tr><tr><td>pNP-&#946;-N-acetyloglukozaminid</td><td>Sigma</td><td>N9376</td><td>p Podłoże NP</td></tr><tr><td>Przezroczyste 96-dołkowe mikropłytki</td><td>Fisher</td><td>12-563-301</td><td>Dostępne zamienniki</td></tr><tr><td>96-dołkowe bloki głębinowe</td><td>Costar</td><td>3958</td><td>Dostępne zamienniki</td></tr><tr><td>Aluminiowe szalki</td><td></td><td></td><td>wagowe Różni dostawcy</td></tr><tr><td>Sterylne probówki</td><td></td><td></td> wirówkowe 15 ml <td>Różni dostawcy</td></tr><tr><td>Sterylne probówki</td><td></td><td></td> <td>wirówkowe 50 mlRóżni dostawcy</td></tr><tr><td>4-metylombellitryron</td><td>Sigma</td><td>M1381</td><td></td></tr><tr><td>4-metylombliferyl (MUB)-fosforan</td><td>Sigma</td><td>M8883</td><td>MUB-substrat</td></tr><tr><td>4-MUB-glukopiranozyd</td><td>Sigma</td><td>M3633</td><td>MUB-substrat</td></tr><tr><td>4-MUB-N-acetyloglukozaminid</td><td>Sigma</td><td>M2133</td><td>MUB-substrat</td></tr><tr><td>Wodorowęglan</td><td></td> sodu<td></td><td>Różni dostawcy</td></tr><tr><td>96-dołkowa mikropłytka</td><td>Costar</td><td>3792</td><td></td></tr><tr>Zbiornik <td></td><td></td><td>na pipety</td><td>Różni dostawcy</td></tr><tr><td colspan="4">EQUIPMENT</td></tr><tr><td>Wirówka</td><td>Eppendorf</td><td>5810R</td><td></td></tr><tr><td>Wirnik wirówki</td><td>Eppendorf</td><td>A-4-81</td><td>Do mikropłytek/bloków</td></tr> <tr><td>głębinowychCzytnik mikropłytek</td><td>BioTek</td><td>Synergy HT</td><td>Dostępne zamienniki</td></tr><tr><td>Fluorometr do mikropłytek</td><td>BioTek</td><td>FLx 800</td><td>Dostępne alternatywnie</td></tr><tr><td>pipety</td><td></td><td></td> 8-kanałowe <td>Różni dostawcy</td></tr></tbody></table>

oznaczanie mikrobiologicznej aktywności enzymów zewnątrzkomórkowych w wodach, glebach i osadach za pomocą wysokoprzepustowych testów mikropłytek

Determination of Microbial Extracellular Enzyme Activity in Waters, Soils, and Sediments using High Throughput Microplate Assays

Znaczna część obiegu składników odżywczych i przetwarzania węgla w naturalnym środowisku odbywa się poprzez aktywność enzymów zewnątrzkomórkowych uwalnianych przez mikroorganizmy. W ten sposób pomiar aktywności tych enzymów zewnątrzkomórkowych może dać wgląd w tempo procesów na poziomie ekosystemu, takich jak rozkład materii organicznej lub mineralizacja azotu i fosforu. Testy aktywności enzymów zewnątrzkomórkowych w próbkach środowiskowych zazwyczaj obejmują wystawienie próbek na działanie sztucznych substratów kolorymetrycznych lub fluorometrycznych i śledzenie szybkości hydrolizy substratu. W tym miejscu opisujemy metody oparte na mikropłytkach dla tych procedur, które pozwalają na analizę dużej liczby próbek w krótkim czasie. Próbki mogą reagować ze sztucznymi podłożami w 96-dołkowych mikropłytkach lub blokach mikropłytek głębokich, a następnie określa się aktywność enzymu przez absorpcję lub fluorescencję otrzymanego produktu końcowego za pomocą typowego czytnika mikropłytek lub fluorometru. Tak wysokowydajne procedury nie tylko ułatwiają porównania między przestrzennie oddzielonymi miejscami lub ekosystemami, ale także znacznie obniżają koszty takich testów poprzez zmniejszenie całkowitej objętości odczynników potrzebnych na próbkę.

Gleby i osady wodne zazwyczaj wykazują znaczną aktywność enzymów zewnątrzkomórkowych, co jest wynikiem obecności przytwierdzonych społeczności drobnoustrojów (biofilmów) rozwijających się na powierzchni cząsteczek. Rysunek 3 przedstawia, w jaki sposób aktywność ta zmienia się w zależności od wielkości cząsteczek pobranych z osadu powierzchniowego strumienia trzeciego rzędu w północnym Mississippi, USA. Poprzednie badanie wykazało, że społeczności bakteryjne na cząsteczkach osadu z tego strumienia można p...

Procedury oparte na mikropłytkach są opisane dla kolorymetrycznej lub fluorometrycznej analizy aktywności enzymów zewnątrzkomórkowych. Procedury te pozwalają na szybkie oznaczenie takiej aktywności na dużej liczbie próbek środowiskowych w rozsądnych ramach czasowych.

Oznaczanie mikrobiologicznej aktywności enzymów zewnątrzkomórkowych w wodach, glebach i osadach za pomocą wysokoprzepustowych testów mikropłytek

Much of the nutrient cycling and carbon  processing in natural environments occurs through the activity of extracellular  enzymes released by ...

Ogólnym celem poniższej procedury jest szybkie oznaczanie aktywności zewnątrzkomórkowych enzymów mikrobiologicznych w różnych środowiskach naturalnych. Osiąga się to poprzez dodanie próbek wody lub zawiesin glebowych do mikropłytek w celu uzyskania odpowiedniej liczby powtórzeń. W drugim kroku do dołków mikropłytki dodaje się sztuczny substrat kolorymetryczny lub fluorometryczny, co umożliwia zajście reakcji enzymatycznych. Następnie mierzy się absorbancję lub fluorescencję, aby określić ilość produktu końcowego uwolnionego podczas reakcji.Wyniki wskazują na różnice w aktywności enzymów zewnątrzkomórkowych między próbkami, w zależności od absorbancji lub fluorescencji produktu końcowego reakcji. Dzisiaj zademonstrujemy, jak mierzyć aktywność enzymów zewnątrzkomórkowych w środowiskach naturalnych. Metoda ta może pomóc w udzieleniu odpowiedzi na kluczowe pytania z zakresu ekologii mikroorganizmów, takie jak tempo przetwarzania materii organicznej w wodzie oraz mineralizacja składników odżywczych w glebach, osadach i wodach. Zazwyczaj osoby rozpoczynające pracę z tą metodą napotykają trudności związane z oddzielaniem cząstek od roztworu reakcyjnego, szczególnie podczas analizy dużej l

determination-microbial-extracellular-enzyme-activity-waters-soils

Research

JoVE Journal

Environment

Środowisko

Oznaczanie aktywności zewnątrzkomórkowych enzymów drobnoustrojów w wodach, glebach i osadach przy użyciu wysoko przepuszczalnych testów płytek mikrotytrajowych

Niniejszy protokół opisuje wysokoprzepustowy screening aktywności celulolitycznej z biblioteki metagenomicznej eksprymowanej w Escherichia coli. Screening opiera się na analizie w roztworze, jest wysoce zautomatyzowany i wykorzystuje chemię jednopojemnikową w mikropłytkach 384-dołkowych, z końcowym odczytem w postaci pomiaru absorbancji.

Wysokoprzepustowy screening aktywności celulazy w procesie biominingu z bibliotek metagenomicznych

Opisujemy niskokosztową, wysokoprzepustową metodę przesiewania aktywności endoglukanazy grzybowej w E. coli. Metoda opiera się na prostym wizualnym odczycie degradacji substratu, nie wymaga oczyszczania enzymu i jest wysoce skalowalna. Umożliwia to szybkie przesiewanie dużych bibliotek wariantów enzymatycznych.

Wysokoprzepustowy screening aktywności grzybowej endoglukanazy w Escherichia coli

Ten film demonstruje test do badania przesiewowego związków przeciwdrobnoustrojowych, które skutecznie eliminują biofilmy za pomocą płytki kołkowej. Metodologia ta monitoruje stan metaboliczny biofilmu po poddaniu działaniu związków przeciwdrobnoustrojowych, ułatwiając określenie minimalnego stężenia eradykacji biofilmu.

Test biofilmu na płytce kołkowej do badań przesiewowych środków przeciwbakteryjnych

Aby zmierzyć potencjalne tempo aktywności enzymów zewnątrzkomórkowych w glebie, do próbek gleby dodaje się syntetyczne substraty, które są związane z barwnikiem fluorescencyjnym.  Aktywność enzymu mierzy się, gdy barwnik fluorescencyjny jest uwalniany z substratu w reakcji katalizowanej enzymatem, gdzie wyższa fluorescencja wskazuje na większą degradację substratu.

Wysokoprzepustowy pomiar fluorometryczny potencjalnej aktywności enzymów zewnątrzkomórkowych w glebie

Tutaj opisujemy test fenotypowy mający zastosowanie do wysokoprzepustowych/wysokotreściowych ekranów małych interferujących bibliotek syntetycznego RNA (siRNA), związków chemicznych i Mycobacterium tuberculosis. Metoda ta polega na wykrywaniu znakowanych fluorescencyjnie Mycobacterium tuberculosis w znakowanej fluorescencyjnie komórce gospodarza za pomocą zautomatyzowanej mikroskopii konfokalnej.

Mikroskopowy test fenotypowy do oznaczania ilościowego prątków wewnątrzkomórkowych przystosowany do badań przesiewowych o wysokiej przepustowości/wysokiej zawartości

Tutaj prezentujemy protokoły do szybkiego badania i charakteryzowania enzymów pod kątem aktywności przeciwdrobnoustrojowej. Test dyfuzji mikroszkiełkowej i test uwalniania barwnika wykorzystują docelowe substraty bakteryjne do jakościowej i ilościowej oceny aktywności enzymatycznej.

Testy jakościowe i ilościowe do wykrywania i charakterystyki białkowych środków przeciwdrobnoustrojowych

Ta praca przedstawia metodę wysokoprzepustowych badań przesiewowych przy użyciu uniwersalnego systemu badań przesiewowych enzymów genetycznych, który teoretycznie można zastosować do ponad 200 enzymów. W tym przypadku pojedynczy system przesiewowy identyfikuje trzy różne enzymy (lipazę, celulazę i fosfatazę alkaliczną), po prostu zmieniając zastosowany substrat (octan p-nitrofenylu, p-nitrofenylo-β-D-celobiozyd i fosforan fenylu).

Badania przesiewowe wielu enzymów przy użyciu wysokoprzepustowego systemu badań przesiewowych enzymów genetycznych

Opisano wysokoprzepustowy test do badań przesiewowych enzymów. Ten multipleksowany, gotowy do użycia zestaw testowy składa się z wstępnie wybranych substratów Chromogennego Polymeru Hydrogelu (CPH) i złożonych Inierozpuszczalnych wC hromogennych substratach ioB (ICB). Enzymy docelowe to endoenzymy i proteazy rozkładające polisacharydy.

Wysokoprzepustowe badania przesiewowe enzymów rozkładających węglowodany przy użyciu nowatorskich zestawów do oznaczania nierozpuszczalnych substratów chromogennych

Przedstawiamy protokół szybkiego badania próbek środowiskowych pod kątem potencjału sideroforu, przyczyniającego się do biodostępności i obrotu mikroelementów w systemach lądowych.

Wysokoprzepustowe przesiewanie sideroforów z próbek środowiskowych: tkanek roślinnych, gleb masowych i gleb ryzosferowych

Testy interakcji międzykulturowych przedstawione w tym protokole są niedrogie, mają wysoką przepustowość i są proste. Testy te można wykorzystać do obserwacji interakcji mikrobiologicznych w kokulturze, identyfikacji wzorców interakcji i scharakteryzowania potencjału hamującego badanego szczepu drobnoustrojów przeciwko patogenom ludzkim i środowiskowym.

Wysokoprzepustowe testy kokultur do badania interakcji mikrobiologicznych

Naucz się oznaczać mikrobiologiczną aktywność enzymów zewnątrzkomórkowych w wodach, glebach i osadach za pomocą wysokoprzepustowych testów mikropłytek. Ta metoda umożliwia szybką analizę aktywności enzymatycznej w różnych środowiskach naturalnych.

Oznaczanie mikrobiologicznej aktywności enzymów zewnątrzkomórkowych w wodach, glebach i osadach za pomocą wysokoprzepustowych testów mikropłytek (Wideo) | JoVE Journal

Oznaczanie mikrobiologicznej aktywności enzymów zewnątrzkomórkowych w wodach, glebach i osadach za pomocą wysokoprzepustowych testów mikropłytek

Przeglądaj więcej filmów