Oznaczanie mikrobiologicznej aktywności enzymów zewnątrzkomórkowych w wodach, glebach i osadach za pomocą wysokoprzepustowych testów mikropłytek

Ogólnym celem poniższej procedury jest szybkie oznaczenie aktywności mikrobiologicznej enzymów zewnątrzkomórkowych w różnych środowiskach naturalnych. Osiąga się to poprzez dodanie próbek zawiesin wodnych lub glebowych do mikropłytki w celu uzyskania odpowiedniej replikacji W drugim etapie do dołków mikropłytek dodaje się sztuczny substrat kolorometryczny lub fluorometryczny, co pozwala na zajście reakcji enzymatycznych. Następnie mierzy się chłonność lub fluorescencję w celu określenia ilości produktu końcowego uwalnianego podczas reakcji.

Wyniki wskazują na różnice w aktywności enzymów zewnątrzkomórkowych między próbkami w oparciu o chłonność lub fluorescencję końcowej reakcji. Dzisiaj pokażemy, jak mierzyć aktywność enzymów zewnątrzkomórkowych w środowisku naturalnym. Metoda ta może pomóc odpowiedzieć na kluczowe pytania w ekologii mikrobiologicznej, takie jak szybkość przetwarzania materii organicznej przez wodę i mineralizacja składników odżywczych w glebach, osadach i wodach Ogólnie rzecz biorąc, osoby, które dopiero zaczynają korzystać z tej metody, będą miały trudności z oddzieleniem cząstek od roztworu reakcyjnego, zwłaszcza podczas oznaczania dużej liczby próbek.

Wizualna demonstracja tej procedury ma kluczowe znaczenie, ponieważ układ płyt może być trudny do nauczenia, a wykonywanie pomiarów w wielu krokach czasowych może sprawić, że procedura ta będzie trudniejsza. Analiza metryczna Chole aktywności enzymów zewnątrzkomórkowych dla gleb i osadów rozpoczyna się od przygotowania buforu substratowego i roztworów wzorcowych zgodnie z opisem w protokole tekstowym dla gleby, przygotować zawiesinę każdej próbki do oznaczenia w sterylnej 15-mililitrowej probówce wirówkowej. Dodać stężenie około jednego grama na mililitr za pomocą 50-milimolowego buforu octanowego do osadów.

Dodaj wystarczającą ilość buforu octanowego, aby gnojowica mogła się łatwo wylać. Dokładna potrzebna objętość gnojowicy będzie się różnić w zależności od liczby badanych enzymów, ale zalecane jest co najmniej pięć mililitrów. Wiruj każdą gnojowicę, aż wszystkie grudki gleby lub osadu rozproszą się.

I zwróćcie uwagę na ostatni tom. Przed pipetowaniem przyciąć końcówki pipet nożyczkami. Ponieważ zawiesiny glebowe mają tendencję do zatykania końcówek, ponownie zwiruj każdą zawiesinę i natychmiast wlej pipetę 150 mikrolitrów do każdej z sześciu studzienek.

Na bloku studni o głębokości 96 odwiertów. Ważne jest, aby dokładnie i często wirować. Aby utrzymać cząstki gleby w zawiesinie, należy pozostawić co najmniej dwie studzienki na blok puste, aby służyły jako kontrola podłoża

Przygotuj 1 96. Dobrze zablokuj dla każdego enzymu, który ma być oznaczony. Wlać około pięciu mililitrów buforu octanowego do zbiornika pipety i użyć pipetera ośmiokanałowego, aby dodać 150 mikrolitrów buforu do dwóch ostatnich studzienek każdej próbki.

Do kontroli buforu próbki i do dwóch studzienek kontrolnych substratu. Wlać około 10 mililitrów odpowiedniego roztworu substratu p nitro fennel lub PNP do zbiornika pipety i za pomocą pipety ośmiokanałowej dodać 150 mikrolitrów roztworu substratu do pierwszych czterech dołków każdej próbki i do dwóch studzienek kontrolnych substratu. Zwróć uwagę na czas rozpoczęcia reakcji, gdy tylko zostanie dodany roztwór substratu.

Inkubować płytki w temperaturze pokojowej przez 0,5 do czterech godzin. Dokładny czas inkubacji będzie się różnić w zależności od poziomu aktywności w próbkach i enzymu, który ma być oznaczony. Podczas inkubacji testów przygotuj jedną przezroczystą 96-dołkową mikropłytkę.

Dla każdego bloku studzienki głębinowej w celu odczytu pipety absorbancyjnej, 190 mikrolitrów wody destylowanej i 10 mikrolitrów jednego molowego wodorotlenku sodu do każdej studzienki mikropłytki. Wodorotlenek sodu spowalnia reakcję enzymatyczną i podnosi pH, co wzmacnia barwę PNP uwalnianego podczas reakcji po inkubacji. Odwiruj 96 bloków dołków w temperaturze od 2000 do 5 000 razy G przez pięć minut, aby osadzać cząstki gleby.

Usunięcie cieczy bez naruszania granulatu może być wyzwaniem. Na początku należy unikać używania zbyt dużej ilości próbki gleby. Pamiętaj, aby wirować wystarczająco długo i używać ostrożnego, ale pewnego ruchu, aby usunąć płyn.

Użyj pipety wielokanałowej, aby pobrać 100 mikrolitrów z każdej z nich. Cóż, uważaj, aby uniknąć pelletu. Przenieść ciecz do odpowiedniego dołka na przygotowanej, przezroczystej 96-dołkowej mikropłytce, włączyć czytnik mikropłytek i ustawić wszelkie niezbędne oprogramowanie zapisuje absorbancję na 410 nanometrach, po oznaczeniu suchej masy próbek zgodnie z opisem w protokole tekstowym, obliczyć końcową absorbancję każdej próbki, odejmując absorbancję kontrolną próbki od absorbancji próbki do oznaczania próbki.

Jeśli kontrole substratu mają wysoką absorbancję większą niż 0,060, odejmij je. Przystąp również do obliczania aktywności enzymu w mikromolach na godzinę na gram suchej masy, korzystając z tego równania. Po ułożeniu czarnej mikropłytki dla każdego enzymu zgodnie z przykładem pokazanym w protokole tekstowym, wlej około pięciu mililitrów pierwszej próbki wody do zbiornika pipety i użyj pipetera ośmiokanałowego, aby pipetować 200 mikrolitrów do wszystkich studzienek.

W pierwszej kolumnie mikropłytki wyrzuć zużyte końcówki pipet i powtórz w razie potrzeby dla każdej próbki wody, aby wypełnić kolumny od pierwszej do dziewiątej. Skonfiguruj kontrole, aby uwzględnić próbki, wzorce, podłoże i hartowanie na tej samej czarnej mikropłytce co próbki. Próbki kontrolne zawierają próbkę wody i bufor wodorowęglanowy i nie są wykorzystywane w obliczeniach aktywności, ale wykażą spójność odczytu przez cały czas trwania eksperymentu.

Kontrole hartowania składają się z próbki wody i standardowej ilości znacznika fluorescencyjnego i służą do pomiaru dyfrakcji fluorescencji. W próbce wody podłoże i standardowe kontrole składają się odpowiednio z substratu połączonego lub standardowego znacznika fluorescencyjnego i buforu wodorowęglanowego. Wlej około pięciu mililitrów pięciomilimolowego buforu wodorowęglanowego do czystego zbiornika na pipety.

Odpipetować 50 mikrolitrów buforu do dołków mikropłytkowych od jednego do dziewięciu w rzędach d i e, aby utworzyć dwa, powtórzyć studzienki kontrolne próbki na próbkę, zmienić końcówki pipet, a następnie przenieść 200 mikrolitrów buforu wodorowęglanowego do studzienek od 10 do 12 w rzędach A i H. Chociaż w tej demonstracji światło jest jasne do celów filmowania, Oświetlenie otoczenia należy zmniejszyć poprzez przyciemnienie lub wyłączenie światła, ponieważ standard fluorescencyjny jest wrażliwy na światło. Wlać około pięciu mililitrów 10 mikromolowych, czterech mone metylowych lub MUB do czystego zbiornika na pipety, odpipetować 50 mikrolitrów do studzienek mikropłytek od jednej do 12 w rzędzie H. Następnie pipetować 50 mikrolitrów do studzienek od jednego do dziewięciu w rzędach G i F, aby utworzyć trzy powtórzenia kontroli tłumienia na próbkę i ogólne standardowe kontrole. Umieść mikropłytkę w ciemności lub przykryj nieprzezroczystą pokrywką, aby zmniejszyć degradację MUB przez światło, włącz fluorymetr i zainstaluj wszelkie niezbędne oprogramowanie, aby było gotowe do odczytu przed dodaniem substratu.

Dla około pięciu mililitrów odpowiedniego substratu wyłożonego MUB do czystego zbiornika pipety, użyj 12-kanałowego pipetera, aby pipetować 50 mikrolitrów do dołków mikropłytek od jednego do 12 w rzędzie A i do studzienek od pierwszego do dziewięciu w rzędach B i C, aby utworzyć trzy, powtórz testy dla każdej próbki i trzy kontrole substratu natychmiast przystąp do rejestracji fluorescencji. Odczytać wstępną fluorescencję natychmiast po dodaniu substratu do mikropłytki po odczycie. Fluorescencyjna inkubacja mikropłytki w temperaturze pokojowej w ciemności lub przykryta nieprzezroczystą pokrywką.

Aby zmniejszyć degradację światła MUB. Czas inkubacji wymagany do zmierzenia maksymalnej potencjalnej aktywności enzymu będzie zależał od stężenia enzymu w próbce. Ponieważ nie jest to znane, zanim próbka zostanie oznaczona, mikropłytka będzie musiała zostać odczytana w wielu krokach.

W przypadku większości enzymów odpowiednie są 10-15-minutowe odstępy w ciągu godziny, chociaż niektóre próbki o wysokich stężeniach osiągają szczyt przed 10 minutami. Kontynuuj czytanie fluorescencji w mikropłytce w wyznaczonych odstępach czasu przez co najmniej godzinę. Upewnij się, że mikropłytka jest zakryta lub w ciemności między odczytami.

Dla każdej próbki w każdym przedziale czasowym należy obliczyć średnią początkową fluorescencję próbki, średnią fluorescencję próbki końcowej, średnią fluorescencję standardową i średnią fluorescencję kontrolną tłumienia dla każdego przedziału czasowego. Obliczyć aktywność enzymu w m na godzinę na mililitr. Korzystając z równania znajdującego się w protokole tekstowym.

Zbadaj wartości aktywności obliczone dla każdego kroku czasowego, określ ostateczną potencjalną aktywność na podstawie kroku czasowego o najwyższej aktywności. Jeśli wartości aktywności będą nadal rosły, mogą być wymagane późniejsze kroki czasowe. Jeśli wartości aktywności spadną w trakcie biegu, uruchom ponownie z krótszymi krokami czasowymi.

Gleby i osady wodne zazwyczaj mają znaczny poziom zewnątrzkomórkowej aktywności enzymatycznej w wyniku przyłączonych społeczności drobnoustrojów rosnących na powierzchni cząstek. Rysunek ten pokazuje, jak ta aktywność zmienia się w zależności od wielkości cząstek uzyskanych z osadów powierzchniowych strumienia trzeciego rzędu w północnej części stanu Missisipi. Poprzednie badania USAA wykazały, że zbiorowiska bakterii na cząstkach osadu z tego strumienia można podzielić na trzy odrębne grupy w oparciu o analizę molekularną ich struktury zbiorowisk.

Te na cząstkach 0,063 milimetra, te na cząstkach 0,1, 2, 5, 0, 0,25 i 0,5 milimetra oraz te na cząstkach o wielkości jednego milimetra. Analiza wzorców aktywności enzymów zewnątrzkomórkowych potwierdza ten wniosek, przy czym fosfataza jest podobna na cząstkach 0,1, 2, 5, 0, 0,25 i 0,5 milimetra, ale znacznie wyższa na frakcjach jedynki i 0,063 milimetra, gdy mierzy się ją techniką substratu połączonego z PNP. Inne enzymy, takie jak beta glucco i n AGA, wykazują podobne piki na najdrobniejszych cząstkach, ale nie są podwyższone na cząstkach o wielkości jednego milimetra.

Podkreślając fakt, że różne enzymy mogą wykazywać różne rozkłady środowiskowe, które można wyjaśnić za pomocą tego testu. Stosunkowo niskie słupki błędu pokazują, że testy metryczne aktywności enzymów na osadach są powtarzalne, a tym samym podatne na analizę statystyczną. Porównując różne i środowiskowe próbki, naturalne wody mają zwykle niższą aktywność enzymów zewnątrzkomórkowych na mililitr niż gleby lub osady na gram.

W związku z tym należy je oznaczać metrycznie pod kątem flory przy użyciu substratów połączonych z MUB. Ten rysunek pokazuje, jak aktywność enzymów, fosfatazy, beta, glucco i NGA zmienia się wraz z głębokością. W płytkim jeziorze w północnym Missisipi w USA jezioro jest znane z ubogiego w składniki odżywcze, co sugeruje również stosunkowo wysoka aktywność fosfatazy i enzymu, które mikroorganizmy wytwarzają w celu pozyskiwania fosforanów ze związków organicznych.

Dla wszystkich trzech enzymów próbki testowe pobrane na powierzchni wody i na głębokości 50 centymetrów wykazały podobną aktywność. Podczas gdy aktywność była podwyższona w próbce o średnicy 100 centymetrów, próbka została zasadniczo pobrana z granicy faz osadu wodnego, a obecność cząstek osadu w próbce prawdopodobnie odpowiada za wyższą aktywność zaobserwowaną w próbce, zwłaszcza w przypadku beta glucco i n AGA. Podobnie jak w przypadku podłoży PNP, niskie słupki błędu pokazują, że nawet przy zaledwie trzech powtórzeniach odczytów, odtwarzalność testów fluorometrycznych z użyciem substratów MUB jest wysoka.

Należy zauważyć, że jednostki aktywności enzymatycznej próbki wody są jednostkami wielkości zużytego substratu, podczas gdy jednostki aktywności enzymu na cząstkach osadu są wyrażone w mikromolach zużytego substratu, mimo że wielkość na jednostkę jest porównywalna. Podkreśla to fakt, że gleby i osady mają zwykle znacznie wyższą aktywność zewnątrzkomórkową niż wody naturalne. Wykazano również zwiększoną czułość techniki substratu połączonego z MUB oraz konieczność wykorzystania tej techniki do oznaczania aktywności enzymów zewnątrzkomórkowych w próbkach wody po opanowaniu.

Technika ta może być wykorzystana do oznaczenia dziewięciu próbek wody na obecność enzymów w ciągu nieco ponad godziny Podczas próby tej procedury dla gleb i osadów. Ważne jest, aby użyć znanego masywnego materiału, aby aktywność mogła być wyrażona na podstawie suchej masy. Po obejrzeniu tego filmu powinieneś dobrze zrozumieć, jak mierzyć aktywność enzymów zewnątrzkomórkowych i różnych środowisk naturalnych za pomocą technik metrycznych kolorów lub niższych wskaźników.