Podejście porównawcze do scharakteryzowania krajobrazu interakcji białko-białko gospodarz-patogen

Ogólnym celem poniższego eksperymentu jest przeprowadzenie badań ektomicznych w celu porównania profili interakcji białek z różnych wariantów patogenów ze wspólnym zestawem czynników komórkowych. Osiąga się to poprzez kojarzenie drożdży, dwa hybrydowe badania przesiewowe CDNA w celu identyfikacji potencjalnych oddziałujących partnerów białek z różnych wariantów patogenów. W drugim kroku partnerzy wchodzący w interakcję otwierają ramki odczytu i są sekwencjonowane i przenoszone do kompatybilnych wektorów w celu dalszej walidacji.

Następnie wybierany jest zestaw indywidualnych partnerów wyłonionych ze wszystkich dwóch badań hybrydowych i ponownie testowany pod kątem ich interakcji z pełnym zakresem badanych szczepów. Odbywa się to za pomocą ortogonalnego testu komplementacji fragmentów białek opartego na gia, lucyferazy, wykonywanego w komórkach ssaków w celu zapewnienia solidnych zestawów danych porównawczych interakcji. Wyniki wskazują na różną intensywność interakcji między białkami patogenu a białkami komórkowymi w oparciu o uzyskane miary lucyferazy, a tym samym zapewniają porównawczy przegląd interakcji białkowych patogenu z białkami gospodarza.

Przetwarzanie profili interakcji za pomocą hierarchicznego grupowania koreluje specyficzne interakcje patogenów gospodarza z cechami patologicznymi i daje wgląd w udział białek patogenów w patogenezie. Główną zaletą tego podejścia w porównaniu z innymi metodami mapowania interakcji białek gospodarza patogenów z białkami gospodarza jest to, że zapewnia ono rygorystyczny zestaw danych porównawczych interakcji między wieloma wariantami szczepu. Techniki te zapewniają wgląd w sieć interakcji białka patogenu, ale mogą być również stosowane w innych systemach jako cząsteczka zakaźna przy użyciu kompletnej genetyki wirusów i rzek, na przykład Rozpocznij ten protokół od krycia i rozprzestrzeniania komórek drożdży, jak opisano w pisemnym nasieniu protokołu.

30 mililitrów selektywnej pożywki bez tryptofanu z kilkoma koloniami szczepu drożdży AH 1, 0, 9 przekształconego za pomocą siedmioplazmidu P-G-B-K-T wykazującego ekspresję białka patogenu. Inkubować 30 godzin w temperaturze 30 stopni Celsjusza z rotacją. Następny siew, 200 mililitrów selektywnej pożywki dropout minus tryptofan z 30 mililitrami AH 1 0 9.

Kultury inkubuje się z rotacją przez 20 godzin w temperaturze 30 stopni Celsjusza. Ponadto inkubowana biblioteka CDNA przekształciła Y 187 w 20 mililitrach kleju YP przez 10 minut w temperaturze 30 stopni Celsjusza z rotacją. Następnie odwirować objętość przekształconej kultury AH 109 PG BK T siedem odpowiadającej równoważnej ilości żywotnych komórek drożdży Y 187 przez pięć minut przy 3, 500 obr./min i 20 stopniach Celsjusza.

Ostrożnie wyjmij supernatant i Resus zawieś podniebienie w 10 mililitrach kleju YP. Wymieszać zawieszone drożdże AH 109 z biblioteką zawierającą Y 187. Przenieś do 50-mililitrowej probówki przed odwirowaniem przez pięć minut przy 3, 500 obr./min i 20 stopniach Celsjusza.

Po ostrożnym wyjęciu super dat Resus zawieś granulat w kleju YP, aby uzyskać w sumie 1,5 mililitra. Następnie rozprowadź drożdże na trzech agarach YCM, 150-milimetrowych płytkach po 0,5 mililitra na płytkę i inkubuj 4,5 godziny w temperaturze 30 stopni Celsjusza. Zbierz sparowane drożdże z płytek YCM, zeskrobując szkłem grabiowym 10 mililitrów selektywnej pożywki do odpadania bez leucyny, tryptofanu i histydyny.

Przepłukać płytkę dwa razy pięcioma mililitrami tego samego podłoża i po odwirowaniu przez pięć minut w temperaturze 3, 500 obr./min i 20 stopniach Celsjusza. Odrzucić supernatant i reus. Zawiesić osad drożdżowy w pięciu mililitrach selektywnej pożywki odpadowej bez leucyny, tryptofanu i histydyny.

Następnie rozprowadź połączone drożdże na 10 płytkach selektywnego agaru bez leucyny, tryptofanu i histaminy uzupełnionych odpowiednim stężeniem trzech aminotriazolu lub trzech w temperaturze określonej w teście automatycznej aktywacji. Obliczyć szybkość diploidalności zgodnie z opisem w pisemnym protokole po inkubacji w temperaturze 30 stopni Celsjusza w wilgotnej atmosferze przez sześć do 10 dni. Zbierz kolonie drożdży i przenieś na talerze przygotowane świeżo z selektywnego agaru dropout minus leucyna, tryptofan i histydyna plus trzy łyżki.

Zamów drożdże w schemacie ośmiu pasów po 12 dołków, odtwarzając płytkę 96-dołkową, aby później łatwiej było je sekwencjonować. Pozwól koloniom drożdży rosnąć przez cztery do pięciu dni w temperaturze 30 stopni Celsjusza w wilgotnej atmosferze. Celem tej sekcji jest PCR, amplifikacja CDNA zawartego w PA ct dwóch wektorów zlizowanych kolonii drożdży hodowanych na selektywnym agarze dropout bez płytek leucyny, trytofanu i histydyny.

Rozpocznij od umieszczenia 96-dołkowej płytki PCR na lodzie do komórek drożdży w 50 mikrolitrach na studzienkę roztworu xmal 20 T. Delikatnie zawieś ponownie jedną kolonię na studzienkę. Inkubować płytkę 15 minut w temperaturze 37 stopni Celsjusza i 15 minut w temperaturze 95 stopni Celsjusza.

Po ponownym umieszczeniu płytki na lodzie, dodaj 50 mikrolitrów wody destylowanej do studzienki, pipetując w górę iw dół, a następnie odwiruj przez pięć minut przy 3, 500 obr./min i czterech stopniach Celsjusza. Po przygotowaniu mieszanki X tack zgodnie z opisem w protokole tekstowym, rozprowadzić 40 mikrolitrów mieszanki na dołku na 96-dołkowej płytce PCR. Dodać 10 mikrolitrów drożdży lizowanych do studzienki i przeprowadzić amplifikację zgodnie z opisem w protokole tekstowym.

Uruchom trzy mikrolitry produktów PCR na 1,2% żelu agros, aby wykryć klony z dodatnim wynikiem PCR. Sekwencjonuj amplifikowane fragmenty PCR wyizolowane z jego trzech dodatnich klonów. Następnie wykonaj analizę wybuchu, aby zidentyfikować otwarte ramki odczytu komórkowego, odrzucając wyrównania o niskim poziomie ufności, a także przesunięcie ramki i przedwczesne zatrzymanie kodu w sekwencjach zawierających przed transfekcją komórki.

Przenieś białko patogenu i otwarte ramki odczytu białka komórkowego do odpowiednich wektorów, aby wygenerować białka połączone z fragmentami lucyferazy Gaia, jak wyszczególniono w protokole tekstowym nasiona 2 9 3 limfocyty T przy 350 000 komórek na mililitr DMEM z 10% płodową surowicą bydlęcą bez antybiotyku. Rozprowadź 100 mikrolitrów na studzienkę na sterylnych białych płytkach hodowlanych przed wzrostem przez 24 godziny w temperaturze 37 stopni Celsjusza z 5% dwutlenkiem węgla następnego dnia. Komórki transfekcyjne przy użyciu dowolnego odpowiedniego protokołu transfekcji wykorzystują 100 nanogramów na studzienkę zarówno patogenu, jak i gospodarza, plazmidy z otwartą ramką odczytu konstruują transfekcję 10 nanogramów na dołek plazmidu lucyferazy świetlika CMV w celu normalizacji wydajności transfekcji.

Każdy punkt jest badany w trzykrotnym przeniesieniu, mieszaninie transfekcyjnej na płytki hodowanych 2, 9, 3 limfocytów T. Uważaj, aby delikatnie umieścić mieszaninę DNA na komórkach, ponieważ 2, 9, 3 limfocyty T nie są silnie przylegające i można je łatwo odłączyć od dna studzienki, inkubować w inkubatorze do hodowli komórkowych przez 24 do 30 godzin w temperaturze 37 stopni Celsjusza z 5% dwutlenkiem węgla, przemyć komórki PBS w ilości 100 mikrolitrów na studzienkę. Dodaj 40 mikrolitrów jednego x lizy waniliowej, buforuj i inkubuj przez 30 minut w temperaturze pokojowej.

Pod wpływem mieszania zachowaj 10 mikrolitrów lizatów komórkowych na innej białej płytce do późniejszego dawkowania lucyferazy świetlików przechowywanej w czterech stopniach Celsjusza lub alternatywnie w temperaturze minus 20 stopni Celsjusza z sufitem do pomiaru aktywności Gaia. Umieścić płytkę w luminometrze i wstrzyknąć 100 mikrolitrów odczynnika do oznaczania lucyferazy waniliowej na lizaty komórkowe. Następnie licz luminescencję przez 10 sekund.

Dozowanie płytki 96-dołkowej trwa około pół godziny. Zawsze używaj świeżych ekstraktów, ponieważ zamrażanie lub długotrwałe przechowywanie może wpływać na aktywność Gaia za pośrednictwem interakcji na pozostałych 10 mikrolitrowych ekstraktach komórkowych. Wstrzyknij 50 mikrolitrów odczynnika do oznaczania lucyferazy świetlików na lizaty komórkowe za pomocą luminometru i zliczania luminescencji przez 10 sekund.

Dozowanie płytki 96-dołkowej zajmuje około pół godziny na każdą interakcję. Oblicz stosunek między aktywnością lucyferazy Gaia a aktywnością lucyferazy świetlika, aby uzyskać znormalizowaną wartość luminescencji GAIA. Biorąc pod uwagę wydajność transfekcji i żywotność komórek.

Oblicz średnią z trzech prób, aby monitorować interakcję. Oszacuj znormalizowany współczynnik luminescencji lub NLR dla każdej pary gospodarzy patogenu. Aby to zrobić, podziel znormalizowaną aktywność luminescencyjną GAIA wykrytą w obecności zarówno patogenu, jak i białek gospodarza przez sumę aktywności zmierzonych w studzienkach kontrolnych.

Wartość odcięcia NLR dla interakcji dodatnich została oszacowana w poprzednim badaniu na około 3,5. Główną zaletą wysokoprzepustowych zasad GIA, testu KOMPLEMENTACJI białek lub H-T-G-P-C-A jest jego wysoka czułość, co ilustruje ocena wskaźników fałszywie dodatnich i fałszywie ujemnych dla białka HPVE two w celu określenia wskaźnika wyników fałszywie ujemnych. Znane interakcje E 2 z HPV 16 oceniano za pomocą H-T-G-P-C-A; cztery z 18 interakcji nie zostały wykryte, co odpowiada 22% odsetkowi wyników fałszywie ujemnych.

Zmierzono liczbę fałszywie dodatnich interakcji na poziomie 5,8% przy użyciu 12 białek HPVE przeciwko losowemu zestawowi białek komórkowych. Silna specyficzność metody jest podkreślona na tym rysunku pokazującym, że pojedyncza mutacja punktowa, o której wiadomo, że zakłóca wiązanie E dwa z jej partnerem komórkowym BRD 4, anihiluje stosunek NLR. To zakrojone na szeroką skalę porównawcze podejście ektomiczne zostało ostatnio z powodzeniem zastosowane do trzech wczesnych białek wirusów brodawczaka ludzkiego, E dwóch, E sześciu i E siedmiu, pochodzących z różnych genotypów, reprezentatywnych dla ich naturalnej różnorodności w tropizmach i patologiach dla każdego z wczesnych białek.

Hierarchiczne grupowanie profili interakcji w większości podsumowuje filogenezę HPV, udowadniając solidność podejścia i jakość zestawów danych dotyczących interakcji. Można go wykorzystać do skorelowania określonych profili interakcji wirusa z gospodarzem z cechami patologicznymi, dostarczając w ten sposób wskazówek na temat udziału białek wirusowych. W patogenezie można wyodrębnić interakcje specyficzne dla genotypu, które potencjalnie odpowiadają tropizmowi lub biomarkerom patogennym.

Jak pokazano tutaj dla E sześciu oddziałujących partnerów, cele komórkowe posortowano na podstawie intensywności interakcji i pogrupowano według typu oddziałującego HPV. Ta reprezentacja pozwala na identyfikację specyficznych biomarkerów, takich jak FAD, który oddziałuje tylko z białkami E six onkogennego HPV. Takie ukierunkowanie musi mieć zasadnicze znaczenie dla właściwości rakotwórczej wszystkich onkogennych wirusów HPV, a zatem stanowi dobrego kandydata do wykorzystania albo jako zastępczy marker zakażenia HPV, albo jako cel terapeutyczny.

Postępując zgodnie z tą procedurą. H-T-G-P-C-A można przystosować do stosowania z trzecim białkiem wyrażonym jako fuzja ze znacznikiem biotyny. Pozwala to na uchwycenie trzech kompleksów partnerskich na kolorowych płytkach do nurkowania paciorkowców, a to może odpowiedzieć na pytanie o powstawanie dużych kompleksów białkowych.

Po obejrzeniu tego filmu powinieneś dobrze zrozumieć, jak scharakteryzować interakcje między patogenem a doniczką gospodarza. Po trzecie, poprzez sondowanie partnerów interakcji wielu wariantów szczepów. Po drugie, porównując ich interakcję z całym zestawem typów patogenów za pomocą czasu trwania białka białkowego, powiedzmy w komórkach ssaków.