Name: Podejście porównawcze do scharakteryzowania krajobrazu interakcji białko-białko gospodarz-patogen (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-07-18T12:00:00.000+00:00
Duration: 13 min 56 s
Description: Poznaj metodę porównawczej interaktyki białko-białko w badaniach gospodarz-patogen z wykorzystaniem Y2H i HT-GPCA. To podejście pozwala identyfikować genotypowo-specyficzne biomarkery i potencjalne cele terapeutyczne.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Ta praca była częściowo wspierana przez fundusze z Instytutu Pasteura oraz przez granty z Ligue nationale contre le Cancer (granty R05/75-129 i RS07/75-75), Association pour la Recherche sur le Cancer (granty ARC A09/1/5031 i 4867) oraz Agence Nationale de la Recherche (ANR07 MIME 009 02 i ANR09 MIEN 026 01). M.M był stypendystą M.E.N.R.T.

1. Drożdżowe badania przesiewowe dwuhybrydowe
<ol>
	<li>Wprowadź następujące wymagane rozwiązania
	<ol>
		<li>Complete Synthetic Drop Out (SD): rozpuść 26,7 g minimalnej zasady SD z glukozą w 1 l wody. Dodać 2 g mieszaniny aminokwasów przygotowanej w następujący sposób: 2 g hemisulfanu adeniny, 2 g HCl argininy, 2 g HCl histydyny, 2 g izoleucyny, 4 g leucyny, 2 g lizyny HCl, 2 g metioniny, 3 g fenyloalaniny, 2 g L-seryny, 2 g L-treoniny, 3 g tryptofanu, 2 g tyrozyny, 1,2 g uracylu, 9 g waliny.</li>
		<li>Selektywne odpadanie SD-L/-W/-H: SD zawierające wszystkie niezbędne aminokwasy z wyjątkiem wymienionych (-L: -Leucyna; -W: -tryptofan; -H: -histydyna).</li>
		<li>YPGLU: Na 1 l wagę 10 g ekstraktu drożdżowego, 10 g peptonu Bacto i 20 g glukozy. W komplecie 25 g agaru Bacto do pożywek stałych.</li>
		<li>YCM: To samo co YPGLU, ale pH dostosowane do 4,5.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Krycie i rozsiewanie
	<ol>
		<li>Użyj zamrożonych podwielokrotności wstępnie przekształconego szczepu drożdży Y187 (typ kojarzenia α) zawierającego bibliotekę cDNA sklonowaną w pACT2. Sprawdź żywotność ogniw, posiewając seryjne rozcieńczenia na płytkach SD-L.</li>
		<li>Sklonuj patogen ORF do wektora pGBKT7 i przekształć rekombinowany plazmid przy użyciu standardowej procedury w szczep drożdży AH109 (kojarzenie typu a).</li>
		<li>Rozprowadź drożdże AH109 przekształcone w pGBKT7 na płytkach SD-W. Inkubować w temperaturze 30 °C przez co najmniej dwa dni w wilgotnym inkubatorze. Płytki można przechowywać w temperaturze 4 °C do czasu przesiewania dwuhybrydowego.</li>
		<li>Stosować 3-aminotriazol (3-AT), kompetycyjny inhibitor enzymu HIS3, aby przeciwdziałać potencjalnej autoaktywacji genu reporterowego HIS3 przez białka patogenów. Wykonaj test autoaktywacji, określając stężenie 3-AT, które zapobiega wzrostowi drożdży przekształconych w pGBKT7 na płytkach SD-W/-H.</li>
		<li>Wysiewaj 30 ml SD-W z kilkoma koloniami AH109 przekształconego w pGBKT7. Inkubować przez 30 godzin w temperaturze 30 °C z rotacją.</li>
		<li>Wysiewać 200 ml SD-W z 30 ml kultur AH109. Inkubować z rotacją około 20 godzin w temperaturze 30 °C.</li>
		<li>Inkubować rozmrożony Y187 przekształcony w bibliotekę cDNA w 20 ml YPGLU, inkubować 10 minut w temperaturze 30 °C z rotacją.</li>
		<li>Odwirować objętość kultury AH109 przekształconej w pGBKT7 odpowiadającą równoważnej ilości żywotnych komórek drożdży Y187 przez 5 minut przy 3 500 obr./min w temperaturze 20 °C. Ostrożnie pobrać supernatant i ponownie zawiesić osad w 10 ml YPGLU.</li>
		<li>Wymieszać zawieszone drożdże AH109 z biblioteką zawierającą Y187. Przenieść w probówce o pojemności 50 ml. Wirować przez 5 minut przy 3 500 obr./min w temperaturze 20 °C, ostrożnie pobrać supernatant (kruche osady).</li>
		<li>Ponownie zawiesić granulat w YPGLU, aby uzyskać w sumie 1,5 ml.</li>
		<li>Rozłóż drożdże na 3 płytkach YCM-Agar 150 mm, 0,5 ml / talerz. Inkubować 4,5 godziny w temperaturze 30 °C.</li>
		<li>Zebrać połączone drożdże z płytek YCM, zeskrobując je grabiami w 10 ml SD-L/-W/-H. Przepłukać płytki dwa razy 5 ml pożywki SD-L/-W/-H i rozlać je w basenie.</li>
		<li>Odwirować 5 minut przy 3 500 obr./min, 20 °C. Odrzucić supernatant i ponownie zawiesić osad drożdży w 5 ml pożywki SD-L/-W/-H.</li>
		<li>Rozprowadzić pokryte drożdże na 10 płytkach (0,5 ml/talerz) agaru SD-L/-W/-H uzupełnionego odpowiednim stężeniem 3-aminotriazolu (3-AT) oznaczonym w teście autoaktywacji. Inkubować w temperaturze 30 °C w wilgotnej atmosferze przez 6-10 dni.</li>
		<li>Określić szybkość diploidalną (2n) w celu oceny efektywności krycia, rozprowadzając 250 μl seryjnych rozcieńczeń (10-4 do 10-6) zawiesiny drożdży na płytkach SD-L/-W. Inkubować płytki w temperaturze 30 °C przez dwa dni. Policz kolonie wyhodowane na SD-L/-W i wydedukuj całkowitą liczbę diploidalną obecną w początkowej objętości pokrytych drożdży. Zgłoś tę liczbę diploidalną do żywej liczby drożdży zawierającej bibliotekę, aby obliczyć szybkość diploidalną. Powinien on wynosić około 10-25%.</li>
		<li>6-10 dni po inkubacji w temperaturze 30 °C zebrać pokryte kolonie drożdży na świeżych płytkach SD-L/-W/-H + 3-AT. [Wskazówka: zamów drożdże w schemacie 8 torów po 12 dołków, odtwarzając płytkę 96-dołkową, aby później łatwiej było je sekwencjonować]. Pozwól koloniom drożdży rosnąć przez 4-5 dni w temperaturze 30 °C w wilgotnej atmosferze.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Badania przesiewowe jego3-dodatnich klonów metodą PCR i sekwencjonowania 
	Celem jest amplifikacja metodą PCR ORF zawartego w wektorach pACT2 kolonii drożdży hodowanych na selektywnych płytkach SD-L/-H/-W.
	<ol>
		<li>Umieść 96-dołkową płytkę PCR na lodzie.</li>
		<li>Aby zlizować komórki drożdży, dodaj 50 μl na studzienkę roztworu zymolazy 20T (2,5 mg / ml w 10 mM bufor HEPES o pH 7,7).</li>
		<li>Delikatnie zawieś ponownie jedną kolonię na studzienkę.</li>
		<li>Inkubować 15 minut w temperaturze 37 °C i 15 minut w temperaturze 95 °C.</li>
		<li>Połóż talerz z powrotem na lodzie. Dodać 50 μl wody destylowanej do studzienki. Dobrze wymieszaj, pipetując w górę i w dół.</li>
		<li>Wirować przez 5 minut przy 3 500 obr./min i 4 °C.</li>
		<li>PCR amplifikuje 10 μl w celu wykrycia wstawki za pomocą starterów wyżarzających po obu stronach ORF pochodzącego z cDNA w wektorach pACT2. Podano protokół amplifikacji 96 lizowanych kolonii drożdży polimerazą ExTaq. Przygotuj następującą mieszankę: 525 μl buforu 10X ExTaq, 420 μl mieszanki dNTPs (2,5 mM), 10,5 μl Forward Primer (1 μg/μl), 10,5 μl Reverse Primer (1 μg/μl), 31,5 μl ExTaq (5 U/μl) i 3202,5 μl H20. Rozprowadzić 40 μl mieszanki na basenie w 96-dołkowej płytce PCR. Dodać 10 μl drożdży lizowanych do dołka. Wykonaj amplifikację w następujący sposób: 94 °C przez 3 min, następnie 35 cykli w 94 °C przez 30 sekund, 60 °C przez 1 min, 72 °C przez 4 minuty i koniec w temperaturze 72 °C przez 7 min. Uruchom 3 μl produktów PCR na 1,2% żelu agarozowym, aby wykryć klony PCR-dodatnie. Należy pamiętać, że zaleca się stosowanie wstępnie obsadzonych 96-dołkowych żeli agarozowych. 
		[Wskazówka: płytka może być przechowywana w temperaturze -20 °C przez kilka miesięcy i ponownie użyta do nowego PCR]</li>
		<li>Sekwencjonuj amplifikowane fragmenty PCR wyizolowane z klonów HIS3-dodatnich. Wykonaj analizę BLAST, aby zidentyfikować komórkowy ORF. Odrzucane są dopasowania o niskim poziomie ufności (wartość E >10-10, tożsamość <80%, długość peptydu <20 aminokwasów), a także sekwencje zawierające kodon STOP z przesunięciem ramki.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
2. Budynek matrycy dla HT-GPCA
HT-GPCA to test oparty na komórkach ssaków, w którym zarówno białka patogenu, jak i gospodarza są przejściowo wyrażane w połączeniu z komplementarnymi fragmentami rozszczepionej lucyferazy Gaussia princeps. W wyniku interakcji partnerów, enzym ten jest odtwarzany, co pozwala na pomiar jego aktywności enzymatycznej. Intensywność oddziaływania jest zatem wyprowadzana ze znormalizowanego współczynnika luminescencji (patrz poniżej i rysunek 1)
<ol start="4">
	<li>Wybór partnerów w komórkach gospodarza
	<ol>
		<li>Wybierz białka, które zostały zidentyfikowane więcej niż trzy razy w badaniach przesiewowych Y2H w celu dalszej walidacji w komórkach ssaków, aby zwiększyć pewność zestawu danych 9.</li>
		<li>Dodaj znanych oddziałujących partnerów białek patogenu jako kontrole pozytywne.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Transfer do wektorów kompatybilnych z HT-GPCA
	<ol>
		<li>Sklonuj każde białko patogenu ORF w wektorze pSPICA-N2, aby wygenerować białka patogenu z aminokwasami od 110 do 185 humanizowanej lucyferazy Gaussia princeps połączonej na ich N-końcu (fuzje białek patogenu GL2).</li>
		<li>PCR amplifikuje białko komórkowe ORF bezpośrednio z klonów Y2H dodatnich lub z innych zasobów ORF (Human ORFeome <a href="http://horfdb.dfci.harvard.edu/" target="_blank">http://horfdb.dfci.harvard.edu/</a>) i przenosi je do wektorów pSPICA-N1 w celu wytworzenia białek połączonych na N-końcu z aminokwasami od 18 do 109 humanizowanej lucyferazy Gaussia princeps (fuzje białek GL1-gospodarza). 
		[Wskazówka: W przypadku klonowania na dużą skalę zalecany jest system klonowania Gateway. W takim przypadku, do amplifikacji PCR, użyj starterów zaprojektowanych tak, aby zawierały miejsca kompatybilne z Gateway].</li>
		<li>Sekwencjonowanie wszystkich wektorów wyrażeń. Sekwencje pSPICA-N1 i pSPICA-N2 można znaleźć w odnośniku 8.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
Zauważ, że konstrukcje plazmidowe mogą być odwrócone, tzn. białka patogenów w pSPICA-N1 i białka gospodarza w pSPICA-N2.
3. Wysokoprzepustowy test komplementacji białek oparty na lucyferazie Gaussia princeps (HT-GPCA)
<ol start="6">
	<li>Transfekcja komórek
	<ol>
		<li>Wysiewaj komórki 293T w 350 000 komórek/ml DMEM z 10% płodową surowicą bydlęcą (FBS) bez antybiotyku. Rozprowadzić 100 μl/basenik na sterylnych białych płytkach hodowlanych. Nie przekraczaj 10 płytek w jednym eksperymencie. Pozwól komórkom rosnąć przez 24 godziny w temperaturze 37 °C z 5% CO2, 
		[Wskazówka: Ponieważ plazmidy pSPICA zawierają pochodzenie SV40, użycie komórek 293T umożliwia ich replikację w transfekowanych komórkach, a tym samym prowadzi do nadekspresji dwóch fragmentów lucyferazy.]</li>
		<li>Następnego dnia należy przeprowadzić transfekcję komórek przy użyciu dowolnego odpowiedniego protokołu transfekcji. Należy pamiętać, że w przypadku niektórych odczynników do transfekcji może być konieczne dostosowanie liczby wysiewanych komórek. Użyj 100 ng na studzienkę zarówno patogenu, jak i konstruktów plazmidu ORF gospodarza. Kotransfekcja 10 ng na studzienkę plazmidu lucyferazy CMV-Firefly w celu normalizacji wydajności transfekcji. Każdy punkt jest testowany w trzech egzemplarzach. 
		[Wskazówka: Mieszanki DNA można wykonać dzień przed transfekcją i przechowywać w temperaturze -20 °C z plombami samoprzylepnymi.]</li>
		<li>Przenieść mieszaninę transfekcyjną na płytki hodowanych komórek 293T. Uważaj, aby delikatnie osadzić mieszaninę DNA na komórkach, ponieważ 293T nie są silnie przylegające i łatwo odrywają się od dna studzienki. Inkubować w inkubatorze do hodowli komórkowych przez 24–30 godzin w temperaturze 37 °C z 5% CO2 .</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
<ol start="7">
	<li>Liza komórek i dawkowanie lucyferazy Gaussia
	<ol>
		<li>Przemyć komórki PBS (100 μl/studzienkę). Dodaj 40 μl 1X bufor do lizy Renilla. Inkubować przez 30 minut w temperaturze pokojowej pod mieszaniem.</li>
		<li>Zaoszczędź 10 μl lizatów komórkowych na innej białej płytce w celu późniejszego dozowania aktywności lucyferazy świetlika. Przechowywać w temperaturze 4 °C lub alternatywnie w temperaturze -20 °C z uszczelnieniem.</li>
		<li>Zmierz aktywność Gaussia na pozostałych 30 μl lizatów komórkowych, dodając 100 μl odczynnika do oznaczania lucyferazy Renilla i licząc luminescencję przez 10 sekund za pomocą luminometru. Dozowanie płytki 96-dołkowej trwa około pół godziny. Pomiar należy wykonać za pomocą świeżych ekstraktów komórkowych, ponieważ zamrażanie lub długotrwałe przechowywanie może wpływać na aktywność Gaussa, w której pośredniczy interakcja.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
<ol start="8">
	<li>Pomiar aktywności świetlików
	<ol>
		<li>Zmierz aktywność Firefly na zapisanych 10 μl lizatów komórkowych, dodając 50 μl odczynnika do testu lucyferazy Firefly i licząc luminescencję przez 10 sekund. Dozowanie płytki 96-dołkowej zajmuje około pół godziny. [Wskazówka: Dawkowanie lucyferazy świetlików można wykonać następnego dnia na zamrożonych lizatach.]</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
<ol start="9">
	<li>Obliczenia NLR
	<ol>
		<li>Dla każdej interakcji oblicz stosunek między aktywnością lucyferazy Gaussia a aktywnością lucyferazy świetlika, aby uzyskać znormalizowaną wartość luminescencji Gaussa, biorąc pod uwagę wydajność transfekcji i żywotność komórek. Obliczyć średnią z trzech egzemplarzy.</li>
		<li>Aby monitorować interakcję, oszacuj znormalizowany współczynnik luminescencji (NLR) dla każdej pary patogen-gospodarz. Aby to zrobić, podziel znormalizowaną aktywność luminescencji Gaussia wykrytą w obecności zarówno patogenu, jak i białek gospodarza przez sumę aktywności zmierzonych w studzienkach kontrolnych (rysunek 1 zaadaptowany z odnośnika 8). Wartość odcięcia NLR dla oddziaływań dodatnich oszacowano na około 3,5 8.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
<ol start="10">
	<li>analiza danych
	<ol>
		<li>Wykonaj klastrowanie hierarchiczne przy użyciu pakietu statystyk języka R. Najpierw pogrupuj dane NLR w kategorie, a następnie oblicz dendrogram interakcji przy użyciu metody pełnego wiązania. Wizualizuj ten dendrogram za pomocą JavaTreeView 10. Oblicz odległość między interakcją dendrogram a drzewem filogenetycznym za pomocą współczynnika korelacji Pearsona.</li>
		<li>Aby wygenerować sieci interakcji, wybierz pozytywne interakcje ze zbioru danych HT-GPCA i użyj oprogramowania Cytoscape 1. Wyodrębnij stopnie białek gospodarza i wykreśl ich rozkład, aby uzyskać dostęp do lokalnej dynamiki sieci. Sieci gospodarz-patogen mogą być nakładane na interaktomę gospodarza, aby zapewnić ocenę globalnego wpływu białek patogenów na sieć komórkową gospodarza.</li>
		<li>Wyodrębnij terminy GO (Gene Ontology) związane z docelowymi czynnikami komórkowymi z bazą danych bioinformatycznych DAVID 12, aby ocenić funkcjonalne wzbogacenie zestawu danych.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

<ol><li>Davey, N. E., Trave, G., Gibson, T. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((How+viruses+hijack+cell+regulation%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+in+Biochemical+Sciences%22%5BJournal%5D)">How viruses hijack cell regulation.</a> Trends in Biochemical Sciences. 36, 159-169 (2011).</li>
<li>Calderwood, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Epstein-Barr+virus+and+virus+human+protein+interaction+maps%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Epstein-Barr virus and virus human protein interaction maps.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 104, 7606-7611 (2007).</li>
<li>de Chassey, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hepatitis+C+virus+infection+protein+network%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Syst.+Biol%22%5BJournal%5D)">Hepatitis C virus infection protein network.</a> Mol. Syst. Biol. 4, 230(2008).</li>
<li>Simonis, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Host-pathogen+interactome+mapping+for+HTLV-1+and+-2+retroviruses%5BTitle%5D)+AND+%22Retrovirology%22%5BJournal%5D)">Host-pathogen interactome mapping for HTLV-1 and -2 retroviruses.</a> Retrovirology. 9, 26(2012).</li>
<li>Dyer, M. D., Murali, T. M., Sobral, B. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+landscape+of+human+proteins+interacting+with+viruses+and+other+pathogens%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Pathog%22%5BJournal%5D)">The landscape of human proteins interacting with viruses and other pathogens.</a> PLoS Pathog. 4, e32(2008).</li>
<li>Rual, J. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Towards+a+proteome-scale+map+of+the+human+protein-protein+interaction+network%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Towards a proteome-scale map of the human protein-protein interaction network.</a> Nature. 437, 1173-1178 (2005).</li>
<li>Venkatesan, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+empirical+framework+for+binary+interactome+mapping%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Methods%22%5BJournal%5D)">An empirical framework for binary interactome mapping.</a> Nat. Methods. 6, 83-90 (2009).</li>
<li>Cassonnet, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Benchmarking+a+luciferase+complementation+assay+for+detecting+protein+complexes%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Methods%22%5BJournal%5D)">Benchmarking a luciferase complementation assay for detecting protein complexes.</a> Nat. Methods. 8, 990-992 (2011).</li>
<li>Ito, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+comprehensive+two-hybrid+analysis+to+explore+the+yeast+protein+interactome%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">A comprehensive two-hybrid analysis to explore the yeast protein interactome.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 98, 4569-4574 (2001).</li>
<li>Saldanha, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Java+Treeview--extensible+visualization+of+microarray+data%5BTitle%5D)+AND+%22Bioinformatics%22%5BJournal%5D)">Java Treeview--extensible visualization of microarray data.</a> Bioinformatics. 20, 3246-3248 (2004).</li>
<li>Smoot, M. E., Ono, K., Ruscheinski, J., Wang, P. L., Ideker, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cytoscape+2.8%3A+new+features+for+data+integration+and+network+visualization%5BTitle%5D)+AND+%22Bioinformatics%22%5BJournal%5D)">Cytoscape 2.8: new features for data integration and network visualization.</a> Bioinformatics. 27, 431-432 (2011).</li>
<li>Huang da, W., Sherman, B. T., Lempicki, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Systematic+and+integrative+analysis+of+large+gene+lists+using+DAVID+bioinformatics+resources%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Protoc%22%5BJournal%5D)">Systematic and integrative analysis of large gene lists using DAVID bioinformatics resources.</a> Nat. Protoc. 4, 44-57 (2009).</li>
<li>Muller, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Large+scale+genotype+comparison+of+human+papillomavirus+E2-host+interaction+networks+provides+new+insights+for+e2+molecular+functions%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Pathog%22%5BJournal%5D)">Large scale genotype comparison of human papillomavirus E2-host interaction networks provides new insights for e2 molecular functions.</a> PLoS Pathog. 8, e1002761(2012).</li>
<li>Neveu, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparative+analysis+of+virus-host+interactomes+with+a+mammalian+high-throughput+protein+complementation+assay+based+on+Gaussia+princeps+luciferase%5BTitle%5D)+AND+%22Methods%22%5BJournal%5D)">Comparative analysis of virus-host interactomes with a mammalian high-throughput protein complementation assay based on Gaussia princeps luciferase.</a> Methods. , (2012).</li>
<li>Braun, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+experimentally+derived+confidence+score+for+binary+protein-protein+interactions%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Methods%22%5BJournal%5D)">An experimentally derived confidence score for binary protein-protein interactions.</a> Nat. Methods. 6, 91-97 (2009).</li>
</ol>

Autorzy oświadczają, że nie mają konkurencyjnych interesów finansowych.

Niezależnie od tego, testy interakcji hybrydowych drożdży-dwóch i ssaków, takie jak GST pull-down, LUMIER lub MAPPIT, okazały się skutecznymi narzędziami do wykrywania interakcji białko-białko, ale są ograniczone przez wysoki odsetek interakcji fałszywie dodatnich i fałszywie ujemnych związanych z tymi technikami 15. Co więcej, pojawia się coraz więcej dowodów na to, że połączenie metod ortogonalnych zwiększa wiarygodność uzyskanego zbioru danych interakcji 7. Niedawny rozwój techniki HT-GPCA opisan...

Rosnąca ilość danych zbieranych do generowania map interakcji białko-białko otwiera perspektywy dla dalszego zrozumienia infekcji patogenami. W miarę jak zaczyna pojawiać się globalna wiedza na temat zakażeń patogenami, zapewnia ona dostęp do szeregu zaburzeń wywołanych przez białka patogenów podczas łączenia ludzkiego proteomu 1. W ten sposób pozwala zrozumieć, w jaki sposób patogeny manipulują maszynerią komórek gospodarza. W szczególności mapowanie kilku sieci interakcji wirus-gospodarz ujawniło, że białka wirusowe preferencyjnie celują w białka gospodarza, które są silnie połączone w sieci komórkowej (węzły) lub które mają kluczowe znaczenie dla wielu ścieżek w sieci (białka wąskich gardeł) 2-4. Interakcje te pozwalają wirusom manipulować ważnymi procesami komórkowymi, co ma zasadnicze znaczenie dla replikacji i produkcji zakaźnego potomstwa. Niedawno przeprowadzono mapowanie interakcji porównawczych na powiązanych wirusach w celu uzyskania informacji dotyczących patogenezy 4. Ponadto badania nad krajobrazem interakcji gospodarz-patogen zostały rozszerzone na wiele patogenów 5. Identyfikacja docelowych czynników komórkowych dostarcza informacji na temat strategii stosowanych przez patogeny do infekowania komórek i umożliwia wykrycie potencjalnych markerów chorobotwórczych.
System dwuhybrydowy drożdży jest najpopularniejszą metodą identyfikacji interakcji binarnych, ponieważ genetyczne badania przesiewowe są wydajnym i czułym narzędziem do wysokoprzepustowego mapowania interakcji białko-białko. Zaproponowane tutaj podejście jeszcze bardziej usprawnia indywidualne badania przesiewowe Y2H poprzez ocenę białka wielu wariantów szczepów patogenów, zapewniając w ten sposób dostęp do porównawczego przeglądu interakcji patogen-białko-białko-gospodarz. Co więcej, głównym ograniczeniem badań przesiewowych drożdży dwuhybrydowych jest wysoki odsetek wyników fałszywie ujemnych, ponieważ odzyskuje się około 20% wszystkich interakcji 6. Oznacza to, że interakcje wykryte tylko z podzbiorem wariantów patogenów mogły uniknąć wykrycia z innymi. W związku z tym poszczególni partnerzy wyłonieni ze wszystkich badań przesiewowych z dwiema hybrydami są dodatkowo zachęcani do interakcji z pełnym zakresem badanych szczepów, dostarczając porównawczych zestawów danych interakcji. Ponieważ wykazano, że połączenie różnych metodologii znacznie zwiększa niezawodność zestawów danych dotyczących interakcji białko-białko 7, walidacja ta jest przeprowadzana w komórkach ssaków za pomocą nowo opracowanego testu komplementacji fragmentów białka o nazwie HT-GPCA 8. Ten oparty na komórkach system umożliwia wykrywanie interakcji białkowych poprzez komplementację rozszczepionej lucyferazy Gaussia princeps i został zaprojektowany tak, aby był kompatybilny z formatem o wysokiej przepustowości. Dzięki technologii opartej na luminescencji i niskiemu poziomowi szumów tła w porównaniu z innymi testami opartymi na fluorescencji, HT-GPCA wykazuje uderzająco wysoką czułość.
Ogólnie rzecz biorąc, to podejście stanowi skuteczne narzędzie do generowania kompleksowego mapowania interakcji gospodarz-patogen, co stanowi pierwszy krok w kierunku globalnego zrozumienia przejmowania kontroli nad komórkami gospodarza.

<table><tbody><tr><td>Szczepy drożdży</td><td>Clontech</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Minimalna baza SD</td><td>US biologiczne</td><td>D9500</td><td></td></tr><tr><td>Aminokwasy</td><td>Sigma</td><td></td><td></td></tr><tr><td>3-amino-1,2,4-triazole (3-AT)</td><td>Acros organics</td><td>264571000</td><td></td></tr><tr><td>Zymolase</td><td>Seikagaku</td><td>120491</td><td></td></tr><tr><td>DMEM</td><td>Gibco-Life Technologies</td><td>31966</td><td></td></tr><tr><td>Płodowa surowica bydlęca</td><td>BioWest</td><td>S1810</td><td></td></tr><tr><td>Bufor fosforanowy Sól fizjologiczna (PBS)</td><td>Gibco-Life Technologies</td><td>14190</td><td></td></tr><tr><td>Penicylina-Streptomycyna</td><td>Gibco-Life Technologies</td><td>15140</td><td></td></tr><tr><td>Trypsyna-EDTA</td><td>Gibco-Life Technologies</td><td>25300</td><td></td></tr><tr><td>Test lucyferazy Renilla</td><td>Promega</td><td>E2820</td><td></td></tr><tr><td>Biały płytka</td><td>hodowlana Greiner Bio-One</td><td>655083</td><td></td></tr><tr><td>96-dołkowe płytki do PCR</td><td>4titude</td><td>4t-i0730/C</td><td></td></tr><tr><td>Inkubator (30 &deg; C)</td> Inkubator <td>Memmert</td><td></td><td></td></tr><tr><td>(37 &deg; C)</td> Luminometr <td>Heraeus</td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td>Berthold</td><td>Centro XS-LB 960</td><td></td></tr></tbody></table>

podejście porównawcze do scharakteryzowania krajobrazu interakcji białko-białko gospodarz-patogen

A Comparative Approach to Characterize the Landscape of Host-Pathogen Protein-Protein Interactions

Podjęto znaczne wysiłki, aby wygenerować na dużą skalę kompleksowe mapy sieci interakcji białko-białko. Ma to zasadnicze znaczenie dla zrozumienia relacji między patogenem a gospodarzem i zostało zasadniczo przeprowadzone za pomocą genetycznych badań przesiewowych w systemach dwuhybrydowych drożdży. Niedawne ulepszenie wykrywania interakcji białko-białko za pomocą testu komplementacji fragmentów opartego na lucyferazie Gaussia daje teraz możliwość opracowania integracyjnych porównawczych podejść interaktomicznych niezbędnych do rygorystycznego porównywania profili interakcji białek z różnych wariantów szczepów patogenów ze wspólnym zestawem czynników komórkowych.
Ten artykuł skupia się na użyteczności połączenia dwóch metod ortogonalnych do generowania zestawów danych interakcji białko-białko: drożdże dwuhybrydowe (Y2H) i nowy test, wysokoprzepustowy test komplementacji białka Gaussia princeps (HT-GPCA) wykonywany w komórkach ssaków.
Zakrojona na szeroką skalę identyfikacja komórkowych partnerów białka patogenu odbywa się za pomocą opartych na kojarzeniu drożdżowych dwuhybrydowych badań przesiewowych bibliotek cDNA przy użyciu wielu wariantów szczepu patogenu. Podzbiór oddziałujących ze sobą partnerów wybranych na podstawie oceny statystycznej o wysokim poziomie ufności jest dalej weryfikowany w komórkach ssaków pod kątem interakcji parami z całym zestawem białek wariantów patogenów przy użyciu HT-GPCA. To połączenie dwóch uzupełniających się metod zwiększa niezawodność zestawu danych interakcji i umożliwia przeprowadzenie rygorystycznej analizy porównawczej interakcji. Takie interaktomiki porównawcze stanowią niezawodną i potężną strategię rozszyfrowywania wszelkich interakcji między patogenem a gospodarzem.

Główną zaletą metody HT-GPCA jest jej wysoka czułość, co zilustrowano poprzez ocenę odsetka wyników fałszywie dodatnich i fałszywie ujemnych dla białka E2 HPV na Rysunku 2 (na podstawie źródła 13). Aby określić odsetek wyników fałszywie ujemnych, za pomocą HT-GPCA oceniono znane oddziaływania białka E2 z HPV16 (Rysunek 2A). Nie wykryto czterech z 18 oddziaływań (co odpowiada 22% wyników fałszywie ujemnych). Odsetek oddziaływań fałszywie dodatnich wyniósł 5,8% przy zastosowaniu 12 białek ...

Ten artykuł skupia się na identyfikacji wysoce pewnych zestawów danych interakcji między białkami gospodarza i patogenu przy użyciu kombinacji dwóch ortogonalnych metod: drożdży dwuhybrydowych, a następnie wysokoprzepustowego testu interakcji w komórkach ssaków o nazwie HT-GPCA.

Podejście porównawcze do scharakteryzowania krajobrazu interakcji białko-białko gospodarz-patogen

Significant efforts were gathered to generate  large-scale comprehensive protein-protein interaction network maps. This is  instrumental to understand the ...

Ogólnym celem następnego eksperymentu jest przeprowadzenie badań ektomicznych w celu porównania profili oddziaływań białek pochodzących od różnych wariantów patogenu z wspólnym zestawem czynników komórkowych. Zostanie to osiągnięte poprzez przesiewy dwuhybrydowe u drożdży oparte na kojeniu, z wykorzystaniem cDNA, w celu zidentyfikowania potencjalnych partnerów oddziaływań dla białek z różnych wariantów patogenu. W drugim etapie ramki odczytu otwartego partnerów oddziaływań zostaną zsekwencjonowane i przeniesione do wektorów kompatybilnych z dalszą walidacją.Następnie zestaw pojedynczych partnerów wyłonionych z obu skriningów hybrydowych zostaje wybrany i poddany ponownemu badaniu pod kątem interakcji z pełnym zakresem analizowanych szczepów. Jest to realizowane przy użyciu ortogonalnego testu komplementacji fragmentów białek opartego na lucyferazie, przeprowadzanego w komórkach ssaczych, aby uzyskać solidne, porównawcze zestawy danych o interakcjach. Wyniki wykazują różną intensywność interakcji między białkami patogenu a białkami komórkowymi na podstawie uzyskanych pomiarów lucyferazy, zapewniając tym samym porównawczy przegląd interakcji białko-białko między patogenem a gospodarz

a-comparative-approach-to-characterize-landscape-host-pathogen

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Immunologia i infekcje

Porównawcze podejście do charakteryzacji krajobrazu interakcji białko-białko gospodarza-patogenu

Ten film opisuje test ligacji zbliżeniowej do badania in situ interakcji białko-białko w komórkach nicieni. Bliskie sąsiedztwo badanych białek generuje kolistą matrycę DNA za pomocą sondy PLA dołączonej do przeciwciała wtórnego. Sonda jest dalej amplifikowana za pomocą roztworu do amplifikacji, który wytwarza długie, jednoniciowe DNA, a następnie hybrydyzuje sondę detektora, umożliwiając lokalizację interakcji białko-białko w komórkach.

Test ligacji zbliżeniowej do badania interakcji białko-białko in situ

Ten artykuł ilustruje zastosowanie znakowania radiowego w pogoni za impulsami w połączeniu z fotosieciowaniem specyficznym dla danego miejsca do monitorowania interakcji między interesującym białkiem a innymi czynnikami w E. coli. W przeciwieństwie do tradycyjnych chemicznych metod sieciowania, podejście to generuje "migawki" o wysokiej rozdzielczości uporządkowanej ścieżki składania w żywej komórce.

Monitorowanie tworzenia się wydzielanego bakteryjnego czynnika wirulencji za pomocą sieciowania specyficznego dla miejsca

Białka oddziałują na siebie nawzajem i te interakcje determinują w dużej mierze ich funkcje. Partnerzy interakcji białkowych można zidentyfikować przy wysokiej przepustowości in vivo za pomocą testu sprawności drożdży opartego na teście komplementacji fragmentów białka reduktazy dihydrofolianu (DHFR-PCA).

Badania przesiewowe interakcji białko-białko w całym genomie za pomocą testu komplementacji fragmentów białka (PCA) w żywych komórkach

Opisany jest proces proteomiki do identyfikacji partnerów interakcji białkowych z frakcji subkomórkowej jądrowej za pomocą wzbogacenia immunopowinowactwa danego białka i bezznacznikowej spektrometrii mas. Przepływ pracy obejmuje frakcjonowanie subkomórkowe, immunoprecypitację, przygotowywanie próbek wspomagane filtrem, oczyszczanie offline, spektrometrię mas i dalszy potok bioinformatyczny.

Bezznacznikowa spektrometria mas immunoprecypitacji do profilowania interaktomii jądrowej na dużą skalę

To badanie miało na celu przedstawienie strategii identyfikacji interakcji lek-peptyd. Strategia obejmuje biopanowanie krótkich peptydów rozpoznających leki w oparciu o bioczujnik mikrowagi kwarcowej (QCM), a następnie analizę bioinformatyczną w celu ilościowej oceny uzyskanych informacji w celu rozpoznania leku i adnotacji miejsc wiązania leku na białkach.

Oparta na biosensorach strategia wysokoprzepustowej analizy biopanningowej i bioinformatycznej do globalnej walidacji interakcji lek-białko

Tutaj prezentujemy protokół do profilowania interakcji między gospodarzem a patogenem podczas infekcji za pomocą proteomiki opartej na spektrometrii mas. Protokół ten wykorzystuje kwantyfikację bez znaczników do pomiaru zmian w obfitości białek zarówno gospodarza (np. Makrofagi), jak i patogenu (np. Cryptococcus neoformans) w jednym eksperymencie.

Bezznacznikowy przepływ pracy proteomiki ilościowej dla interakcji gospodarz-patogen opartych na odkryciach

Protokół przedstawiony tutaj opisuje kompletny potok do analizy danych transkryptomu sekwencjonowania RNA, od surowych odczytów do analizy funkcjonalnej, w tym etapy kontroli jakości i wstępnego przetwarzania do zaawansowanych metod analizy statystycznej.

Wysokoprzepustowa analiza transkryptomu do badania interakcji gospodarz-patogen

Prezentujemy narzędzie do biologii systemów JUMPn do przeprowadzania i wizualizacji analizy sieci dla ilościowych danych proteomicznych, ze szczegółowym protokołem obejmującym wstępne przetwarzanie danych, grupowanie koekspresji, wzbogacanie szlaków i analizę sieci interakcji białko-białko.

JUMPn: Usprawniona aplikacja do grupowania koekspresji białek i analizy sieci w proteomice

Przedstawiamy protokół umożliwiający wychwytywanie i identyfikację specyficznych dla choroby interakcji białko-białko z komórek i tkanek rodzimych za pomocą sond chemicznych i spektrometrii mas. Uzyskane zbiory danych interakcji są analizowane za pomocą dedykowanej platformy internetowej, aby ujawnić dynamiczne dysfunkcje sieci oraz zmiany w ścieżkach związane z chorobą.

Mapowanie dysfunkcyjnych interakcji białko-białko w chorobach

Opisano metodę indywidualnego wyboru, manipulowania i obrazowania żywych patogenów przy użyciu pułapki optycznej sprzężonej z mikroskopem dyskowym (spinning disk). Pułapka optyczna zapewnia przestrzenną i czasową kontrolę nad organizmami i pozwala na umieszczenie ich w bezpośrednim sąsiedztwie komórek gospodarza. Mikroskopia fluorescencyjna pozwala na rejestrację dynamicznych interakcji międzykomórkowych przy minimalnym zaburzeniu stanu komórek.

Wykorzystanie pułapki optycznej do badania oddziaływań gospodarz-patogen w dynamicznym obrazowaniu żywych komórek

Poznaj metodę porównawczej interaktyki białko-białko w badaniach gospodarz-patogen z wykorzystaniem Y2H i HT-GPCA. To podejście pozwala identyfikować genotypowo-specyficzne biomarkery i potencjalne cele terapeutyczne.

Podejście porównawcze do scharakteryzowania krajobrazu interakcji białko-białko gospodarz-patogen

Przeglądaj więcej filmów