Podejście porównawcze do scharakteryzowania krajobrazu interakcji białko-białko gospodarz-patogen

Ogólnym celem następnego eksperymentu jest przeprowadzenie badań ektomicznych w celu porównania profili oddziaływań białek pochodzących od różnych wariantów patogenu z wspólnym zestawem czynników komórkowych. Zostanie to osiągnięte poprzez przesiewy dwuhybrydowe u drożdży oparte na kojeniu, z wykorzystaniem cDNA, w celu zidentyfikowania potencjalnych partnerów oddziaływań dla białek z różnych wariantów patogenu. W drugim etapie ramki odczytu otwartego partnerów oddziaływań zostaną zsekwencjonowane i przeniesione do wektorów kompatybilnych z dalszą walidacją.

Następnie zestaw pojedynczych partnerów wyłonionych z obu skriningów hybrydowych zostaje wybrany i poddany ponownemu badaniu pod kątem interakcji z pełnym zakresem analizowanych szczepów. Jest to realizowane przy użyciu ortogonalnego testu komplementacji fragmentów białek opartego na lucyferazie, przeprowadzanego w komórkach ssaczych, aby uzyskać solidne, porównawcze zestawy danych o interakcjach. Wyniki wykazują różną intensywność interakcji między białkami patogenu a białkami komórkowymi na podstawie uzyskanych pomiarów lucyferazy, zapewniając tym samym porównawczy przegląd interakcji białko-białko między patogenem a gospodarzem.

Przetwarzanie profili interakcji za pomocą grupowania hierarchicznego pozwala powiązać specyficzne interakcje patogen-gospodarz z cechami patologicznymi i dostarcza informacji o udziale białek patogenu w patogenezie. Główną zaletą tego podejścia w porównaniu z innymi metodami mapowania interakcji białko-białko między patogenem a gospodarzem jest zapewnienie rygorystycznego, porównawczego zbioru danych o interakcjach pomiędzy wieloma wariantami szczepów. Technika ta pozwala na poznanie sieci interakcji białka patogenu, ale może być również zastosowana do innych systemów z wykorzystaniem cząsteczek zakaźnych, na przykład kompletnych wirusów i inżynierii genetycznej. Protokół należy rozpocząć od krzyżowania i wysiewania komórek drożdży zgodnie z opisem w pisemnym protokole wstępnym.

30 ml selektywnego podłoża dropout pozbawionego tryptofanu z kilkoma koloniami szczepu drożdży AH 1 0 9 transformowanego plazmidem P-G-B-K-T siedem wykazującym ekspresję białka patogenu. Inkubować przez 30 h w temperaturze 30 °C z rotacją. Następnie zaszczepić 200 ml selektywnego podłoża dropout minus tryptofan za pomocą 30 ml zawiesiny AH 1 0 9.

Hodowle inkubuje się z rotacją przez 20 godzin w temperaturze 30°C. Następnie inkubuje się szczep Y 187 z transformowaną biblioteką cDNA w 20 ml pożywki YP-glue przez 10 minut w temperaturze 30°C z rotacją. Następnie wirować objętość hodowli AH 109 z transformowanym pGBKT7, odpowiadającą równoważnej liczbie żywych komórek drożdży Y 187, przez pięć minut przy 3500 RPM i 20°C.

Ostrożnie odessać nadsącz i resuspendować osad w 10 mililitrach podłoża YP. Wymieszać resuspendowane drożdże AH 109 z biblioteką znajdującą się w szczepie Y 187. Przenieść zawiesinę do probówki o pojemności 50 mililitrów, a następnie wirować przez pięć minut przy 3 500 RPM i 20 stopniach Celsjusza.

Po ostrożnym odprowadzeniu nadsączu z zawiesiny, zresuspenduj osad w kleju YP, aby uzyskać łącznie 1,5 milliliters. Następnie rozsiej drożdże na trzy szalki z agarem YCM o średnicy 150 millimeter, nakładając 0,5 milliliters na szalkę, i inkubuj przez 4,5 hours w temperaturze 30 degrees Celsius. Zbierz skoniugowane drożdże z szalek YCM, zeskrobując je szklanym skrobakiem do 10 milliliters selektywnego medium dropout bez leucyny, tryptofanu i histydyny.

Przepłucz płytkę dwukrotnie pięcioma mililitrami tego samego medium, a następnie po wirowaniu przez pięć minut przy 3 500 RPM i 20 stopniach Celsjusza połącz osady. Odrzuć nadsącz i powtórz czynność. Zawieś pellet drożdży w pięciu mililitrach selektywnego medium dropout bez leucyny, tryptofanu i histydyny.

Następnie rozsień skrzyżowane drożdże na 10 płytek z selektywnym agarem typu dropout bez leucyny, tryptofanu i histydyny, uzupełnionym odpowiednim stężeniem triazolu trzech aminowego (3-AT), wyznaczonym w teście autoaktywacji. Oblicz wskaźnik diploidalności zgodnie z opisem w protokole pisemnym po inkubacji w temperaturze 30°C w atmosferze zwiększonej wilgotności przez okres od 6 do 10 dni. Wybierz kolonie drożdży i przenieś je na świeżo przygotowane płytki z selektywnym agarem typu dropout bez leucyny, tryptofanu i histydyny z dodatkiem 3-AT.

Rozmieść drożdże w schemacie ośmiu rzędów po 12 dołków, odwzorowując płytkę 96-dołkową, aby ułatwić późniejszy proces sekwencjonowania. Pozostaw kolonie drożdży do wzrostu przez cztery do pięciu dni w temperaturze 30 °C w warunkach zwiększonej wilgotności. Celem tej sekcji jest amplifikacja metodą PCR cDNA zawartego w wektorach PA ct dwa z lizowanych kolonii drożdży, wyhodowanych na selektywnych pożywkach agarowych z pominięciem leucyny, tryptofanu i histydyny.

Zacznij od umieszczenia płytki PCR z 96 dołkami w lodzie, aby przeprowadzić lizę komórek drożdży, dodając 50 µL roztworu xmal 20 T do każdego dołka. Delikatnie resuspenduj jedną kolonię na dołek. Inkubuj płytkę przez 15 minut w temperaturze 37 °C oraz przez 15 minut w temperaturze 95 °C.

Po ponownym umieszczeniu płytki w lodzie, dodaj do każdej studzienki 50 µL wody destylowanej, wymieszaj poprzez pipetowanie w górę i w dół, a następnie wiruj przez pięć minut przy prędkości 3 500 RPM i temperaturze 4 °C. Po przygotowaniu mieszaniny X tack zgodnie z opisem w protokole tekstowym, rozdziel do 96-dołkowej płytki PCR po 40 µL mieszaniny na studzienkę. Dodaj do każdej studzienki 10 µL lizowanych drożdży i przeprowadź amplifikację zgodnie z procedurą opisaną w protokole tekstowym.

Nanieś 3 µL produktów PCR na żel agarozowy 1,2% w celu wykrycia klonów pozytywnych pod kątem PCR. Przeprowadź sekwencjonowanie fragmentów amplifikowanych metodą PCR, wyizolowanych z trzech pozytywnych klonów. Następnie wykonaj analizę BLAST w celu identyfikacji komórkowych otwartych ramek odczytu, odrzucając dopasowania o niskiej wiarygodności oraz sekwencje zawierające przesunięcia ramki odczytu i przedwczesne kodony stop przed przeprowadzeniem transfekcji komórek.

Przenieś otwarte ramki odczytu białka patogenu i białka komórkowego do odpowiednich wektorów, aby uzyskać białka połączone z fragmentami lucyferazy Gaia, zgodnie ze szczegółowym protokołem tekstowym; wysiej komórki 2 9 3 T w gęstości 350 000 komórek na mililitr DMEM z 10% płodowej surowicy bydlęcej bez antybiotyku. Rozdziel 100 µL na każdą studzienkę w sterylnych białych płytkach hodowlanych, a następnie inkubuj przez 24 godziny w temperaturze 37 °C przy 5% CO2. Następnego dnia przeprowadź transfekcję komórek przy użyciu dowolnego odpowiedniego protokołu transfekcji; użyj 100 ng na studzienkę dla obu plazmidowych konstruktów otwartych ramek odczytu patogenu i gospodarza. Przetransfekuj 10 ng na studzienkę plazmidu CMV lucyferazy świetlikowej w celu normalizacji wydajności transfekcji.

Każdy punkt testowany jest w trzech powtórzeniach; mieszaninę do transfekcji przenosi się na płytki z hodowlą komórek 2 9 3 T. Należy ostrożnie nanosić mieszaninę DNA na komórki, ponieważ komórki 2 9 3 T nie przylegają silnie i są łatwo odrywane od dna dołka. Inkubować w inkubatorze do hodowli komórkowych przez 24 do 30 godzin w temperaturze 37 °C przy 5% carbon dioxide. Przemyć komórki PBS w ilości 100 µL na dołek. Dodać 40 µL buforu do lizy 1x vanilla i inkubować przez 30 minut w temperaturze pokojowej.

Podczas mieszania należy pobrać 10 µL lizatów komórkowych do oddzielnej białej płytki w celu późniejszego dozowania lucyferazy świetlikowej przechowywanej w temperaturze 4 °C lub alternatywnie w -20 °C, aby zmierzyć aktywność Gaia. Płytkę należy umieścić w luminometrze i wstrzyknąć 100 µL odczynnika do analizy lucyferazy do lizatów komórkowych. Następnie należy zmierzyć luminescencję przez 10 sekund.

Dozowanie płytki 96-dołkowej zajmuje około pół godziny. Zawsze należy używać świeżych ekstraktów, ponieważ zamrażanie lub długotrwałe przechowywanie może wpłynąć na aktywność Gaia zapośredniczoną przez interakcje w pozostałych 10 µL ekstraktów komórkowych. Do lizatów komórkowych należy wstrzyknąć 50 µL odczynnika do analizy lucyferazy świetlikowej przy użyciu luminometru, mierząc luminescencję przez 10 sekund.

Dozowanie płytki 96-dołkowej zajmuje około pół godziny dla każdej interakcji. Oblicz stosunek aktywności lucyferazy Gaia do aktywności lucyferazy świetlika, aby uzyskać znormalizowaną wartość luminescencji GAIA, uwzględniając wydajność transfekcji oraz żywotność komórek.

Oblicz średnią z trzech powtórzeń, aby monitorować interakcję. Oszacuj znormalizowany stosunek luminescencji (NLR) dla każdej pary patogen-gospodarz. W tym celu podziel znormalizowaną aktywność luminescencyjną GAIA wykrytą w obecności białek patogenu i gospodarza przez sumę aktywności zmierzonych w dołkach kontrolnych.

W poprzednim badaniu oszacowano, że wartość odcięcia NLR dla interakcji dodatnich wynosi około 3.5. Główną zaletą wysokoprzepustowych zasad GIA, testu KOMPLEMENTACJI białek, czyli H-T-G-P-C-A, jest jego wysoka czułość, co zilustrowano poprzez ocenę wskaźników wyników fałszywie dodatnich i fałszywie ujemnych dla dwóch białek HPVE w celu określenia wskaźnika wyników fałszywie ujemnych. Znane interakcje E2 z HPV 16 zostały ocenione za pomocą H-T-G-P-C-A; cztery z 18 interakcji nie zostały wykryte, co odpowiada 22% wskaźnikowi wyników fałszywie ujemnych.

Odsetek fałszywie dodatnich oddziaływań wyniósł 5,8% przy zastosowaniu 12 białek HPVE E2 w zestawieniu z losowym zbiorem białek komórkowych. Wysoka swoistość tej metody została podkreślona na niniejszej rycinie, która pokazuje, że pojedyncza mutacja punktowa, znana z zakłócania wiązania E2 z jego partnerem komórkowym BRD4, znosi stosunek NLR. To wielkoskalowe porównawcze podejście ektomiczne zostało niedawno z sukcesem zastosowane do trzech wczesnych białek wirusów brodawczaka ludzkiego – E2, E6 i E7 – pochodzących z różnych genotypów, reprezentujących naturalną różnorodność tropizmów i patologii dla każdego z tych białek wczesnych.

Hierarchiczna analiza skupień profili interakcji w większości odzwierciedla filogenezę HPV, co dowodzi solidności zastosowanego podejścia oraz spójności zestawów danych dotyczących interakcji. Metoda ta może być wykorzystana do korelacji specyficznych profili interakcji wirus-gospodarz z cechami patologicznymi, dostarczając tym samym wskazówek na temat roli białek wirusowych. W badaniach nad patogenezą można wyodrębnić interakcje specyficzne dla genotypu, które potencjalnie odpowiadają tropizmowi lub biomarkerom patogennym.

Jak pokazano tutaj dla sześciu partnerów oddziałujących z białkiem E6, cele komórkowe zostały posortowane na podstawie intensywności oddziaływania i pogrupowane zgodnie z oddziałującym typem HPV. Taka reprezentacja pozwala na identyfikację specyficznych biomarkerów, takich jak fad, który oddziałuje wyłącznie z białkami E6 onkogennych typów HPV. Takie ukierunkowanie musi mieć kluczowe znaczenie dla cech kancerogennych wszystkich onkogennych typów HPV, a zatem stanowi dobry kandydat do wykorzystania albo jako marker zastępczy infekcji HPV, albo jako cel terapeutyczny.

Stosując tę procedurę, metodę H-T-G-P-C-A można dostosować do użycia z trzecim białkiem wykazującym ekspresję jako fuzja z tagiem biotyny. Pozwala to na wychwyt trzech kompleksów partnerskich na płytkach streptawidynowych, co może pomóc w udzieleniu odpowiedzi na pytanie dotyczące tworzenia dużych kompleksów białkowych.

Po obejrzeniu tego filmu powinni Państwo posiadać gruntowną wiedzę na temat charakterystyki interakcji między patogenem a gospodarzem: po pierwsze, poprzez badanie partnerów interakcji wielu wariantów szczepów; po drugie, poprzez porównanie ich interakcji z całym zestawem typów patogenów, wykorzystując badanie interakcji białko-białko, na przykład w komórkach ssaków.