Manipulacja genetyczna myszy rozwijającej podwzgórze poprzez elektroporację in utero
July 24th, 2013
Pomimo funkcjonalnego i medycznego znaczenia podwzgórza, rzadko próbowano genetycznej manipulacji jego rozwojem in utero. Przedstawiamy szczegółową procedurę elektroporacji in utero do podwzgórza myszy i pokazujemy reprezentatywne wyniki całkowitej i częściowej (regionalnej) transfekcji podwzgórza.
Ogólnym celem tej procedury jest transfekcja DNA osocza do podwzgórza zarodków myszy rozwijających się w macicy w celu aktywacji lub stłumienia funkcji genu będącego przedmiotem zainteresowania. Osiąga się to poprzez uprzednie znieczulenie ciężarnej myszy i odsłonięcie macicy za pomocą laparotomii. Drugim krokiem jest wstrzyknięcie roztworu DNA do trzeciej komory embrionalnego mózgu.
Następnie elektrodę dodatnią umieszcza się w macicy między łożyskiem a głową zarodka. Elektrodę ujemną umieszcza się na zewnętrznej powierzchni macicy i stosuje się impulsy elektryczne. Ostatnim krokiem jest usunięcie transfekowanych mózgów embrionalnych sześć dni później.
Ostatecznie mikroskopia fluorescencyjna służy do analizy zmian fenotypowych transfekowanych komórek, liczby, kształtu, położenia, ekspresji markera i tak dalej. Główne zalety tej techniki w porównaniu z istniejącymi metodami, takimi jak transfekcja wirusa, to po pierwsze, nie wymaga ona specjalnych środków ostrożności, a ponieważ są to dwie placówki, możliwe jest drugie celowanie w określony region. I po trzecie, dzięki elektroporacji Ute badanie przesiewowe genów kandydujących jest szybsze.
Ogólnie rzecz biorąc, osoby nowe w tej metodzie będą miały trudności, ponieważ wstrzyknięcie roztworu DNA do trzeciej komory i prawidłowe ustawienie elektrody igłowej wymaga zaawansowanego ręcznego pochylania wraz z pewnym doświadczeniem. Metoda ta może pomóc odpowiedzieć na pytania z zakresu rozwoju podwzgórza, szczególnie te związane z migracją komórek, a także w jaki sposób poszczególne regiony i jądro są genetycznie określone. Rozpocznij tę procedurę od wyciągnięcia dobrej jakości szklanych mikropipet, ponieważ są one niezbędne do zmniejszenia początkowego wysokiego wskaźnika poronień z powodu utraty płynu owodniowego.
Aby przygotować DNA, rozpuść oczyszczone DNA osocza wolne od endotoksyn w PBS zawierającym 0,1% szybkiej zieleni do końcowego stężenia od jednego do dwóch mikrogramów na mikrolitr. Szybka zieleń sprawi, że wstrzyknięty roztwór będzie widoczny w embrionalnej komorze mózgu. Następnie załaduj 10 mikrolitrów roztworu DNA do szklanej mikropipety.
Następnie podłącz szklaną mikropipetę do systemu iniekcyjnego lub pipety doustnej. Na tym etapie przygotuj stół operacyjny z poduszką grzewczą i narzędziami chirurgicznymi Włącz zimne źródła światła, aby ułatwić wizualizację zarodków. Następnie zdezynfekuj narzędzia chirurgiczne za pomocą sterylizatora z kulkami szklanymi.
Następnie znieczulij ciężarną mysz izofluorem. Po znieczuleniu myszy nałóż maść na jej oczy, aby zapobiec wysuszeniu. Następnie dopasuj maskę do twarzy, aby utrzymać znieczulenie w sposób ciągły.
Teraz umieść mysz na poduszce grzewczej brzuchem do góry. Zabezpiecz jego ciało na miejscu, przymocowując jego cztery kończyny taśmą. Upewnij się, że mysz jest całkowicie znieczulona, szczypiąc jej ogon w celu refluksu.
Następnie ogol powierzchnię brzucha i zdezynfekuj ją roztworem jodu. Wykonaj podłużne nacięcie o długości około jednego do półtora centymetra na skórze brzucha. Następnie przetnij otrzewną.
Następnie umieść bawełnianą gazę wokół nacięcia. Opłucz gazę PBS. Odsłoń jeden róg macicy, wyciągając go ostrożnie kleszczami.
Unikaj mocnego ciągnięcia mięśniówki macicy lub macicy. Ponieważ wysokie ciśnienie wewnątrz macicy zwiększa ryzyko utraty płynu zarodkowego po wstrzyknięciu, co prowadzi do poronienia. Następnie umieść róg macicy na gazie płukanej PBS i płukaj go PBS co kilka minut, aby był nawilżony.
Teraz pod mikroskopem trzymaj macicę w taki sposób, aby można było uwidocznić komory mózgu. Nie należy nadmiernie zmieniać położenia zarodka, który leży w niekorzystnej pozycji. To tylko zwiększa szanse na aborcję.
Spójrz na głowę zarodka od góry, aby zlokalizować szczelinę, w której znajduje się szczelina między lewą a prawą półkulą korową. Półkule są łatwe do odróżnienia, a boczne komory w ich wnętrzu mogą być zwykle postrzegane jako nieco ciemniejsze kształty. Jeśli okaże się, że zarodek jest idealnie zorientowany do wstrzyknięcia DNA, możliwe jest przebicie ściany macicy i natychmiastowe wejście do trzeciej komory.
Przyłóż szklaną mikropipetę z przygotowanym wcześniej DNA pod kątem 45 stopni do ściany macicy i nakłuj ją na rostralnym końcu szczeliny międzypółkulowej, penetrując na głębokość około jednego milimetra. W ten sposób końcówka szklanej mikropipety wejdzie do trzeciej komory mózgu, a nie do komory bocznej. Po wstrzyknięciu około jednego mikrolitra roztworu DNA do trzeciej komory, zielony płyn wypełni komorę w dobrym wstrzyknięciu, powtórz tę samą procedurę ze wszystkimi zarodkami tego samego rogu macicy.
Pozwoli to na równomierne wymieszanie roztworu DNA z płynem komorowym i dotarcie do całego nabłonka nerwowego. Teraz włącz elektro perter i dostosuj ustawienia do wieku embrionalnego. Użyj elektrody igłowej ze stali nierdzewnej jako bieguna dodatniego i okrągłej płaskiej elektrody jako bieguna ujemnego, wybierz zarodki grzbietową stroną do góry do elektroporacji.
Następnie przebij ścianę macicy obok głowy zarodka między workiem owodniowym a łożyskiem, wpychając przez nią końcówkę elektrody igłowej w dół. Następnie użyj palca wskazującego drugiej ręki jako bloku ciągu. Około pięciu milimetrów końcówki elektrody powinno znajdować się między workiem owodniowym a ścianą macicy mniej więcej na poziomie śródmózgowia.
Ponieważ jest to elektroda celownicza, jej położenie określi, która część nabłonka nerwowego podwzgórza jest najbardziej narażona na transfekcję. Następnie drugą ręką umieść okrągłą płaską elektrodę na zewnątrz ściany macicy po przeciwnej stronie głowy zarodka. Następnie delikatnie ściśnij zarodek między elektrodami.
Użyj przełącznika pedału, aby przyłożyć napięcie. Następnie powoli wyciągnij elektrodę igłową z macicy, przytrzymując macicę palcem wskazującym drugiej ręki. Jeśli płyn owodniowy zostanie utracony przez przebitą ścianę, zwykle zarodek zostanie poddany aborcji.
Po wstrzyknięciu i elektroporacji wszystkich zarodków, bardzo ostrożnie umieść macicę z powrotem w jamie brzusznej myszy i ustaw je dokładnie tak, jak wcześniej. Następnie zwilż jamę otrzewnej solą fizjologiczną przed jej zamknięciem. Zszyj otrzewną chirurgicznym jelitem kota, a następnie zszyj skórę bardziej odpornym szwem.
Zdezynfekuj powierzchnię brzucha roztworem jodu i wstrzyknij podskórnie niesteroidowy środek przeciwzapalny w celu złagodzenia bólu. Następnie wyjmij matkę z urządzenia znieczulającego i umieść ją w klatce, która jest podgrzewana przez poduszkę grzewczą. Monitoruj mysz, aż całkowicie wyzdrowieje ze znieczulenia i sprawdzaj ją codziennie, aby upewnić się, że wraca do zdrowia po zabiegu bez żadnych oznak infekcji lub bólu.
Na tym etapie zbierz zarodki lub zarodki po urodzeniu zgodnie z pożądanym dniem analizy. Wybierz embriony, którym wstrzyknięto DNA i poddano je elektropostacji, a następnie przeprowadź sekcję mózgów pod mikroskopem stereoskopowym. Następnie sprawdź, czy w odpowiednim obszarze znajduje się zielony sygnał fluorescencyjny.
Aby przeanalizować mózg wybranego zarodka, utrwal tkankę na krótki czas w 4% paraldehydzie. Następnie zanurz go w aros 4% lub w albuminie żelatyny. Następnie podziel mózg na vibrato.
Rysunki te pokazują podwzgórze po transfekcji in utero DNA osocza, niosącego fluorescencyjne geny reporterowe, GFP lub CFP w E 12,5. Jest to przekrój strzałkowy przedstawiający podwzgórze przetransfekowane z rostralu na dorszowego, a tutaj jest przekrój poprzeczny z oznaczonymi komórkami na różnych poziomach wzdłuż osi bocznej pożywki. Ten przekrój strzałkowy pokazuje specyficznie transfekowane ciało sutka i oznaczenie jego charakterystycznego drzewa aksonalnego, a po stronie elektroparady tego przekroju poprzecznego pokazuje oznakowane pasmo odpowiadające neuronom urodzonym na E 12,5.
Aby dokładniej przeanalizować sekcje. Przygotowano przekroje poziome równoległe do płaszczyzny promieniowych wyrostków glejowych wychodzących z wgłębienia sutkowego. Neurony ambi O powstałe z nabłonka nerwowego transfekowanego w dniu E 12,5 zostały zidentyfikowane w dniu E 18,5 za pomocą przeciwciał przeciwko GFP.
W tym przykładzie przeciwciało znakowało ograniczoną grupę komórek MBO. Grupa ta znajdowała się między dwoma nieznakowanymi bocznymi i przyśrodkowymi obszarami MBO odpowiadającymi neuronom MBO, urodzonym przed i po E 12,5, a barwieniem co przeciwciałem przeciwko nestonowi. Na czerwono pokazany jest tryb migracji indywidualnie znakowanych neuronów na promieniowe procesy glejowe nabłonka nerwowego Po opanowaniu tej techniki można wykonać w ciągu 30 minut, jeśli zostanie wykonana prawidłowo.
Po obejrzeniu tego filmu powinieneś dobrze zrozumieć, jak wstrzyknąć DNA do trzeciej komory i jak ustawić igłę jako elektrodę dodatnią między zarodkiem, głową i łożyskiem, aby skutecznie celować w podwzgórze. Postępując zgodnie z tą procedurą. Inne metody, takie jak immunohistochemia lub hybrydyzacja inidów, mogą być wykonane w celu uzyskania odpowiedzi na dodatkowe pytania dotyczące fenotypu transfekowanych neuronów.
View the full transcript and gain access to thousands of scientific videos
Przegląd
W tym artykule przedstawiono szczegółową procedurę elektroperacji wewnątrzciałowej do podwzgórza myszy. Metoda ma na celu transfekcję DNA plazmidowego do podwzgórza zarodków myszy w celu manipulowania funkcją genów.
Kluczowe Elementy Badania
Dziedzina Nauki
- Neurobiologia
- Manipulacja Genetyczna
- Biologia Rozwojowa
Tło
- Podwzgórze odgrywa kluczową rolę w różnych procesach fizjologicznych.
- Wewnątrzciałowa manipulacja genetyczna w tym obszarze była dotychczas słabo zbadana.
- Elektroperacja to technika stosowana do wprowadzania DNA do komórek.
- Celem tego badania jest pogłębienie wiedzy na temat rozwoju podwzgórza.
Cel Badania
- Transfekcja DNA do podwzgórza zarodków myszy.
- Aktywacja lub represja specyficznych funkcji genów.
- Dostarczenie szczegółowej metodologii dla przyszłych badań.
Wykorzystane Metody
- Znieczulenie ciężarnych myszy i wykonanie laparotomii.
- Wstrzyknięcie roztworu DNA do trzeciego komory mózgowej zarodka.
- Ustawienie elektrod do elektroperacji.
- Usunięcie transfekowanych mózgów zarodkowych po sześciu dniach.
Główne Wyniki
- Uzyskano skuteczną transfekcję podwzgórza.
- Wykonano transfekcję zarówno całkowitą, jak i częściową (regionalną) podwzgórza.
- Procedurę można odtworzyć w dalszych badaniach.
- Wyniki wskazują na potencjał manipulacji funkcją genów in vivo.
Wnioski
- Badanie dostarcza nowatorskiego podejścia do badań nad podwzgórzem.
- Elektroperacja wewnątrzciałowa jest wykonalną metodą manipulacji genetycznej.
- Przyszłe badania mogą bazować na tej metodologii w celu zrealizowania różnych zastosowań.
Najczęściej zadawane pytania
Executive Industry Relevance
Targeted genetic manipulation of the developing hypothalamus enables mechanistic interrogation of neurodevelopmental pathways relevant to metabolic and behavioral disorders. This approach supports target validation by allowing precise spatiotemporal gene modulation in a physiologically intact embryonic system. It enhances predictive confidence in early discovery by linking genetic perturbation to phenotypic outcomes in a disease-relevant brain region.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables functional interrogation of candidate genes in hypothalamic neuroepithelium to clarify role in developmental pathways.
- Operational Value: Provides a reproducible method for regional transfection without requiring germline mutant generation.
- Therapeutic Value: Supports target de-risking by linking gene function to cellular phenotypes such as migration and marker expression in situ.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Facilitates rapid screening of candidate genes via fluorescent reporter expression in transfected hypothalamic nuclei.
- Operational Value: Uses standardized electroporation parameters and histological readouts for consistent transfection assessment.
- Therapeutic Value: Enables quantitative analysis of transfected cell number, position, and morphology for phenotype-based hit evaluation.
Translational & Preclinical Research
- Scientific Value: Models developmental gene regulation in a mammalian system with relevance to human hypothalamic disorders.
- Operational Value: Allows postnatal analysis of electroporated embryos to assess long-term cellular consequences of embryonic gene modulation.
- Therapeutic Value: Supports biomarker alignment by enabling co-labeling of transfected cells with lineage or migration markers.
Pipeline & Workflow Integration
The method integrates into early discovery workflows by enabling hypothesis-driven gene screening in a physiologically contextualized embryonic brain model prior to lead identification.
- Discovery Biology: Supports pathway clarification and target validation through region-specific gene manipulation in the developing hypothalamus.
- Screening: Enables assay-ready transfection with fluorescent reporters for automated or manual phenotypic scoring.
- Analytics: Generates quantitative readouts on transfected cell distribution, morphology, and marker expression for comparative condition analysis.
- Translational Research: Connects embryonic genetic manipulation to postnatal phenotypic analysis, supporting developmental-to-adult disease modeling.
- Enterprise Reuse: Establishes a reusable platform for iterative gene screening across multiple targets in the same embryonic system.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Reduces mechanistic ambiguity by enabling direct observation of gene function in hypothalamic cell migration and specification.
- Operational Value: Standardizes surgical and electroporation steps to improve reproducibility and reduce embryo loss across users.
- Strategic Value: Accelerates target evaluation timelines by bypassing lengthy mutant generation pipelines.
- Portfolio Impact: Informs go/no-go decisions through early phenotypic screening of genetic targets in a disease-relevant neural substrate.
Implementation Considerations
- Requires expertise in microsurgery, embryonic handling, and precise electrode placement for successful transfection.
- Dependent on specialized instrumentation including glass micro pipettes, electroporator, stereo microscope, and histological processing tools.
- Necessitates standardized protocols for DNA preparation, injection volume, and electrical pulse parameters to ensure consistency.
- Must account for variability in embryonic orientation and uterine horn handling to maintain transfection efficiency and survival rates.
- Limited to embryonic stages where hypothalamic neuroepithelium is accessible via third ventricle injection, restricting postnatal application.
Biopharma FAQs
Chapters in this video
0:05
Title
2:06
Preparation of DNA and Glass Micropipettes for Injection
2:57
Laparotomy
4:33
DNA Injection into the Brain Ventricle
5:59
Targeting the Hypothalamus for Electroporation
7:17
Finishing the Surgery
8:28
Analyzing the Results
9:18
Results: Hypothalamus Transfection by In utero Electroporation
10:54
Conclusion
