Manipulacja genetyczna myszy rozwijającej podwzgórze poprzez elektroporację in utero

Ogólnym celem tej procedury jest transfekcja DNA osocza do podwzgórza zarodków myszy rozwijających się w macicy w celu aktywacji lub stłumienia funkcji genu będącego przedmiotem zainteresowania. Osiąga się to poprzez uprzednie znieczulenie ciężarnej myszy i odsłonięcie macicy za pomocą laparotomii. Drugim krokiem jest wstrzyknięcie roztworu DNA do trzeciej komory embrionalnego mózgu.

Następnie elektrodę dodatnią umieszcza się w macicy między łożyskiem a głową zarodka. Elektrodę ujemną umieszcza się na zewnętrznej powierzchni macicy i stosuje się impulsy elektryczne. Ostatnim krokiem jest usunięcie transfekowanych mózgów embrionalnych sześć dni później.

Ostatecznie mikroskopia fluorescencyjna służy do analizy zmian fenotypowych transfekowanych komórek, liczby, kształtu, położenia, ekspresji markera i tak dalej. Główne zalety tej techniki w porównaniu z istniejącymi metodami, takimi jak transfekcja wirusa, to po pierwsze, nie wymaga ona specjalnych środków ostrożności, a ponieważ są to dwie placówki, możliwe jest drugie celowanie w określony region. I po trzecie, dzięki elektroporacji Ute badanie przesiewowe genów kandydujących jest szybsze.

Ogólnie rzecz biorąc, osoby nowe w tej metodzie będą miały trudności, ponieważ wstrzyknięcie roztworu DNA do trzeciej komory i prawidłowe ustawienie elektrody igłowej wymaga zaawansowanego ręcznego pochylania wraz z pewnym doświadczeniem. Metoda ta może pomóc odpowiedzieć na pytania z zakresu rozwoju podwzgórza, szczególnie te związane z migracją komórek, a także w jaki sposób poszczególne regiony i jądro są genetycznie określone. Rozpocznij tę procedurę od wyciągnięcia dobrej jakości szklanych mikropipet, ponieważ są one niezbędne do zmniejszenia początkowego wysokiego wskaźnika poronień z powodu utraty płynu owodniowego.

Aby przygotować DNA, rozpuść oczyszczone DNA osocza wolne od endotoksyn w PBS zawierającym 0,1% szybkiej zieleni do końcowego stężenia od jednego do dwóch mikrogramów na mikrolitr. Szybka zieleń sprawi, że wstrzyknięty roztwór będzie widoczny w embrionalnej komorze mózgu. Następnie załaduj 10 mikrolitrów roztworu DNA do szklanej mikropipety.

Następnie podłącz szklaną mikropipetę do systemu iniekcyjnego lub pipety doustnej. Na tym etapie przygotuj stół operacyjny z poduszką grzewczą i narzędziami chirurgicznymi Włącz zimne źródła światła, aby ułatwić wizualizację zarodków. Następnie zdezynfekuj narzędzia chirurgiczne za pomocą sterylizatora z kulkami szklanymi.

Następnie znieczulij ciężarną mysz izofluorem. Po znieczuleniu myszy nałóż maść na jej oczy, aby zapobiec wysuszeniu. Następnie dopasuj maskę do twarzy, aby utrzymać znieczulenie w sposób ciągły.

Teraz umieść mysz na poduszce grzewczej brzuchem do góry. Zabezpiecz jego ciało na miejscu, przymocowując jego cztery kończyny taśmą. Upewnij się, że mysz jest całkowicie znieczulona, szczypiąc jej ogon w celu refluksu.

Następnie ogol powierzchnię brzucha i zdezynfekuj ją roztworem jodu. Wykonaj podłużne nacięcie o długości około jednego do półtora centymetra na skórze brzucha. Następnie przetnij otrzewną.

Następnie umieść bawełnianą gazę wokół nacięcia. Opłucz gazę PBS. Odsłoń jeden róg macicy, wyciągając go ostrożnie kleszczami.

Unikaj mocnego ciągnięcia mięśniówki macicy lub macicy. Ponieważ wysokie ciśnienie wewnątrz macicy zwiększa ryzyko utraty płynu zarodkowego po wstrzyknięciu, co prowadzi do poronienia. Następnie umieść róg macicy na gazie płukanej PBS i płukaj go PBS co kilka minut, aby był nawilżony.

Teraz pod mikroskopem trzymaj macicę w taki sposób, aby można było uwidocznić komory mózgu. Nie należy nadmiernie zmieniać położenia zarodka, który leży w niekorzystnej pozycji. To tylko zwiększa szanse na aborcję.

Spójrz na głowę zarodka od góry, aby zlokalizować szczelinę, w której znajduje się szczelina między lewą a prawą półkulą korową. Półkule są łatwe do odróżnienia, a boczne komory w ich wnętrzu mogą być zwykle postrzegane jako nieco ciemniejsze kształty. Jeśli okaże się, że zarodek jest idealnie zorientowany do wstrzyknięcia DNA, możliwe jest przebicie ściany macicy i natychmiastowe wejście do trzeciej komory.

Przyłóż szklaną mikropipetę z przygotowanym wcześniej DNA pod kątem 45 stopni do ściany macicy i nakłuj ją na rostralnym końcu szczeliny międzypółkulowej, penetrując na głębokość około jednego milimetra. W ten sposób końcówka szklanej mikropipety wejdzie do trzeciej komory mózgu, a nie do komory bocznej. Po wstrzyknięciu około jednego mikrolitra roztworu DNA do trzeciej komory, zielony płyn wypełni komorę w dobrym wstrzyknięciu, powtórz tę samą procedurę ze wszystkimi zarodkami tego samego rogu macicy.

Pozwoli to na równomierne wymieszanie roztworu DNA z płynem komorowym i dotarcie do całego nabłonka nerwowego. Teraz włącz elektro perter i dostosuj ustawienia do wieku embrionalnego. Użyj elektrody igłowej ze stali nierdzewnej jako bieguna dodatniego i okrągłej płaskiej elektrody jako bieguna ujemnego, wybierz zarodki grzbietową stroną do góry do elektroporacji.

Następnie przebij ścianę macicy obok głowy zarodka między workiem owodniowym a łożyskiem, wpychając przez nią końcówkę elektrody igłowej w dół. Następnie użyj palca wskazującego drugiej ręki jako bloku ciągu. Około pięciu milimetrów końcówki elektrody powinno znajdować się między workiem owodniowym a ścianą macicy mniej więcej na poziomie śródmózgowia.

Ponieważ jest to elektroda celownicza, jej położenie określi, która część nabłonka nerwowego podwzgórza jest najbardziej narażona na transfekcję. Następnie drugą ręką umieść okrągłą płaską elektrodę na zewnątrz ściany macicy po przeciwnej stronie głowy zarodka. Następnie delikatnie ściśnij zarodek między elektrodami.

Użyj przełącznika pedału, aby przyłożyć napięcie. Następnie powoli wyciągnij elektrodę igłową z macicy, przytrzymując macicę palcem wskazującym drugiej ręki. Jeśli płyn owodniowy zostanie utracony przez przebitą ścianę, zwykle zarodek zostanie poddany aborcji.

Po wstrzyknięciu i elektroporacji wszystkich zarodków, bardzo ostrożnie umieść macicę z powrotem w jamie brzusznej myszy i ustaw je dokładnie tak, jak wcześniej. Następnie zwilż jamę otrzewnej solą fizjologiczną przed jej zamknięciem. Zszyj otrzewną chirurgicznym jelitem kota, a następnie zszyj skórę bardziej odpornym szwem.

Zdezynfekuj powierzchnię brzucha roztworem jodu i wstrzyknij podskórnie niesteroidowy środek przeciwzapalny w celu złagodzenia bólu. Następnie wyjmij matkę z urządzenia znieczulającego i umieść ją w klatce, która jest podgrzewana przez poduszkę grzewczą. Monitoruj mysz, aż całkowicie wyzdrowieje ze znieczulenia i sprawdzaj ją codziennie, aby upewnić się, że wraca do zdrowia po zabiegu bez żadnych oznak infekcji lub bólu.

Na tym etapie zbierz zarodki lub zarodki po urodzeniu zgodnie z pożądanym dniem analizy. Wybierz embriony, którym wstrzyknięto DNA i poddano je elektropostacji, a następnie przeprowadź sekcję mózgów pod mikroskopem stereoskopowym. Następnie sprawdź, czy w odpowiednim obszarze znajduje się zielony sygnał fluorescencyjny.

Aby przeanalizować mózg wybranego zarodka, utrwal tkankę na krótki czas w 4% paraldehydzie. Następnie zanurz go w aros 4% lub w albuminie żelatyny. Następnie podziel mózg na vibrato.

Rysunki te pokazują podwzgórze po transfekcji in utero DNA osocza, niosącego fluorescencyjne geny reporterowe, GFP lub CFP w E 12,5. Jest to przekrój strzałkowy przedstawiający podwzgórze przetransfekowane z rostralu na dorszowego, a tutaj jest przekrój poprzeczny z oznaczonymi komórkami na różnych poziomach wzdłuż osi bocznej pożywki. Ten przekrój strzałkowy pokazuje specyficznie transfekowane ciało sutka i oznaczenie jego charakterystycznego drzewa aksonalnego, a po stronie elektroparady tego przekroju poprzecznego pokazuje oznakowane pasmo odpowiadające neuronom urodzonym na E 12,5.

Aby dokładniej przeanalizować sekcje. Przygotowano przekroje poziome równoległe do płaszczyzny promieniowych wyrostków glejowych wychodzących z wgłębienia sutkowego. Neurony ambi O powstałe z nabłonka nerwowego transfekowanego w dniu E 12,5 zostały zidentyfikowane w dniu E 18,5 za pomocą przeciwciał przeciwko GFP.

W tym przykładzie przeciwciało znakowało ograniczoną grupę komórek MBO. Grupa ta znajdowała się między dwoma nieznakowanymi bocznymi i przyśrodkowymi obszarami MBO odpowiadającymi neuronom MBO, urodzonym przed i po E 12,5, a barwieniem co przeciwciałem przeciwko nestonowi. Na czerwono pokazany jest tryb migracji indywidualnie znakowanych neuronów na promieniowe procesy glejowe nabłonka nerwowego Po opanowaniu tej techniki można wykonać w ciągu 30 minut, jeśli zostanie wykonana prawidłowo.

Po obejrzeniu tego filmu powinieneś dobrze zrozumieć, jak wstrzyknąć DNA do trzeciej komory i jak ustawić igłę jako elektrodę dodatnią między zarodkiem, głową i łożyskiem, aby skutecznie celować w podwzgórze. Postępując zgodnie z tą procedurą. Inne metody, takie jak immunohistochemia lub hybrydyzacja inidów, mogą być wykonane w celu uzyskania odpowiedzi na dodatkowe pytania dotyczące fenotypu transfekowanych neuronów.