Name: Manipulacja genetyczna myszy rozwijającej podwzgórze poprzez elektroporację in utero (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-07-24T12:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 48 s
Description: Poznaj metodę elektroporacji in utero do manipulacji genami w podwzgórzu myszy. Technika ta umożliwia transfekcję DNA w embrionach, aktywację lub represję funkcji genów oraz badanie rozwoju neuronalnego in vivo.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Ta praca została sfinansowana przez Niemiecką Fundację Badawczą (Deutsche Forschungsgemeinschaft).

1. Przygotowanie mikropipet DNA i szklanych do iniekcji
<ol>
	<li>Dobrej jakości szklane mikropipety są niezbędne do zmniejszenia początkowego wysokiego wskaźnika poronień z powodu utraty płynu owodniowego. Procedura pobierania szklanych mikropipet została dobrze udokumentowana13,18,25. Stosować kapilary o średnicy 1,2 mm wciągnięte w konwencjonalne urządzenie Sutter P-97 o ustawieniach P=500; Ciepło=300; Ciągnięcie = 40; Prędkość=50; Czas=50. Zamontuj ściągacz z filamentami "rynnowymi" 3 mm (Sutter Instrument FT330B). Filamenty o rozmiarze 2 mm przyniosły nam mniej zadowalające efekty. Z drugiej strony, ukosowanie końcówek mikropipet nie wydaje się poprawiać naszych wyników.</li>
	<li>Rozpuścić oczyszczone, wolne od endotoksyn plazmidowe DNA w PBS (Cell Culture Grade) zawierającym 0,1% Fast Green do końcowego stężenia od 1 do 2 μg/μl. Fast Green sprawi, że wstrzyknięty roztwór będzie widoczny w embrionalnej komorze mózgu.</li>
	<li>Załadować 10 μl roztworu DNA do szklanej mikropipety.</li>
	<li>Podłączyć szklaną mikropipetę do systemu iniekcyjnego (Pico Pump) lub pipety doustnej.</li>
</ol>
2. Znieczulenie
Przygotuj stół chirurgiczny z poduszką grzewczą i narzędziami chirurgicznymi. Włącz źródła zimnego światła, aby ułatwić wizualizację zarodków. Zdezynfekuj narzędzia chirurgiczne, na przykład za pomocą sterylizatora z kulkami szklanymi.
Trzy różne procedury znieczulenia są możliwe dla tego protokołu (zobacz Dyskusja). Tutaj opiszemy ten, który uważamy za najlepszy, stosując inhalację izofluranu do indukcji znieczulenia (przepływ 0,5 l/min), a także konserwacji (przepływ 1 l/min).
<ol>
	<li>Umieść ciężarną mysz w małym przezroczystym (tak, aby mysz pozostała widoczna) pojemniku połączonym z urządzeniem anestezjologicznym Komesaroff Mark 5 za pomocą krótkiego odcinka rurki.</li>
	<li>Napełnij waporyzator izofluranem, a następnie otwórz butlę z tlenem dołączoną do urządzenia. Wdmuchnij jeden lub dwa impulsy izofluranu/tlenu (0,5 l/min) do pojemnika trzymającego mysz i obserwuj, czy nie pojawi się narkoza.</li>
	<li>Wyjmij mysz, zakryj jej oczy maścią, aby zapobiec ich wyschnięciu i natychmiast załóż maskę do znieczulenia przepływowego na głowę.</li>
</ol>
3. Laparotomia
<ol>
	<li>Połóż mysz brzuszkiem do góry na poduszce grzewczej (w przeciwnym razie temperatura jej ciała bardzo szybko spadnie, zmniejszając szanse na powrót do zdrowia) i zabezpiecz jej ciało na miejscu, przymocowując cztery nogi po bokach taśmą. Oceń głębokość znieczulenia, sprawdzając, czy nie ma utraty reakcji na stymulację odruchową (np. uszczypnięcie palca u nogi lub ogona przy silnym nacisku).</li>
	<li>Ogolić powierzchnię brzucha i zdezynfekować ją jodem jodoforpowidonu (Braunoderm).</li>
	<li>Wykonaj podłużne nacięcie (o długości od 1 do 1,5 cm) na skórze brzucha. Następnie przetnij otrzewną. Umieść bawełnianą gazę wokół nacięcia. Spraw, aby jeden róg macicy był widoczny i ostrożnie wyciągnij go kleszczami na gazę płukaną PBS. Bardzo często płucz macicę PBS, aby była zawsze nawilżona (ryc. 2A i 2B). Podczas całego zabiegu należy unikać naciągania mezometrium lub macicy, ponieważ wysokie ciśnienie wewnątrz macicy przeniesie się na zarodek, zwiększając ryzyko utraty płynu po wstrzyknięciu, co prowadzi do poronienia.</li>
</ol>
4. Wstrzyknięcie DNA do komory mózgu
<ol>
	<li>Trzymaj macicę w taki sposób, aby można było uwidocznić komory mózgu. Nie należy nadmiernie zmieniać położenia zarodka, który leży w niekorzystnej pozycji - zwiększa to tylko szanse na aborcję.</li>
	<li>Patrząc na głowę zarodka od góry, zlokalizuj wizualnie przerwę lub szczelinę między lewą i prawą półkulą korową. Półkule są łatwe do odróżnienia, a boczne komory w ich wnętrzu (nie do celu) mogą być zwykle postrzegane jako nieco ciemniejsze kształty. Jeśli okaże się, że zarodek jest idealnie zorientowany do wstrzyknięcia DNA (ryc. 2C i 2D), możliwe jest przebicie ściany macicy i natychmiastowe wejście do trzeciej komory. Trzymać szklaną mikropipetę pod kątem 45° przy ścianie macicy i nakłuć ją na rostralnym końcu szczeliny między półkulami korowymi, penetrując na około 1 mm. W ten sposób końcówka szklanej mikropipety wejdzie do trzeciej komory mózgu (nie do komory bocznej) (ryc. 2C i 2D). U zarodków mniej korzystnie zorientowanych warto najpierw przekłuć ścianę macicy (zawsze pod kątem 45°) w pobliżu głowy zarodka, umieścić końcówkę mikropipety we właściwej pozycji między półkulami korowymi i dopiero wtedy przebić mózg. Wstrzyknąć około 1 μl roztworu DNA do trzeciej komory (dobre wstrzyknięcie wypełnia komorę zielonym płynem). Powtórz tę samą procedurę ze wszystkimi zarodkami jednego rogu macicy. Daje to pewien czas, aby roztwór DNA równomiernie wymieszał się z płynem komorowym i dotarł do całego nabłonka nerwowego.</li>
</ol>
5. Celowanie w podwzgórze w celu elektroporacji
<ol>
	<li>Włącz elektroporator i dostosuj ustawienia do wieku embrionalnego (dla E12,5 używamy 5 impulsów prostokątnych, 50 V, 50 ms ON/950 ms OFF). Jako biegun dodatni należy użyć elektrody igłowej ze stali nierdzewnej (CUY550-10), a jako bieguna ujemnego okrągłej płaskiej elektrody (CUY700P4L). (Ważne jest, aby elektrody były mniejsze niż zarodek, ponieważ w przeciwnym razie prąd po prostu przepływa wokół zarodka, ale nie przez niego).</li>
	<li>Do elektroporacji należy wybrać te zarodki, których strona grzbietowa jest skierowana do góry (tj. zwrócona w stronę eksperymentatora) (jak większość z nich), a odrzucić te, których orientacja nie jest korzystna. Teraz można bezpiecznie dotykać macicy palcami zdezynfekowanymi etanolem lub w rękawiczkach. Trzymanie macicy kleszczami zakłóciłoby jednak przepływ prądu podczas elektroporacji.</li>
	<li>Przebij ścianę macicy przy głowie zarodka między workiem owodniowym a łożyskiem, wpychając ją w dół końcówką elektrody igłowej. Użyj palca wskazującego drugiej ręki jako bloku pchnięcia. Około 5 mm końcówki elektrody musi znajdować się teraz między workiem owodniowym a ścianą macicy, mniej więcej na poziomie śródmózgowia (ryc. 2E i 2F). Pamiętaj, że jest to "elektroda celownicza", więc jej położenie określi, która część nabłonka neuronabłonka podwzgórza jest najbardziej narażona na transfekcję. Zarodek musi być bardzo delikatnie "ściśnięty" między elektrodami.</li>
	<li>Drugą ręką umieść okrągłą płaską elektrodę na zewnątrz ściany macicy po przeciwnej stronie głowy zarodka (ryc. 2E i 2G).</li>
	<li>Użyj przełącznika pedałowego, aby przyłożyć voltage (50 V, 50 ms ON, 950 ms OFF, 5 impulsów prostokątnych).</li>
	<li>Powoli wyciągnij elektrodę igłową z macicy, jednocześnie przytrzymując macicę palcem wskazującym drugiej ręki - jeśli płyn owodniowy zostanie utracony przez przebitą ścianę, zwykle zarodek zostanie poddany poronieniu. Powtórz procedurę ze wszystkimi zarodkami.</li>
	<li>Zwróć róg macicy do jamy brzusznej i powtórz wstrzyknięcie i elektroporację w pozostałym rogu.</li>
</ol>
6. Zakończenie operacji
<ol>
	<li>Po wstrzyknięciu i elektroporacji wszystkich zarodków, należy bardzo ostrożnie umieścić macicę z powrotem w jamie brzusznej, ustawioną dokładnie tak, jak wcześniej, a przed jej zamknięciem zwilżyć jamę otrzewnej solą fizjologiczną.</li>
	<li>Zszyj otrzewną chirurgicznym katgutem (Vicryl Polyglactin 910, 5-0, Ethicon V4914). Do zamknięcia skóry należy zastosować metodę "przerywanego szwu" z bardziej odpornym szwem (Supramid Nylon, 6-0, Serag Wiessner TO 07171L).</li>
	<li>Zdezynfekuj powierzchnię brzucha jodonem powidonu (Braunoderm) i wstrzyknij podskórnie niesteroidowy środek przeciwzapalny (np. 100 μl roztworu rimadylu w proporcji 1:10 w 0,9% NaCl) lub, jeszcze lepiej, opioidu, takiego jak buprenorfina (Temgesic, 0,05 do 0,1 mg/kg masy ciała w 0,9% NaCl) w celu złagodzenia bólu.</li>
	<li>Wyjmij matkę z urządzenia znieczulającego i umieść ją w klatce ogrzewanej przez poduszkę grzewczą. Monitoruj mysz w sposób ciągły, aż całkowicie wyzdrowieje po znieczuleniu. Później codziennie sprawdzaj zwierzęta, aby upewnić się, że wracają do zdrowia po zabiegu bez żadnych oznak infekcji lub bólu.</li>
</ol>
7. Analiza wyników
<ol>
	<li>Zbierz zarodki (lub zarodki po urodzeniu) zgodnie z pożądanym dniem analizy. Myszy po urodzeniu (w wieku od 1 do 2 dni) są zabijane przez ścięcie.</li>
	<li>Oddziel każdy zarodek zgodnie z poprzednią adnotacją dotyczącą elektroporacji. Przeprowadź sekcję mózgu pod mikroskopem stereoskopowym i sprawdź pod mikroskopem, czy w odpowiednim obszarze nie ma zielonego sygnału fluorescencyjnego (z reportera GFP).</li>
	<li>Wybrany mózg można przeanalizować "na świeżo": utrwalić tkankę na krótki czas w 4% paraformaldehydzie i zatopić w agarozie 4% lub w albuminie żelatyny, a następnie przeciąć na urządzeniu typu wibratom (ryc. 3). W celu uzyskania bardziej szczegółowej analizy immunohistochemicznej (ryc. 4) należy zabezpieczyć mózg kriogenicznie w 30% roztworze sacharozy, zatopić w podłożu montażowym OCT (Tissue Tek), a następnie wyciąć odcinki 20 μm w kriostacie.</li>
</ol>

<ol><li>Itasaki, N., Bel-Vialar, S., Krumlauf, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Shocking%27+developments+in+chick+embryology%3A+electroporation+and+in+ovo+gene+expression%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Shocking' developments in chick embryology: electroporation and in ovo gene expression.</a> Nat. Cell Biol. 1, E203-E207 (1999).</li>
<li>Miyasaka, N., Arimatsu, Y., Takiguchihayashi, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Foreign+gene+expression+in+an+organotypic+culture+of+cortical+anlage+after+in+vivo+electroporation%5BTitle%5D)+AND+%22Neuroreport%22%5BJournal%5D)">Foreign gene expression in an organotypic culture of cortical anlage after in vivo electroporation.</a> Neuroreport. 10, 2319-2323 (1999).</li>
<li>Saito, T., Nakatsuji, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Efficient+gene+transfer+into+the+embryonic+mouse+brain+using+in+vivo+electroporation%5BTitle%5D)+AND+%22Dev.+Biol%22%5BJournal%5D)">Efficient gene transfer into the embryonic mouse brain using in vivo electroporation.</a> Dev. Biol. 240, 237-246 (2001).</li>
<li>Tabata, H., Nakajima, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Efficient+in+utero+gene+transfer+system+to+the+developing+mouse+brain+using+electroporation%3A+visualization+of+neuronal+migration+in+the+developing+cortex%5BTitle%5D)+AND+%22Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Efficient in utero gene transfer system to the developing mouse brain using electroporation: visualization of neuronal migration in the developing cortex.</a> Neuroscience. 103, 865-872 (2001).</li>
<li>Fukuchi-Shimogori, T., Grove, E. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neocortex+patterning+by+the+secreted+signaling+molecule+FGF8%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Neocortex patterning by the secreted signaling molecule FGF8.</a> Science. 294, 1071-1074 (2001).</li>
<li>Tabata, H., Nakajima, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neurons+tend+to+stop+migration+and+differentiate+along+the+cortical+internal+plexiform+zones+in+the+Reelin+signal-deficient+mice%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci.+Res%22%5BJournal%5D)">Neurons tend to stop migration and differentiate along the cortical internal plexiform zones in the Reelin signal-deficient mice.</a> J. Neurosci. Res. 69, 723-730 (2002).</li>
<li>Fukuchi-Shimogori, T., Grove, E. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Emx2+patterns+the+neocortex+by+regulating+FGF+positional+signaling%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Emx2 patterns the neocortex by regulating FGF positional signaling.</a> Nat. Neurosci. 6, 825-831 (2003).</li>
<li>Shimogori, T., Banuchi, V., Ng, H. Y., Strauss, J. B., Grove, E. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Embryonic+signaling+centers+expressing+BMP%2C+WNT+and+FGF+proteins+interact+to+pattern+the+cerebral+cortex%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Embryonic signaling centers expressing BMP, WNT and FGF proteins interact to pattern the cerebral cortex.</a> Development. 131, 5639-5647 (2004).</li>
<li>Shimogori, T., Grove, E. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fibroblast+growth+factor+8+regulates+neocortical+guidance+of+area-specific+thalamic+innervation%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Fibroblast growth factor 8 regulates neocortical guidance of area-specific thalamic innervation.</a> J. Neurosci. 25, 6550-6560 (2005).</li>
<li>Saito, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+electroporation+in+the+embryonic+mouse+central+nervous+system%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Protoc%22%5BJournal%5D)">In vivo electroporation in the embryonic mouse central nervous system.</a> Nat. Protoc. 1, 1552-1558 (2006).</li>
<li>Dixit, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Efficient+Gene+Delivery+into+Multiple+CNS+Territories+Using+In+Utero+Electroporation%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis.+Exp%22%5BJournal%5D)">Efficient Gene Delivery into Multiple CNS Territories Using In Utero Electroporation.</a> J. Vis. Exp. (52), e2957(2011).</li>
<li>Rice, H., Suth, S., Cavanaugh, W., Bai, J., Young-Pearse, T. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+utero+Electroporation+followed+by+Primary+Neuronal+Culture+for+Studying+Gene+Function+in+Subset+of+Cortical+Neurons%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis.+Exp%22%5BJournal%5D)">In utero Electroporation followed by Primary Neuronal Culture for Studying Gene Function in Subset of Cortical Neurons.</a> J. Vis. Exp. (44), e2103(2010).</li>
<li>Walantus, W., Castaneda, D., Elias, L., Kriegstein, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+Utero+Intraventricular+Injection+and+Electroporation+of+E15+Mouse+Embryos%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis.+Exp%22%5BJournal%5D)">In Utero Intraventricular Injection and Electroporation of E15 Mouse Embryos.</a> J. Vis. Exp. (6), e239(2007).</li>
<li>Walantus, W., Elias, L., Kriegstein, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+Utero+Intraventricular+Injection+and+Electroporation+of+E16+Rat+Embryos%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis.+Exp%22%5BJournal%5D)">In Utero Intraventricular Injection and Electroporation of E16 Rat Embryos.</a> J. Vis. Exp. (6), e236(2007).</li>
<li>Borrell, V., Yoshimura, Y., Callaway, E. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Targeted+gene+delivery+to+telencephalic+inhibitory+neurons+by+directional+in+utero+electroporation%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci.+Methods%22%5BJournal%5D)">Targeted gene delivery to telencephalic inhibitory neurons by directional in utero electroporation.</a> J. Neurosci. Methods. 143, 151-158 (2005).</li>
<li>Haddad-Tovolli, R., Heide, M., Zhou, X., Blaess, S., Alvarez-Bolado, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mouse+thalamic+differentiation%3A+gli-dependent+pattern+and+gli-independent+prepattern%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Mouse thalamic differentiation: gli-dependent pattern and gli-independent prepattern.</a> Front Neurosci. 6, 27(2012).</li>
<li>Kataoka, A., Shimogori, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fgf8+controls+regional+identity+in+the+developing+thalamus%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Fgf8 controls regional identity in the developing thalamus.</a> Development. 135, 2873-2881 (2008).</li>
<li>Matsui, A., Yoshida, A. C., Kubota, M., Ogawa, M., Shimogori, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mouse+in+Utero+Electroporation%3A+Controlled+Spatiotemporal+Gene+Transfection%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis.+Exp%22%5BJournal%5D)">Mouse in Utero Electroporation: Controlled Spatiotemporal Gene Transfection.</a> J. Vis. Exp. (54), e3024(2011).</li>
<li>Vue, T. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sonic+hedgehog+signaling+controls+thalamic+progenitor+identity+and+nuclei+specification+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Sonic hedgehog signaling controls thalamic progenitor identity and nuclei specification in mice.</a> J. Neurosci. 29, 4484-4497 (2009).</li>
<li>Tanaka, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transcriptional+regulation+of+the+hypocretin%2Forexin+gene+by+NR6A1%5BTitle%5D)+AND+%22Biochem.+Biophys.+Res.+Commun%22%5BJournal%5D)">Transcriptional regulation of the hypocretin/orexin gene by NR6A1.</a> Biochem. Biophys. Res. Commun. 403, 178-183 (2010).</li>
<li>Tsuchiya, R., Takahashi, K., Liu, F. C., Takahashi, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Aberrant+axonal+projections+from+mammillary+bodies+in+Pax6+mutant+mice%3A+possible+roles+of+Netrin-1+and+Slit+2+in+mammillary+projections%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci.+Res%22%5BJournal%5D)">Aberrant axonal projections from mammillary bodies in Pax6 mutant mice: possible roles of Netrin-1 and Slit 2 in mammillary projections.</a> J. Neurosci. Res. 87, 1620-1633 (2009).</li>
<li>Canteras, N. S. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aCanteras%2C+NS+%22The+Mouse+Nervous+System%22">The Mouse Nervous System</a>. Watson, C., Paxinos, G., Puelles, L. , Academic Press. 539-562 (2011).</li>
<li>Caqueret, A., Yang, C., Duplan, S., Boucher, F., Michaud, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Looking+for+trouble%3A+a+search+for+developmental+defects+of+the+hypothalamus%5BTitle%5D)+AND+%22Horm.+Res%22%5BJournal%5D)">Looking for trouble: a search for developmental defects of the hypothalamus.</a> Horm. Res. 64, 222-230 (2005).</li>
<li>Petros, T. J., Rebsam, A., Mason, C. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+utero+and+ex+vivo+Electroporation+for+Gene+Expression+in+Mouse+Retinal+Ganglion+Cells%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis.+Exp%22%5BJournal%5D)">In utero and ex vivo Electroporation for Gene Expression in Mouse Retinal Ganglion Cells.</a> J. Vis. Exp. (31), e1333(2009).</li>
<li>Nijagal, A., Le, T., Wegorzewska, M., Mackenzie, T. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Mouse+Model+of+in+Utero+Transplantation%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis.+Exp%22%5BJournal%5D)">A Mouse Model of in Utero Transplantation.</a> J. Vis. Exp. (47), e2303(2011).</li>
<li>Altman, J., Bayer, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Development+of+the+Rat+Hypothalamus%5BTitle%5D)+AND+%22Adv.+Anat.+Embryol.+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">The Development of the Rat Hypothalamus.</a> Adv. Anat. Embryol. Cell Biol. 100, 1-178 (1986).</li>
<li>Clancy, B., Darlington, R. B., Finlay, B. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Translating+developmental+time+across+mammalian+species%5BTitle%5D)+AND+%22Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Translating developmental time across mammalian species.</a> Neuroscience. 105, 7-17 (2001).</li>
<li>Clancy, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Web-based+method+for+translating+neurodevelopment+from+laboratory+species+to+humans%5BTitle%5D)+AND+%22Neuroinformatics%22%5BJournal%5D)">Web-based method for translating neurodevelopment from laboratory species to humans.</a> Neuroinformatics. 5, 79-94 (2007).</li>
<li>Ishii, Y., Bouret, S. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Embryonic+birthdate+of+hypothalamic+leptin-activated+neurons+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Endocrinology%22%5BJournal%5D)">Embryonic birthdate of hypothalamic leptin-activated neurons in mice.</a> Endocrinology. 153, 3657-3667 (2012).</li>
<li>Karim, M. A., Sloper, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Histogenesis+of+the+supraoptic+and+paraventricular+neurosecretory+cells+of+the+mouse+hypothalamus%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Anat%22%5BJournal%5D)">Histogenesis of the supraoptic and paraventricular neurosecretory cells of the mouse hypothalamus.</a> J. Anat. 130, 341-347 (1980).</li>
<li>Shimada, M., Nakamura, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Time+of+neuron+origin+in+mouse+hypothalamic+nuclei%5BTitle%5D)+AND+%22Exp.+Neurol%22%5BJournal%5D)">Time of neuron origin in mouse hypothalamic nuclei.</a> Exp. Neurol. 41, 163-173 (1973).</li>
<li>Alvarez-Bolado, G., Paul, F. A., Blaess, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sonic+hedgehog+lineage+in+the+mouse+hypothalamus%3A+from+progenitor+domains+to+hypothalamic+regions%5BTitle%5D)+AND+%22Neural.+Dev%22%5BJournal%5D)">Sonic hedgehog lineage in the mouse hypothalamus: from progenitor domains to hypothalamic regions.</a> Neural. Dev. 7, 4(2012).</li>
<li>Vann, S. D., Aggleton, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+mammillary+bodies%3A+two+memory+systems+in+one%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Rev.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">The mammillary bodies: two memory systems in one.</a> Nat. Rev. Neurosci. 5, 35-44 (2004).</li>
<li>Gratsch, T. E., De Boer, L. S., O'Shea, K. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((RNA+inhibition+of+BMP-4+gene+expression+in+postimplantation+mouse+embryos%5BTitle%5D)+AND+%22Genesis%22%5BJournal%5D)">RNA inhibition of BMP-4 gene expression in postimplantation mouse embryos.</a> Genesis. 37, 12-17 (2003).</li>
<li>Wu, N., Yu, A. B., Zhu, H. B., Lin, X. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effective+silencing+of+Sry+gene+with+RNA+interference+in+developing+mouse+embryos+resulted+in+feminization+of+XY+gonad%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biomed.+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Effective silencing of Sry gene with RNA interference in developing mouse embryos resulted in feminization of XY gonad.</a> J. Biomed. Biotechnol. 2012, 343891(2012).</li>
<li>Kikuchi, N., Nakamura, S., Ohtsuka, M., Kimura, M., Sato, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Possible+mechanism+of+gene+transfer+into+early+to+mid-gestational+mouse+fetuses+by+tail+vein+injection%5BTitle%5D)+AND+%22Gene+Ther%22%5BJournal%5D)">Possible mechanism of gene transfer into early to mid-gestational mouse fetuses by tail vein injection.</a> Gene Ther. 9, 1529-1541 (2002).</li>
<li>Foust, K. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intravascular+AAV9+preferentially+targets+neonatal+neurons+and+adult+astrocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Intravascular AAV9 preferentially targets neonatal neurons and adult astrocytes.</a> Nat. Biotechnol. 27, 59-65 (2009).</li>
<li>Xin, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+brain+targeting+mechanism+of+Angiopep-conjugated+poly%28ethylene+glycol%29-co-poly%28epsilon-caprolactone%29+nanoparticles%5BTitle%5D)+AND+%22Biomaterials%22%5BJournal%5D)">The brain targeting mechanism of Angiopep-conjugated poly(ethylene glycol)-co-poly(epsilon-caprolactone) nanoparticles.</a> Biomaterials. 33, 1673-1681 (2012).</li>
<li>Niwa, H., Yamamura, K., Miyazaki, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Efficient+selection+for+high-expression+transfectants+with+a+novel+eukaryotic+vector%5BTitle%5D)+AND+%22Gene%22%5BJournal%5D)">Efficient selection for high-expression transfectants with a novel eukaryotic vector.</a> Gene. 108, 193-199 (1991).</li>
<li>Kaufman, R. J., Davies, M. V., Wasley, L. C., Michnick, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Improved+vectors+for+stable+expression+of+foreign+genes+in+mammalian+cells+by+use+of+the+untranslated+leader+sequence+from+EMC+virus%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">Improved vectors for stable expression of foreign genes in mammalian cells by use of the untranslated leader sequence from EMC virus.</a> Nucleic Acids Res. 19, 4485-4490 (1991).</li>
<li>Tsien, R. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+green+fluorescent+protein%5BTitle%5D)+AND+%22Annu.+Rev.+Biochem%22%5BJournal%5D)">The green fluorescent protein.</a> Annu. Rev. Biochem. 67, 509-544 (1998).</li>
<li>Londrigan, S. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evaluation+of+promoters+for+driving+efficient+transgene+expression+in+neonatal+porcine+islets%5BTitle%5D)+AND+%22Xenotransplantation%22%5BJournal%5D)">Evaluation of promoters for driving efficient transgene expression in neonatal porcine islets.</a> Xenotransplantation. 14, 119-125 (2007).</li>
</ol>

Autorzy oświadczają, że nie mają konkurencyjnych interesów finansowych.

O znieczuleniu: Ponieważ elektroporacja in utero do podwzgórza może być technicznie żmudna i wymagać dłuższego czasu narkozy, wolimy indukować i utrzymywać znieczulenie poprzez podawanie mieszaniny tlenu i izofluranu. Z naszego doświadczenia wynika, że zwierzęta mogą pozostać w tym miejscu w odpowiednim znieczuleniu przez okres co najmniej jednej godziny, powrót do zdrowia matki jest bardzo szybki, a przeżywalność zarodka poprawiona. Dostępne są również inne podejścia do znieczulenia. Najprostszy zabieg polega ...

Manipulacja genetyczna embrionalnego mózgu myszy jest preferowanym podejściem do nauki o regulacji rozwoju. Generowanie zmutowanych linii myszy jest jednak powolne i kosztowne. Jedną z potężnych metod wprowadzania określonych zmian genetycznych w rozwijających się neuronach mózgu ssaków jest elektroporacja in utero. Zasadniczo technika ta polega na transfekcji DNA do embrionalnego nabłonka mózgu za pomocą impulsów elektrycznych, a następnie umożliwieniu zarodkowi przetrwania przez określony czas, pobraniu mózgu i zbadaniu go pod kątem możliwych nowych, informacyjnych fenotypów. W ten sposób eksperymentator może testować hipotezy niemal natychmiast, bez długich okresów oczekiwania niezbędnych do produkcji mutantów myszy.	
	Transfekcja DNA do rozwijających się zarodków rozpoczęła się od elektroporacji in ovo na zarodkach piskląt1. Zasadniczy dowód słuszności koncepcji dla myszy przeprowadzono w kulturze2. Wkrótce potem pojawiły się pierwsze opisy tej techniki na myszy in utero3,4.	
	Głównym problemem jest transfekcja mózgu embrionów rozwijających się w macicy bez zabijania ich lub matki. Nauka wykonywania niezbędnych operacji (laparotomia, iniekcja, elektroporacja) wymaga długiego okresu szkolenia. Gdy operacja zostanie opanowana do punktu, w którym współczynnik przeżywalności zarodka jest akceptowalny, następnym kluczowym pytaniem jest: które struktury mózgu są dostępne? Nic dziwnego, że pierwsze opublikowane prace pokazujące wyniki uzyskane za pomocą elektroporacji in utero koncentrowały się na rozwoju kory mózgowej5-9. Jest to nadal prawdą w przypadku większości publikacji wykorzystujących tę technikę, ponieważ regionem rozwijającego się mózgu myszy najbardziej dostępnym do zabiegów chirurgicznych jest kora mózgowa (ryc. 1). Procedura elektroporacji in utero do kory mózgowej została opisana na druku10 oraz na filmie11-14. Modyfikacja techniki może być wykorzystana do celowania w brzuszną część kresomózgowia, zwoje podstawy15.	
	Poza kresomózgowiem, międzymózgowie (klasycznie podzielone na wzgórze i podwzgórze) jest regionem przodomózgowia trudniejszym do osiągnięcia. Niewielka liczba prac donosi o celowaniu w jego grzbietową i najbardziej dostępną część, wzgórze16-19.	
	Podwzgórze jest najbardziej brzuszną częścią przodomózgowia, a więc zlokalizowaną najgłębiej od powierzchni grzbietowej (kory) (Rysunek 1). Region ten pozostaje trudnym wyzwaniem dla naukowców zajmujących się genetyczną manipulacją mózgiem myszy w macicy. O ile nam wiadomo, tylko bardzo niewiele artykułów informuje o wynikach transfekcji in utero do podwzgórza myszy 20,21. Nie można jednak przecenić funkcjonalnego znaczenia podwzgórza, ponieważ reguluje ono zachowania takie jak jedzenie i picie, krycie, rozmnażanie i rodzicielstwo22. Co więcej, zmiany w rozwoju podwzgórza przyczyniają się do powstania w późniejszym życiu stanów takich jak otyłość, nadciśnienie, cukrzyca i przedwczesne dojrzewaniepłciowe 23. Możliwość genetycznej zmiany podwzgórza podczas rozwoju dostarczyłaby bardzo potężnego narzędzia do jego zrozumienia.	
	Podstawowy protokół chirurgiczny dla laparotomii ciężarnych myszy, którego tutaj używamy, jest podobny do tego stosowanego w innych protokołach11,13,14,24. Opiszemy je tutaj pokrótce dla kompletności. Z drugiej strony kluczowe dla naszego zabiegu są rodzaj znieczulenia, miejsce wstrzyknięcia, rodzaj elektrod oraz wprowadzenie i położenie elektrody dodatniej względem głowy zarodka. Wolimy indukować i utrzymywać znieczulenie poprzez inhalację gazową niż zwykłe znieczulenie dootrzewnowe, ponieważ to pierwsze pozwala na nieco dłuższe okresy narkozy wymagane do trudnej operacji. Wdychanie izofluranu powoduje szybszy powrót do zdrowia po znieczuleniu, ponieważ zwykle matka wykazuje normalne zachowanie już kilka minut po operacji. Najprostszym punktem wstrzyknięcia roztworu DNA za pomocą szklanej mikropipety jest komora boczna, która jednak zupełnie nie nadaje się do elektroporacji podwzgórza. Wstrzyknięcie bezpośrednio do trzeciej komory jest rzeczywiście niezbędne do celowania w głębokie struktury międzymózgowia. Możliwe jest transfekcja podwzgórza z E12.0 lub E12.5 za pomocą standardowych, dostępnych od ręki elektrod. Znaleźliśmy niektóre z elektrod wyprodukowanych przez Nepa Gene (Chiba, Japonia) szczególnie nadające się do tego celu.	
	Dzięki naszej procedurze uzyskujemy transfekcję całego podwzgórza neuroepithelium lub częściową, regionalną transfekcję w zależności od orientacji elektrody. Tutaj demonstrujemy technikę poprzez transfekcję ciała sutkowego, prawdopodobnie najgłębszego i najbardziej zagłębionego ze wszystkich jąder podwzgórza. Dodatkowo pokazujemy szczegółową analizę histologiczną transfekowanych komórek aż do komórkowego poziomu rozdzielczości.	
	Porównanie elektroporacji in utero z innymi podejściami do transfekcji rozwijającego się mózgu myszy w macicy można znaleźć w sekcji Dyskusja.

<table><tbody><tr><td>&nbsp;</td><td></td><td></td><td>ODCZYNNIKI</td></tr><tr><td>Acepromazine</td><td>Sanofi GmbH</td><td></td><td>znieczulenie</td></tr><tr><td>Isoflurane</td><td>Baxter</td><td>HDG9623</td><td>znieczulenie</td></tr><tr><td>Ketamin</td><td>Pharma GmbH</td><td></td><td>znieczulenie</td></tr><tr><td>Fast Green</td><td>Fluka</td><td>44715</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>Rimadyl</td><td>Pfizer</td><td></td><td>niesteroidowy przeciwzapalny</td></tr><tr><td>Braunoderm</td><td>Braun</td><td>3887138</td> Bufor fosforanowy <td>powidonu i jodu</td></tr><tr><td>Sól fizjologiczna PBS</td><td>Gibco</td><td>14190</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>Temgesic (buprenorfina)</td><td>Essex Pharma</td><td></td><td>opioidowy środek przeciwbólowy</td></tr><tr><td>Maść do oczu</td><td>Pan-Ophtal</td><td>7136926</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>Ksylazyna</td><td>Bayer</td><td></td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>&nbsp;</td><td></td><td></td><td><mocny>SPRZĘT</mocny></td></tr><tr><td>Anestezjologiczny Komesaroff Mark-5</td><td>Medical Developments Australia</td><td>ACN 004 903 682</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>Ściągacz kapilarny P-97</td><td>Sutter Instrument Co.</td><td>P-97</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>Compresstome</td><td>Precyzyjny Instr.</td><td>VF-300</td><td>Urządzenie wibratomowe</td></tr><tr><td>Mikroskop konfokalny</td><td>Zeiss</td><td>LSM700</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>Kriostat</td><td>Leica</td><td>CM3050S</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>Elektroporator</td><td>Nepa Gene Co., Ltd.</td><td>CUY21EDIT</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>Elektroda 1</td><td>Nepa Gene Co., Ltd.</td><td>CUY550-10</td><td>Elektroda igłowa ze stali nierdzewnej, końcówka 10 mm, średnica 0,5 mm</td></tr><tr><td>Elektroda 2</td><td>Nepa Gene Co., Ltd.</td><td>CUY700P4L</td><td>Pokrywa Okrągła platynowa płyta o średnicy 4 mm</td></tr><tr><td>Światłowodowe źródło zimnego światła</td><td>Leica</td><td>KL2500 LCD</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>Kapilary szklane</td><td>Aparat Harvard</td><td>GC120T-15</td><td>1. 2 mm średnica zewnętrzna x średnica wewnętrzna 94 mm</td></tr><tr><td>Sterylizator z kulkami szklanymi</td><td>Fine Science Tools</td><td>FST250</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>Poduszka grzewcza</td><td>Aparat Harvard</td><td>py872-5272</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>Urządzenie iniekcyjne</td><td>World Precision Instruments</td><td>Pneumatyczna pompa Pico PV820</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>Nici do szwów powlekane Vicryl</td><td>Ethicon</td><td>V4914</td><td>Szew otrzewnowy</td></tr><tr><td>Thr. Supramid</td><td>Serag Wiessner</td><td>TO07171L</td><td>Szew do skóry</td></tr></tbody></table>

manipulacja genetyczna myszy rozwijającej podwzgórze poprzez elektroporację in utero

Genetic Manipulation of the Mouse Developing Hypothalamus through In utero Electroporation

Genetyczna modyfikacja określonych regionów rozwijającego się mózgu ssaków jest bardzo potężnym eksperymentalnym podejściem. Jednak generowanie nowych mutantów myszy jest często frustrująco powolne. Wykazano, że możliwy jest dostęp do mózgu myszy rozwijającego się w macicy z rozsądnym przeżyciem pooperacyjnym. Mimo to wyniki tej procedury zostały przedstawione prawie wyłącznie dla najbardziej powierzchownej i łatwo dostępnej części rozwijającego się mózgu, tj. kory mózgowej. Wzgórze, węższy i bardziej przyśrodkowy obszar, okazał się trudniejszy do namierzenia. Transfekcja do głębszych jąder, zwłaszcza do podwzgórza, jest prawdopodobnie najtrudniejsza i dlatego opisano bardzo niewiele wyników. Tutaj demonstrujemy procedurę celowania w cały nabłonek neuronabłonka podwzgórza lub jego część (obszary podwzgórza) w celu transfekcji przez elektroporację. Kluczem do naszego podejścia są dłuższe czasy narkozy, wstrzyknięcie do trzeciej komory oraz odpowiedni rodzaj i ułożenie elektrod. Dodatkowo pokazujemy wyniki celowania, a następnie analizy histologicznej najbardziej zagłębionego jądra podwzgórza, czyli ciała sutkowego.

Większość neuronów podwzgórza powstaje między E11,5 a E15,2, zgodnie z analizą datowania narodzin u szczura26 przeliczoną na nieco krótszy okres rozwoju myszy27,28. Szczyt neurogenezy podwzgórza przypada na E12,529-31. W związku z tym, w wybranym dla niniejszego badania wieku transfekcji (E12,5), znaczną część neuronów podwzgórza można znakować na dowolnym poziomie w osi rostro-kaudalnej.
Analiza w dniu E18,5 na grubych przekrojach wykonanych za pomocą wibrato...

Pomimo funkcjonalnego i medycznego znaczenia podwzgórza, rzadko próbowano genetycznej manipulacji jego rozwojem in utero. Przedstawiamy szczegółową procedurę elektroporacji in utero do podwzgórza myszy i pokazujemy reprezentatywne wyniki całkowitej i częściowej (regionalnej) transfekcji podwzgórza.

Manipulacja genetyczna myszy rozwijającej podwzgórze poprzez elektroporację in utero

Genetic  modification of specific regions of the developing mammalian brain is a very  powerful experimental approach. However, generating novel mouse ...

Ogólnym celem niniejszej procedury jest transfekcja plazmidowego DNA do podwzgórza embrionów myszy rozwijających się wewnątrzmacicznie, w celu aktywacji lub represji funkcji badanego genu. Jest to osiągane poprzez uprzednie znieczulenie ciężarnej myszy i odsłonięcie macicy za pomocą laparotomii. Drugim krokiem jest wstrzyknięcie roztworu DNA do trzeciej komory mózgu embrionalnego.Następnie elektrodę dodatnią umieszcza się wewnątrz macicy pomiędzy łożyskiem a głową zarodka. Elektrodę ujemną umieszcza się na zewnętrznej powierzchni macicy, a następnie przykłada się impulsy elektryczne. Ostatnim krokiem jest usunięcie przetransfekowanych mózgów zarodków po sześciu dniach.Ostatecznie mikroskopia fluorescencyjna jest wykorzystywana do analizy zmian fenotypowych w komórkach transfekowanych, takich jak ich liczba, kształt, pozycja, ekspresja markerów i inne. Głównymi zaletami tej techniki w porównaniu z istniejącymi metodami, takimi jak transfekcja wirusowa, są po pierwsze: brak konieczności stosowania specjalnych środków ostrożności oraz posiadania dwóch osobnych zapleczy, po drugie: możliwość ukierunkowania na konkretny obszar, a po trzecie: szybsze przesiewanie genów kandydackich dzięki elektroporacji.Zazwyczaj osoby rozpoczynające pracę z tą metodą napotykają trudności, ponieważ wstrzykiwanie roztworu DNA do trzeciej komory oraz prawidłowe rozmieszczenie elektrody igłowej wymagają zaawansowanej sprawności manualnej oraz doświadczenia. Metoda ta może pomóc w rozwiązaniu problemów badawczych w obszarze rozwoju podwzgórza, szczególnie tych dotyczących migracji komórek, a także sposobu genetycznej specyfikacji poszczególnych obszarów i jąder. Procedurę należy rozpocząć od przygotowania wysokiej jakości szklanych mikropipet, gdyż są one niezbędne do zmniejszenia początkowo wysokiego odsetka niepowodzeń wynikających z utraty płynu owodniowego.Aby przygotować DNA, rozpuść oczyszczone, wolne od endotoksyn plazmidowe DNA w PBS zawierającym 0,1% fast green do końcowego stężenia od 1 do 2 µg/µL. Fast green sprawi, że wstrzyknięty roztwór będzie widoczny w komorze mózgu zarodka. Następnie pobierz 10 µL roztworu DNA do szklanej mikropipety.Następnie podłącz szklaną mikropipetę do systemu wtryskowego lub pipety ustnej. Na tym etapie przygotuj stół chirurgiczny z matą grzewczą oraz narzędzia chirurgiczne. Włącz źródła zimnego światła, aby ułatwić wizualizację embrionów. Następnie zdezynfekuj narzędzia chirurgiczne, używając sterylizatora szklanego koralika.Następnie znieczul ciężarną mysz izofluranem. Po znieczuleniu myszy nanieś maść na jej oczy, aby zapobiec ich wysychaniu. Następnie załóż maskę na pysk zwierzęcia, aby utrzymać ciągłe znieczulenie.Teraz należy umieścić mysz na podgrzewaczu, brzuszkiem do góry. Unieruchomić ciało zwierzęcia, mocując cztery kończyny za pomocą taśmy. Upewnić się, że mysz jest całkowicie znieczulona, uciskając ogon w celu sprawdzenia odruchu.Następnie należy ogolić powierzchnię brzucha i zdezynfekować ją roztworem jodu. Wykonać nacięcie podłużne o długości około jednego do półtora centymetra na skórze brzucha. Następnie należy rozciąć otrzewną.Następnie umieść gazę bawełnianą wokół nacięcia. Przepłucz gazę roztworem PBS. Odsłoń jeden róg macicy, ostrożnie wyciągając go za pomocą kleszczyków tępych.Należy unikać mocnego naciągania miometrium lub macicy. Wysokie ciśnienie wewnątrz macicy zwiększy bowiem ryzyko utraty płynu z zarodkiem podczas iniekcji, co może prowadzić do aborcji. Następnie należy umieścić róg macicy na gazie wypłukanej w PBS i płukać go PBS co kilka minut, aby utrzymać odpowiednie nawilżenie.Teraz, pod mikroskopem, przytrzymaj macicę w taki sposób, aby widoczne były komory mózgu. Nie przesuwaj nadmiernie zarodka, który znajduje się w niekorzystnej pozycji. Zwiększa to jedynie ryzyko poronienia.Obejrzyj głowę zarodka od góry, aby zlokalizować szczelinę oddzielającą lewą i prawą półkulę kory mózgowej. Półkule są łatwe do rozróżnienia, a znajdujące się w nich boczne komory mózgu są zazwyczaj widoczne jako nieco ciemniejsze kształty. Jeśli zarodek jest idealnie zorientowany do wstrzyknięcia DNA, możliwe jest jednoczesne przebicie ściany macicy i wprowadzenie igły do komory trzeciej.Trzymaj szklaną mikropipetę z wcześniej przygotowanym DNA pod kątem 45 stopni do ściany macicy i nakłuj ją w przedniej części szczeliny między półkulami, penetrując na głębokość około 1 mm. W ten sposób końcówka szklanej mikropipety dostanie się do trzeciej komory mózgu, a nie do komory bocznej. Następnie wstrzyknij około 1 µL roztworu DNA do trzeciej komory; w przypadku prawidłowej iniekcji zielony płyn wypełni komorę. Powtórz tę procedurę we wszystkich embrionach w tym samym rogu macicy.Pozwoli to na równomierne wymieszanie się roztworu DNA z płynem komorowym i dotarcie go do całego neuroepitelium. Teraz włącz elektroporator i dostosuj ustawienia zgodnie z wiekiem embrionalnym. Jako biegun dodatni wykorzystaj igłową elektrodę ze stali nierdzewnej, a jako biegun ujemny elektrodę okrągłą i płaską; do elektroporacji wybierz embriony ułożone grzbietem do góry.Następnie przebij ścianę macicy obok głowy zarodka, pomiędzy pęcherzykiem owodniowym a łożyskiem, wbijając końcówkę elektrody igłowej w dół. Jako blok oporowy należy wykorzystać palec wskazujący drugiej ręki. Około pięciu milimetrów końcówki elektrody powinno znajdować się między pęcherzykiem owodniowym a ścianą macicy, mniej więcej na poziomie śródmózgowia.Ponieważ jest to elektroda celująca, jej położenie określi, która część neuroepitelium podwzgórza zostanie najprawdopodobniej poddana transfekcji. Następnie, drugą ręką umieść okrągłą płaską elektrodę na zewnątrz ściany macicy, po przeciwnej stronie głowy zarodka. Po tym delikatnie ściśnij zarodek pomiędzy elektrodami.Użyj przełącznika nożnego, aby przyłożyć napięcie. Następnie powoli wyciągnij elektrodę igłową z macicy, przytrzymując macicę palcem wskazującym drugiej ręki. Jeśli przez przebitą ścianę wycieknie płyn owodniowy, zazwyczaj dojdzie do aborcji zarodka.Po wstrzyknięciu i elektroporacji wszystkich embrionów, bardzo ostrożnie umieść macicę z powrotem w jamie brzusznej myszy, pozycjonując ją dokładnie tak, jak znajdowała się przed zabiegiem. Następnie, przed zamknięciem jamy brzusznej, zwilż jamę otrzewnową roztworem soli fizjologicznej. Zaszyj otrzewną chirurgicznym katgutem, a następnie zszyj skórę bardziej wytrzymałą nicią chirurgiczną.Zdezynfekuj powierzchnię brzucha roztworem jodu i wstrzyknij podskórnie niesteroidowy lek przeciwzapalny w celu uśmierzenia bólu. Następnie zdejmij matkę z aparatu do znieczulania i umieść ją w klatce ogrzewanej za pomocą mata grzewczego. Monitoruj mysz do czasu całkowitego wybudzenia z narkozy i sprawdzaj jej stan codziennie, aby upewnić się, że rekonwalescencja po zabiegu przebiega bez oznak infekcji lub bólu.Na tym etapie należy pobrać zarodki lub zwierzęta postnatalne zgodnie z wybranym dniem analizy. Należy wyselekcjonować zarodki, w które wstrzyknięto DNA i poddano elektroporacji, a następnie wypreparować mózgi pod tym stereomikroskopem. Następnie należy sprawdzić obecność zielonego sygnału fluorescencyjnego w odpowiednim obszarze.Aby przeanalizować mózg wybranego zarodka, utrwal tkankę przez krótki czas w 4%paraldehyde. Następnie zatop ją w aros 4% lub w żelatynie albuminowej. Potem wykonaj przekroje mózgu na vibrato.Ryciny te przedstawiają podwzgórze po transfekcji wewnątrzmacicznej DNA plazmidowego niosącego fluorescencyjne geny reporterowe, GFP lub CFP, w dniu E 12.5. Jest to przekrój strzałkowy ukazujący podwzgórze przetransfekowane od strony rostralnej do kaudalnej, a tutaj znajduje się przekrój poprzeczny z oznakowanymi komórkami na różnych poziomach wzdłuż osi przyśrodkowo-bocznej. Ten przekrój strzałkowy pokazuje specyficznie przetransfekowane ciało suteczkowate oraz oznakowanie jego charakterystycznego drzewa aksonalnego, a po stronie elektrody tego przekroju poprzecznego widoczny jest oznakowany pas odpowiadający neuronom powstałym w dniu E 12.5.W celu dokładniejszej analizy przekrojów przygotowano sekcje poziome równoległe do płaszczyzny wyrostków gleju radialnego wychodzących z recesusu suteczkowatego. Neurony ambi O, powstałe z neuroepithelium przetransfekowanego w dniu E 12.5, zidentyfikowano w dniu E 18.5 za pomocą przeciwciał przeciwko GFP.W tym przykładzie przeciwciało oznakowało ograniczoną grupę komórek MBO. Grupa ta znajdowała się pomiędzy dwoma nieoznakowanymi obszarami MBO, bocznym i przyśrodkowym, odpowiadającymi neuronom MBO powstałym przed i po E 12.5, oraz współbarwieniem przeciwciałem przeciwko nestonowi. Kolor czerwony pokazuje sposób migracji pojedynczo oznakowanych neuronów wzdłuż wypustek gleju radialnego neuroepithelium. Po opanowaniu technika ta może zostać wykonana w 30 minut, jeśli jest przeprowadzona prawidłowo.Po obejrzeniu tego filmu powinni Państwo posiadać dobrą wiedzę na temat tego, jak wstrzyknąć DNA do trzeciej komory oraz jak ustawić igłę jako elektrodę dodatnią pomiędzy embrionem, głową a łożyskiem, aby skutecznie skierować działanie na podwzgórze. Po przeprowadzeniu tej procedury można zastosować inne metody, takie jak immunohistochemia lub hybrydyzacja in situ, w celu udzielenia odpowiedzi na dodatkowe pytania dotyczące fenotypu transfekowanych neuronów.

genetic-manipulation-mouse-developing-hypothalamus-through-utero

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Neuronauka

Manipulacja genetyczna rozwijającego się podwzgórza myszy poprzez In utero elektroporację

In-utero in-vivo iniekcja i elektroporacja zarodkowego neokortyksu myszy stanowią potężne narzędzie do manipulacji pojedynczymi komórkami progenitorowymi ...

Wewnątrzkomorowe wstrzyknięcie i elektroporacja in utero embrionów myszy w 15. dniu rozwoju (E15)

W niniejszej pracy przedstawiamy dwie techniki manipulowania ekspresją genów w komórkach zwojowych siatkówki (RGCs) myszy za pomocą elektroporacji in utero oraz ex vivo. Techniki te pozwalają badać, w jaki sposób zmiany w ekspresji genów wpływają na rozwój RGCs, prowadzenie aksonów oraz właściwości funkcjonalne.

Elektroporacja in utero oraz ex vivo w celu ekspresji genów w komórkach zwojowych siatkówki myszy

In utero elektroporacja umożliwia szybkie dostarczanie genów w sposób kontrolowany przestrzennie i czasowo do rozwijającego się ośrodkowego układu nerwowego (OUN). W niniejszej pracy opisujemy wysoce adaptowalny protokół elektroporacji in utero, który może być wykorzystany do dostarczania konstruktów ekspresyjnych do wielu embrionalnych domen OUN, w tym do telencefalonu, diencefalonu i siatkówki.

Efektywne dostarczanie genów do wielu obszarów OUN z wykorzystaniem elektroporacji in utero

Opisano metodę transferu genów do rozwijającego się mózgu myszy z wykorzystaniem unikalnej metody chirurgicznej oraz specjalnego kształtu elektrod. Ta wyjątkowa technika umożliwia czasową i przestrzenną transfekcję plazmidowego DNA, co pomoże wielu neuronaukowcom w badaniu rozwoju mózgu.

Elektroporacja myszy in utero: kontrolowana spatiotemporalna transfekcja genów

Niniejsza praca opisuje opracowanie techniki elektroporacji in vitro, która umożliwia manipulację ekspresją genów w dolnej części wargi rombowej embrionów w połowie okresu gestacji.

In vitro elektroporacja dolnej wargi rombowej zarodków myszy w połowie okresu gestacji

Niniejszy artykuł szczegółowo opisuje protokół elektroporacji in utero kory mózgowia oraz hipokampa u myszy w stadium E14.5. Wykazujemy również, że jest to cenna metoda badania dendrytów i kolców dendrytycznych w tych dwóch obszarach mózgu.

Wizualizacja i manipulacja genetyczna dendrytów i kolców w korze mózgu i hipokampie myszy z wykorzystaniem elektroporacji in utero

Tutaj prezentujemy protokół dostarczający narzędzie do badania mechanizmów regulacyjnych określonych genów podczas rozwoju hipokampa. Zastosowanie elektroporacji ex utero i organotypowej hodowli plastrów pozwala na regulację w górę i w dół ekspresji interesujących genów w pojedynczych komórkach i śledzenie ich losów podczas rozwoju.

Ex Utero Elektroporacja i organotypowa hodowla warstwowa tkanki hipokampa myszy

Ten protokół opisuje szczegółowo, jak specyficznie transfekować różne regiony w ośrodkowym układzie nerwowym C57BL/6 za pomocą elektroporacji in utero. W tym protokole zawarte są szczegółowe instrukcje dotyczące transfekcji regionów, które rozwijają się w korę, hipokamp, wzgórze, podwzgórze, jądro przegrody bocznej i prążkowie.

Kora mózgowa, hipokamp, wzgórze, podwzgórze, jądro przegrody bocznej i jądro prążkowia specyficzne dla macicy elektroporacja u myszy C57BL/6

Rola niedawno odkrytych genów związanych z chorobą w patogenezie zaburzeń neuropsychiatrycznych pozostaje niejasna. Zmodyfikowana technika obustronnej elektroporacji in utero pozwala na transfer genów w dużych populacjach neuronów i badanie przyczynowego wpływu zmian ekspresji genów na zachowania społeczne.

Rurociąg wykorzystujący obustronną elektroporację in utero do badania wpływów genetycznych na zachowanie gryzoni

W tym protokole opisujemy, jak wstrzyknąć lentiwirusowi do mysiej jamy owodniowej w E7.5, prowadząc do jednolitej transdukcji całej płytki nerwowej, przy minimalnym szkodliwym wpływie na przeżycie lub rozwój embrionalny.

Celowanie w mysią płytkę nerwową za pomocą nanoiniekcji in utero (NEPTUNE) w 7. dniu embrionalnym

Poznaj metodę elektroporacji in utero do manipulacji genami w podwzgórzu myszy. Technika ta umożliwia transfekcję DNA w embrionach, aktywację lub represję funkcji genów oraz badanie rozwoju neuronalnego in vivo.

Manipulacja genetyczna myszy rozwijającej podwzgórze poprzez elektroporację in utero

Przeglądaj więcej filmów