Name: Mikromanipulacja ekspresją genów w mózgu dorosłego danio pręgowanego za pomocą mikroiniekcji oligonukleotydów morfolino do komory mózgowej (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-05-23T17:00:00.000+00:00
Duration: 5 min 48 s
Description: Poznaj mikroiniekcję oligonukleotydów morfolino do komory mózgowej danio pręgowanego w celu manipulacji ekspresją genów w komórkach radialnych glejowych. Ta metoda umożliwia szybkie i efektywne badanie funkcji genów w mózgu dorosłego kręgowca.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Ta praca była wspierana przez Deutsche Forschungsgemeinschaft (SFB 655) i Unię Europejską (Zf-Health).

1. Przygotowanie mieszaniny iniekcyjnej
<ol>
	<li>Używaj morfolinosów vivo, ponieważ komórki internalizują je skuteczniej niż normalne cząsteczki morfolino. Szczegółowe informacje można znaleźć w informacjach producenta (Tabela 1: Odczynniki i materiały).</li>
	<li>Użyj fluorescencyjnego barwnika śledzącego (np. CellTracker Red CMTPX, Invitrogen), aby zobrazować dokładność wstrzyknięcia. Barwnik ten jest metabolizowany w komórce i staje się fluorescencyjny dopiero w komórce po wychwycie. Dlatego ten krok ma kluczowe znaczenie dla określenia komórek, które są skutecznie celem mikroiniekcji komory mózgowej.</li>
	<li>Przygotować sól fizjologiczną buforowaną fosforanami (PBS) (137 mM NaCl, 2,7 mM KCl, 10mM Na2HPO4, 2 mM KH2PO4, pH: 7.4) do rozcieńczenia roztworu morfoliny. Jeśli wymagane jest rozcieńczenie roztworu morfolino, należy zawsze użyć PBS.</li>
	<li>Przygotować 10 μl mieszanki do wstrzykiwań, dodając 9 μl roztworu morfoliny i 1 μl barwnika do śledzenia komórek (rozcieńczonego lub nierozcieńczonego. Stężenie podstawowe roztworu morfolino wynosi 500 μM. Nasze poprzednie wyniki 22 wskazują, że kilka różnych dawek morfolinu - od 50 μM do 500 μM - powoduje różne poziomy knockdownu od skutecznego knockdownu do hipomorficznych fenotypów). 1 μl roztworu wystarcza do wstrzyknięcia do jednego mózgu danio pręgowanego.</li>
	<li>Dobrze wymieszać i przechowywać w temperaturze pokojowej do momentu wstrzyknięcia.</li>
</ol>
2. Przygotowanie aparatu do iniekcji
<ol>
	<li>Przygotować szklane kapilary iniekcyjne za pomocą ściągacza igłowego. Użyj następujących parametrów: wartość cyklu grzania: 463, wartość cyklu ciągnięcia: 230, prędkość: 1,5 s, czas: 75 ms.</li>
	<li>Włącz źródło ciśnienia i dostosuj ustawienia ciśnienia do 50 psi lub 3.5 bara.</li>
	<li>Dostosuj ustawienia mikrowtryskiwacza w następujący sposób: ciśnienie podtrzymania 20 psi, ciśnienie wyrzutu 10 psi, wartość okresu 2.5 i zakres bramkowania 100 ms.</li>
	<li>Włącz oświetlacz pierścieniowy i umieść pierścień nad stolikiem mikroskopu.</li>
	<li>Umieść uchwyt kapilarny w odpowiedniej pozycji obok mikroskopu.</li>
	<li>Włóż szklaną kapilarnę do uchwytu. Ustaw kąt wtrysku na 45 stopni.</li>
	<li>Oderwij końcówkę szklanej kapilary za pomocą kleszczyków z drobnym końcem i skalibruj ciśnienie wyjściowe z kryzy. Należy to sprawdzić, zanurzając końcówkę igły w wodzie dla ryb i podając ciągły impuls ciśnienia. Powstające pęcherzyki powietrza powinny znajdować się tylko w jednym rzędzie, co wskazuje na optymalne ciśnienie/rozmiar otworu. Zapoznaj się z filmem, aby zademonstrować tę kalibrację.</li>
	<li>Napełnić szklaną kapilarnę roztworem do wstrzykiwań, nie zatrzymując pęcherzyków powietrza.</li>
	<li>Zastosować ciśnienie, aby usunąć powietrze między końcówką szklanej kapilary a załadowanym roztworem iniekcyjnym.</li>
</ol>
3. Znieczulenie
<ol>
	<li>Przygotować roztwór podstawowy środków znieczulających (0,1% MESAB - metanosulfonian etylo-m-aminobenzoesanu).</li>
	<li>Usuń żądaną liczbę ryb z ich zbiorników do plastikowych klatek na myszy lub innego pojemnika transportowego z wystarczającą ilością wody.</li>
	<li>Przygotuj roztwór znieczulający w małym plastikowym pudełku, mieszając 200 ml wody rybnej z 5 ml roztworu podstawowego środka znieczulającego. Końcowe stężenie środków znieczulających: 0,0025% (v/v).</li>
	<li>Napełnij do połowy plastikową szalkę Petriego środkami znieczulającymi. Używaj tego naczynia do wstrzykiwań.</li>
	<li>Inkubuj rybę w środkach znieczulających, aż ryba się ujarzmi.</li>
</ol>
4. Nacięcie i mikroiniekcja komorowa mózgu
<ol>
	<li>Wyjmij rybę z pudełka za pomocą siatki na ryby i umieść ją na szalce Petriego.</li>
	<li>Delikatnie chwyć rybę kleszczami i ustaw głowę w taki sposób, aby lekko przechyliła się w dół. Ułatwi to nacięcie.</li>
	<li>Wygeneruj małą szczelinę na czaszce za pomocą igły z zadziorowym końcem o rozmiarze 30. Używaj tylko końcówki igły i nie wnikaj w głąb mózgu więcej niż wystarczająco, ponieważ spowoduje to uszkodzenie tkanki mózgowej i objawi się krwawieniem.</li>
	<li>Trzymaj rybę i włóż końcówkę szklanej kapilary przez miejsce nacięcia.</li>
	<li>Skieruj końcówkę szklanej kapilary w stronę kresomózgowia. Należy unikać dotykania tkanki mózgowej, ponieważ powoduje to uszkodzenie tkanki, a także zapobiega dyspersji wstrzykniętego roztworu.</li>
	<li>Wstrzyknąć roztwór. Ciecz rozprasza się natychmiast po wstrzyknięciu.</li>
</ol>
5. Odzyskiwanie i analiza dokładności wtrysku
<ol>
	<li>Wyjąć rybę z zestawu do wstrzykiwań i umieścić w plastikowym pudełku ze świeżą wodą dla ryb.</li>
	<li>Zezwalaj na odzyskiwanie.</li>
	<li>Ponownie znieczulić rybę 0,0025% MESAB na krótko i sprawdzić rybę pod mikroskopem fluorescencyjnym. Dokładna dyspersja czerwonej fluorescencji wskazuje na szerokie rozprowadzenie wstrzykiwanej cieczy.</li>
	<li>Włóż rybę z powrotem do plastikowego pudełka.</li>
	<li>Podłącz plastikowe pudełko do systemu cyrkulacji, aby natlenić ryby i utrzymać je przez dłuższy czas.</li>
	<li>Wykorzystać ryby do pożądanych celów, takich jak analizy behawioralne lub uśmiercać zwierzęta w pożądanych punktach czasowych po wstrzyknięciu, aby przygotować próbki tkanek do dalszych analiz (barwienia histologiczne, immunohistochemia itp.). Poniższe referencje podają przykłady analizowania mózgu dorosłego danio pręgowanego: 9,11,17-20,24-27. Najszybszy czas zaobserwowania skutecznego knockdownu (ponad 50% knockdown) wynosił 12 godzin w naszych badaniach 22.</li>
</ol>
6. Sugerowane kontrole naukowe
<ol>
	<li>Użyj cząsteczki morfoliny niedopasowanej, która nie powinna powodować żadnego fenotypu, jako kontroli negatywnej. Użyj standardowej cząsteczki morpholino lub specjalnie zaprojektuj kontrolę morpholino dla każdego genu będącego przedmiotem zainteresowania. Dodatkowo należy użyć rozpuszczalnika (w tym przypadku PBS) jako dalszej kontroli ujemnej w celu oceny niespecyficznych skutków lub toksyczności wstrzyknięć morfolino w niedopasowaniu/kontroli.</li>
	<li>Stosować morfoliny PCNA opisane wcześniej 22 jako kontrole pozytywne. Morfolino ta powoduje skuteczne knockdown w mózgu dorosłego danio pręgowanego (75-95% skuteczności knockdown w ciągu 1 dnia od wstrzyknięcia) 22.</li>
</ol>

<ol><li>Stocum, D. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aStocum%2C+D+%22Regenerative+Biology+and+Medicine%22">Regenerative Biology and Medicine</a>. , Academic Press. London. (2006).</li>
<li>Poss, K. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Advances+in+understanding+tissue+regenerative+capacity+and+mechanisms+in+animals%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Rev.+Genet%22%5BJournal%5D)">Advances in understanding tissue regenerative capacity and mechanisms in animals.</a> Nat. Rev. Genet. 11 (10), 710-722 (2010).</li>
<li>Doetsch, F., Scharff, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Challenges+for+brain+repair%3A+insights+from+adult+neurogenesis+in+birds+and+mammals%5BTitle%5D)+AND+%22Brain+Behav.+Evol%22%5BJournal%5D)">Challenges for brain repair: insights from adult neurogenesis in birds and mammals.</a> Brain Behav. Evol. 58 (5), 306-322 (2001).</li>
<li>Kaslin, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Proliferation%2C+neurogenesis+and+regeneration+in+the+non-mammalian+vertebrate+brain%5BTitle%5D)+AND+%22Philos.+Trans.+R.+Soc.+Lond.+B.+Biol.+Sci%22%5BJournal%5D)">Proliferation, neurogenesis and regeneration in the non-mammalian vertebrate brain.</a> Philos. Trans. R. Soc. Lond. B. Biol. Sci. 363 (1489), 101-122 (2008).</li>
<li>Kizil, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Adult+neurogenesis+and+brain+regeneration+in+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22Dev.+Neurobiol%22%5BJournal%5D)">Adult neurogenesis and brain regeneration in zebrafish.</a> Dev. Neurobiol. 72 (3), 429-461 (2012).</li>
<li>Grandel, H., Brand, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparative+aspects+of+adult+neural+stem+cell+activity+in+vertebrates%5BTitle%5D)+AND+%22Dev.+Genes+Evol%22%5BJournal%5D)">Comparative aspects of adult neural stem cell activity in vertebrates.</a> Dev. Genes Evol. , In Press (2013).</li>
<li>Kempermann, G. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aKempermann%2C+G+%22Adult+Neurogenesis+2%3A+Stem+Cells+and+Neuronal+Development+in+the+Adult+Brain%22">Adult Neurogenesis 2: Stem Cells and Neuronal Development in the Adult Brain</a>. , 2nd Edition, Oxford University Press. Oxford. (2010).</li>
<li>Ihrie, R. A., Alvarez-Buylla, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cells+in+the+astroglial+lineage+are+neural+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Tissue+Res%22%5BJournal%5D)">Cells in the astroglial lineage are neural stem cells.</a> Cell Tissue Res. 331 (1), 179-191 (2008).</li>
<li>Grandel, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neural+stem+cells+and+neurogenesis+in+the+adult+zebrafish+brain%3A+origin%2C+proliferation+dynamics%2C+migration+and+cell%5BTitle%5D)+AND+%22%22%5BJournal%5D)">Neural stem cells and neurogenesis in the adult zebrafish brain: origin, proliferation dynamics, migration and cell.</a> 295 (1), 263-277 (2006).</li>
<li>Chapouton, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Adult+neurogenesis+in+non-mammalian+vertebrates%5BTitle%5D)+AND+%22Bioessays%22%5BJournal%5D)">Adult neurogenesis in non-mammalian vertebrates.</a> Bioessays. 29 (8), 745-757 (2007).</li>
<li>Adolf, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Conserved+and+acquired+features+of+adult+neurogenesis+in+the+zebrafish+telencephalon%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Biol%22%5BJournal%5D)">Conserved and acquired features of adult neurogenesis in the zebrafish telencephalon.</a> Dev Biol. 295 (1), 278-293 (2006).</li>
<li>Byrd, C. A., Brunjes, P. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neurogenesis+in+the+olfactory+bulb+of+adult+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Neurogenesis in the olfactory bulb of adult zebrafish.</a> Neuroscience. 105 (4), 793-801 (2001).</li>
<li>Pellegrini, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+aromatase-positive+radial+glial+cells+as+progenitor+cells+in+the+ventricular+layer+of+the+forebrain+in+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Comp.+Neurol%22%5BJournal%5D)">Identification of aromatase-positive radial glial cells as progenitor cells in the ventricular layer of the forebrain in zebrafish.</a> J. Comp. Neurol. 501 (1), 150-167 (2007).</li>
<li>Lam, C. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((gfap+and+nestin+reporter+lines+reveal+characteristics+of+neural+progenitors+in+the+adult+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22%22%5BJournal%5D)">gfap and nestin reporter lines reveal characteristics of neural progenitors in the adult zebrafish.</a> 238 (2), 475-486 (2009).</li>
<li>Wang, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+Wnt-responsive+cells+in+the+zebrafish+hypothalamus%5BTitle%5D)+AND+%22Zebrafish%22%5BJournal%5D)">Identification of Wnt-responsive cells in the zebrafish hypothalamus.</a> Zebrafish. 6 (1), 49-58 (2009).</li>
<li>Kaslin, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stem+cells+in+the+adult+zebrafish+cerebellum%3A+initiation+and+maintenance+of+a+novel+stem+cell+niche%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Stem cells in the adult zebrafish cerebellum: initiation and maintenance of a novel stem cell niche.</a> J. Neurosci. 29 (19), 6142-6153 (2009).</li>
<li>Ganz, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Heterogeneity+and+Fgf+dependence+of+adult+neural+progenitors+in+the+zebrafish+telencephalon%5BTitle%5D)+AND+%22Glia%22%5BJournal%5D)">Heterogeneity and Fgf dependence of adult neural progenitors in the zebrafish telencephalon.</a> Glia. 58 (11), 1345-1363 (2010).</li>
<li>März, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Heterogeneity+in+progenitor+cell+subtypes+in+the+ventricular+zone+of+the+zebrafish+adult+telencephalon%5BTitle%5D)+AND+%22Glia%22%5BJournal%5D)">Heterogeneity in progenitor cell subtypes in the ventricular zone of the zebrafish adult telencephalon.</a> Glia. 58 (7), 870-888 (2010).</li>
<li>Rothenaigner, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Clonal+analysis+by+distinct+viral+vectors+identifies+bona+fide+neural+stem+cells+in+the+adult+zebrafish+telencephalon+and+characterizes+their+division+properties+and+fate%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Clonal analysis by distinct viral vectors identifies bona fide neural stem cells in the adult zebrafish telencephalon and characterizes their division properties and fate.</a> Development. 138 (8), 1459-1469 (2011).</li>
<li>Kroehne, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regeneration+of+the+adult+zebrafish+brain+from+neurogenic+radial+glia-type+progenitors%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Regeneration of the adult zebrafish brain from neurogenic radial glia-type progenitors.</a> Development. 138 (22), 4831-4841 (2011).</li>
<li>Ito, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+of+neural+stem+cells+and+their+progeny+in+the+adult+zebrafish+optic+tectum%5BTitle%5D)+AND+%22Dev.+Biol%22%5BJournal%5D)">Characterization of neural stem cells and their progeny in the adult zebrafish optic tectum.</a> Dev. Biol. 342 (1), 26-38 (2010).</li>
<li>Kizil, C., Brand, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cerebroventricular+microinjection+%28CVMI%29+into+adult+zebrafish+brain+is+an+efficient+misexpression+method+for+forebrain+ventricular+cells%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Cerebroventricular microinjection (CVMI) into adult zebrafish brain is an efficient misexpression method for forebrain ventricular cells.</a> PLoS One. 6 (11), e27395(2011).</li>
<li>Morcos, P. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Vivo-Morpholinos%3A+a+non-peptide+transporter+delivers+Morpholinos+into+a+wide+array+of+mouse+tissues%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechniques%22%5BJournal%5D)">Vivo-Morpholinos: a non-peptide transporter delivers Morpholinos into a wide array of mouse tissues.</a> Biotechniques. 45 (6), 613-614 (2008).</li>
<li>Kizil, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+chemokine+receptor+cxcr5+regulates+the+regenerative+neurogenesis+response+in+the+adult+zebrafish+brain%5BTitle%5D)+AND+%22Neural+Dev%22%5BJournal%5D)">The chemokine receptor cxcr5 regulates the regenerative neurogenesis response in the adult zebrafish brain.</a> Neural Dev. 7, 27(2012).</li>
<li>Chapouton, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((her5+expression+reveals+a+pool+of+neural+stem+cells+in+the+adult+zebrafish+midbrain%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">her5 expression reveals a pool of neural stem cells in the adult zebrafish midbrain.</a> Development. 133 (21), 4293-4303 (2006).</li>
<li>Kizil, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regenerative+neurogenesis+from+neural+progenitor+cells+requires+injury-induced+expression+of+Gata3%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+Cell%22%5BJournal%5D)">Regenerative neurogenesis from neural progenitor cells requires injury-induced expression of Gata3.</a> Developmental Cell. 23 (6), 1230-1237 (2012).</li>
<li>Kyritsis, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Acute+inflammation+initiates+the+regenerative+response+in+the+adult+zebrafish+brain%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Acute inflammation initiates the regenerative response in the adult zebrafish brain.</a> Science. 338 (6112), 1353-1356 (2012).</li>
<li>Rosen, J. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microinjection+of+zebrafish+embryos+to+analyze+gene+function%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis.+Exp%22%5BJournal%5D)">Microinjection of zebrafish embryos to analyze gene function.</a> J. Vis. Exp. (25), e1115(2009).</li>
<li>Yuan, S., Sun, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microinjection+of+mRNA+and+morpholino+antisense+oligonucleotides+in+zebrafish+embryos%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis.+Exp%22%5BJournal%5D)">Microinjection of mRNA and morpholino antisense oligonucleotides in zebrafish embryos.</a> J. Vis. Exp. (27), e1113(2009).</li>
<li>Rikin, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+reverse+genetic+approach+to+test+functional+redundancy+during+embryogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis.+Exp%22%5BJournal%5D)">A reverse genetic approach to test functional redundancy during embryogenesis.</a> J. Vis. Exp. (42), e2020(2010).</li>
</ol>

Firma Gene Tools, LLC ufundowała dodatkowe opłaty za publikację tego artykułu w otwartym dostępie.

Metoda, którą tutaj opisujemy, pozwala na łatwe i szybkie podanie morfolinosów do mózgu dorosłego danio pręgowanego. Wykazaliśmy, że nasza metoda iniekcji skutecznie blokuje ekspresję genów w komórkach komór i powoduje funkcjonalne konsekwencje w odpowiedzi neurogenezy.
Istnieją ważne punkty, na które należy zachować ostrożność podczas wykonywania mikroiniekcji komorowej mózgu. Na przykład działanie cząsteczek morfolino zależy od zastosowanego stężenia. Stężenie to musi zostać określone przez użytkownika końcowego. Zalecamy rozpoczęcie od roztworu podstawowego (500 μM) i wykonywanie seryjnych rozcieńczeń, a najlepiej wstępne badanie przez wstrzyknięcie do zarodków przy użyciu standardowych protokołów wstrzyknięcia zarodków 28-30. Wcześniej uzyskaliśmy różne poziomy skuteczności wybijania przy stężeniach morfolinosów w zakresie od 50 μM do 500 μM 22. Po drugie, otwór szklanej kapilary nie powinien być duży, ponieważ doprowadzi to do rozległego napływu płynu do mózgu po wstrzyknięciu. Podobnie, otwór nie może być zbyt wąski, ponieważ uniemożliwi to odpowiednie wstrzyknięcie. Optymalna kombinacja kryzy i ciśnienia można określić, pompując powietrze do szalki Petriego z wodą. Powstające bąbelki powinny znajdować się w jednym rzędzie, ale nie w wielu rzędach. Pokazujemy to na filmie. Po trzecie, inkubacja ryb w środkach znieczulających ma kluczowe znaczenie. Ryba nie powinna być trzymana dłużej niż 2 minuty w środkach znieczulających. Utrudni to tempo rekonwalescencji po wstrzyknięciu. Po czwarte, lokalizacja nacięcia ma kluczowe znaczenie dla dokładnego rozproszenia wstrzykniętej cieczy. Obszar komorowy nad tektum nerwu wzrokowego jest większy powyżej linii środkowej i zwęża się bocznie. Dlatego eksperymentator powinien wygenerować szczelinę w czaszce w pobliżu linii środkowej i tylko doogonowo do płytki czaszki pokrywającej obszar kresomózgowia.
Jedną z zalet metody iniekcji komorowej mózgu (CVMI) jest jej szybkość. CVMI to szybka metoda oznaczania funkcji genów. Ta cecha jest ważna i przydatna w porównaniu z generowaniem linii transgenicznych do badań funkcjonalnych, które zwykle trwają kilka miesięcy. Dodatkowo, CVMI prowadzi do równomiernego rozprowadzenia wstrzykiwanej cieczy, a zatem zapewnia stosunkowo dokładną manipulację aktywnością genu w porównaniu z iniekcjami ogniskowymi lub elektroporacją. Dzięki CVMI wiele genów może być jednocześnie obalonych poprzez przygotowanie mieszanek iniekcyjnych zawierających wiele oligonukleotydów morfolinowych. CVMI może być używany do wstrzykiwania różnych stężeń danych oligonukleotydów morfolino, a zatem może być używany do analizy fenotypów hipomorficznych. Wreszcie, ten paradygmat wstrzykiwania nie powoduje toksyczności ani nie zagraża przetrwaniu zwierząt.
Technika CVMI może zostać rozszerzona na inne rodzaje badań, takie jak wstrzykiwanie peptydów modulujących, leków, plazmidowego DNA lub modulujących cząsteczek RNA lub innych substancji, które mogą wpływać na fizjologię komórek. Oznaczanie kombinacji cząsteczek i przeprowadzanie analiz dawka-odpowiedź jest możliwe przy użyciu naszej metody, co pozwala na badanie fenotypów hipomorficznych. Dzięki tym właściwościom CVMI okazuje się być szybkim i łatwym testem do badań ekspresji w mózgu dorosłego danio pręgowanego i otwiera szybkie badania przesiewowe i analizy funkcjonalne.
Mózg dorosłego danio pręgowanego może konstytutywnie wytwarzać nowe neurony wzdłuż całej osi ogonowej, a także może się regenerować po urazach. Jest to wyraźny kontrast z mózgami ssaków z ograniczoną neurogenezą i jeśli w ogóle, raczej słabą zdolnością regeneracyjną. Tak powszechna aktywność komórek macierzystych i zdolność do rekonwalescencji sprawiają, że danio pręgowany jest użytecznym organizmem modelowym do zrozumienia programów molekularnych wymaganych do regeneracji ośrodkowego układu nerwowego, które są obecnie w dużej mierze nieznane. Dlatego badanie molekularnych podstaw zdolności regeneracyjnych mózgu danio pręgowanego jest interesującą dziedziną badań, która może wyjaśnić fundamentalną różnicę, w jaki mózgi ryb i ssaków reagują po urazie, a także otworzyć drogę do regeneracyjnych terapii medycznych u ludzi. Aby zrozumieć molekularną infrastrukturę plastyczności i regeneracji mózgu kręgowców, komórki glejowe służą jako ważny obszar badawczy, ponieważ są neurogennymi prekursorami 3,8,20. Tak więc zastosowanie techniki CVMI do zmiany funkcji genów w promieniowych komórkach glejowych mózgu danio pręgowanego ma zasadnicze znaczenie dla wyjaśnienia, w jaki sposób mózg ryb może łączyć aktywność progenitorów z wydajną neurogenezą i reakcją regeneracyjną u dorosłych. Niedawno wykazaliśmy udział i zapotrzebowanie kilku czynników i szlaków sygnałowych w regeneracyjną odpowiedź neurogenezy mózgu dorosłego danio pręgowanego 24,26,27, a badania te były możliwe dzięki zastosowaniu metody CVMI. Ogólnie rzecz biorąc, wiedza, którą uzyskamy z mózgu danio pręgowanego, może zostać wykorzystana do narzucenia zdolności regeneracyjnych komórkom glejowym ssaków, które reagują na urazy, a tym samym pomoże w projektowaniu terapii klinicznych zaburzeń neurologicznych i ostrych urazów u ludzi.

Neurogeneza u dorosłych jest cechą typową dla kręgowców, jednak jej stopień rozpowszechnienia i skuteczności różni się w zależności od filogenezy 1,2,3,4,5,6. Na przykład mózgi dorosłych ssaków zawierają obszary komórek macierzystych w dużej mierze ograniczone do przodomózgowia 7,8, podczas gdy danio pręgowany teleost zawiera szesnaście różnych domen komórek macierzystych i związanych z nimi stref neurogennych w całym mózgu 4,5,9,10. Ta różnica między ssakami a danio pręgowanymi może odzwierciedlać rozbieżność w mechanizmach utrzymania komórek macierzystych i zdolności neurogennych komórek progenitorowych. Trwająca całe życie zdolność danio pręgowanego do wytwarzania neuronów w mózgu może również mieć konsekwencje kliniczne, ponieważ mechanizmy molekularne wykorzystywane w mózgu danio pręgowanego mogą zostać wykorzystane do zastosowań terapeutycznych w walce z zaburzeniami neurodegeneracyjnymi u ludzi.
Przeanalizowano kilka stref komórek macierzystych mózgu dorosłego danio pręgowanego i wykazano, że komórki wyściełające powierzchnię komór tych regionów służą jako komórki progenitorowe 9,11-20. Szczegółowe analizy w kresomózgowiu danio pręgowanego, na przykład, zidentyfikowały promieniste komórki glejowe, które wyznaczają powierzchnię komorową tego obszaru mózgu, jako neurogenne komórki progenitorowe 19, 20. Dotyczy to również innych regionów, takich jak móżdżek i tektum nerwu wzrokowego, gdzie komórki neuroepitelistyczne zlokalizowane w komorach dostarczają bodźca neurogennego 16,21. W tym celu zrozumienie mechanizmów molekularnych rządzących powszechną kompetencją neurogenną w mózgu dorosłego danio pręgowanego wymaga manipulacji ekspresją genów w komórkach progenitorowych.
Wcześniej opisano różne metody modulowania funkcji genów u danio pręgowanego. Obejmują one generowanie warunkowych linii transgenicznych wyrażających pożądane warianty pojedynczego białka, iniekcje ogniskowe oparte na plazmidzie sprzężone z elektroporacją lub zabiegami chemicznymi. Wcześniej opracowaliśmy metodę podawania różnych substancji, w tym oligonukleotydów morfolinooligonukleotydów lub białek, do mózgu dorosłego danio pręgowanego za pomocą mikroiniekcji mózgowo-komorowej jako szybkiego i skutecznego sposobu modulowania funkcji genów w komórkach komorowych przodomózgowia dorosłego danio pręgowanego 22. W naszych badaniach morpholinos vivo zostały użyte ze względu na ich chemię obejmującą cząsteczkę morpholino kowalencyjnie połączoną z peptydami dostarczającymi bogatymi w argininę, które umożliwiają skuteczne dostarczanie do komórek będących przedmiotem zainteresowania bez konieczności dodatkowej przepuszczalności, takiej jak elektroporacja 23. Pozwoliłoby to na dokładne ukierunkowanie pożądanej tkanki po wstrzyknięciu, tak jak to zaobserwowaliśmy u dorosłego danio pręgowanego telencephalon 22. Stosowanie morfolinosów in vivo jest zatem lepsze od już istniejących metod celowania w tkanki, takich jak elektroporacja lub ogniskowa iniekcja cząsteczek DNA.
Tutaj pokazujemy wizualnie, jak wykonujemy tę operację i udostępniamy protokół krok po kroku. Zaczynamy od wyjaśnienia przygotowania mieszanki do wstrzykiwań i ryb, które mają być wstrzyknięte, a następnie przechodzimy do pokazania, jak ustawia się aparat do wstrzykiwań. Przedstawiamy opis metody iniekcji komorowej mózgu, która polega na wykonaniu nacięcia w czaszce i wstrzyknięciu morfolinosu za pomocą mikroiniekcji. Omawiamy również krytyczne punkty, na które należy uważać podczas całej procedury, podając je jako przewodniki optymalizacji lub rozwiązywania problemów.

<table><tbody><tr><td colspan="4">Odczynnik/Materiał</td></tr><tr><td>CellTracker Red CMTPX</td><td>Life Technologies, Invitrogen</td><td>C34552</td><td>Stosować w rozcieńczeniu 1:100 do pomiaru dokładności iniekcji</td></tr><tr><td>MESAB (methanosulphonate etylo-m-aminobenzoesanu)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A5040</td><td>Do znieczulania ryb</td></tr><tr><td>Szalki Petriego</td><td>Sarstedt</td><td>821,472</td><td>Do obróbki ryb podczas wstrzykiwania i obrazowania</td></tr><tr><td>Sól fizjologiczna buforowana fosforanami</td><td>Life Technologies, GIBCO</td><td>10010-056</td><td>Jako sterylne podłoże do rozcieńczania</td></tr><tr><td>Vivo morpholinos</td><td>Gene Tools Inc.</td><td>Dostosowane</td><td>Więcej informacji na temat morfolinosów vivo: <a href="http://www.gene-tools.com" target="_blank">www.gene-tools.com</a></td></tr><tr><td colspan="4">Equipment</td></tr> <tr><td>Igła z zadziorowym końcem</td><td>Becton-Dickinson</td><td>305178</td><td>Aby wygenerować nacięcie w czaszce</td></tr><tr><td>Mikroskop preparacyjny</td><td>Olympus, Leica, Zeiss</td><td>Różni się w zależności od producenta</td><td>Część Cała konfiguracja wtrysku</td></tr><tr><td>Pęseta Dumont</td><td>World Precision Instruments</td><td>501985</td><td>Aby oderwać końcówkę szklanej kapilary</td></tr><tr><td>Aparat fluorescencyjny</td><td>Zeiss, Nikon, Leica</td><td>Różni się w zależności od producenta</td><td>Aby uwidocznić fluorescencję po wstrzyknięciu</td></tr><tr><td>Kleszcze preparacyjne Gillies</td><td>World Precision Instruments</td><td>501265</td><td>Aby utrzymać rybę w pozycji</td></tr><tr><td>Wstrzykiwanie szkła kapilary</td><td>World Precision Instruments</td><td>TWF10</td><td>Do mikroiniekcji</td></tr><tr><td>Zestaw dysz PicoNozzle (uchwyt do mikrowtryskiwaczy)</td><td>World Precision Instruments</td><td>5430-12</td><td>Do mikroiniekcji</td></tr><tr><td>Pneumatyczna pompa PicoPump (mikrowtryskiwacz)</td><td>World Precision Instruments</td><td>SYS-PV820</td><td>Do mikroiniekcji</td></tr><tr><td>Iluminator pierścieniowy; Przewodnik po lampie pierścieniowej</td><td>Parkland Scientific</td><td>ILL-RLG</td><td>Do oświetlania okazu</td></tr></tbody></table>

mikromanipulacja ekspresją genów w mózgu dorosłego danio pręgowanego za pomocą mikroiniekcji oligonukleotydów morfolino do komory mózgowej

Micromanipulation of Gene Expression in the Adult Zebrafish Brain Using Cerebroventricular Microinjection of Morpholino Oligonucleotides

Manipulacja ekspresją genów w tkankach jest wymagana do przeprowadzenia badań funkcjonalnych. W tym artykule demonstrujemy technikę mikroiniekcji komorowej mózgu (CVMI) jako sposób modulowania ekspresji genów w mózgu dorosłego danio pręgowanego. Za pomocą CVMI substancje mogą być podawane do płynu komorowo-komorowego mózgu i dokładnie rozprowadzane wzdłuż osi ogonowej mózgu. Szczególnie skupiamy się na wykorzystaniu antysensownych oligonukleotydów morfolino, które są silnymi narzędziami do obniżania ekspresji genów in vivo. W naszej metodzie, po zastosowaniu, cząsteczki morfolino są wychwytywane przez komórki wyściełające powierzchnię komory. Komórki te obejmują promieniste komórki glejowe, które działają jako neurogenne komórki progenitorowe. W związku z tym obniżenie ekspresji genów w promieniowych komórkach glejowych ma ogromne znaczenie dla analizy powszechnej odpowiedzi neurogenezy u danio pręgowanego, a także dostarczyłoby informacji na temat tego, w jaki sposób kręgowce mogą utrzymać odpowiedź neurogenezy u dorosłych. Takie zrozumienie pomogłoby również w wysiłkach na rzecz zastosowań klinicznych w chorobach neurodegeneracyjnych u ludzi i regeneracji ośrodkowego układu nerwowego. W związku z tym przedstawiamy metodę mikroiniekcji komorowej mózgu jako szybki i skuteczny sposób na zmianę ekspresji genów i odpowiedzi neurogenezy w przodomózgowiu dorosłego danio pręgowanego. Udostępniamy również wskazówki dotyczące rozwiązywania problemów i inne przydatne informacje na temat przeprowadzania procedury CVMI.

Mikroiniekcja do komór mózgowych prowadzi do szerokiego rozprowadzenia wstrzykniętego roztworu
Wykorzystując schemat postępowania i układ techniczny mikroiniekcji do komór mózgu przedstawione na Rysunku 1, podaliśmy oligonukleotydy morpholino do mózgu dorosłych rybek danio-ostrobłotniczych. Precyzyjny protokół iniekcji prowadzi do rozproszenia wstrzykniętego płynu w całym mózgu i efektywnego ukierunkowania na komórki znajdujące się blisko powierzchni komorowej (Rysunek 2A). W przypadku iniekcji, podczas których kapilara szklana przebija tkankę mózgu, w miejscu wstrzyknięcia pojawi się intensywny sygnał fluorescencyjny (Rysunek 2B). Jeśli podana ilość będzie niewystarczająca, zaobserwowany zostanie słaby sygnał fluorescencyjny (Rysunek 2C).
Mikrowstrzyknięcia do komór mózgu można wykorzystać do wyciszenia ekspresji genów w obszarze komorowym mózgu dorosłego zebrafisha
Wykazaliśmy, że morfolino typu vivo mogą przenikać na głębokość kilku średnic komórek wewnątrz powierzchni komór i w związku z tym mogą efektywnie celować w komórki komorowe (Ryciny 3A, 3B). Iniekcja morfolino może powodować wyciszenie ekspresji genu, ponieważ hamuje ona produkcję odpowiadającego mu białka (przykładem jest PCNA, przedstawiony na Rycynach 3C, 3D). Wcześniej udowodniliśmy, że wyciszanie genów za pomocą tej techniki prowadzi do skutków funkcjonalnych podczas neurogenezy u osobników dorosłych (Ryciny 3E, 3F) lub odpowiedzi regeneracyjnej (Ryciny 3G, 3H). Wykazaliśmy, że efektywny zakres wyciszenia (powyżej 50% wyciszenia) jest osiągany w przybliżeniu 12 h po iniekcji morfolino 22. Zaobserwowaliśmy również, że okres efektywnego wyciszenia dla białka PCNA trwa do około 5 dni po iniekcji 22. Wyciszenie powyżej 70% utrzymywało się do 3 dni po iniekcji 22. Krzywe wyciszenia zależą od poziomu ekspresji endogennych białek oraz wydajności cząsteczek morfolino i muszą być określane przez badacza dla każdego genu. W naszych badaniach nie stwierdziliśmy, aby procedura CVMI upośledzała przeżywalność zwierząt, prawdopodobnie dlatego, że podawanie cząsteczek morfolino ma charakter miejscowy i nie wywołuje toksyczności systemowej.
<img alt="Schemat anatomii mózgu ryby z procesem sekcji; telencefalon, opłaz węchowy, wzgórze optyczne." fo:content-width="6in" fo:src="/files/ftp_upload/50415/50415fig1highres.jpg" src="/files/ftp_upload/50415/50415fig1.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Rysunek 1"> 
Rysunek 1. Schematyczne przedstawienie techniki iniekcji do układu komorowego mózgu. (A) Iniekcja jest wykonywana od strony grzbietowej dorosłego danio przebrzuchłego (1) na poziomie wzgórza optycznego (ot, 2). Za pomocą igły 30G (3) wykonuje się nacięcie nad płytką czaszki w obrębie wzgórza optycznego. Przy użyciu kapilar szklanych cząsteczki morpholino są wstrzykiwane do płynu komorowego (4). Natychmiast osiągnięto dokładną dyspersję (5). (B) Kanula i jej ząbkowany koniec pokazane w dużym powiększeniu. (C) Orientacja igły przed nacięciem. (D) Miejsce nacięcia zaznaczone okręgiem i liniami przerywanymi. (E) Kapilara do iniekcji umieszczona zgodnie z rysunkiem; wykonano wstrzyknięcie. Wszystkie panele zostały zaadaptowane z ref. 22. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/50415/50415fig1large.jpg" target="_blank"> Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększony rysunek</a>.
<img alt="Wyniki mikroskopii fluorescencyjnej pokazujące regiony emitujące czerwone światło w próbce biologicznej, oznaczone A-C." src="/files/ftp_upload/50415/50415fig2.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Rysunek 2"> 
Rysunek 2. Porównanie wydajności i dokładności iniekcji. (A) Prawidłowa iniekcja prowadzi do ukierunkowania komórek blisko powierzchni komorowej. (B) Wprowadzenie kapilary szklanej w głąb tkanki mózgowej spowoduje powstanie sygnału fluorescencyjnego zlokalizowanego centralnie. (C) Zbyt mała objętość iniekcji doprowadzi do słabszego sygnału fluorescencyjnego.
<img alt="Analiza proliferacji komórek; obrazy z mikroskopii fluorescencyjnej GFP i PCNA; grupy kontrolna i doświadczalna; wykres." fo:content-width="5.5in" fo:src="/files/ftp_upload/50415/50415fig3highres.jpg" src="/files/ftp_upload/50415/50415fig3.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Rysunek 3"> 
Rysunek 3. Przenikanie morfolino, wydajność wyciszania genów i konsekwencje funkcjonalne. (A) Immunobarwienie GFP na przekrojach poprzecznych telencefalonu linii transgenicznej Tg(H2A:GFP) po wstrzyknięciu morfolino kontrolnego, wykazujące jądra GFP-dodatnie. (B) Immunobarwienie GFP na przekrojach poprzecznych telencefalonu linii transgenicznej Tg(H2A:GFP) po wstrzyknięciu antysensownego morfolino gfp, wykazujące jądra GFP-dodatnie. Zwróć uwagę na różnicę w sygnale GFP w obrębie obszaru komorowego. v: komora. (C) Immunobarwienie PCNA w mózgach po wstrzyknięciu morfolino kontrolnego, wykazujące rozległy rozkład komórek PCNA-dodatnich. (D) Immunobarwienie PCNA w mózgach po wstrzyknięciu antysensownego morfolino pcna, wykazujące znacznie zmniejszoną liczbę komórek PCNA-dodatnich, co dowodzi, że CVMI może wyciszać geny endogenne. (E) Immunobarwienie BrdU i HuC/D w mózgach po wstrzyknięciu morfolino kontrolnego w celu oznaczenia nowo powstałych neuronów po eksperymencie BrdU pulse-chase opisanym wcześniej 22. (F) Immunobarwienie BrdU i HuC/D w mózgach po wstrzyknięciu antysensownego morfolino pcna w celu oznaczenia nowo powstałych neuronów po eksperymencie BrdU pulse-chase opisanym wcześniej 22. (G) Wyciszenie PCNA prowadzi do znacznego zmniejszenia liczby nowo powstałych neuronów, co wskazuje, że CVMI może być wykorzystywane do wyciszania genów endogennych, wywołując konsekwencje funkcjonalne. Wszystkie panele zostały zaadaptowane z ref. 22 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/50415/50415fig3large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększony rysunek</a>.

W tym artykule demonstrujemy metodę manipulowania ekspresją genów w komórkach komorowych dorosłego kresomózgowia danio pręgowanego za pomocą antysensownych oligonukleotydów morfolino. Przedstawiamy tę metodę jako skuteczny i szybki protokół, który można wykorzystać do badań funkcjonalnych w mózgu dorosłego kręgowca.

Mikromanipulacja ekspresją genów w mózgu dorosłego danio pręgowanego za pomocą mikroiniekcji oligonukleotydów morfolino do komory mózgowej

Manipulation of gene expression in tissues is  required to perform functional studies. In this paper, we demonstrate the  cerebroventricular ...

Ogólnym celem tej procedury jest mikroiniekcja morpholino oligonukleotydów do komory mózgu dorosłego danio pręgowanego w celu wyciszenia aktywności genów w komórkach glejowych promieniastych. W tym celu w pierwszej kolejności przeprowadza się znieczulenie ryby. Następnie, za pomocą zadziurionej igły stomatologicznej, wykonuje się nacięcie w czaszce nad guzkiem wzrokowym.Następnie roztwór morpholino wstrzykuje się przez miejsce nacięcia do płynu komor mózgowych. Na koniec, pod mikroskopem fluorescencyjnym, sprawdza się wydajność i precyzję wstrzyknięcia. Ostatecznie można uzyskać bardzo wydajną i rozległą blokadę produkcji białek z genów zainteresowania w komórkach glei promienistej mózgu dorosłego danio-zebry poprzez wyciszenie genów za pomocą morpholino, co można potwierdzić za pomocą przekrojów histologicznych i barwień immunohistochemicznych.Główną zaletą tej techniki w porównaniu z istniejącymi metodami, takimi jak podejścia transgeniczne czy metody dostarczania oparte na elektroporacji, jest to, że CVMI jest mniej czasochłonna i bardziej efektywna w celowaniu w całą populację komórek glejowych promieniście ułożonych. Metoda ta jest modyfikowalna i pozwala na jednoczesne wyciszenie wielu genów. Aby przygotować mieszaninę do iniekcji, należy rozpocząć od sporządzenia roztworu zapasowego Morpho o stężeniu 500 Micromolar.Używając PBS do 10 iniekcji, przygotuj 10 µL mieszaniny do iniekcji, łącząc 9 µL rozcieńczonego lub nierozcieńczonego roztworu morpholino z 1 µL fluorescencyjnego barwnika śledzącego. Przechowuj w temperaturze pokojowej. Użyj wyciągacza igieł, aby przygotować szklane kapilary do iniekcji zgodnie z poniższymi parametrami.Włącz źródło ciśnienia i ustaw wartość ciśnienia na 50 PSI lub 3,5 bara. Skonfiguruj ustawienia mikroinjektora w następujący sposób: ciśnienie podtrzymujące (hold pressure) 20 PSI, ciśnienie wtrysku (eject pressure) 10 PSI, wartość okresu (period value) 2,5 oraz 100 ms.Zakres bramkowania. Włącz oświetlacz pierścieniowy i ustaw go nad stolikiem mikroskopu. Umieść uchwyt do kapilar w odpowiedniej pozycji obok mikroskopu.Włóż kapilarę szklaną do uchwytu i ustaw kąt wstrzykiwania na 45 stopni. Za pomocą pęsety precyzyjnej odłam końcówkę kapilary szklanej i skalibruj ciśnienie wyjściowe z otworu. Po zanurzeniu końcówki igły w wodzie z rybami i zastosowaniu ciągłego impulsu ciśnienia, pęcherzyki powietrza powinny układać się w pojedynczym rzędzie, co wskazuje na optymalne ciśnienie lub rozmiar otworu.Napełnij szklaną kapilarę roztworem do iniekcji. Unikając powstania pęcherzyków powietrza, wywarzyj nacisk, aby usunąć powietrze znajdujące się pomiędzy końcówką szklanej kapilary a wprowadzonym roztworem do iniekcji. Po przygotowaniu 0,1% roztworu środka znieczulającego meab, przenieś odpowiednią liczbę ryb do pojemnika transportowego z wodą dla ryb.Przygotuj roztwór roboczy środka znieczulającego, mieszając 200 mililitrów wody z akwarium z pięcioma mililitrami roztworu stokowego MISP. Wypełnijy połowę szalki Petriego środkiem znieczulającym, który będzie wykorzystany do iniekcji. Inkubuj rybę w środku znieczulającym aż do całkowitego ustania ruchów.Następnie za pomocą siatki przenieś rybę do szalki Petriego z anestetykiem. Aby ułatwić nacięcie, użyj pęsety do delikatnego przytrzymania ryby i ustaw ją tak, aby głowa była lekko pochylona w dół. Używając czubka igły z haczykiem o rozmiarze 30 G, wykonaj niewielkie nacięcie w czaszce, nie wnikając zbyt głęboko, aby nie uszkodzić tkanki mózgowej.Kontynuując trzymanie ryby, wprowadź końcówkę szklanej kapilary przez miejsce nacięcia na głębokość około pół milimetra i, unikając kontaktu z tkanką mózgową, skieruj ją w stronę cephalonu. Wstrzyknij roztwór; powinien on natychmiast się rozprzestrzenić. Przenieś rybę do świeżej wody i pozwól jej na regenerację.Około 30 minut później ponownie podać rybie środek znieczulający i sprawdzić ją pod mikroskopem fluorescencyjnym w celu oceny rozprzestrzeniania się cieczy, opierając się na czerwonej fluorescencji. Przenieść rybę z powrotem do zbiornika i przywrócić ją do obiegu wody.Do czasu wykorzystania w analizach behawioralnych lub do przygotowania preparatów tkankowych, jak pokazano tutaj, prawidłowa iniekcja prowadzi do rozprzestrzenienia się wstrzykniętego roztworu w całym mózgu i efektywnego targetowania komórek znajdujących się blisko powierzchni komorowej. Jednak w przypadku iniekcji, w których kapilara szklana przebija tkankę mózgową, w punkcie wstrzyknięcia pojawi się silny sygnał fluorescencyjny. Natomiast w przypadku niewystarczającej ilości podanego roztworu, zaobserwowany zostanie słaby sygnał fluorescencyjny.Rysunek ten pokazuje, że vivo morphosy mogą przenikać na głębokość kilku średnic komórek wewnątrz powierzchni komorowej, a zatem mogą efektywnie celować w komórki komorowe w porównaniu z kontrolnym Morpho. Iniekcja morpho przeciwko PCNA efektywnie wycisza ekspresję genu w komórkach komorowych. Na tych obrazach immunofluorescencyjnych barwienie immunochemiczne BRDU i QCD po eksperymencie pulse-chase z A-B-R-D-U wykazuje, że wyciszenie PCNA za pomocą antysensownych morphosów prowadzi do znacznej redukcji nowo powstałych neuronów, co sugeruje, że CVMI może być wykorzystywane do wyciszania genów endogennych, co w konsekwencji wywołuje skutki funkcjonalne.Po opracowaniu ta technika utorowała drogę badaczom z dziedziny neuronauki do zgłębiania mechanizmów molekularnych uczestniczących w regeneracyjnej odpowiedzi neurogennej w mózgu dorosłych ryb.

micromanipulation-gene-expression-adult-zebrafish-brain-using

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Neuronauka

Mikromanipulacja ekspresji genów w mózgu dorosłych danionis pręgowanych przy użyciu mikroiniekcji do komory mózgowej oligonukleotydów morfolinowych

Mikroiniekcja jest uznaną i skuteczną metodą wprowadzania obcych substancji do zapłodnionych embrionów danio pręgowanego. W niniejszej pracy prezentujemy niezawodną technikę mikroiniekcji służącą do przeprowadzania badań nad nadekspresją mRNA oraz wyciszaniem genów za pomocą morfolino oligonukleotydów u danio pręgowanego.

Mikroiniekcja mRNA i morfolinoowych oligonukleotydów antysensownych w embriony ryb danio pręgowanych.

W niniejszym filmie pokazano, w jaki sposób morpholino lub mRNA można wstrzyknąć do embrionów zebrafish w stadium jednej komórki, aby obniżyć lub zwiększyć poziom produktów konkretnych genów podczas dalszego rozwoju.

Mikroiniekcja embrionów ryb danio w celu analizy funkcji genów

Opracowano metodę bezpośredniego dostarczania morfolino do otocysty ryby zebrafish w 24hpf. Dzięki zastosowaniu mikroiniekcji morfolino do światła pęcherzyka słuchowego oraz elektroporacji w celu umożliwienia penetracji, udało się ominąć wpływ morfolino na mózg i uzyskać efekty specyficzne dla ucha wewnętrznego.

Bezpośrednie dostarczenie morfolin MIF do otocysty rybki danio poprzez wstrzyknięcie i elektroporację wpływa na rozwój ucha wewnętrznego

Opisano metodę warunkowego wyciszania ekspresji białka docelowego w siatkówce dorosłego danio-zebry, która polega na dokonywaniu iniekcji domięśniowych morfolino antysensownych oraz ich elektroporacji do siatkówki. W wyniku tego procesu ekspresja białka jest wyciszona przez kilka dni, co umożliwia zbadanie roli tego białka w regenerującej się lub nienaruszonej siatkówce.

In vivo elektroporacja morfolin do siatkówki dorosłego danio pręgowanego

Opisujemy metodę warunkowego wyciszania ekspresji białka docelowego podczas regeneracji płetwy u dorosłych ryb zebrafish. Technika ta polega na mikroiniekcji i elektroporacji antysensownych oligonukleotydów morpholino do tkanki płetwy, co pozwala na badanie roli białka w różnych etapach regeneracji płetwy, w tym podczas gojenia rany, tworzenia blastemy oraz regeneracyjnego wzrostu.

In vivo elektroporacja morfolin do regenerującej płetwy ogonowej dorosłego zebrafisha

Protokół opisuje celowe obniżenie ekspresji genów u danio pręgowanego poprzez wstrzyknięcie morfoliny w ogon.

Wstrzyknięcie morfolino: metoda obniżania docelowej ekspresji genów w celu zbadania funkcji u danio pręgowanego

Adaptowalna metoda odwrotnej genetyki dla danio pręgowanego do oceny funkcji genów podczas późniejszych etapów rozwoju i fizjologicznej homeostazy, takich jak regeneracja tkanek za pomocą dokomorowych iniekcji specyficznych dla genu morpholinos.

Odwrotne podejście genetyczne morpholino za pomocą wstrzyknięcia do komory serca w celu transfekcji wielu trudnych do namierzenia tkanek u larwy danio pręgowanego

Śledzenie na żywo poszczególnych komórek progenitorowych siatkówki WT w różnych tłach genetycznych pozwala na ocenę udziału nieautonomicznej sygnalizacji komórek podczas neurogenezy. W tym celu wykorzystano kombinację knockdownu genów, generowania chimer poprzez przeszczep zarodka i poklatkowego obrazowania konfokalnego in vivo.

In vivo (in vivo)Obrazowanie ekspresji genów transgenicznych w poszczególnych progenitorach siatkówki w chimerycznych zarodkach danio pręgowanego w celu zbadania nieautonomicznych wpływów komórek

Prezentacja sposobu wykonania i zastosowania zewnątrzkomórkowej elektrody ssącej używanej do pomiarów elektrofizjologicznych w rdzonach kręgowych noworodków gryzoni in...

Elektrofizjologia rdzenia kręgowego II: Wytwarzanie przyssawkowych elektrod zewnątrzkomórkowych

Obrazowanie tkanki zarodkowej w czasie rzeczywistym przez długie okresy stanowi duże wyzwanie. Przedstawiamy tutaj metodę monitorowania zmian komórkowych i podkomórkowych w rdzeniu kręgowym kurczaka przez dłuższy czas z wysoką rozdzielczością przestrzenną i czasową. Technikę tę można zaadaptować do innych obszarów układu nerwowego oraz rozwijającego się zarodka.

Obrazowanie na żywo w wysokiej rozdzielczości zachowania komórek w rozwijającym się neuroepitelium

Poznaj mikroiniekcję oligonukleotydów morfolino do komory mózgowej danio pręgowanego w celu manipulacji ekspresją genów w komórkach radialnych glejowych. Ta metoda umożliwia szybkie i efektywne badanie funkcji genów w mózgu dorosłego kręgowca.

Mikromanipulacja ekspresją genów w mózgu dorosłego danio pręgowanego za pomocą mikroiniekcji oligonukleotydów morfolino do komory mózgowej (Wideo) | JoVE Journal

Mikromanipulacja ekspresją genów w mózgu dorosłego danio pręgowanego za pomocą mikroiniekcji oligonukleotydów morfolino do komory mózgowej

Przeglądaj więcej filmów