Mikromanipulacja ekspresją genów w mózgu dorosłego danio pręgowanego za pomocą mikroiniekcji oligonukleotydów morfolino do komory mózgowej

Ogólnym celem tej procedury jest mikrowstrzyknięcie oligonukleotydów morfowych do komory mózgowej mózgu dorosłego danio pręgowanego i obniżenie aktywności genów w komórkach gleju radiowego. Osiąga się to poprzez uprzednie znieczulenie ryby danio pręgowanego. Następnie w czaszce powstaje szczelina, która nakłada się na guzek wzrokowy za pomocą kolczastej igły do wgniecenia.

Następnie roztwór morpho jest wstrzykiwany przez miejsce nacięcia do płynu komorowego mózgu. Na koniec sprawdzana jest skuteczność i dokładność iniekcji pod mikroskopem fluorescencyjnym. Ostatecznie można uzyskać wyniki zbyt wydajnego i powszechnego blokowania produkcji białek przez interesujące geny w promieniowych komórkach glejowych mózgu dorosłego danio pręgowanego poprzez knockdown genów za pośrednictwem morfo, który można oznaczyć za pomocą skrawków histologicznych i barwień immunohistochemicznych.

Główną przewagą tej techniki nad istniejącymi metodami, takimi jak podejścia transgeniczne lub metody dostarczania oparte na elektrooperacji, jest to, że CVMI jest mniej czasochłonne, bardziej skuteczne w celowaniu w całą populację komórek gleju radiowego. Te regulowane i wiele genów może zostać powalonych w tym samym czasie. Aby przygotować mieszaninę do wstrzykiwań, należy rozpocząć od przygotowania 500 mikromolowego roztworu podstawowego Morpho.

Używając PBS do 10 wstrzyknięć, przygotuj 10 mikrolitrów mieszanki do wstrzykiwań, łącząc dziewięć mikrolitrów rozcieńczonego lub nierozcieńczonego roztworu morpho z jednym mikrolitrem fluorescencyjnego barwnika śledzącego. Przechowuj w temperaturze pokojowej. Za pomocą ściągacza igłowego przygotuj szklane kapilary iniekcyjne zgodnie z poniższymi parametrami.

Włącz źródło ciśnienia i dostosuj ustawienia ciśnienia do 50 PSI lub 3.5 bara. Dostosuj ustawienia mikrowtryskiwaczy w następujący sposób. Ciśnienie podtrzymania: 20 PSI, ciśnienie wyrzutu: 10 PSI, wartość okresu 2,5 i 100 milisekund.

Zakres bramkowania. Włącz oświetlacz pierścieniowy i umieść pierścień nad stolikiem mikroskopu. Umieść uchwyt kapilarny w odpowiedniej pozycji obok mikroskopu.

Włóż szklaną kapilarnę do uchwytu i wyreguluj kąt wtrysku na 45 stopni. Za pomocą kleszczyków końcowych oderwij końcówkę szklanej kapilary i skalibruj ciśnienie wyjściowe z kryzy. Zanurzając końcówkę igły w wodzie dla ryb i stosując ciągły impuls ciśnienia, pęcherzyki powietrza powinny tworzyć pojedynczy rząd wskazujący optymalne ciśnienie lub rozmiar otworu.

Napełnić szklaną kapilarnę roztworem do wstrzykiwań. Unikając pęcherzyków powietrza, należy wywierać ciśnienie, aby usunąć powietrze znajdujące się między końcówką szklanej kapilary a załadowanym roztworem do wstrzykiwań. Po przygotowaniu 0,1% roztworu łodygi znieczulającego meabu, przenieś żądaną liczbę ryb do pojemnika transportowego z wodą dla ryb.

Przygotuj roboczy roztwór środka znieczulającego, mieszając 200 mililitrów wody rybnej z pięcioma mililitrami roztworu podstawowego MISP. Napełnij szalkę Petriego do połowy środkiem znieczulającym, aby użyć go do wstrzyknięć. Wysiaduj rybę w znieczulaczu, aż przestanie się poruszać.

Następnie użyj siatki, aby przenieść go na szalkę Petriego środka znieczulającego. Aby ułatwić nacięcie, użyj kleszczy, aby delikatnie przytrzymać rybę i ustawić ją z głową lekko pochyloną w dół. Używając końcówki igły o rozmiarze 30, wykonaj małe nacięcie na czaszce, nie wnikając zbyt głęboko, ponieważ spowoduje to uszkodzenie tkanki mózgowej.

Kontynuując trzymanie ryby, włóż końcówkę szklanej kapilary przez miejsce nacięcia na około pół milimetra i unikając kontaktu z tkanką mózgową, skieruj ją w stronę głowa. Wstrzyknąć roztwór, powinien natychmiast się rozproszyć. Przenieś rybę do świeżej wody rybnej i pozwól jej się zregenerować.

Około 30 minut później ponownie znieczul rybę i sprawdź ją pod mikroskopem fluorescencyjnym, aby poszukać rozległego rozprowadzenia płynu. Na podstawie czerwonej fluorescencji. Włóż rybę z powrotem do zbiornika i umieść ją z powrotem w obiegu.

Do czasu użycia do analiz behawioralnych lub do przygotowania próbek tkanek, jak pokazano tutaj, dokładne wstrzyknięcie prowadzi do dyspersji wstrzykniętego roztworu w mózgu i skutecznego kierowania komórek w pobliżu powierzchni komory. Jednak zastrzyki, w których szklana kapilara przebija się, tkanka mózgowa będzie miała gęsty sygnał fluorescencyjny w miejscu wstrzyknięcia. A jeśli wstrzyknięta ilość nie jest wystarczająca, zaobserwuje się słaby sygnał fluorescencyjny.

Rysunek ten pokazuje, że vivo morphos może przenikać do komórek o kilku średnicach wewnątrz powierzchni komory, a zatem może skutecznie celować w komórki komorowe w porównaniu z kontrolą. Morpho. Wstrzyknięcie morpho przeciwko PCNA skutecznie obniża ekspresję genów w komórkach komór. Na tych obrazach immunofluorescencyjnych barwienie immunologiczne BRDU i QCD po eksperymencie pościgu za impulsem A-B-R-D-U pokazuje, że knockdown PCNA z morfozami antysensownymi prowadzi do znacznego zmniejszenia liczby nowonarodzonych neuronów, co sugeruje, że CVMI może być używany do niszczenia endogennych genów, co następnie powoduje konsekwencje funkcjonalne.

Tak więc po jej opracowaniu, technika ta utorowała drogę naukowcom z dziedziny neurobiologii do zbadania mechanizmów molekularnych zaangażowanych w reakcję neurogenezy regeneratora dorosłego S mózgu ryby.