Obrazowanie i rekonstrukcja 3D struktur naczyniowo-mózgowych u embrionalnego danio pręgowanego

Ogólnym celem tej procedury jest ocena struktur naczyniowo-mózgowych u embrionalnej ryby danio pręgowanej. Osiąga się to poprzez najpierw zebranie zapłodnionych jaj zebry i stworzenie warunków leczenia. Po trzydniowym okresie wzrostu ryba danio pręgowany jest uśmiercana, a oko jest ostrożnie usuwane przed zamontowaniem próbki na szkle nakrywkowym.

Następnie naczynia krwionośne mózgu są obrazowane za pomocą mikroskopii konfokalnej. Na koniec rendery 3D układu naczyniowego są generowane przy użyciu oprogramowania open source. Ostatecznie analiza rekonstrukcji służy do określenia wpływu warunków leczenia na rozgałęzienia i gęstość naczyń krwionośnych.

W rozwijającym się mózgu danio pręgowanego. Technika ta ocenia cały układ naczyniowy embrionalnego danio pręgowanego. Pozwoliło nam to na zbadanie biologii beta-amyloidu na poziomie układów narządów.

Wizualna demonstracja tej metody ma kluczowe znaczenie, ponieważ sekcja i analiza obrazu są trudne do nauczenia, ponieważ są trudne technicznie. Na początek hoduj transgeniczny szczep danio pręgowanego wyrażający wzmocnione białko zielonej fluorescencji w pożądanych tkankach w temperaturze 28,5 stopnia Celsjusza z 14-godzinnym światłem i 10-godzinnym ciemnym cyklem. W tym przykładzie transgeniczne ryby, które wyrażają EGFP w komórkach śródbłonka naczyń krwionośnych, są hodowane w noc przed pobraniem jaj, ustawiają samce i samice w zbiornikach godowych z siatkowym dnem Następnego ranka usuń przegrodę i pozwól rybom łączyć się w pary, sprawdzając jaja co 15 minut.

Po użyciu sitka siatkowego do zebrania jaj i pożywki E trzy do ich umycia, użyj E trzy, aby przenieść jaja do 100-milimetrowych szalek hodowlanych i inkubować je w temperaturze 28 stopni Celsjusza, aby zmienić rozgałęzienia naczyń mózgowych. Zaczynając od 24 godzin po zapłodnieniu, dodaj substancję chemiczną, taką jak inhibitor sekretazy gamma rozpuszczony w DMSO. W razie potrzeby dodaj 0,03% PTU, aby zahamować tworzenie się pigmentu.

Po przeniesieniu zarodków w roztworze do dołków 12, płytka dołkowa inkubuje się w temperaturze 28,5 stopni Celsjusza, aż zarodki osiągną pożądany etap rozwoju. Po poświęceniu zarodków w trica i utrwaleniu ich aldehydem przez noc w temperaturze czterech stopni Celsjusza. Przechowuj zarodki w PBS w ciemności w temperaturze czterech stopni Celsjusza.

Aby usunąć oko z zarodka, użyj zaostrzonej igły wolframowej i przetnij wokół tkanki łączącej jedno oko. Następnie przetnij mięśnie, a na końcu nerw wzrokowy, aby usunąć oko. Po usunięciu oka odwróć zarodek na szkło nakrywkowe pustym oczodołem skierowanym w dół i dotykającym szkła nakrywkowego.

Dodaj kroplę 3% metylocelulozy, aby utrzymać zarodek na miejscu i przykryć cały zarodek, aby zapobiec wysuszeniu. Podczas obrazowania za pomocą odwróconego mikroskopu konfokalnego z obrazem obiektywu 20 x plan APO, zarodek natychmiast, wiele systemów obrazowania będzie w stanie rozdzielić struktury naczyniowe tylko w połowie tej próbki. W takim przypadku należy zawiesić zarodek w PBS i ponownie zamontować go po stronie przeciwnej w celu dalszego obrazowania w celu przeprowadzenia rekonstrukcji 3D obrazów naczyń mózgowych przy użyciu obrazu J, który jest zoptymalizowany pod kątem renderowania 3D.

Zaimportuj stosy konfokalne, przechodząc do importera wtyczek, loci, formatów bio, a następnie wybierz plik konfokalny dla stosów Nikona, wybierz wyświetl stos z hiperstosem i ustaw tryb kolorów na skalę szarości. Następnie sprawdź automatyczne skalowanie i dzielenie kanałów. Te wybory otworzą cztery oddzielne panele kanałów.

Zamknij wszystkie obrazy z wyjątkiem 16-bitowego z nazwą pliku, po której następuje c równa jeden. Dostosuj próg, używając karty przewijania u dołu, aby przeskanować i znaleźć wycinek, który ma interesujący Cię region lub strukturę. Następnie przejdź do progu regulacji obrazu.

W panelu, który się pojawi, przesuń górny pasek w lewo, aby struktura była dość dobrze widoczna na tle, i pozostaw dolny slajd tam, gdzie jest, aby utworzyć nowy ośmiobitowy obraz. Wybierz b i w. Następnie ciemne tło.

Nie wybieraj opcji Oblicz próg dla każdego obrazu, chyba że dla każdego przekroju wymagane są różne korekty. Następnie przejdź do wtyczki Przeglądarka 3D próg zerowego współczynnika ponownego próbkowania jeden lub dwa i odznacz pola koloru czerwonego i niebieskiego, aby uzyskać zielony wynik 3D. W przeciwnym razie uzyska białe renderowanie.

Następnie wybierz pozycję Zastosuj. Użyj elementów sterujących myszy i klawiatury, aby obracać, obracać i powiększać obraz 3D, aby zapisać nieruchome obrazy w dowolnym momencie. Użyj opcji przechwytywania w menu.

Rozmiar pola obrazu na ekranie dyktuje wymiary w pikselach tworzonego obrazu, więc jeśli pożądany jest obraz o wysokiej rozdzielczości, powiększ pole, przeciągając prawy dolny róg. Utwórz obracający się film 3D, wybierając opcję Wyświetl rejestr obrót o 360 stopni. Na koniec zapisz plik w jednym z kilku dostępnych formatów i użyj bezpłatnego odtwarzacza multimedialnego VLC o otwartym kodzie źródłowym do przeglądania 3D.

Rekonstrukcja struktur naczyniowych daje kompleksową i ciekawą wizualnie perspektywę rozwoju danio pręgowanego. Pokazano tutaj kilka kątów struktur naczyniowych w zarodku danio pręgowanego po sześciu dniach od zapłodnienia, który wyrażał EGFP w komórkach śródbłonka o monochromatycznym zielonym lub białym kolorze. Oszacowanie intensywności sygnału może być trudne, ale pseudokolorowanie zapewnia intensywność obrazu z tabeli przeglądowej, co pozwala na lepszą percepcję głębi nakładających się struktur.

Na przykład ten rysunek przedstawia pseudo kolorowy obraz 3D układu naczyniowego u zebry zebry po sześciu dniach po zapłodnieniu po jego rozwoju. Ta technika pozwoliła nam zbadać naczyniowe działanie beta-amyloidu w mózgu kręgowców. Po obejrzeniu tego filmu powinieneś dobrze zrozumieć, jak wizualizować sieci naczyniowe u embrionalnego danio pręgowanego, co zapewnia ekonomiczny i dostępny system do badania angiogenezy.