Name: Obrazowanie i rekonstrukcja 3D struktur naczyniowo-mózgowych u embrionalnego danio pręgowanego (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-04-22T13:45:00.000+00:00
Duration: 8 min
Description: Poznaj metody obrazowania i rekonstrukcji 3D struktur naczyniowo-mózgowych u embrionalnego danio pręgowanego. Technika ta umożliwia badanie rozwoju układu naczyniowego i angiogenezy.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Autorzy dziękują byłym i obecnym członkom naszych laboratoriów, którzy pomogli rozwinąć te techniki. Częściowe finansowanie udzielone DE w ramach grantu z Kalifornijskiego Instytutu Medycyny Regeneracyjnej/CIRM (RN1-00538).

1. Hodowla danio pręgowanego, tworzenie zarodków i leczenie
<ol>
	<li>Przeprowadź następujące protokoły dotyczące danio pręgowanego pod kierunkiem instytucjonalnego komitetu ds. opieki nad zwierzętami i ich wykorzystania (IACUC) oraz w ramach wytycznych NIH lub innych organów regulacyjnych/wytycznych dotyczących opieki nad zwierzętami.</li>
	<li>Szczepy danio pręgowanego, które eksprymują białka fluorescencyjne w określonych tkankach, komórkach lub narządach, są dostępne w Międzynarodowym Centrum Zasobów Danio Pręgowanego (ZIRC). Na przykład Tg (kdr:EGPF)s843 wyraża EGFP w komórkach śródbłonka naczyń krwionośnych6, które można wykorzystać do produkcji kompletnych struktur naczyniowych 3D, jak pokazano w tym protokole. Inne linie transgenicznych danio pręgowanego są dostępne w ZIRC.</li>
	<li>Trzymanie dorosłych danio pręgowanego w odpowiednim systemie akwakultury, który monitoruje pH, zasolenie, temperaturę, rozpuszczony tlen, światło i inne czynniki środowiskowe7. Pokazany tutaj danio pręgowany był trzymany w systemie Aquaneering Inc. (San Diego, Kalifornia) w temperaturze 28,5 °C z 14-godzinnym cyklem świetlnym / 10-godzinnym ciemnym cyklem. Karm dorosłe danio pręgowane zbilansowaną dietą składającą się z krewetek solankowych i pokarmu dla ryb NRD 4/6 (Brine Shrimp Direct, Ogden, Utah).</li>
	<li>Dorosłe samce i samice danio pręgowanego w wieku rozrodczym powinny być trzymane oddzielnie, aby zwiększyć udane krycie.</li>
	<li>Stymuluj składanie jaj i zapłodnienie, umieszczając samice (2-4) i samce (4-6) razem w pojemniku godowym, który ma siatkowe dno z otworami wystarczająco dużymi, aby jaja mogły przez nie wpaść, ale zbyt małymi, aby dorosłe rybki danio pręgowany mogły przejść. Ustaw krycie poprzedniego wieczoru; jaja są składane o świcie, zwykle podczas gdy cykl światła w ciągu dnia powoli zwiększa swoją intensywność (świt). Co 15-30 minut sprawdzaj, czy na dnie pojemnika do krycia nie ma jaj.</li>
	<li>Zebrać jaja za pomocą sitka siatkowego i oczyścić buforem E3 (5 mM NaCl, 0,17 mM KCl, 0,33 mM CaCl2, 0,33 mMMgSO4). Przenieść jaja na 100-milimetrowe płytki hodowlane wypełnione buforem E3 i przechowywać w inkubatorze o temperaturze 28 °C.</li>
	<li>Aby zbadać substancje chemiczne, które zmieniają rozgałęzienia naczyń mózgowych, dodaj pożądane stężenia chemiczne. Na przykład rozgałęzienie neowaskularne można indukować za pomocą inhibitora γ-sekretazy (GSI IX/DAPT/N-[N-(3,5-Difluorophenacetyl-L-alanyl)]-S-fenyloglicyno-estru butylowego) rozpuszczonego w DMSO4, rozpoczynającego się 24 godziny po zapłodnieniu (hpf). W tym momencie zarodki nadal znajdują się w kosmówce i wiele substancji chemicznych może przez niąprzechodzić8. Jeśli stan leczenia ma skutki neuronalne lub motoryczne, które mogą upośledzać zdolność zarodków do uwolnienia się od kosmówki, wówczas zarodki powinny zostać zdekorionowane między 24 a 48 hpf, co można zrobić za pomocą kleszczy pronazy2. Zarodki pokazane na dostarczonych zdjęciach zostały poddane dechorionacji poprzez delikatne złapanie kosmówki dwoma zaostrzonymi kleszczami i rozerwanie jej.</li>
	<li>W razie potrzeby/pożądania, tworzenie pigmentu można zahamować, dodając 0,003% N-fenylotiomocznika (PTU) do buforu E3 przy 24 hpf.</li>
</ol>
2. Konfokalne obrazowanie struktur naczyniowo-mózgowych w utrwalonych zarodkach danio pręgowanego
<ol>
	<li>Zarodki należy umieścić w 250 mg/l metanosulfonianu trikainy, a następnie utrwalić je przez zanurzenie w 2 - 4% paraformaldehydzie przez noc w temperaturze 4 °C. Pojemniki z fluorescencyjnymi zarodkami należy zawinąć w folię. Po utrwaleniu zarodki należy przechowywać w PBS w temperaturze 4 °C do czasu zobrazowania - intensywność fluorescencji EGFP staje się mniej rozdzielcza po około tygodniu, ale morfologia (widziana w jasnym polu) jest zachowana znacznie dłużej.</li>
	<li>Przygotuj się do zamontowania zarodka, najpierw usuwając jedno oko za pomocą zaostrzonej igły wolframowej. Najpierw przetnij tkankę łączącą oko, następnie przetnij mięśnie, a na koniec przetnij nerw wzrokowy, aby przemieścić oko. (Uwaga: Jeśli pożądane jest obrazowanie po obu stronach, usuń oba oczy.)</li>
	<li>Po usunięciu oka zamontuj zarodek na szkle nakrywkowym za pomocą kropli 3% metylocelulozy. Ustaw zarodek tak, aby strona z usuniętym okiem była skierowana w stronę szkła nakrywkowego i znajdowała się jak najbliżej szkła. Przykryj cały zarodek metylocelulozą, aby zapobiec wysuszeniu podczas obrazowania.</li>
	<li>Natychmiast zobrazuj zamontowany zarodek za pomocą odwróconego mikroskopu konfokalnego wyposażonego w wysokiej jakości obiektyw Plan Apo 20x (apertura numeryczna = 0,75 lub lepsza). Ta konfiguracja jest lepsza niż mikroskop nieodwrócony, który wymagałby umieszczenia zarodka między dwiema szklanymi płaszczyznami i dociśnięcia zarodka do górnej szklanki.</li>
	<li>Zbieraj warstwy optyczne w odstępach co 1 μm, używając średniego lub dużego ustawienia przysłony. Można również zastosować większe kroki 2,5 μm, ale określenie kolejności przestrzennej mniejszych obiektów może być trudniejsze. Małe otwory przysłony zapewniają ostrzejsze szczegóły, ale wymagane dłuższe skany mogą wybielić EGFP, a także ograniczyć głębokość obrazowania zarodka, którą można uzyskać. Mikroskop konfokalny pozwala na obrazowanie mniej więcej w połowie zarodka.</li>
	<li>Jeśli pożądane jest obrazowanie całej ryby, należy na początku usunąć oboje oczu (patrz uwaga w kroku 3.2), obrócić zarodek po obrazowaniu z jednej strony i powtórzyć kroki 2.3 - 2.5 dla drugiej strony.</li>
</ol>
3. 3D Rekonstrukcja embrionalnej naczyniowości mózgowej danio pręgowanego
<ol>
	<li>Skorzystaj z dystrybucjiFiji 3 oprogramowania ImageJ (http://fiji.sc o otwartym kodzie źródłowym, która jest zoptymalizowana pod kątem renderowania 3D, bezpłatna i kompatybilna z komputerami PC, Mac i Linux.</li>
	<li>Zaimportuj stosy konfokalne na Fidżi, przechodząc do Plugins>LOCI>BioFormats Importer 9, a następnie wybierz plik konfokalny, np. name.ids dla stosów Nikon (Rysunek 2A). Wybierz Wyświetl stos za pomocą Hyperstack, Tryb koloru: skala szarości, sprawdź autoskalowanie, sprawdź podział kanałów.</li>
	<li>Te wybory otworzą cztery oddzielne panele kanałów; dla EGFP potrzebny będzie tylko jeden, zwykle trzeci w dół. Zamknij pozostałe trzy panele (czerwony, niebieski i alfa), pozostawiając 16-bitowy obraz z długą nazwą, po której następuje C=1 (rysunek 2A).</li>
	<li>Dostosuj próg, skanując obraz za pomocą zakładki przewijania u dołu, aby znaleźć wycinek z interesującym Cię regionem lub strukturą, a następnie przejdź do opcji Image>Adjust>Threshold (Obraz)AdjustThreshold (Rysunek 2C).</li>
	<li>W panelu, który się pojawi, przesuń górny pasek (poziom) w lewo, tak aby struktura była dość dobrze widoczna przez tło, a dolny slajd (biały poziom) pozostaw tam, gdzie jest (Rysunek 2D). Wybierz opcję Czarno-białe, a następnie wybierz opcję Ciemne tło. Nie wybieraj opcji Oblicz próg dla każdego obrazu, chyba że wymagane są różne korekty dla każdego plasterka, wybierz opcję Czarne tło. Ten proces tworzy nowy 8-bitowy obraz.</li>
	<li>OSTRZEŻENIE: Progu nie można cofnąć ani zapisać w ImageJ, więc stos konfokalny będzie musiał być ponownie ładowany za każdym razem, gdy potrzebna jest zmiana. Zapisz liczby i wypróbuj różne ustawienia, aż do osiągnięcia pożądanego rezultatu.</li>
	<li>Przejdź do Plugins>3D Viewer>Threshold 0, Resampling factor 1 (najlepszy) lub 2 (dobry), odznacz pola koloru czerwonego i niebieskiego, aby utworzyć zielony wynik 3D - w przeciwnym razie spowoduje to renderowanie bieli - wybierz Zastosuj (nie automatycznie) (Rysunek 2E).</li>
	<li>Obracaj, obracaj i powiększaj obraz 3D za pomocą elementów sterujących myszą i klawiaturą (Rysunek 2F).</li>
	<li>Zdjęcia można zapisywać w dowolnym momencie, korzystając z opcji przechwytywania w menu. Rozmiar pola obrazu na ekranie dyktuje wymiary utworzonego obrazu w pikselach, więc jeśli pożądany jest obraz o wysokiej rozdzielczości, powiększ pole, przeciągając prawy dolny róg.</li>
	<li>Utwórz obracający się film 3D, wybierając opcję Widok>Nagraj obrót o 360 stopni (Rysunek 2G). Obrót jest domyślnie ustawiony na 2 stopnie na krok, ale można go zmienić na przykład na 5 stopni, co spowoduje utworzenie znacznie mniejszych rozmiarów plików, ale może spowodować szarpnięcie animacji.</li>
	<li>Zapisz plik w jednym z kilku dostępnych formatów do późniejszego wyświetlenia za pomocą odtwarzaczy multimedialnych, przesłania do Internetu lub użycia w prezentacjach PowerPoint. Odtwarzacz multimedialny o otwartym kodzie źródłowym, VLC (<a href="http://www.videolan.org/vlc/index.html">http://www.videolan.org/vlc/index.html</a>), jest bezpłatny i bardzo dobrze radzi sobie z tymi filmami.</li>
</ol>

<ol><li>Staudt, D., Stainier, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Uncovering+the+molecular+and+cellular+mechanisms+of+heart+development+using+the+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22Annu+Rev+Genet%22%5BJournal%5D)">Uncovering the molecular and cellular mechanisms of heart development using the zebrafish.</a> Annu Rev Genet. 46, 397-418 (2012).</li>
<li>Westerfield, M. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aWesterfield%2C+M+%22The+Zebrafish+Book%22">The Zebrafish Book</a>. , University of Oregon Press. (2007).</li>
<li>Schindelin, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fiji%3A+an+open-source+platform+for+biological-image+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Methods%22%5BJournal%5D)">Fiji: an open-source platform for biological-image analysis.</a> Nat Methods. 9, 676-682 (2012).</li>
<li>Cameron, D. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Alzheimer%27s-related+peptide+amyloid-%CE%B2+plays+a+conserved+role+in+angiogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+ONE%22%5BJournal%5D)">Alzheimer's-related peptide amyloid-β plays a conserved role in angiogenesis.</a> PLoS ONE. 7, (2012).</li>
<li>Cunvong, K., Huffmire, D., Ethell, D. W., Cameron, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Amyloid-%CE%B2+increases+capillary+bed+density+in+the+adult+zebrafish+retina%5BTitle%5D)+AND+%22Invest+Ophthalmol+Vis+Sci%22%5BJournal%5D)">Amyloid-β increases capillary bed density in the adult zebrafish retina.</a> Invest Ophthalmol Vis Sci. 54, 1516-1521 (2013).</li>
<li>Jin, S. W., Beis, D., Mitchell, T., Chen, J. N., Stainier, D. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cellular+and+molecular+analyses+of+vascular+tube+and+lumen+formation+in+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Cellular and molecular analyses of vascular tube and lumen formation in zebrafish.</a> Development. 132, 5199-5209 (2005).</li>
<li>Lawrence, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+husbandry+of+zebrafish+%28Danio+rerio%29%3A+a+review%5BTitle%5D)+AND+%22Aquaculture%22%5BJournal%5D)">The husbandry of zebrafish (Danio rerio): a review.</a> Aquaculture. 269, 1-20 (2007).</li>
<li>Hagedorn, M., Kleinhans, F. W., Artemov, D., Pilatus, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+of+a+major+permeability+barrier+in+the+zebrafish+embryo%5BTitle%5D)+AND+%22Biol+Reprod%22%5BJournal%5D)">Characterization of a major permeability barrier in the zebrafish embryo.</a> Biol Reprod. 59, 1240-1250 (1998).</li>
<li>Schmid, B., Schindelin, J., Cardona, A., Longair, M., Heisenberg, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+high-level+3D+visualization+API+for+Java+and+ImageJ%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Bioinformatics%22%5BJournal%5D)">A high-level 3D visualization API for Java and ImageJ.</a> BMC Bioinformatics. 11, 274(2010).</li>
<li>Opitz, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transgenic+zebrafish+illuminate+the+dynamics+of+thyroid+morphogenesis+and+its+relationship+to+cardiovascular+development%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Biol%22%5BJournal%5D)">Transgenic zebrafish illuminate the dynamics of thyroid morphogenesis and its relationship to cardiovascular development.</a> Dev Biol. 372, 203-216 (2012).</li>
<li>Gleave, J. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neuroanatomical+phenotyping+of+the+mouse+brain+with+three-dimensional+autofluorescence+imaging%5BTitle%5D)+AND+%22Physiol+Genomics%22%5BJournal%5D)">Neuroanatomical phenotyping of the mouse brain with three-dimensional autofluorescence imaging.</a> Physiol Genomics. 44, 778-785 (2012).</li>
<li>Chung, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structural+and+molecular+interrogation+of+intact+biological+systems%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Structural and molecular interrogation of intact biological systems.</a> Nature. 497, 332-337 (2013).</li>
<li>Markaki, Y., Smeets, D., Cremer, M., Schermelleh, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fluorescence+in+situ+hybridization+applications+for+super-resolution+3D+structured+illumination+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Fluorescence in situ hybridization applications for super-resolution 3D structured illumination microscopy.</a> Methods Mol Biol. 950, 43-64 (2013).</li>
<li>Walter, T. J., Sparks, E. E., Huppert, S. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((3-dimensional+resin+casting+and+imaging+of+mouse+portal+vein+or+intrahepatic+bile+duct+system%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">3-dimensional resin casting and imaging of mouse portal vein or intrahepatic bile duct system.</a> J Vis Exp. 68, e4272(2012).</li>
</ol>

Nie ma nic do ujawnienia.

Opisane tutaj metody stanowią podstawę do wizualnych badań układu naczyniowego w rozwoju danio pręgowanego. Żywe próbki można wykorzystać do oceny parametrów fizjologicznych, takich jak tętno i objętość udaru serca, podczas gdy próbki utrwalone można wykorzystać do obrazowania konfokalnego o wysokiej rozdzielczości. Drosophila i C. elegans pozwalają na obrazowanie całego ciała, ale danio pręgowany są kręgowcami i stanowią użyteczny model dla tkanek kręgowców, w tym układu naczyniowego wyściełanego komórkami śródbłonka. Badania te mogą obejmować znaczące linie transgeniczne i zasoby genomiczne pochodzące ze społeczności badawczej danio pręgowanego. Rekonstrukcja 3D i renderowanie obrazów konfokalnych z embrionalnego danio pręgowanego, jak opisano tutaj, pozwala na podejście biologii systemowej do rozgałęzień naczyń krwionośnych i gęstości naczyń krwionośnych, co nie jest możliwe w przypadku większych modeli zwierzęcych, takich jak szczury i myszy. Ponadto, jako owodniowce, danio pręgowany rozwija się w modyfikowalnym środowisku (bufor E3), w którym można łatwo dodać substancje chemiczne, które hamują określone enzymy lub inne procesy wpływające na rozwój naczyń krwionośnych. Stężenie i czas dostarczania substancji chemicznej mogą być zmieniane, co umożliwia badaczowi precyzyjne dostrojenie warunków leczenia.
1. Modyfikacje i rozwiązywanie problemów
Modyfikacje tego systemu mogą obejmować transgeniczne linie danio pręgowanego, które wyrażają EGFP lub inne białka fluorescencyjne w różnych wzorcach specyficznych dla tkanek, narządów lub regionów10. Ponadto niedawno opublikowano analizę zmian neowaskularnych w siatkówce danio pręgowanego5. Problemy z pigmentacją u starszych zarodków i dorosłych danio pręgowanego można skompensować poprzez krzyżowanie z liniami transgenicznymi, które nie wytwarzają pigmentów łuskowatych ani pigmentu siatkówki. Problemy ze zmniejszoną fluorescencją zwykle wynikają z niewłaściwych warunków utrwalania. Optymalna jest paraformaldehyd (4%) przez 1 dzień, ale silniejsze utrwalacze, takie jak aldehyd glutarowy, tetratlenek osmu lub alkohol, mogą niszczyć fluorescencję EGFP. Po utrwaleniu zarodki powinny być przechowywane w PBS w temperaturze 4 °C i zawsze chronione przed bezpośrednim działaniem promieni słonecznych.
2. Ograniczenia tej techniki
Jakość i rozdzielczość renderingów 3D wykonanych za pomocą tego protokołu zależy od jakości generowanych obrazów. Przenikanie światła przez te zarodki jest ograniczone do płaszczyzny środkowej strzałkowej przy użyciu standardowego mikroskopu konfokalnego. Ten aspekt obrazowania ogranicza głębokość obrazowania u starszych zarodków i dorosłych, ale bardziej zaawansowane systemy mikroskopii wielofotonowej pozwalają na obrazowanie na większych głębokościach.
3. Znaczenie w odniesieniu do istniejących metod
Protokół ten zapewnia podejście do analizy sieci naczyń krwionośnych na poziomie systemów, które mogą obejmować całe zwierzę. Wcześniejsze reprezentacje takich danych często opierały się na seriach obrazów ułożonych razem, ale renderowanie 3D zapewnia lepszą rozdzielczość zaangażowanych relacji przestrzennych.
4. Przyszłe zastosowania
Nowe osiągnięcia w obrazowaniu i przetwarzaniu tkanek zapewnią wiele nowych zastosowań dla tych metod, które mogą obejmować uczynienie starszych zarodków lub dorosłych przezroczystymi11-14. Zwiększona przezroczystość znacznie zwiększy penetrację tkanek przez lasery konfokalne i wielofotonowe. Co więcej, wraz ze wzrostem prędkości kamer i fotopowielaczy, wkrótce może być możliwe tworzenie renderingów 3D ryb w czasie rzeczywistym, zapewniając4-ty wymiar analizy.
5. Kroki krytyczne
Krytycznym krokiem w tym protokole jest przygotowanie do obrazowania, które obejmuje prawidłowe utrwalenie. Obrazowanie powinno być wykonane tak szybko, jak to możliwe po utrwaleniu, za pomocą wysokiej jakości obiektywów, które mają najlepsze dostępne otwory numeryczne. Rozdzielczość zależy od zastosowanego systemu obrazowania, więc systemy wysokiej jakości są na ogół lepsze. Generowanie renderingów 3D wymaga dużej ilości pamięci w przypadku nowszych, wysokiej klasy komputerów z dużą ilością pamięci i dobrymi procesorami graficznymi.
Opisany tutaj system biologii wizualnej został zoptymalizowany dla transgenicznych danio pręgowanego, które wyrażają EGFP w komórkach śródbłonka naczyń krwionośnych, chociaż metody te można dostosować do transgenicznych zarodków, które wyrażają GFP lub inne białka fluorescencyjne w populacjach neuronów, mięśni, gruczołów lub dowolnej liczby innych komórek. Główną zaletą pracy z tym systemem jest możliwość badania, co dzieje się w całym zarodku w dowolnym momencie tego okresu rozwojowego, u zwierząt stałych i/lub żywych.

Danio pręgowany dostarcza potężnego systemu do badania biologii rozwojowej, a względna przejrzystość ich zarodków jest podatna na badania oparte na obrazowaniu1. Danio pręgowany jest obecnie od dziesięcioleci wykorzystywany jako model rozwoju kręgowców. Teleosty, w tym danio pręgowany, mają uproszczony układ naczyniowy kręgowców, który nie ma rozsądnego homologu u bezkręgowców. Krew jest pompowana z przedniej komory dwukomorowego serca przez skrzela, gdzie jest natleniona. Krew ze skrzeli zbiega się w aorcie grzbietowej i przechodzi przez tętnice, które rozgałęziają się na coraz mniejsze naczynia, docierając ostatecznie do naczyń włosowatych w tkankach narządów. W naczyniach włosowatych uwalniany jest tlen i pochłaniany jest dwutlenek węgla. Po żylnej stronie naczyń włosowatych krew przepływa do coraz większych żył i ostatecznie jest wciągana do tylnej komory serca, gdzie cykl się powtarza.
Dorosły danio pręgowany może złożyć 200 lub więcej jaj na raz, a po zapłodnieniu szybko się rozwijają2. W ciągu jednego dnia oś ciała jest dobrze rozwinięta, w tym mięśnie, które kurczą się i poruszają zarodkiem wewnątrz błony kosmówkowej. Od 2 do 7 dni po zapłodnieniu (dpf) rozwija się większość układów organizmu, w tym oczy i ośrodkowy układ nerwowy, który może koordynować pływanie w kierunku pożywienia lub z dala od jasnego światła. Do 7 zarodków dpf jest wystarczająco małych, aby umożliwić wizualizację za pomocą mikroskopii. Linie transgeniczne, które wyrażają białka fluorescencyjne, można obrazować za pomocą mikroskopii konfokalnej lub fluorescencyjnej. Obrazowanie konfokalne można połączyć z oprogramowaniem typu open source3 w celu tworzenia renderingów 3D kompletnych struktur naczyniowych w zarodkach danio pręgowanego, które zapewniają perspektywę biologii systemowej rozwoju naczyniowego. Badania dotyczące zmian w złożoności naczyń krwionośnych i naczyń mózgowych skorzystają z tego protokołu, ponieważ pozwala on na analizę sieci naczyniowych na poziomie systemowym4,5. Przedstawiono kompilację metod i zasobów, aby umożliwić łatwe przyjęcie tych technik w badaniach, które wymagają obrazowania struktur naczyniowych u embrionalnego danio pręgowanego. Efektywność kosztowa danio pręgowanego jako modelu zwierzęcego łączy się z nowymi technologiami obrazowania, aby zapewnić nowe platformy do oceny angiogennego wpływu szlaków molekularnych na rozwój kręgowców i homeostazę.

<table><tbody><tr><td>N &ndash; Fenylotiomocznik&nbsp;</td><td>Alfa Aesar, katalog #41972</td><td></td><td>0.2 M w buforze E3, przechowywany na 4 &#176; Bufor C</td></tr><tr><td>E3</td><td>Sigma</td><td></td><td>5 mM NaCl, 0,17 mM KCl, 0,33 mM CaCl2, 0,33 mM MgSO4</td></tr><tr><td>Mikroskop konfokalny&nbsp;</td><td>Nikon</td><td></td><td>D-EclipseC1 na Nikon TE-2000U</td></tr><tr><td>Naczynia ze szklanym dnem</td><td>Mat-Tek</td><td></td><td></td></tr><tr><td>GSI IX/DAPT</td><td></td><td></td><td>N-[N-(3,5-Difluorofenacetyl-L-alanyl)]-S-fenyloglicyno-butylowy ester EMD Biosciences</td></tr><tr><td>24-dołkowe&nbsp;</td><td>Becton-Dickinson, kat# 351147</td><td></td><td>Pipety transferowe BD Falcon</td></tr><tr><td>&nbsp;</td><td>VWR, kat. #414004-001</td><td></td><td>Jednorazowe pipety transferowe VWR</td></tr><tr><td>Metyloceluloza&nbsp;</td><td>Alfa Aesar, kat#43146</td><td></td><td>3% w buforze E3</td></tr><tr><td>NRD 4/6 Pokarm dla ryb&nbsp;</td><td>Krewetki solankowe Krewetki solankowe suszone</td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td>Krewetki solankowe Bezpośrednie</td><td></td><td>żywe</td></tr><tr><td>druty wolframowe&nbsp;</td><td>Małe części # TW-016-60</td><td></td><td>0,016" OD</td></tr><tr><td>Tricaine</td><td>VWR # 101107-950</td><td></td><td>Metanosulfonian trikainy 250 mg/L w buforze E3</td></tr></tbody></table>

obrazowanie i rekonstrukcja 3d struktur naczyniowo-mózgowych u embrionalnego danio pręgowanego

Imaging and 3D Reconstruction of Cerebrovascular Structures in Embryonic Zebrafish

Danio pręgowany to potężne narzędzie do badania biologii rozwojowej i patologii in vivo. Niewielki rozmiar i względna przezroczystość zarodków danio pręgowanego sprawiają, że są one szczególnie przydatne do wizualnego badania procesów, takich jak rozwój serca i naczyń krwionośnych. W kilku ostatnich badaniach transgeniczny danio pręgowany, który wykazuje ekspresję EGFP w komórkach śródbłonka naczyń krwionośnych, wykorzystano do obrazowania i analizy złożonych sieci naczyniowych w mózgu i siatkówce za pomocą mikroskopii konfokalnej. Opisy służą do przygotowania, leczenia i obrazowania zarodków danio pręgowanego, które wykazują ekspresję wzmocnionego białka zielonej fluorescencji (EGFP), a następnie wygenerowania kompleksowych renderingów 3D układu naczyniowo-mózgowego. Protokoły obejmują leczenie zarodków, obrazowanie konfokalne i protokoły fiksacji, które zachowują fluorescencję EGFP. Ponadto podano przydatne wskazówki dotyczące uzyskiwania wysokiej jakości obrazów struktur naczyniowo-mózgowych, takich jak usuwanie oka bez uszkadzania pobliskiej tkanki nerwowej. Omówiono potencjalne pułapki związane z obrazowaniem konfokalnym, a także kroki niezbędne do generowania rekonstrukcji 3D ze stosów obrazów konfokalnych przy użyciu ogólnodostępnego oprogramowania open source.

Rekonstrukcja 3D struktur naczyniowych zapewnia kompleksową i interesującą wizualnie perspektywę rozwoju danio prążkowanego. Ryciny 1 i 2 przedstawiają metody w sposób, w jaki są one zazwyczaj wykonywane. Rycina 3 pokazuje kilka kątów struktur naczyniowych w embrionie danio prążkowanego w 6 dpf, który wykazuje ekspresję EGFP w komórkach śródbłonka. Przy jednolitym zielonym lub białym kolorze trudniej jest ocenić intensywność sygnału; pseudokolorowanie przypisuje intensywność obrazu na podstawie tabeli przeglądowej i pozwala na lepsze postrzeganie głębi, gdy struktury na siebie nachodzą. Przykład pseudokolorowanego obrazu 3D naczyń w 6 dpf danio prążkowanego przedstawiono na Rycynie 4. Obrazowanie fluorescencyjne żywych embrionów może być wykorzystane do badania charakterystyk fizjologicznych, obejmujących ruch oka i ciała oraz aktywność serca. Ryciny 3 i 4 pokazują reprezentatywne wyniki uzyskane tymi metodami z użyciem opisanej transgenicznej linii danio prążkowanego. Rozdzielczość obrazowania zależy od charakterystyki mikroskopu, jednak jasność sygnału EGFP jest wystarczająca do uzyskania dobrej jakości obrazu w większości systemów komercyjnych. Rekonstrukcja i renderowanie reprezentacji 3D są powtarzalne, a opcje dostępne w tym oprogramowaniu open-source zapewniają konsekwentnie dobre wyniki.
<img alt="Schemat etapów wypreparowania oka rybki zebrafish: nacięcie, usunięcie oka, montaż do badań nad biologią rozwoju." fo:content-width="6in" src="/files/ftp_upload/50417/50417fig1highres.jpg" width="600" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Rysunek 1"> 
Rysunek 1. Usunięcie oka. A) Utrwalony zarodek w 3 dpf z igłą wolframową umieszczoną obok oka. Z tej pozycji nacinana jest tkanka wokół oka. B) Oko wypada, a znajdujące się pod nim mięśnie gałkowe i nerw wzrokowy zostają przecięte. Pusty oczodół zaznaczono przerywanym okręgiem. C) Ten sam zarodek zostaje odwrócony i zamontowany w metylocelulozie, tak aby nienaruszone oko było skierowane do góry. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/50417/50417fig1highres.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby zobaczyć powiększoną wersję tego rysunku.</a>
<img alt="Przetwarzanie obrazów rentgenowskich w celu analizy struktury kości, ilustrujące regulację progu w oprogramowaniu analitycznym." fo:content-width="6in" src="/files/ftp_upload/50417/50417fig2highres.jpg" width="600" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Rysunek 2"> 
Rysunek 2. Krok po kroku rekonstrukcja 3D stosu obrazów konfokalnych. A) Otwarcie pliku (4104.1.ids) załadowanego w programie Fiji za pomocą Plugins&gt;LOCI&gt;Bioformat w celu wyboru. B) Po zlokalizowaniu przekroju z obszarem zainteresowania wybrano regulację progu, jak pokazano. C) Próg został ustawiony na 214 za pomocą górnego suwaka, a następnie wybrano opcję apply. D) Wywołano widok 3D, jak pokazano. E) Przedstawiono rekonstrukcję 3D danio przebrzuchłego z nienaruszonym okiem w celu orientacji. F) Obraz został powiększony i obrócony. G) Utworzono film z obrotem o 360 stopni, jak pokazano. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/50417/50417fig2highres.jpg" target="_blank">Aby zobaczyć powiększoną wersję tego rysunku, kliknij tutaj.</a>
<img alt="Obrazy mikroskopii fluorescencyjnej, przekroje tkanek, znakowanie białkiem fluorescencyjnym GFP." fo:content-width="6in" src="/files/ftp_upload/50417/50417fig3highres.jpg" width="600" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Rycina 3"> 
Rycina 3. Perspektywy z rekonstrukcji 3D. A) Widok przyśrodkowy zarodka w 6 dpf obrazowany obiektywem 10x; otwór gębowy znajduje się po prawej stronie, wewnątrz nie widać skrzeli. B) Widok boczny tego samego zarodka, zwróć uwagę, że płetwa tworzy pętlę w środku. C) Ten sam zarodek obrazowany obiektywem 20x, widok przyśrodkowy, zwróć uwagę na rozdzielczość skrzeli. D) Widok boczny obrazowania obiektywem 20x. Płetwa znajduje się na prawej krawędzi panelu. E) Widok przednio-przyśrodkowy obrazowania obiektywem 20x, zwróć uwagę na skrzela wewnątrz otworu gębowego. F) Brzuch tego samego zarodka obrazowany obiektywem 20x, głowa skierowana w prawo. Zwróć uwagę na układ naczyniowy na worku żółtkowym w dolnym prawym rogu. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/50417/50417fig3highres.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.</a>
<img alt="Schemat mikroskopii fluorescencyjnej zebrafish, przedstawiający mózg, worek żółtkowy, skrzela; analiza struktury naczyniowej." fo:content-width="6in" src="/files/ftp_upload/50417/50417fig4highres.jpg" width="600" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Rycina 4"> 
Rycina 4. Różnice w intensywności w embrionie w 6 dpf. Obraz rekonstrukcji w 6 dpf z wykorzystaniem pseudokolorowej tabeli wyszukiwania (LUT) dla intensywności sygnału. W celu orientacji zaznaczono jamę ustną, mózg, skrzela i worek żółtkowy. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/50417/50417fig4highres.jpg" target="_blank">Aby wyświetlić większą wersję tej ryciny, kliknij tutaj.</a>
<img alt="Obraz mikroskopowy sieci grzybni, wizualizacja fluorescencyjno-zielona, analiza struktury grzybów." fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/50417/Zfish_still.jpg" width="500" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Rysunek 5"> 
Rysunek 5. Film zrekonstruowanego układu naczyniowego u 4 dpf zebrafish. Ryba została zobrazowana w rozdzielczości 2.5 μm. Obrazy przedstawiają jedną połowę zarodka. Porównaj struktury naczyniowe ze strukturami u zebrafish poddanego działaniu GSI, przedstawionymi na Rysunku 6. Zwróć uwagę na niższą gęstość naczyń krwionośnych w głowie oraz większe skrzela. (Patrz plik uzupełniający „Zfish_spin.avi” w sekcji Pobieranie)
<img alt="Mikroskopia fluorescencyjna naczyń krwionośnych danio pręgowanego, zielona fluorescencja, obraz z badań biologicznych." fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/50417/Zfish_still1.jpg" width="500" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Rysunek 6"> 
Rysunek 6. Film 3D układu naczyniowego w embrionie traktowanym GSI w 4. dniu po zapłodnieniu (dpf). Obrazowanie ryby wykonano w odstępach 2,5 μm od strony bocznej do linii środkowej. Porównaj struktury naczyniowe z rybą kontrolną w 4. dniu po zapłodnieniu przedstawioną na Rysunku 5. Wygięty grzbiet i mniejszy rozmiar są typowe dla embrionów traktowanych tym związkiem chemicznym. (Patrz plik uzupełniający „GSI-treated_4dpf_fish.avi” w sekcji Downloads)

Opisano obrazowanie rozwoju naczyń mózgowych u larw danio pręgowanego. Dostępne są również techniki ułatwiające obrazowanie 3D i modyfikujące rozwój naczyń mózgowych za pomocą zabiegów chemicznych.

Obrazowanie i rekonstrukcja 3D struktur naczyniowo-mózgowych u embrionalnego danio pręgowanego

Zebrafish are a powerful tool to study developmental biology and pathology in vivo.  The small size and relative transparency of zebrafish embryos make ...

Ogólnym celem niniejszej procedury jest ocena struktur naczyniowych mózgu u embrionów ryb danio prążkowanych. Osiąga się to poprzez wstępne zebranie zapłodnionych ikry danio prążkowanych i ustalenie warunków traktowania. Po trzydniowym okresie wzrostu ryby danio prążkowane są uśmiercane i utrwalane, a następnie ostrożnie usuwa się oko przed osadzeniem preparatu na szkiełku nakrywowym.Następnie unaczynienie mózgu obrazuje się za pomocą mikroskopii konfokalnej. Na koniec, przy użyciu oprogramowania o otwartym kodzie źródłowym, generuje się rendery 3D naczyń krwionośnych. Ostatecznie analiza rekonstrukcji służy do określenia wpływu warunków leczenia na rozgałęzianie i gęstość naczyń krwionośnych.W rozwijającym się mózgu danio pręgowanego. Technika ta pozwala na ocenę całego układu naczyniowego embrionów danio pręgowanego. Umożliwiło nam to badanie biologii amyloidu beta na poziomie układów narządowych.Wizualna demonstracja tej metody jest kluczowa, ponieważ sekcja i analiza obrazu są trudne do opanowania ze względu na wysoki stopień skomplikowania technicznego. W pierwszej kolejności należy hodować transgeniczny szczep danio pręgowanego, wykazujący ekspresję wzmocnionego zielonego białka fluorescencyjnego w pożądanych tkankach, w temperaturze 28.5 °C przy 14-godzinnym cyklu światła i 10-godzinnym cyklu ciemności. W tym przykładzie ryby transgeniczne, które wykazują ekspresję EGFP w komórkach śródbłonka naczyniowego, są hodowane; wieczorem, przed zbiorem jaj, umieszcza się samce i samice w zbiornikach do tarła z siatkowym dnem. Następnego ranka należy usunąć przegrodę i pozwolić rybom na tarło, sprawdzając obecność jaj co 15 minut.Po zebraniu jaj i medium E3 za pomocą sitka o drobnych oczkach w celu ich przemycia, należy przenieść jaja do szalek hodowlanych o średnicy 100 mm za pomocą medium E3 i inkubować je w temperaturze 28°C, aby zmodyfikować rozgałęzienia naczyń mózgowych. Począwszy od 24 godzin po zapłodnieniu, należy dodać substancję chemiczną, taką jak inhibitor gamma-sekretazy rozpuszczony w DMSO. W razie potrzeby można dodać 0,03% PTU, aby zahamować tworzenie się pigmentu.Po przeniesieniu zarodków w roztworze do dołków płytki 12-dołkowej, inkubować w temperaturze 28,5 °C, aż zarodki osiągną pożądany stopień rozwoju. Następnie utrwalić zarodki w trica i inkubować w aldehydzie przez noc w temperaturze 4 °C. Przechowywać zarodki w PBS w ciemności w temperaturze 4 °C.Aby usunąć oko z zarodka, należy użyć zaostrzonej igły wolframowej i wyciąć tkankę łączącą jedno z oczu. Następnie należy przeciąć mięśnie, a na koniec nerw wzrokowy, aby wydobyć oko. Po usunięciu oka należy obrócić zarodek na szkiełku nakrywkowe tak, aby pusty oczodół był skierowany w dół i dotykał szkiełka.Dodaj kroplę 3% metylocelulozy, aby unieruchomić embrion i pokryć go w całości, co zapobiegnie wysychaniu. Podczas obrazowania za pomocą odwróconego mikroskopu konfokalnego z obiektywem plan APO 20x, obrazuj embrion niezwłocznie; wiele systemów obrazowania będzie w stanie rozdzielić struktury naczyniowe tylko do połowy preparatu. W takim przypadku zawieś embrion w PBS i zamontuj go ponownie po przeciwnej stronie w celu dalszego obrazowania, aby przeprowadzić rekonstrukcję 3D obrazów naczyń mózgowych przy użyciu programu ImageJ, który jest zoptymalizowany do renderowania 3D.Zaimportuj stosy konfokalne, przechodząc do plugins, loci, bio formats importer, a następnie wybierz plik konfokalny dla stosów Nikon, wybierz view stack with hyper stack i ustaw tryb kolorów na gray scale. Następnie zaznacz auto scale oraz split channels. Wybrane opcje otworzą cztery oddzielne panele kanałów.Zamknij wszystkie obrazy z wyjątkiem obrazu 16-bitowego, którego nazwa pliku kończy się frazą c equals one. Dostosuj próg, korzystając z paska przewijania na dole, aby przeszukać obraz i znaleźć przekrój zawierający interesujący region lub strukturę. Następnie przejdź do opcji image adjust threshold.W wyświetlonym panelu przesuń górny suwak w lewo, aby struktura była wyraźnie widoczna na tle, a dolny suwak pozostaw w niezmienionej pozycji, aby utworzyć nowy obraz ośmiobitowy. Wybierz opcję b and w, a następnie dark background.Nie zaznaczaj opcji obliczania progu (calculate threshold) dla każdego obrazu, chyba że każdy przekrój wymaga innych ustawień. Następnie przejdź do plugins 3D viewer threshold zero resampling factor one or two i odznacz czerwone oraz niebieskie pola kolorów, aby uzyskać zielony obraz 3D. W przeciwnym razie renderowanie będzie białe.Następnie wybierz opcję zastosuj. Użyj myszy i klawiatury, aby obracać, obracać wokół osi i powiększać obraz 3D, co pozwoli na zapisanie nieruchomych obrazów w dowolnym momencie. W tym celu skorzystaj z opcji przechwytywania w menu.Wielkość ramki obrazu na ekranie określa wymiary w pikselach generowanego obrazu; zatem, jeśli pożądana jest wysoka rozdzielczość, należy powiększyć ramkę, przeciągając jej prawy dolny róg. Aby utworzyć obracający się film 3D, należy wybrać opcję zapisu widoku z obrotem o 360 stopni. Na koniec należy zapisać plik w jednym z kilku dostępnych formatów i użyć bezpłatnego odtwarzacza multimedialnego o otwartym kodzie źródłowym VLC do odtwarzania treści 3D.Rekonstrukcja struktur naczyniowych zapewnia kompleksową i interesującą wizualnie perspektywę rozwoju danio pręgowanego. Przedstawiono tutaj kilka ujęć struktur naczyniowych w embrionie danio pręgowanego sześć dni po zapłodnieniu, w którym komórki śródbłonka wykazywały ekspresję EGFP, w kolorach monochromatycznej zieleni lub bieli. Trudno może być ocenić intensywność sygnału, jednak pseudokolorowanie przypisuje intensywność obrazu z tabeli wyszukiwania, co pozwala na lepsze postrzeganie głębi nakładających się na siebie struktur.Na przykład niniejsza rycina przedstawia obraz 3D w pseudokolorach naczyń krwionośnych u sześciodniowej larwy danio pręgowanego po zapłodnieniu, po zakończeniu ich rozwoju. Technika ta pozwoliła nam zbadać wpływ amyloidu beta na układ naczyniowy w mózgu kręgowca. Po obejrzeniu tego filmu powinni Państwo posiadać gruntowną wiedzę na temat wizualizacji sieci naczyniowych u embrionalnych ryb danio, które stanowią ekonomiczny i dostępny system do badania angiogenezy.

imaging-3d-reconstruction-cerebrovascular-structures-embryonic

Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

Obrazowanie i 3D Rekonstrukcja Struktur Naczyń Mózgowych U Zarodków Rybki Zebrowanej

W tym filmie demonstrujemy metodę analizy rozwijającego się mózgu kręgowca w żywych embrionach danio pręgowanego z rozdzielczością pojedynczej komórki przy użyciu mikroskopii konfokalnej. Obejmuje ona sposób, w jaki wstrzykujemy substancje do embrionu danio pręgowanego w stadium jednej komórki, a następnie montujemy i obrazujemy rozwijający się mózg.

Obrazowanie na żywo embrionalnego mózgu rybki zebrafish przy użyciu mikroskopii konfokalnej

Po uformowaniu się rurki neuralnej neuroepithelium ulega zwężeniu i fałdowaniu, podczas gdy rurka wypełnia się embrionalnym płynem mózgowo-rdzeniowym (eCSF), tworząc embrionalne komory mózgu. Opracowaliśmy tę technikę wstrzykiwania do komór, aby lepiej wizualizować wypełnioną płynem przestrzeń w kontraście do kształtu neuroepithelium w żywym embrionie.

Iniekcja do komór mózgowych danio pręgowanego

Obrazowanie konfokalne w czasie jest potężną techniką przydatną do charakteryzowania rozwoju embrionalnego. W tym miejscu opisujemy metodologię i charakteryzujemy morfogenezę twarzoczaszki w zarodkach typu dzikiego, a także pdgfra, smad5 i zmutowanych smo.

Analiza morfogenezy twarzoczaszki u danio pręgowanego przy użyciu mikroskopii konfokalnej 4D

Obrazowanie dynamicznego zachowania organelli i innych struktur subkomórkowych in vivo może rzucić światło na ich funkcję w warunkach fizjologicznych i chorobowych. W tym artykule przedstawiono metody genetycznego znakowania dwóch organelli, centrosomów i mitochondriów oraz obrazowania ich dynamiki w żywych zarodkach danio pręgowanego za pomocą mikroskopii szerokokątnej i konfokalnej.

Obrazowanie struktur subkomórkowych w żywym zarodku danio pręgowanego

Tutaj prezentujemy uniwersalną metodę montażu, która pozwala na długoterminowe obrazowanie poklatkowe rozwoju tylnej części ciała żywych zarodków danio pręgowanego bez zakłócania normalnego rozwoju.

Uniwersalna metoda montażu do długoterminowego obrazowania rozwoju danio pręgowanego

Obrazowanie in vivo jest potężnym narzędziem, które może być użyte do zbadania mechanizmów komórkowych leżących u podstaw rozwoju układu nerwowego. W tym miejscu opisujemy technikę wykorzystania poklatkowej mikroskopii konfokalnej do wizualizacji dużej liczby wielokolorowych komórek znakowanych Brainbow w czasie rzeczywistym w rozwijającym się układzie nerwowym danio pręgowanego.

Wizualizacja rozwijającego się mózgu u żyjących danio pręgowanych za pomocą Brainbow i poklatkowego obrazowania konfokalnego

Ten protokół opisuje podejście do etykietowania in toto i wielowymiarowego obrazowania wczesnego rozwoju oczu danio pręgowanego. Opisujemy znakowanie, osadzanie i obrazowanie czterowymiarowe (4D) za pomocą laserowej skaningowej mikroskopii konfokalnej oraz rozważania dotyczące optymalizacji pozyskiwania zestawów danych do analizy mechanizmów morfogenezy panewki wzrokowej.

4-wymiarowe obrazowanie morfogenezy kubka wzrokowego danio pręgowanego

Tutaj prezentujemy metodę obrazowania embrionalnego mózgu danio pręgowanego in vivo, aż do stadium larwalnego i młodocianego. Ta mikroinwazyjna procedura, zaadaptowana z podejść elektrofizjologicznych, zapewnia dostęp do szczegółów komórkowych i subkomórkowych dojrzałego neuronu i może być połączona z badaniami optogenetycznymi i neurofarmakologicznymi w celu scharakteryzowania funkcji mózgu i interwencji farmakologicznej.

Obrazowanie in vivo w pełni aktywnej tkanki mózgowej u wybudzonych larw i osobników młodocianych danio pręgowanego poprzez usunięcie czaszki i skóry

Prezentowany tutaj jest protokół do obrazowania in vivo całego mózgu larw danio pręgowanego za pomocą trójwymiarowej mikroskopii fluorescencyjnej. Procedura eksperymentalna obejmuje przygotowanie próbki, akwizycję obrazu i wizualizację.

In vivo (in vivo) Obrazowanie całego mózgu larw danio pręgowanego za pomocą trójwymiarowej mikroskopii fluorescencyjnej

Protokół ten opisuje tanią metodę mikroskopii świetlnej do oceny morfologii i funkcji serca w embrionach danio pręgowanych, umożliwiającą powtarzalną ocenę rozwojowej kardiotoksyczności bez potrzeby stosowania zaawansowanych systemów obrazowania.

Funkcjonalne obrazowanie serca w zarodkach danio dano za pomocą standardowej mikroskopii i analizy wideo: zastosowania w badaniach środowiskowych i biomedycznych

Poznaj metody obrazowania i rekonstrukcji 3D struktur naczyniowo-mózgowych u embrionalnego danio pręgowanego. Technika ta umożliwia badanie rozwoju układu naczyniowego i angiogenezy.

Obrazowanie i rekonstrukcja 3D struktur naczyniowo-mózgowych u embrionalnego danio pręgowanego

Przeglądaj więcej filmów