Name: Analiza immunohistochemiczna w ośrodkowym układzie nerwowym szczura i skrawkach tkanek obwodowych węzłów chłonnych (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-11-14T12:30:00.000+00:00
Duration: 9 min 11 s
Description: Poznaj protokół podwójnego immunobarwienia w tkankach OUN i węzłach chłonnych szczura. Metoda umożliwia wizualizację lokalizacji białek przy użyciu mikroskopii świetlnej.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Dziękujemy Hansowi Lassmannowi i Janowi Bauerowi za ich wskazówki i wsparcie. Dziękujemy również Katalin Benedek za doskonałą pomoc techniczną oraz Caroline Westerlund za krytyczną i językową ocenę.
To badanie było wspierane przez granty od Biogen Idec, Fundacji Wenner-Gren, Szwedzkiej Rady ds. Badań Naukowych, Szwedzkiego Stowarzyszenia Osób z Niepełnosprawnościami Neurologicznymi, Szwedzkiej Fundacji Mózgu, EU 6TH Framework EURATools (LSHG-CT-2005-019015) i Neuropromise (LSHM-CT-2005-018637). Fundatorzy nie odgrywali żadnej roli w projektowaniu badania, gromadzeniu i analizie danych, podejmowaniu decyzji o publikacji lub przygotowaniu manuskryptu.

Oświadczenie etyczne 
Niniejsze badanie zostało przeprowadzone zgodnie z wytycznymi Szwedzkiej Krajowej Rady ds. Zwierząt Laboratoryjnych oraz Dyrektywą Rady Wspólnoty Europejskiej (86/609/EWG) na podstawie zezwoleń etycznych N338/09, N15/10 i N65/10, które zostały zatwierdzone przez Komitet ds. Etyki Zwierząt w Północnym Sztokholmie.
1. Przygotowanie tkanek
<ol>
	<li>Perfuzja i utrwalenie
	<ol>
		<li>Znieczulić zwierzę izofluranem w celu przeprowadzenia perfuzji przezsercowej przez lewą komorę. Rozpocząć płukanie naczyń krwionośnych solą fizjologiczną buforowaną fosforanami (PBS) w celu usunięcia składników krwi, a następnie 4% paraformaldehydu w 0,1 M PBS (PFA).</li>
		<li>Utrwal wypreparowane mózgi, rdzeń kręgowy i obwodową tkankę LN, zanurzając się w PFA. Po 24 godzinach w temperaturze 4 °C przenieść tkankę z PFA do PBS i przechowywać w temperaturze 4 °C do czasu dalszego przetwarzania. Alternatywnie do komercyjnego PBS, rozpuścić 9 g NaCl w 250 ml buforu Sörensena i dodać 750 ml wody dejonizowanej (dH2O); przygotować 0,2 M bufor Sörensena (pH 7,4) rozpuścić 13,8 g NaH2PO4 x 1H2O i 71,2 g Na2HPO4 x 2H2O w 2,5 L dH2O.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Odwodnienie i osadzanie
	<ol>
		<li>Pokrój tkankę na porcje o grubości około 5 mm za pomocą żyletki.</li>
		<li>Rozpocznij proces utwardzania tkanek (odwodnienia) za pomocą procesora do infiltracji próżniowej Tissue-TekV.I.P (STANDARDOWA PROCEDURA POLEGAJĄCA NA ZANURZENIU W ROSNĄCYCH STĘŻENIACH ETANOLU, NASTĘPNIE KSYLENU I WRESZCIE PARAFINY (tabela 1).</li>
		<li>Umieść chusteczkę w formie i wlej płynną parafinę wokół próbki, aby utworzyć "blok parafiny". Długotrwałe przechowywanie wymaga temperatury pokojowej (RT). Jednak przed cięciem zaleca się schłodzenie bloków, np. przez noc (o/n) w temperaturze 4 °C.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
2. Podział na sekcje
<ol>
	<li>Umieść blok parafiny w stałym uchwycie mikrotomu sań, który może poruszać się do tyłu i do przodu po nożu. Dostosuj optymalny kąt między blokiem a nożem mikrotomowym (zależy to od geometrii noża, ale także od prędkości i techniki cięcia).</li>
	<li>Wyciąć przekroje o grubości 3 - 5 μm z bloku parafinowego.</li>
	<li>Przenieś właśnie wycięty fragment do pojemnika na wodę, a następnie zamontuj go z wody na szklanym szkiełku.</li>
	<li>Ostrożnie dociśnij zamontowaną sekcję do ręcznika papierowego, aby usunąć resztki wody i potencjalne pęcherzyki powietrza. Zalecane są komercyjnie wstępnie powlekane szkiełka samoprzylepne.</li>
	<li>Suche zjeżdżalnie zamontowane przez kilka godzin w piecu w temperaturze 50 - 60 °C.</li>
</ol>
3. Deparafinowanie (nawodnienie i blokowanie endogennej peroksydazy)
<ol>
	<li>Zanurz szkiełka 2x w ksylenie (alternatywnie substytut ksylenu XEM-200), za każdym razem 15 - 20'.</li>
	<li>Spłucz w 99% etanolu.</li>
	<li>Aby zablokować endogenną aktywność peroksydazy, inkubuj skrawki przez 30' w roztworze metanolu zawierającym 0,25% nadtlenku wodoru.</li>
	<li>Kontynuuj nawadnianie, stosując etanol o zwiększonej zawartości wody (99%, 70%, kończąc w wodzie destylowanej.</li>
	<li>Od tego momentu, aż do momentu montażu szkiełek nakrywkowych, sekcje muszą być wilgotne.</li>
</ol>
4. Pobieranie antygenu
<ol>
	<li>Do gotowania szkiełek należy używać parowaru w roztworze do pobierania antygenu (w tym przypadku buforze EDTA pH 8,5) przez 60' (podstawowy roztwór buforowy EDTA zawiera 1,21 g Tris i 0,37 g EDTA rozpuszczonych w 50 ml dH2O; w celu przygotowania roztworu roboczego rozcieńczyć 2,5 ml roztworu podstawowego EDTA w 47,5 ml dH2O).</li>
	<li>Schłodzić szkiełka na RT przez ok. 1 godzinę, a następnie spłukać 3 - 5x buforowaną solą fizjologiczną Tris (TBS, stosować alternatywnie PBS) składającą się z 0,05 M Tris i 0,15 M NaCl; pH 7,5 skorygowane HCl. Alternatywnie użyj komercyjnego TBS.</li>
</ol>
5. Blokowanie nieokreślonych stron wiążących
<ol>
	<li>Aby uniknąć niespecyficznych reakcji tła, należy inkubować skrawki na RT przez 30' w roztworze blokującym zawierającym 10% płodowej surowicy cielęcej (FCS) i 90% buforu DAKO.</li>
</ol>
6. Podwójne znakowanie immunologiczne: jednoczesna inkubacja z pierwotnym abs
<ol>
	<li>Rozcieńczyć wymaganą ilość przeciwciał pierwszorzędowych w roztworze blokującym i inkubować o/n w temperaturze 4 °C. W celu podwójnego barwienia immunologicznego należy połączyć α-eotaksynę (Ccl11; 1:300) z α-Cd68 (Ed1; 1:1,000) lub α-Iba1 (Aif1, 1:1,000) lub α-Cd8α (Ox-8; 1:200).</li>
	<li>Przepłukać szkiełka 3-5x buforem TBS (użyć alternatywnie 10x rozcieńczonego buforu DAKO).</li>
	<li>Rozcieńczyć wymaganą ilość przeciwciał drugorzędowych (biotynylowane przeciwciała antykozie i anty-myszy sprzężone z AP, oba w stosunku 1:200) w roztworze blokującym i inkubować przez 1 godzinę na RT.</li>
	<li>Przepłukać szkiełka 3 - 5x buforem TBS (użyć alternatywnie 10x rozcieńczonego buforu DAKO).</li>
	<li>Inkubować szkiełka z kompleksem peroksydazy awidynowo-chrzanowej (HRP) rozcieńczonym w roztworze blokującym przez 1 godzinę w temperaturze pokojowej.</li>
	<li>Przepłukać szkiełka 3 - 5x buforem TBS (użyć alternatywnie 10x rozcieńczonego buforu DAKO).</li>
</ol>
7. Wizualizacja
<ol>
	<li>Wizualizacja związanego przeciwciała drugorzędowego znakowanego AP
	<ol>
		<li>Przygotować 0,1 M bufor Tris-HCl, rozpuszczając 12,1 g Tris w 1 L dH2O i dostosować pH do za pomocą HCl. Użyj tego samego buforu Tris-HCl do przygotowania 1 M roztworu lewamizolu. Przygotować świeżo 4% roztwórNaNO2 w dH2O.</li>
		<li>Aby otrzymać 50 ml substratu Fast Blue (FB) (objętość wymagana dla jednej standardowej szklanej kuwety), rozpuścić 6,25 mg fosforanu naftol-AS-MX w 312,5 μl DMF w szklanej probówce i wymieszać z 50 ml wstępnie podgrzanego (37 °C) buforu Tris-HCl. Aby rozpuścić 12,5 mg soli FB RR w 312,5 μl 2 N HCl, dodaj 312,5 μl wcześniej przygotowanego 4% roztworuNaNO2 i wymieszaj mieszaninę z tymi samymi 50 ml wstępnie podgrzanego buforu Tris-HCl. Lekko wstrząsać, aż żółty płyn stanie się klarowny, a na koniec dodać 77 μl wcześniej przygotowanego 1 M roztworu lewamizolu. Przefiltrować otrzymaną mieszaninę i wylać na szkiełka umieszczone w szklanej kuwecie.</li>
		<li>Rozpocząć inkubację w temperaturze 37 °C i kontrolować proces wywoływania pod mikroskopem świetlnym co ok. 15 - 30 minut. Jeśli stanie się rozmyty, zastąp roztwór FB świeżą mieszanką.</li>
		<li>Przepłukać szkiełka 3 - 5 razy buforem TBS, a następnie przenieść do bufora PBS.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Wizualizacja związanego biotynylowanego przeciwciała drugorzędowego
	<ol>
		<li>Przygotować roztwór rozwijający DAB/H2O2 przez rozcieńczenie 1 ml roztworu podstawowego DAB (25 mg DAB na 1 ml PBS) w 49 ml PBS. Dodać 16,5 μlH2O2i przefiltrować przed wylaniem na sekcje.</li>
		<li>Konwersja chromogenu DAB w wytrącający się brązowy pigment może być natychmiastowa. Kontroluj proces wywoływania pod mikroskopem świetlnym (nawet kilka sekund dłuższej inkubacji może podnieść wysokie tło i zamaskować określony sygnał).</li>
		<li>Intensywność osadu brązowego pigmentu można alternatywnie zwiększyć przez inkubację w roztworze składającym się z 2% siarczanu miedzi i 0,9% NaCl przez 5'.</li>
		<li>Przepłukać szkiełka 3 - 5x PBS i na koniec dH2O, użyć alternatywnie wody z kranu.</li>
		<li>Szkiełka z szkiełkami nakrywkowymi należy montować bezpośrednio z wody za pomocą wodnego medium montażowego GelTol. Unikaj tworzenia się pęcherzyków powietrza.</li>
		<li>Pozostawić do całkowitego wyschnięcia medium montażowego, np. o/n w temperaturze 4 °C. Wysuszone szkiełka należy przechowywać na RT.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Rozdział 1.</td>
			<td>% Etanol</td>
			<td>20'</td>
			<td>40 °C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>cyfra arabska.</td>
			<td>% Etanol</td>
			<td>60'</td>
			<td>40 °C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rozdział 3.</td>
			<td>% Etanol</td>
			<td>90'</td>
			<td>40 °C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rozdział 4.</td>
			<td>% Etanol</td>
			<td>60'</td>
			<td>40 °C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rozdział 5.</td>
			<td>% Etanol</td>
			<td>90'</td>
			<td>40 °C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lokal mieszkalny</td>
			<td>% Etanol</td>
			<td>60'</td>
			<td>40 °C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rozdział 7.</td>
			<td>% Etanol</td>
			<td>90'</td>
			<td>40 °C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rozdział 8.</td>
			<td>% Etanol</td>
			<td>120'</td>
			<td>40 °C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rozdział 9.</td>
			<td>Ksylol</td>
			<td>30'</td>
			<td>40 °C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rozdział 10.</td>
			<td>Ksylol</td>
			<td>60'</td>
			<td>40 °C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rozdział 11.</td>
			<td>parafina</td>
			<td>60'</td>
			<td>60 °C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rozdział 12.</td>
			<td>parafina</td>
			<td>60'</td>
			<td>60 °C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rozdział 13.</td>
			<td>parafina</td>
			<td>60'</td>
			<td>60 °C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rozdział 14.</td>
			<td>parafina</td>
			<td>120'</td>
			<td>60 °C</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
Tabela 1. Przetwarzanie tkanek przez procesor infiltracji próżniowej Tissue-TekV.I.P.

<ol><li>Coons, A., Creech, H. J., Jones, R. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Immunological+properties+of+an+antibody+containing+a+fluorescent+group%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Soc+Exp+Biol+Med%22%5BJournal%5D)">Immunological properties of an antibody containing a fluorescent group.</a> Proc Soc Exp Biol Med. 47, 200-202 (1941).</li>
<li>Nakane, P. K., Pierce, G. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Enzyme-labeled+antibodies%3A+preparation+and+application+for+the+localization+of+antigens%5BTitle%5D)+AND+%22The+journal+of+histochemistry+and+cytochemistry+%3A+official+journal+of+the+Histochemistry+Society%22%5BJournal%5D)">Enzyme-labeled antibodies: preparation and application for the localization of antigens.</a> The journal of histochemistry and cytochemistry : official journal of the Histochemistry Society. 14, 929-931 (1966).</li>
<li>Avrameas, S., Uriel, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Method+of+antigen+and+antibody+labelling+with+enzymes+and+its+immunodiffusion+application%5BTitle%5D)+AND+%22C+R+Acad+Sci+Hebd+Seances+Acad+Sci+D%22%5BJournal%5D)">Method of antigen and antibody labelling with enzymes and its immunodiffusion application.</a> C R Acad Sci Hebd Seances Acad Sci D. 262, 2543-2545 (1966).</li>
<li>Mason, D. Y., Sammons, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid+preparation+of+peroxidase%3A+anti-peroxidase+complexes+for+immunocytochemical+use%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+immunological%22%5BJournal%5D)">Rapid preparation of peroxidase: anti-peroxidase complexes for immunocytochemical use.</a> Journal of immunological. 20, 317-324 (1978).</li>
<li>Faulk, W. P., Taylor, G. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+immunocolloid+method+for+the+electron+microscope%5BTitle%5D)+AND+%22Immunochemistry%22%5BJournal%5D)">An immunocolloid method for the electron microscope.</a> Immunochemistry. 8, 1081-1083 (1971).</li>
<li>Coons, A. H., Kaplan, M. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Localization+of+antigen+in+tissue+cells%3B+improvements+in+a+method+for+the+detection+of+antigen+by+means+of+fluorescent+antibody%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+experimental+medicine%22%5BJournal%5D)">Localization of antigen in tissue cells; improvements in a method for the detection of antigen by means of fluorescent antibody.</a> The Journal of experimental medicine. 91, 1-13 (1950).</li>
<li>Polak, J. M., Van Noorden, S. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aPolak%2C+JM+%22Introduction+to+immunocytochemistry%22">Introduction to immunocytochemistry</a>. , Bios Scientific Publishers Ltd. Oxford, UK. (2003).</li>
<li>Elias, J. M., Margiotta, M., Gaborc, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sensitivity+and+detection+efficiency+of+the+peroxidase+antiperoxidase+%28PAP%29%2C+avidin-biotin+peroxidase+complex+%28ABC%29%2C+and+peroxidase-labeled+avidin-biotin+%28LAB%29+methods%5BTitle%5D)+AND+%22American+journal+of+clinical+pathology%22%5BJournal%5D)">Sensitivity and detection efficiency of the peroxidase antiperoxidase (PAP), avidin-biotin peroxidase complex (ABC), and peroxidase-labeled avidin-biotin (LAB) methods.</a> American journal of clinical pathology. 92, 62-67 (1989).</li>
<li>Ramos-Vara, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Technical+aspects+of+immunohistochemistry%5BTitle%5D)+AND+%22Vet+Pathol%22%5BJournal%5D)">Technical aspects of immunohistochemistry.</a> Vet Pathol. 42, 405-426 (2005).</li>
<li>Adzemovic, M. Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Expression+of+Ccl11+associates+with+immune+response+modulation+and+protection+against+neuroinflammation+in+rats%5BTitle%5D)+AND+%22PloS+one%22%5BJournal%5D)">Expression of Ccl11 associates with immune response modulation and protection against neuroinflammation in rats.</a> PloS one. 7, 39794(2012).</li>
<li>Bauer, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Endoplasmic+reticulum+stress+in+PLP-overexpressing+transgenic+rats%3A+gray+matter+oligodendrocytes+are+more+vulnerable+than+white+matter+oligodendrocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+neuropathology+and+experimental+neurology%22%5BJournal%5D)">Endoplasmic reticulum stress in PLP-overexpressing transgenic rats: gray matter oligodendrocytes are more vulnerable than white matter oligodendrocytes.</a> Journal of neuropathology and experimental neurology. 61, 12-22 (2002).</li>
<li>Bradl, M., Bauer, J., Flugel, A., Wekerle, H., Lassmann, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Complementary+contribution+of+CD4+and+CD8+T+lymphocytes+to+T-cell+infiltration+of+the+intact+and+the+degenerative+spinal+cord%5BTitle%5D)+AND+%22The+American+journal+of+pathology%22%5BJournal%5D)">Complementary contribution of CD4 and CD8 T lymphocytes to T-cell infiltration of the intact and the degenerative spinal cord.</a> The American journal of pathology. 166, 1441-1450 (2005).</li>
<li>Zhang, C., Lam, T. T., Tso, M. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Heterogeneous+populations+of+microglia%2Fmacrophages+in+the+retina+and+their+activation+after+retinal+ischemia+and+reperfusion+injury%5BTitle%5D)+AND+%22Experimental+eye+research%22%5BJournal%5D)">Heterogeneous populations of microglia/macrophages in the retina and their activation after retinal ischemia and reperfusion injury.</a> Experimental eye research. 81, 700-709 (2005).</li>
<li>Hirasawa, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Visualization+of+microglia+in+living+tissues+using+Iba1-EGFP+transgenic+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+neuroscience+research%22%5BJournal%5D)">Visualization of microglia in living tissues using Iba1-EGFP transgenic mice.</a> Journal of neuroscience research. 81, 357-362 (2005).</li>
<li>Norment, A. M., Salter, R. D., Parham, P., Engelhard, V. H., Littman, D. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell-cell+adhesion+mediated+by+CD8+and+MHC+class+I+molecules%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Cell-cell adhesion mediated by CD8 and MHC class I molecules.</a> Nature. 336, 79-81 (1988).</li>
<li>Hoetelmans, R. W., van Slooten, H. J., Keijzer, R., Jvan de Velde, C. J., van Dierendonck, J. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Routine+formaldehyde+fixation+irreversibly+reduces+immunoreactivity+of+Bcl-2+in+the+nuclear+compartment+of+breast+cancer+cells%2C+but+not+in+the+cytoplasm%5BTitle%5D)+AND+%22Applied+immunohistochemistry+%26+molecular+morphology+%3A+AIMM+%2F+official+publication+of+the+Society+for+Applied+Immunohistochemistry%22%5BJournal%5D)">Routine formaldehyde fixation irreversibly reduces immunoreactivity of Bcl-2 in the nuclear compartment of breast cancer cells, but not in the cytoplasm.</a> Applied immunohistochemistry & molecular morphology : AIMM / official publication of the Society for Applied Immunohistochemistry. 9, 74-80 (2001).</li>
<li>Hayat, M. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aHayat%2C+M+%22Microscopy%2C+Immunohistochemistry+and+antigen+retrieval+methods+for+light+and+electron+microscopy%22">Microscopy, Immunohistochemistry and antigen retrieval methods for light and electron microscopy</a>. , Kluwer Academic. New York. (2002).</li>
<li>Boenisch, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Formalin-fixed+and+heat-retrieved+tissue+antigens%3A+a+comparison+of+their+immunoreactivity+in+experimental+antibody+diluents%5BTitle%5D)+AND+%22Applied+immunohistochemistry+%26+molecular+morphology+%3A+AIMM+%2F+official+publication+of+the+Society+for+Applied+Immunohistochemistry%22%5BJournal%5D)">Formalin-fixed and heat-retrieved tissue antigens: a comparison of their immunoreactivity in experimental antibody diluents.</a> Applied immunohistochemistry & molecular morphology : AIMM / official publication of the Society for Applied Immunohistochemistry. 9, 176-179 (2001).</li>
<li>Shi, S. R., Key, M. E., Kalra, K. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Antigen+retrieval+in+formalin-fixed%2C+paraffin-embedded+tissues%3A+an+enhancement+method+for+immunohistochemical+staining+based+on+microwave+oven+heating+of+tissue+sections%5BTitle%5D)+AND+%22The+journal+of+histochemistry+and+cytochemistry+%3A+official+journal+of+the+Histochemistry+Society%22%5BJournal%5D)">Antigen retrieval in formalin-fixed, paraffin-embedded tissues: an enhancement method for immunohistochemical staining based on microwave oven heating of tissue sections.</a> The journal of histochemistry and cytochemistry : official journal of the Histochemistry Society. 39, 741-748 (1991).</li>
<li>Huang, S. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Immunohistochemical+demonstration+of+hepatitis+B+core+and+surface+antigens+in+paraffin+sections%5BTitle%5D)+AND+%22Laboratory+investigation%3B+a+journal+of+technical+methods+and+pathology%22%5BJournal%5D)">Immunohistochemical demonstration of hepatitis B core and surface antigens in paraffin sections.</a> Laboratory investigation; a journal of technical methods and pathology. 33, 88-95 (1975).</li>
<li>Shi, S. R., Cote, R. J., Taylor, C. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Antigen+retrieval+immunohistochemistry%3A+past%2C+present%2C+and+future%5BTitle%5D)+AND+%22The+journal+of+histochemistry+and+cytochemistry+%3A+official+journal+of+the+Histochemistry+Society%22%5BJournal%5D)">Antigen retrieval immunohistochemistry: past, present, and future.</a> The journal of histochemistry and cytochemistry : official journal of the Histochemistry Society. 45, 327-343 (1997).</li>
<li>Taylor, C. R., Shi, S. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Antigen+retrieval%3A+call+for+a+return+to+first+principles%5BTitle%5D)+AND+%22Applied+immunohistochemistry+%26+molecular+morphology+%3A+AIMM+%2F+official+publication+of+the+Society+for+Applied+Immunohistochemistry%22%5BJournal%5D)">Antigen retrieval: call for a return to first principles.</a> Applied immunohistochemistry & molecular morphology : AIMM / official publication of the Society for Applied Immunohistochemistry. 8, 173-174 (2000).</li>
<li>Kitamoto, T., Ogomori, K., Tateishi, J., Prusiner, S. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Formic+acid+pretreatment+enhances+immunostaining+of+cerebral+and+systemic+amyloids%5BTitle%5D)+AND+%22Laboratory+investigation%3B+a+journal+of+technical+methods+and+pathology%22%5BJournal%5D)">Formic acid pretreatment enhances immunostaining of cerebral and systemic amyloids.</a> Laboratory investigation; a journal of technical methods and pathology. 57, 230-236 (1987).</li>
<li>Nelson, P. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Monoclonal+antibodies%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+pathology+%3A+MP%22%5BJournal%5D)">Monoclonal antibodies.</a> Molecular pathology : MP. 53, 111-117 (2000).</li>
<li>Van der Loos, C. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aVan+der+Loos%2C+C+%22Immunoenzyme+multiple+staining+methods%22">Immunoenzyme multiple staining methods</a>. , Bios Scientifc publishers Ltd. New York. (1999).</li>
<li>Elias, J. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aElias%2C+J+%22Immunohistopathology.+A+practical+approach+to+diagnosis%22">Immunohistopathology. A practical approach to diagnosis</a>. , ASCP Press. Chicago. (2003).</li>
<li>Straus, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Letter%3A+Cleavage+of+heme+from+horseradish+peroxidase+by+methanol+with+inhibition+of+enzymic+activity%5BTitle%5D)+AND+%22The+journal+of+histochemistry+and+cytochemistry+%3A+official+journal+of+the+Histochemistry+Society%22%5BJournal%5D)">Letter: Cleavage of heme from horseradish peroxidase by methanol with inhibition of enzymic activity.</a> The journal of histochemistry and cytochemistry : official journal of the Histochemistry Society. 22, 908-911 (1974).</li>
<li>Streefkerk, J. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inhibition+of+erythrocyte+pseudoperoxidase+activity+by+treatment+with+hydrogen+peroxide+following+methanol%5BTitle%5D)+AND+%22The+journal+of+histochemistry+and+cytochemistry+%3A+official+journal+of+the+Histochemistry+Society%22%5BJournal%5D)">Inhibition of erythrocyte pseudoperoxidase activity by treatment with hydrogen peroxide following methanol.</a> The journal of histochemistry and cytochemistry : official journal of the Histochemistry Society. 20, 829-831 (1972).</li>
<li>Ponder, B. A., Wilkinson, M. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inhibition+of+endogenous+tissue+alkaline+phosphatase+with+the+use+of+alkaline+phosphatase+conjugates+in+immunohistochemistry%5BTitle%5D)+AND+%22The+journal+of+histochemistry+and+cytochemistry+%3A+official+journal+of+the+Histochemistry+Society%22%5BJournal%5D)">Inhibition of endogenous tissue alkaline phosphatase with the use of alkaline phosphatase conjugates in immunohistochemistry.</a> The journal of histochemistry and cytochemistry : official journal of the Histochemistry Society. 29, 981-984 (1981).</li>
<li>Petrelli, F., Coderoni, S., Moretti, P., Paparelli, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effect+of+biotin+on+phosphorylation%2C+acetylation%2C+methylation+of+rat+liver+histones%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+biology+reports%22%5BJournal%5D)">Effect of biotin on phosphorylation, acetylation, methylation of rat liver histones.</a> Molecular biology reports. 4, 87-92 (1978).</li>
<li>Yagi, T., Terada, N., Baba, T., Ohno, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Localization+of+endogenous+biotin-containing+proteins+in+mouse+Bergmann+glial+cells%5BTitle%5D)+AND+%22The+Histochemical+journal%22%5BJournal%5D)">Localization of endogenous biotin-containing proteins in mouse Bergmann glial cells.</a> The Histochemical journal. 34, 567-572 (2002).</li>
<li>Van Hecke, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Routine+Immunohistochemical+Staining+Today%3A+Choices+to+Make%2C+Challenges+to+Take%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Histotechnology%22%5BJournal%5D)">Routine Immunohistochemical Staining Today: Choices to Make, Challenges to Take.</a> Journal of Histotechnology. 1, 45-54 (2002).</li>
</ol>

Autorzy deklarują brak konfliktu interesów.

Standardowe procedury IHC często wymagają określonych korekt w celu uzyskania optymalnego wyniku, co zwykle wiąże się z dużym doświadczeniem, ale także podejściem "prób i błędów". Od przygotowania tkanki do wizualizacji celu, prawie każdy krok w protokole może być poddany indywidualnie zaprojektowanym modyfikacjom w celu poprawy końcowego wyniku. Przedstawiony tutaj protokół podwójnego barwienia jest przykładem celowania w białka oparte na IHC, szczególnie dostosowane do oceny wzajemnych relacji między białkami docelowym...

Pomimo wykorzystania zaawansowanych wysokoprzepustowych analiz wykonywanych na poziomie metylomu, transkryptomu czy nawet proteomu, barwienie immunologiczne pozostaje złotym standardem do wykrywania białek bezpośrednio w próbce tkanki, hodowli komórkowej lub rozmazie komórkowym. Ujawniając wzorzec lokalizacji/dystrybucji, immunohistochemia (IHC) może ocenić względne proporcje i wzajemne powiązania topograficzne docelowych białek, a nawet wskazać ich aktywność biologiczną. Dlatego IHC jest szeroko stosowany do celów klinicznych i badawczych, np. do diagnozy, oceny leczenia, badania mechanizmów chorobowych, zmian funkcjonalnych i fenotypowych w modelach zwierzęcych itp.
Zasadniczo obejmujący histologię, patologię, biochemię i immunologię, IHC znacznie się rozwinął od 1941 roku, kiedy to po raz pierwszy użyto fluorescencyjnie znakowanych przeciwciał do identyfikacji antygenów pneumokokowych w zakażonej tkance 1. Wizualizacja produktów i komponentów komórkowych przez IHC opiera się na wiązaniu przeciwciał (Abs) z ich specyficznym antygenem (Ag). Oprócz stosowania przeciwciał znakowanych fluoroforem, reakcje immunologiczne można również uwidocznić za pomocą enzymów, takich jak peroksydaza 2,3 lub fosfataza alkaliczna 4. Ponadto przeciwciała koloidalne znakowane złotem5 są używane do wykrywania specyficznej interakcji antygen-przeciwciało zarówno za pomocą mikroskopii świetlnej, jak i elektronowej, podczas gdy znaczniki radioaktywne są wizualizowane za pomocą autoradiografii.
Reakcja immunologiczna Ag-Ab może być wykryta za pomocą metod bezpośrednich i pośrednich. Metoda bezpośrednia jest zasadniczo szybsza i prostsza, ponieważ wykorzystuje bezpośrednio oznaczone pierwotne Abs 6. Jednak ze względu na znaczny brak wrażliwości preferowane są metody pośrednie w stosunku do bezpośrednich. Dwuetapowe procedury wykrywania pośredniego wymagają nieoznakowanych pierwotnych Abs, jako pierwszego, i oznakowanego wtórnego Abs, skierowanego przeciwko pierwotnemu Abs, jako drugiej warstwy 7. Wzmocnienie sygnału można osiągnąć poprzez zastosowanie dalszego, sprzężonego z enzymem trzeciorzędowego Ab (trzyetapowa metoda pośrednia), który wiąże się z wtórnym Ab. Powszechnie stosowanymi metodami wykrywania pośredniego są awidyna-biotyna i peroksydaza-antyperoksydaza (PAP). Alternatywnie zamiast metody PAP można zastosować kompleks fosfatazy alkalicznej i fosfatazy antyalkalicznej (APAAP). Warto zauważyć, że metody fosfatazy alkalicznej (AP) wydają się być jeszcze bardziej czułe niż metody immunoperoksydazy 4. Metoda kompleksu awidyna-biotyna (ABC) wykorzystuje biotynylowany drugorzędowy Ab w połączeniu ze znakowanym kompleksem awidyna-biotyna (LAB) lub znakowanym kompleksem streptawidyna-biotyna (SLAB). Czułość wykrywania można dodatkowo zwiększyć poprzez zastosowanie awidyny znakowanej peroksydazą lub fosfatazą alkaliczną 8. Inne stosowane metody wykrywania to znakowanie polimerowe, amplifikacja tyraminy i koło immunowalcowania 9. Warto zauważyć, że różne metody wykrywania można łączyć w celu wielokrotnego wykrywania Ag w tej samej próbce tkanki, co po raz pierwszy opisano w 1978 r. 4. Przedstawione tutaj równoczesne podwójne barwienie immunologiczne przeprowadzono w utrwalonych formaliną, zatopionych w parafinie odcinkach tkanki szczura przy użyciu odpowiednio przeciwciał drugorzędowych związanych z peroksydazą i sprzężonych z AP. Sygnały wizualizowano odpowiednio za pomocą chromogenu 3,3'-diaminoobcydyny (DAB) i kompleksu APAAP Fast Blue (FB).

<table><tbody><tr><td colspan="4">Odczynnik</td></tr><tr><td>Isoflurane (Isofluran): 1-Chlor-2,2,2-trifluorethyl (eter difluormetylowy) 2-Chlor-2-(difluormethoxy)-1,1,1-trifluorethan (C3H2ClF5O)</td><td>Baxter</td><td>1001936060</td><td>Napromienianie oczu. Prawdopodobnie wpływa na płodność i uszkadza dziecko w macicy. Podawać tylko w odpowiednio wyposażonym środowisku anestezjologicznym.</td></tr><tr><td>Chlorek sodu (NaCl)</td><td>Merck</td><td>1.0604</td><td></td></tr><tr><td>Bufor fosforanowy sól fizjologiczna (PBS), tabletka</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P4417</td><td></td></tr><tr><td>Paraformaldehyd (OH(CH2O)nH (n = 8 - 100)), 4% w 1x PBS</td><td>Apl pharma</td><td>34 24 28</td><td>Zagrożenie dla zdrowia. . Łatwopalny. Ostra toksyczność.</td></tr><tr><td>Alkohol etylowy &#8805; 99,5%, bezwzględny (CH3CH2OH)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>459844-1L</td><td>Łatwopalny.</td></tr><tr><td>Ksylen (Ksyleny, stopień histologiczny; C6H4(CH3)2 </td><td>Sigma-Aldrich</td><td>534056</td><td>Łatwopalny. Ostra toksyczność.</td></tr><tr><td>Histo-Comp Wosk parafinowy</td><td>Tissue-Tek</td><td>V0-5-1001</td><td></td></tr><tr><td>Adhezyjne szkiełka mikroskopowe</td><td>Starfrost</td><td>MIC-1040-W</td><td></td></tr><tr><td>Substytut ksylolu XEM-200 </td><td>Vogel GmbH</td><td>ND-HS-200</td><td>Działanie uczulające na drogi oddechowe. Rakotwórczość.</td></tr><tr><td>&alpha;-CD8 (Ox-8) mysi antyszczur, pierwszorzędowe przeciwciało</td><td>AbD Serotec</td><td>MCA48G</td><td></td></tr><tr><td>&alpha;-Iba1 (AIF1) mysie przeciwciało przeciw szczurom, pierwszorzędowe przeciwciało</td><td>Millipore</td><td>MABN92</td><td></td></tr><tr><td>&alpha;-CD68 (ED1) mysie przeciwciało przeciwszczurze, pierwszorzędowe przeciwciało</td><td>AbD Serotec</td><td>MCA341R</td><td></td></tr><tr><td>&alfa;-eotaksyna C-19 (CCL11) kozie przeciwciało przeciw szczurom, pierwszorzędowe przeciwciało</td><td>Santa Cruz BT</td><td>SC-6181</td><td></td></tr><tr><td>Przeciwciało drugorzędowe sprzężone z fosfatazą alkaliczną (AP)</td><td>Dakopatts, Dania</td><td>D0314</td><td></td></tr><tr><td>Biotynylowane przeciwciało drugorzędowe</td><td>Amersham Biotech</td><td>RPN1025</td><td></td></tr><tr><td>Avidin-kompleks peroksydazy chrzanowej (HRP) </td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A3151</td><td></td></tr><tr><td>Fosforan naftolu AS-MX (C19H18NO5P)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>N4875-1G</td><td>Ostra toksyczność.</td></tr><tr><td>Szybka niebieska sól RR, azoiczny diazo nr 24 (C15H14ClN3O3 x 1/2 ZnCl2)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>FBS25</td><td></td></tr><tr><td>Chlorowodorek lewamizolu (C11H13ClN2S)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>31742</td><td>Ostra toksyczność.</td></tr><tr><td>Tetrachlorowodorek 3,3'-diaminobenzydyny (DAB Chromogen)</td><td>DAKO</td><td>S3000</td><td>Wysoce łatwopalny. Toksyczny.</td></tr><tr><td>Siarczan miedzi (CuSO4)</td><td>Merck</td><td>1.02791</td><td>Toksyczność ostra. Środowiskowe zamieszanie.</td></tr><tr><td>GelTol Wodne medium montażowe</td><td>Thermo Electron Corporation</td><td>230100</td><td></td></tr><tr><td>Nadtlenek wodoru, 30% (H2O2)</td><td>Merck</td><td>107210</td><td>Ostra toksyczność.</td></tr><tr><td>Metanol (CH3OH)</td><td>Fluka</td><td>65543</td><td>Toksyczność ostra. Uczulenie na drogi oddechowe. Rakotwórczość. Łatwopalny.</td></tr><tr><td>Tris (hydroksymetylo)aminometan, zasada TRIS (C4H11NO3 )</td><td>AppliChem</td><td>A1379</td><td>Działanie drażniące na skórę i oczy.</td></tr><tr><td>Tris Sól fizjologiczna buforowana (TBS), tabletka</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T5030</td><td></td></tr><tr><td>Di-Wodorofosforan sodu dwuwodny (Na2HPO4 x 2H2O)</td><td>Merck</td><td>1.0658</td><td></td></tr><tr><td>Diwodorofosforan sodu jednowodny (NaH2PO4 x 1H2O) </td><td>Merck</td><td>1.06346</td><td></td></tr><tr><td>Surowica cielęca płodu (FCS) </td><td>Cambrex BioScience</td><td>DE-14-802F</td><td></td></tr><tr><td>DAKO bufor do płukania cytomacji 10x </td><td>DAKO</td><td>S3006</td><td>Należy przechowywać w temperaturze 2-8 stopni; C w celu zahamowania rozwoju bakterii. Unikaj pienienia.</td></tr><tr><td>N,N-dimetyloformamid; DMF (C3H7NO)</td><td>Fluka</td><td>40250</td><td>Łatwopalny. Ostra toksyczność.</td></tr><tr><td>Szkiełka nakrywkowe szklane 24 x 36 mm </td><td>Menzel-Gl&#228; ser</td><td>BB024036A1</td><td></td></tr><tr><td>Kwas solny, stężenie (HCl)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>30721</td><td>, drażniące, przenikające. Substancja uczulająca na płuca (w postaci kwaśnej mgły). Toksyczny.</td></tr><tr><td>Roztwór kwasu solnego objętościowy, 2 M HCl (2 N)</td><td>Fluka</td><td>71826</td><td>, drażniący, przenikający. Substancja uczulająca na płuca (w postaci kwaśnej mgły). Toksyczny.</td></tr><tr><td>Azotyn sodu, ReagentPlus, &#8805; 99,0% (NaNO2)</td><td>Utleniacz Sigma-Aldrich</td><td>S2252</td><td>. Toksyczny. Niebezpieczny dla środowiska.</td></tr><tr><td>Kwas etylenodinitrotetraoctowy sól disodowa dwuwodna (EDTA; C10H14N2Na2O8 x 2H2O)</td><td>Merck</td><td>1.08454</td><td>Narażenie doustne może powodować skutki reprodukcyjne i rozwojowe.</td></tr><tr><td colspan="4"> Sprzęt</td></tr><tr><td>Tissue-TekV.I.P Procesor infiltracji próżniowej</td><td>Sakura</td><td>5902 VIP Jr. 115 V, 60 Hz</td><td></td></tr><tr><td>Sanki bazowe Hacker-Bright serii 8000 Mikrotom </td><td>Instrumenty</td><td></td><td></td>hakerskie</tr><tr><td>Domowy parowar </td><td>Braun</td><td>MultiGourmet FS 20</td><td></td></tr><tr><td>Mikroskop świetlny </td><td>Leica Polyvar 2</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

analiza immunohistochemiczna w ośrodkowym układzie nerwowym szczura i skrawkach tkanek obwodowych węzłów chłonnych

Immunohistochemical Analysis in the Rat Central Nervous System and Peripheral Lymph Node Tissue Sections

Immunohistochemistry (IHC) zapewnia wysoce specyficzną, wiarygodną i atrakcyjną wizualizację białek. Prawidłowe wykonanie i interpretacja wielokolorowego znakowania opartego na IHC jest wyzwaniem, zwłaszcza gdy jest wykorzystywane do oceny wzajemnych relacji między białkami docelowymi w tkance o wysokiej zawartości tłuszczu, takiej jak ośrodkowy układ nerwowy (OUN).
Nasz protokół stanowi udoskonalenie standardowej techniki znakowania immunologicznego, szczególnie dostosowanej do wykrywania zarówno strukturalnych, jak i rozpuszczalnych białek w OUN szczura i obwodowych węzłach chłonnych (LN) dotkniętych zapaleniem nerwów. Niemniej jednak, z dalszymi modyfikacjami lub bez, nasz protokół może być prawdopodobnie wykorzystany do wykrywania innych powiązanych celów białkowych, nawet w innych narządach i gatunkach niż przedstawione tutaj.

Podwójne barwienia immunocytochemiczne (barwienia współwystępujące) wykonano na utrwalonych w formalinie i zatopionych w parafinie przekrojach OUN oraz węzłów chłonnych szczura. Plastry tkanki o grubości 3-5 µm wycinano przy użyciu mikrotomu ślizgowego, następnie mocowano na pokrytych specjalną warstwą adhezyjną szkiełkach i przetwarzano zgodnie z wcześniejszymi opisami 10,11,12. W skrócie, po deparafinizacji, rehydratacji tkanki i inaktywacji endogennej peroksydazy, przekroje ...

Prezentujemy tutaj zoptymalizowany, szczegółowy protokół podwójnego barwienia immunologicznego w utrwalonych formaliną, zatopionych w parafinie odcinkach tkanek ośrodkowego układu nerwowego (OUN) i obwodowych węzłów chłonnych (LN).

Analiza immunohistochemiczna w ośrodkowym układzie nerwowym szczura i skrawkach tkanek obwodowych węzłów chłonnych

Immunohistochemistry (IHC) provides highly specific, reliable and attractive protein visualization. Correct performance and interpretation of an IHC-based ...

Ogólnym celem tej procedury jest wycelowanie w konkretne białko w tkance szczura. Osiąga się to poprzez wstępną izolację, utrwalenie i zatopienie tkanki w parafinie, a następnie jej sekcjonowanie i osadzenie na szkiełkach przedmiotowych. Drugim krokiem jest deparafinizacja i rehydratacja sekcji tkanki zatopionej w parafinie, a następnie zablokowanie endogennej peroksydazy.Następnie, w procesie odsłaniania antygenów, odsłania się epitopy. W dalszej kolejności przeprowadza się blokowanie, aby zredukować nieswoiste wiązanie przed wprowadzeniem przeciwciał. Ostatnim etapem jest wykrycie specyficznego epitopu poprzez immunoznakowanie przeciwciałami pierwszorzędowymi i drugorzędowymi oraz wywołanie sygnału z oznakowanego przeciwciała drugorzędowego.Ostatecznie sygnał jest wizualizowany przy użyciu mikroskopii świetlnej w celu ukazania wzorca lokalizacji białka w przekrojach tkankowych. Chociaż metoda ta pozwala na uzyskanie informacji o wzorcach lokalizacji i ekspresji białka w ośrodkowym układzie nerwowym szczura oraz w obwodowych węzłach chłonnych, można ją zastosować również do innych organów i gatunków. Procedurę zademonstruje technik.Przedstawiamy Katalin Benedek z jednostki centralnej centrum mikrobiologii, biologii nowotworów i biologii komórki w Karolinska Institutet. Aby rozpocząć przygotowanie tkanek, zanurz wypreparowany mózg, rdzeń kręgowy oraz tkankę obwodowych węzłów chłonnych w 4% paraformaldehydzie i pozostaw w temperaturze 4 °C na 24 godziny. Po utrwaleniu tkanek przenieś je do PBS i przechowuj w temperaturze 4 °C do czasu dalszej obróbki.Aby rozpocząć obróbkę tkanki, należy za pomocą żyletki pociąć ją na fragmenty o wielkości około 5 mm. Następnie należy przeprowadzić proces utwardzania tkanki w procesorze do infiltracji próżniowej. Standardowa procedura polega na zanurzaniu w rosnących stężeniach etanolu, następnie w ksylolu, a na koniec w parafinie.Następnie umieść tkankę w formie. Wlej ciekłą parafinę wokół próbki, aby utworzyć blok parafinowy, i przechowuj go w temperaturze pokojowej. Przed wykonaniem skrawków tkanki schłodź blok parafinowy przez noc na płycie chłodzącej lub w lodówce.Po ostygnięciu bloku parafiny umieść go w uchwycie mikrotomu ślizgowego, który umożliwia ruchy w przód i w tył względem noża. Następnie ustaw blok oraz nóż mikrotomu pod optymalnym kątem, zależnym od geometrii noża, prędkości cięcia oraz zastosowanej techniki. Wykonaj trzy przekroje poprzeczne o grubości 5 µm z bloku parafiny.Następnie przenieść wycięte sekcje do pojemnika z wodą, a następnie nanieść sekcje z wody na komercyjne, fabrycznie powlekane szkiełka przedmiotu z klejem. Dalej, ostrożnie docisnąć naniesioną sekcję do ręcznika papierowego, aby usunąć resztki wody oraz potencjalne pęcherzyki powietrza. Suszyć naniesione preparaty przez kilka godzin w suszarce ustawionej na 50 do 60 °C.Po wyschnięciu szkiełek zanurz je dwukrotnie w ksylolu na 15 do 20 minut każdorazowo. Następnie opłucz każde szkiełko w 99% etanolu. Aby zablokować endogenną aktywność peroksydazy, inkubuj preparaty przez 30 minut w roztworze metanolu zawierającym 0,25% nadtlenku wodoru.Następnie kontynuuj rehydratację skrawków tkanki, płucząc je w roztworach etanolu o coraz większej zawartości wody. Ostatni etap rehydratacji przeprowadź w wodzie destylowanej. Należy upewnić się, że skrawki pozostają wilgotne do momentu nałożenia szkiełek zakrywek.Aby przeprowadzić odsłonięcie antygenu, podgrzewaj preparaty na szkiełkach za pomocą domowego parowaru w buforze EDTA o pH 8.5 przez 60 minut. Następnie schłodź szkiełka w temperaturze pokojowej przez około jedną godzinę. Po wystygnięciu opłucz każde szkiełko od trzech do pięciu razy w soli w buforze Tris, czyli T-B-S.Następnie inkubuj skrawki tkanek w temperaturze pokojowej przez 30 minut w roztworze blokującym zawierającym 10% płodowej surowicy cielęcej i 90% buforu płuczącego, aby zablokować nieswoiste reakcje tła. Po zablokowaniu skrawków tkanek rozcieńcz wymaganą ilość przeciwciał pierwszorzędowych w roztworze blokującym, a następnie inkubuj preparaty w tym roztworze przeciwciał pierwszorzędowych przez noc w temperaturze 4°C. Następnego dnia wypłucz preparaty od trzech do pięciu razy buforem T-B-S.Następnie inkubować preparaty z przeciwciałami wtórnymi rozcieńczonymi w roztworze blokującym przez jedną godzinę w temperaturze pokojowej. Po tym czasie ponownie przepłukać preparaty od trzech do pięciu razy buforem T-B-S. Następnie inkubować preparaty z kompleksem awidyny i peroksydazy chrzanowej, rozcieńczonym 1:100 w roztworze blokującym, przez jedną godzinę w temperaturze pokojowej.Po zakończeniu jednogodzinnej inkubacji wypłucz preparaty od trzech do pięciu razy w buforze T-B-S. Po przygotowaniu roztworu fast blue zgodnie z opisem w protokole tekstowym, lekko wstrząśnij naczyniem i przefiltruj otrzymaną mieszaninę. Wlej roztwór na preparaty znajdujące się w kuwecie szklanej.Rozpocznij inkubację w temperaturze 37 °C i obserwuj proces wywoływania pod mikroskopem świetlnym co 15–30 minut. Po zakończeniu inkubacji wypłucz preparaty trzy do pięciu razy buforem T-B-S, a następnie przenieś je do buforu P-B-S. Aby przygotować roztwór wywołujący D-A-B z nadtlenkiem wodoru, najpierw rozcieńcz 1 ml roztworu zapasowego D-A-B w 49 ml P-B-S.Dodaj 16,5 µL nadtlenku wodoru, a następnie przefiltruj roztwór. Wlej roztwór na szkiełka przedmiotowe, dbając o kontrolę procesu wywoływania pod mikroskopem świetlnym, aby uniknąć wysokiego tła, które mogłoby zamaskować specyficzny sygnał. Następnie wypłucz szkiełka od trzech do pięciu razy w P-B-S, a na koniec przemyj je wodą destylowaną lub wodą z kranu.Przygotuj preparaty, nakładając szkiełka nakrywkowe bezpośrednio z wody, używając wodnego medium montażowego. Unikaj powstawania pęcherzyków powietrza między szkiełkiem nakrywkowym a szkiełkiem podstawnym. Po zamontowaniu przekrojów inkubuj preparaty przez noc w temperaturze 4 °C, aby medium montażowe całkowicie wyschło.Przesuszone preparaty przechowywać w temperaturze pokojowej. Podwójne barwienie przekrojów tkanki węzłów chłonnych obwodowych izolowanych od szczurów w siódmej dobie po immunizacji wykazało, że limfocyty T cd8 pozytywne nie wydzielały chemokiny C-C-L 11. Zamiast tego stwierdzono ko-lokalizację C-C-L 11 z E-D one, markerem białka lizosomalnego w aktywowanych makrofagach.Podwójne barwienie immunohistochemiczne rdzenia kręgowego szczura wykazało produkcję CCL11 w perikariach neuronalnych, dendrytach i aksonach, ale nie w makrofagach i komórkach mikrogleju rezydentnego w mózgu wykazujących pozytywność dla IBA1. Dodatkowo stwierdzono, że większość makrofagów i komórek mikrogleju rezydentnego w mózgu wykazujących pozytywność dla ED1 była również negatywna pod kątem CCL11. Po obejrzeniu tego filmu powinni Państwo posiadać dobrą wiedzę na temat tego, jak przeprowadzić specyficzne i wiarygodne celowanie immunohistochemiczne w białko bezpośrednio w sekcjach tkankowych.

immunohistochemical-analysis-rat-central-nervous-system-peripheral

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Neuronauka

Analiza immunohystochemiczna w tkankach nerwowych centralnego układu nerwowego szczura i obwodowych węzłów chłonnych

Ten film pokazuje immunohistochemiczne barwienie włókien cholinergicznych w jądrze podstawnym regionu Meynerta w sekcjach mózgu myszy. Skrawki są blokowane i leczone pierwotną przeciwko acetylotransferazie choliny, a następnie biotynylowanym przeciwciałom drugorzędowym. Dodaje się kompleksy awidyna-biotyna-peroksydaza, które wiążą się z przeciwciałami drugorzędowymi, a następnie z substratem chromogennym. Skrawki są następnie odwadniane i montowane przed wizualizacją pod mikroskopem.

Immunohistochemiczne barwienie włókien nerwowych w jądrze podstawnym Meynera mózgu myszy

Źródło: Evilsizor, M. N., et. al., Elementarz immunohistochemii na kriowyciętej tkance mózgowej szczura: Przykład barwienia mikrogleju i neuronów. J. Vis. Exp. (2015)Ten film demonstruje krok po kroku procedurę barwienia immunohistochemicznego na kriosekcji tkanki mózgowej szczura w celu wizualizacji przestrzennego rozmieszczenia mikrogleju i neuronów.

Barwienie immunohistochemiczne kriosekcji tkanek koronalnych szczurów dla mikrogleju i neuronów

Ten protokół wprowadzający opisuje odczynniki, sprzęt i techniki wymagane do przeprowadzenia immunohistochemicznego barwienia mózgów gryzoni, używając jako przykładu markerów dla mikrogleju i elementów neuronalnych.

Podstawa immunohistochemii na kriowyciętej tkance mózgowej szczura: przykładowe barwienie mikrogleju i neuronów

Tutaj opisujemy prostą i tanią metodę, która pozwala na ilościowe określenie komórek nowotworowych adhezji do kriosekcji węzłów chłonnych (LN). Komórki nowotworowe przylegające do LN są łatwo identyfikowane za pomocą mikroskopii świetlnej i potwierdzane metodą opartą na fluorescencji, dając wskaźnik adhezji, który ujawnia powinowactwo wiązania komórek nowotworowych do miąższu LN.

Kwantyfikacja adhezji komórek nowotworowych w kriosekcjach węzłów chłonnych

Główne zwoje miednicy zawierają neurony przywspółczulne i współczulne, które unerwiają narządy miednicy. Tutaj opisujemy metodę preparacji i podajemy schematy identyfikacji tych zwojów i związanych z nimi nerwów. Metody te można zastosować do eksperymentalnej manipulacji tymi zwojami in vivo lub usunięcia pośmiertnego w celu dalszych badań.

Rozwarstwienie autonomicznych zwojów miednicy i związanych z nimi nerwów u samców i samic szczurów

Ten manuskrypt przedstawia protokół indukcji aktywnego eksperymentalnego autoimmunologicznego zapalenia mózgu i rdzenia (EAE) u myszy. Przedstawiono również metodę izolacji i charakterystyki naciekających limfocytów w ośrodkowym układzie nerwowym (OUN), aby pokazać, w jaki sposób limfocyty są zaangażowane w rozwój choroby autoimmunologicznej OUN.

Analiza cytometryczna przepływowa nacieku limfocytów w ośrodkowym układzie nerwowym podczas eksperymentalnego autoimmunologicznego zapalenia mózgu i rdzenia kręgowego

Ten artykuł przedstawia dwa zoptymalizowane protokoły badania rezydentnych i obwodowo pochodzących komórek odpornościowych w ośrodkowym układzie nerwowym, w tym mózgu, rdzeniu kręgowym i oponach mózgowych. Każdy z tych protokołów pomaga ustalić funkcję i skład komórek zajmujących te przedziały w stanie stacjonarnym i stanach zapalnych.

Izolowanie tkanek ośrodkowego układu nerwowego i związanych z nimi opon mózgowych w celu dalszej analizy komórek odpornościowych

Tutaj opisujemy dokładną metodę pobierania limfocytów przewodu piersiowego i obserwacji migracji limfocytów tropikalnych jelitowych w plamach Peyera szczura przez 3 godziny za pomocą fotografii poklatkowej. Ta technika może wyjaśnić, w jaki sposób dynamika limfocytów wpływa na stan zapalny.

Obserwacja mikroskopowa dynamiki limfocytów w szczurzych łatach Peyera

Technika swobodnego pływania pozwala badaczom na wykonywanie barwień histologicznych, w tym immunohistochemii na stałych odcinkach tkanki, w celu wizualizacji struktur biologicznych, typu komórki oraz ekspresji i lokalizacji białek. Jest to wydajna i niezawodna technika histochemiczna, która może być przydatna do badania wielu tkanek, takich jak mózg, serce i wątroba.

Barwienia histologiczne z wykorzystaniem swobodnie unoszących się skrawków tkanek

Prezentowana jest wygodna metoda perfuzji grawitacyjnej do analizy histologicznej ośrodkowego układu nerwowego myszy. Immunofluorescencyjne wykrywanie fosforylowanej α-synukleiny wykazano w mysim modelu choroby Parkinsona. Praca ta kompleksowo opisuje również etapy perfuzji przezsercowej, rozwarstwienia, zamrażania/osadzania tkanek i zamrażania sekcji.

Grawitacyjna metoda perfuzji przezsercowej do analizy histologicznej ośrodkowego układu nerwowego myszy

Ten protokół opisuje wielobarwną technikę immunofluorescencji do oceny szczurzego modelu alergicznego nieżytu nosa.

Znakowanie immunofluorescencyjne w skrawkach tkanki błony śluzowej nosa alergicznych szczurów z nieżytem nosa za pomocą wielokolorowego testu immunologicznego

Poznaj protokół podwójnego immunobarwienia w tkankach OUN i węzłach chłonnych szczura. Metoda umożliwia wizualizację lokalizacji białek przy użyciu mikroskopii świetlnej.

Analiza immunohistochemiczna w ośrodkowym układzie nerwowym szczura i skrawkach tkanek obwodowych węzłów chłonnych

Przeglądaj więcej filmów