Analiza immunohistochemiczna w ośrodkowym układzie nerwowym szczura i skrawkach tkanek obwodowych węzłów chłonnych

Ogólnym celem tej procedury jest celowanie w określone białko w tkance szczura. Osiąga się to poprzez najpierw izolację, utrwalenie i zatopienie parafiny w tkance, a następnie przecięcie tkanki i zamontowanie jej na szkiełkach. Drugim krokiem jest odparafinizowanie i ponowne nawodnienie skrawków tkanek zatopionych w parafinie, a następnie zablokowanie endogennej peroksydazy.

Następnie epitopy są odsłaniane przez pobranie antygenu. Następnie przeprowadza się blokowanie w celu zmniejszenia niespecyficznego wiązania przed wprowadzeniem przeciwciał. Ostatnim krokiem jest wykrycie specyficznego epitopu poprzez znakowanie immunologiczne przeciwciałami pierwszorzędowymi i drugorzędowymi oraz opracowanie sygnału z znakowanego przeciwciała drugorzędowego.

Ostatecznie sygnał jest wizualizowany za pomocą mikroskopii świetlnej, aby pokazać wzorzec lokalizacji białka w sekcjach tkanki. Chociaż metoda ta może zapewnić wgląd w lokalizację i wzorce ekspresji białek w ośrodkowym układzie nerwowym szczura i w obwodowych węzłach chłonnych, może być również stosowana do innych narządów i gatunków. Do zademonstrowania procedury będzie technik.

Nazywa się Katalin Benedek i pracuje w centrum mikrobiologii, nowotworów i biologii komórki w Instytucie Karolinska. Aby rozpocząć przygotowanie tkanki, zanurz wypreparowany mózg, rdzeń kręgowy i tkankę obwodowych węzłów chłonnych w czterech procentach paraformaldehydu i umieść go w temperaturze czterech stopni Celsjusza na 24 godziny. Po utrwaleniu tkanek przenieś tkankę do PBS i przechowuj ją w temperaturze czterech stopni Celsjusza do czasu dalszej obróbki.

Aby rozpocząć przetwarzanie tkanki, użyj żyletki, aby pokroić tkankę na porcje o wielkości około pięciu milimetrów. Następnie zainicjuj proces utwardzania tkanek za pomocą procesora infiltracji próżniowej. Standardowa procedura opiera się na zanurzeniu w rosnących stężeniach etanolu, następnie ksylolu, a na końcu parafiny.

Następnie umieść chusteczkę w formie. Wlej ciekłą parafinę wokół próbki, aby utworzyć blok parafiny i przechowuj go w temperaturze pokojowej. Przed pocięciem tkanki schłodzić blok parafiny przez noc na zimnej płycie lub w lodówce.

Po schłodzeniu bloku parafiny umieść go w stałym uchwycie mikrotomu sań, który może poruszać się do tyłu i do przodu po nożu. Następnie ustaw blok i nóż mikrotomowy pod optymalnym kątem, który zależy od geometrii noża oraz prędkości i techniki cięcia. Wytnij trzy przekroje o grubości pięciu mikronów z bloku parafinowego.

Następnie przenieś pocięte sekcje do pojemnika na wodę i zamontuj sekcje z wody na komercyjnym, wstępnie powlekanym szkiełku samoprzylepnym. Następnie ostrożnie dociśnij zamontowaną sekcję do ręcznika papierowego, aby usunąć resztki wody i potencjalne pęcherzyki powietrza. Suszyć zamontowane szkiełka przez kilka godzin w piecu ustawionym na 50 do 60 stopni Celsjusza.

Po wyschnięciu szkiełek zanurz je dwa razy w ksylolu na 15 do 20 minut każda. Następnie przepłucz każde szkiełko w 99 procentach etanolu. Aby zablokować endogenną aktywność peroksydazy, inkubuj skrawki przez 30 minut w roztworze metanolu zawierającym 0,25 procent nadtlenku wodoru.

Następnie kontynuuj nawadnianie skrawków tkanki, spłukując roztworami etanolu zawierającymi zwiększającą się zawartość wody. Wykonaj ostatni etap nawadniania w wodzie destylowanej. Upewnij się, że sekcje są wilgotne do momentu zamontowania szkiełek nakrywkowych.

Aby pobrać antygen, podgrzej szkiełka za pomocą domowego parowaru i buforu EDTA o pH 8,5 przez 60 minut. Następnie schłodzić szkiełka w temperaturze pokojowej przez około godzinę. Gdy szkiełka ostygną, opłucz każde szkiełko trzy do pięciu razy w soli fizjologicznej buforowanej Tris lub TBS.

Następnie inkubuj skrawki tkanek w temperaturze pokojowej przez 30 minut w roztworze blokującym zawierającym 10 procent płodowej surowicy cielęcej i 90 procent buforu do mycia, aby zablokować wszelkie niespecyficzne reakcje tła. Po zablokowaniu skrawków tkanki należy rozcieńczyć wymaganą ilość przeciwciał pierwszorzędowych w roztworze blokującym i inkubować szkiełka w tym roztworze przeciwciał pierwszorzędowych przez noc w temperaturze czterech stopni Celsjusza. Następnego dnia przepłucz szkiełka trzy do pięciu razy buforem TBS.

Następnie inkubować szkiełka z przeciwciałami drugorzędowymi rozcieńczonymi w roztworze blokującym przez jedną godzinę w temperaturze pokojowej. Następnie ponownie przepłukać szkiełka trzy do pięciu razy buforem TBS. Następnie inkubować szkiełka z kompleksem peroksydazy chrzanowej awidyny, rozcieńczonym od 1 do 100 w roztworze blokującym, przez godzinę w temperaturze pokojowej.

Po zakończeniu jednogodzinnej inkubacji przepłukać szkiełka trzy do pięciu razy buforem TBS. Po przygotowaniu szybkiego niebieskiego roztworu zgodnie z opisem w protokole tekstowym, należy lekko wstrząsnąć naczyniem i przefiltrować otrzymaną mieszaninę. Wlej roztwór na szkiełka w szklanej kuwecie.

Rozpocznij inkubację w temperaturze 37 stopni Celsjusza i obserwuj proces rozwoju pod mikroskopem świetlnym co 15 do 30 minut. Po zakończeniu inkubacji przepłukać szkiełka trzy do pięciu razy buforem TBS, a następnie przenieść szkiełka do bufora PBS. Aby uzyskać roztwór do wywoływania nadtlenku wodoru DAB, najpierw rozcieńczyć jeden mililitr roztworu podstawowego DAB w 49 mililitrach PBS.

Dodaj 16,5 mikrolitra nadtlenku wodoru, a następnie przefiltruj roztwór. Wlej roztwór na szkiełka i upewnij się, że kontrolujesz proces wywoływania pod mikroskopem świetlnym, aby uniknąć wysokiego tła, które może zamaskować określony sygnał. Następnie spłucz szkiełka trzy do pięciu razy środkiem P-B-S, a następnie umyj je wodą destylowaną lub wodą z kranu.

Szkiełka nakrywkowe należy montować bezpośrednio z wody, używając wodnego medium montażowego. Należy unikać tworzenia się pęcherzyków powietrza między szkiełkiem nakrywkowym a szkiełkiem. Po zamontowaniu sekcji inkubuj szkiełka przez noc w temperaturze czterech stopni Celsjusza, aby podłoże montażowe całkowicie wyschło.

Wysuszone szkiełka należy przechowywać w temperaturze pokojowej. Podwójne barwienie skrawków tkanek obwodowych węzłów chłonnych wyizolowanych od szczurów w siódmym dniu po szczepieniu ujawniło, że limfocyty t cd8-dodatnie nie wydzielają chemokiny C-C-L 11. Alternatywnie, stwierdzono, że C-C-L 11 kolokalizuje się z E-D, markerem białka lizosomalnego w aktywowanych makrofagach.

Podwójne barwienie rdzenia kręgowego szczura I-H-C zidentyfikowało jedenastą produkcję C-C-L w neuronalnych perikarya, dendrytach i aksonach, ale nie w I-B-A one dodatnich makrofagach i komórkach mikrogleju rezydujących w mózgu. Ponadto stwierdzono, że większość makrofagów E-D One i komórek mikrogleju rezydujących w mózgu nie jest C-C-L 11 dodatnich. Po obejrzeniu tego filmu powinieneś dobrze zrozumieć, jak wykonać specyficzne i niezawodne celowanie immunohistochemiczne białka bezpośrednio w skrawki tkanki.