Generowanie ludzkich kardiomiocytów: protokół różnicowania od indukowanych przez człowieka pluripotencjalnych komórek macierzystych bez karmienia

Ogólnym celem niniejszej procedury jest różnicowanie ludzkich kardiomiocytów z ludzkich komórek iPS hodowanych w warunkach bez fibroblastów pokarmowych. Osiąga się to poprzez uprzednie wysianie komórek iPS na płytki o ultraniskiej adhezji w celu utworzenia ciał embrionalnych. Drugim krokiem procedury jest przeniesienie powstałych ciał embrionalnych do naczyń pokrytych żelatyną.

Po pojawieniu się obszarów kurczliwych, są one ręcznie wycinane pod mikroskopem stereoskopowym i wysiewane na płytki pokryte fibronektyną. W celu dalszego różnicowania, ostatnim krokiem jest uzyskanie pojedynczych kardiomiocytów poprzez trawienie enzymatyczne kurczliwych skupisk. Ostatecznie wyniki mogą wykazać różnicowanie komórek przypominających kardiomiocyty, które wykazują ekspresję typowych markerów strukturalnych, takich jak troponina sercowa, co potwierdza mikroskopia immunofluorescencyjna.

Metoda ta może pomóc w odpowiedzi na kluczowe pytania z zakresu biologii układu sercowo-naczyniowego, takie jak mechanizmy napędzające różnicowanie i dysfunkcję kardiomiocytów podczas rozwoju serca oraz w przebiegu chorób na poziomie ludzkiego kardiomiocytu. Jest to niezwykle interesująca technika, ponieważ umożliwia generowanie kardiomiocytów in vitro z komórek pacjentów i zdrowych osób. Ponadto pozwala ona na odtworzenie przebiegu choroby w probówce, co umożliwia testowanie nowych leków in vitro przed przejściem do badań in vivo.

Doświadczenie rozpoczyna się od konfluentnych kultur komórek iPS hodowanych na płytkach 35 milimetrowych powlekanych Matrigel. Pożywkę wzrostową należy zastąpić 1 ml PBS zawierającego 1 mg diss. Komórki należy zbadać przy użyciu szklanych pipet pasterowskich.

Usuń obszary z zróżnicowanymi komórkami, takie jak struktury kraterowate lub torbielowate w centrum kolonii. Usuń również wszelkie obszary, w których komórki oddzieliły się, spłaszczyły i wydają się migrować na zewnątrz. Następnie inkubuj pozostałe komórki w temperaturze 37 °C w dygestorium dla kultur komórkowych, aż brzegi kolonii staną się jaśniejsze i zaczną się odrywać.

Zazwyczaj trwa to od pięciu do siedmiu minut. Na tym etapie należy usunąć roztwór dispa i przemyć komórki jednym mililitrem HESM. Następnie należy odrzucić roztwór do płukania.

W świeżym mililitrze HESM, używając cell liftera, należy zebrać kolonie. Przenieść kolonie do probówki o pojemności 15 ml. Następnie wypłukać komórki kolejnym mililitrem HESM i odwirować je z prędkością 1000 ×g przez cztery minuty.

Następnie należy przystąpić do wysiewania komórek na matrigel i codziennie wymieniać pożywkę podczas hodowli. Rozpocznij od zebrania niezróżnicowanych kolonii iPS zgodnie z opisem w poprzedniej sekcji. Po wyizolowaniu niezróżnicowanych populacji, delikatnie resuspenduj je w 1 mL EBM 20.

Używając pipety o pojemności 2 ml, należy unikać nadmiernego rozbijania aglomeratów komórek. Ogranicz pipetowanie do dwóch lub trzech cykli. Pomiędzy cyklami należy sprawdzać wielkość kolonii pod stereomikroskopem.

Gdy kolonie osiągną zbliżoną wielkość, nie wymagają one dalszego mieszania. Teraz należy wysiać komórki na płytki ultra-low attachment, wypełniając jedną płytkę 6-dołkową na każdą płytkę zebranych komórek. Należy pamiętać o przepłukaniu probówki 1 mL EBM 20 i rozprowadzeniu płuczki na płytce.

Po trzecim dniu inkubacji należy wymienić medium, korzystając z mikroskopu, aby uniknąć usunięcia ciał embrionów. Pipetę należy trzymać blisko krawędzi płytki. Siódmego dnia przenieść ciała embrionów na płytki pokryte 0,1% żelatyną, ogrzewane w temperaturze 37°C przez 30 minut.

Do każdej szalki 35 mm w 2 mL pożywki przenieść od 35 do 40 zarodków. W trakcie hodowli regularnie wymieniać pożywkę dwa razy w tygodniu.

Sprawdź ciała zarodków pod kątem obszarów kurczliwych i zaznacz miejsca, w których występują te obszary. Na powierzchni pokrywki szalki obszary kurczliwe powinny pojawić się po około 10 do 20 dniach. Gdy pojawią się obszary z samoistnymi skurczami, zmień ich pożywkę na EBM two. Po pojawieniu się obszarów kurczliwych kontynuuj hodowlę i monitoruj pozostałe obszary na płytce przez okres do jednego miesiąca.

Łącznie. W EBM niedobory procesu różnicowania są wysoce zależne od kilku czynników, z których najbardziej krytyczne są konkretne linie komórkowe oraz partia surowicy użytej do indukcji różnicowania kardiogenicznego. Aby uzyskać najwyższą wydajność, należy przetestować kilka linii pod kątem potencjału kardiogenicznego oraz różne partie surowicy. Należy rozpocząć od powlekania 12.

Płytki do hodowli z fibonektyną w PBS w stężeniu 5 µg/cm² (300 µL na dołek) powinny całkowicie pokrywać powierzchnię każdego dołka. Pozostaw płytki do wyschnięcia bez przykrycia w komorze z laminarnym przepływem powietrza. Aby usunąć obszary grudkowania w hodowli komórkowej, należy użyć wypalanej pipety szklanej oraz skalpela.

Następnie, używając pipety o objętości 1 ml, przenieś od czterech do pięciu klastrów do każdej studni płytki pokrytej fibronektyną. Po zakończeniu wszystkich transferów, dodaj 1 ml EBM 2 do załadowanych studni na płytce zbierającej i zaznacz obszary, z których usunięto komórki. Następnie wymień medium i przenieś płytkę z powrotem do komory kultury.

Jeśli pod mikroskopem stereoskopowym wymagane są mniejsze, kurczące się skupiska, należy przepuścić wypreparowane obszary przez pipetę. Pozwala to na uzyskanie małych klastrów zawierających kilka kurczących się komórek w hodowli.

Wymieniaj medium dwa razy w tygodniu, aż próbki będą gotowe do analizy. Najpierw przygotuj dwukomorowe szkiełka o wymiarach czterech centymetrów kwadratowych, pokrywając je 20 µg fibronektyny rozpuszczonej w ilości PBS wystarczającej do pokrycia powierzchni. W przypadku zastosowania podłoża szklanego, dodaj dodatkowe 20 µg lamininy.

Odizoluj obszar hodowli na koralikach zgodnie z wcześniejszym opisem. Za pomocą pipety 1 ml przenieś komórki do probówki 15 ml zawierającej 500 µL kolagenazy. Inkubuj komórki przez 15 minut, wstrząsając probówką raz w trakcie inkubacji.

Po 15 minutach przenieś komórki za pomocą pipety 200 µL, aby usunąć ewentualne pozostałe grudki. Przenieś komórki do świeżej kolagenazy II i powtórz inkubację, aż do całkowitego usunięcia dużych grudek. Zakończ trawienie, dodając 3 mL pożywki EBM 2 bez kwasu askorbinowego, zgodnie z ich przygotowaniem.

Przechowywać probówki w podgrzewanym statywie pod wyciągiem, a następnie wirować je z prędkością 1000 ×g przez cztery minuty w temperaturze pokojowej. Po odwirowaniu sporządzić zawiesinę frakcji komórkowych z tej samej próbki początkowej w 1 ml 0,25% trypsyny EDTA w PBS. Następnie inkubować zawiesinę przez pięć minut w bloku grzejnym i dezaktywować trypsynę za pomocą 4 ml E BM two bez kwasu asooic.

Następnie przepuść komórki przez igłę o rozmiarze 18 G w strzykawce o pojemności 2,5 ml do siedmiu razy, aż pod mikroskopem nie będą widoczne duże skupiska. Następnie odwiruj komórki z prędkością 1000 ×g przez cztery minuty. Teraz zawieś osad komórkowy w medium EBM-2 i wysiej go na szkiełka z dwukomorową komorą.

Komórki będą gotowe do analiz po dwóch do trzech dniach inkubacji. CMS zostały wygenerowane z kilku linii komórek IPS. Linie te zostały początkowo wygenerowane na warstwie karmionek meth, a następnie niezwłocznie przeniesione na matrigel z użyciem zdefiniowanego medium.

Komórki wykazywały morfologię przypominającą ludzkie ESC z jasnymi krawędziami w kontraście fazowym i wyraźnymi jądrami. Analiza immunofluorescencyjna wykazała, że komórki IPS prawidłowo wykazują ekspresję czynnika transkrypcyjnego T four oraz antygenu powierzchniowego TRA one 60. Analiza cytofluometryczna potwierdziła ekspresję typowych powierzchniowych antygenów pluripotencji: SS EEA four i TRA one 60.

Strategia bramkowania została przedstawiona na lewym wykresie rozrzutu. Przeprowadzono również analizę kariotypu komórek IP FS hodowanych na żelu matrycowym. Indukcja w kierunku linii kardiologicznej została zainicjowana poprzez agregację komórek IPS w ciała embrionalne (ebs) oraz hodowlę w obecności specyficznego rodzaju surowicy.

Ponieważ obszary kurczące się pod wpływem kwasu sorbowego stanowiły od 20 do 35% całej hodowli, w zależności od użytej linii komórkowej, kurczące się CMS wyizolowano z tych obszarów poprzez trawienie enzymatyczne i poddano analizie pod kątem ekspresji białek. Metodą R-T-P-C-R stwierdzono ekspresję specyficznych dla serca kanałów jonowych w komórkach bijących pochodzących z iPSC, natomiast nie odnotowano jej w komórkach niebijących.

Kanały te obejmowały jednostkę alfa 1, będącą podjednostką napięciowo zależnego kanału wapniowego, podjednostkę alfa typu piątego napięciowo bramkowanego kanału sodowego, potasowy napięciowo bramkowany kanał z podrodziny podobnej do KQT oraz obie formy miozyny. Analiza immunofluorescencyjna ciężkich łańcuchów wykazała, że pojedyncze kardiomiocyty pochodzące z iPS wykazują ekspresję białek strukturalnych: aktyny sarkomerycznej alfa, troponiny I serca oraz specyficznej dla serca koneksyny 43. W rezultacie technika ta utorowała drogę do modelowania chorób mięśnia sercowego in vitro i umożliwia testowanie leków w środowisku ludzkim bez konieczności ich wstrzykiwania do organizmów ludzi.

Po obejrzeniu tego filmu powinni Państwo posiadać gruntowną wiedzę na temat tego, jak utrzymywać komórki IPS w warunkach bezsurowiczych oraz jak różnicować je w kardiomiocyty za pomocą metody opartej na agregacji ciał embrionalnych.