Name: Generowanie ludzkich kardiomiocytów: protokół różnicowania od indukowanych przez człowieka pluripotencjalnych komórek macierzystych bez karmienia (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-06-28T14:00:00.000+00:00
Duration: 13 min 18 s
Description: Poznaj protokół różnicowania ludzkich kardiomiocytów z komórek iPS przy użyciu agregacji ciał zarodkowych. Ta metoda umożliwia uzyskanie funkcjonalnych komórek sercowych do badań kardiologicznych.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

BS był wspierany przez University of Milan-Bicocca Summer Student Research Training Program; badania były wspierane z funduszy włoskiego Ministerstwa Zdrowia i włoskiego Ministerstwa Edukacji, Uniwersytetu i Badań oraz Fondazione Humanitas dla GC; dziękujemy Michaelowi V.G. Latronico za krytyczne przeczytanie manuskryptu.

1. Konserwacja i pasażowanie linii komórkowych ludzkiego iPS bez użycia feederów
<ol>
	<li>Przygotuj naczynia pokryte Matrigelem. Rozmrozić jedną fiolkę z ludzkim Matrix zakwalifikowanym do ESC na lodzie przez jedną godzinę i rozcieńczyć ją w 25 ml pożywki DMEM-F12. Dodaj 1 ml do każdej płytki o średnicy 35 mm (lub równoważnej ilości na powierzchnię, jeśli używane są inne naczynia), trzymając wszystko na lodzie i upewniając się, że wszystkie talerze i rurki są wstępnie schłodzone. Przykryj płyty folią aluminiową.</li>
</ol>
Uwaga: Stężenia masywu Matrigel różnią się w zależności od partii. Instrukcje dotyczące rozcieńczania znajdują się w karcie katalogowej.
<ol start="2">
	<li>Trzymaj talerze na lodzie przez noc i zdejmij z lodu następnego dnia. Talerze można przechowywać w lodówce do tygodnia przed użyciem.</li>
	<li>Przygotować kompletną pożywkę mTESR1 (lub rozmrozić fiolkę z pożywką Nutristem) i pożywkę H-ESM (pożywkę dla ludzi ESC) zgodnie z poniższą tabelą.
	<table border="1" fo:keep-together.within-page="zawsze">
		<tbody>
			<tr>
				<td>H-ESM</td>
				<td>KOŃCOWE STĘŻENIE</td>
				<td>NA 500 ml</td>
			</tr>
			<tr>
				<td>Wymiana surowicy nokautującej (KSR)</td>
				<td>20%</td>
				<td>Pojemność 100 ml</td>
			</tr>
			<tr>
				<td>GlutaMAX 100X</td>
				<td>2 mM</td>
				<td>Pojemność 5 ml</td>
			</tr>
			<tr>
				<td>Aminokwasy endogenne MEM</td>
				<td>0,1 mM</td>
				<td>Pojemność 5 ml</td>
			</tr>
			<tr>
				<td>Penicylina-streptomycyna</td>
				<td>100 U/ml - 0,1 mg/ml</td>
				<td>Pojemność 5 ml</td>
			</tr>
			<tr>
				<td>2-merkaptoetanol</td>
				<td>0,1 mM</td>
				<td>900 μl</td>
			</tr>
			<tr>
				<td>Suplement B27 - bez witaminy A</td>
				<td>1 proc</td>.
				<td>Pojemność 10 ml</td>
			</tr>
			<tr>
				<td>Suplement N2</td>
				<td>1 proc</td>.
				<td>Pojemność 5 ml</td>
			</tr>
			<tr>
				<td>Nokaut DMEM</td>
				<td>-</td>
				<td>Pojemność 370 ml</td>
			</tr>
		</tbody>
	</table>
	 
	Podłoże podstawowe można przechowywać w temperaturze 4 °C nie dłużej niż 2 tygodnie. Aby przygotować kompletną pożywkę wzrostową, tuż przed karmieniem dodaje się zasadowy FGF w końcowym stężeniu 20 ng/ml.</li>
</ol>
Uwaga: Kompletny H-ESM oparty na mysich fibroblastach embrionalnych może być stosowany zamiast mTESR1 lub Nutristem dla komórek iPS.
<ol start="4">
	<li>Umieścić powlekane płytki w inkubatorze w temperaturze 37 °C na 30 minut do 2 godzin przed pasażem.</li>
	<li>Komórki powinny być przepuszczane mniej więcej co 5 dni, nawet jeśli nie osiągnęły zbiegu. Kolonie nie powinny się stykać.</li>
	<li>Zastąp pożywkę wzrostową 1 ml dypazy (1 mg/ml, rozpuścić z 10 mg/ml zapasu w PBS).</li>
	<li>Usunąć zróżnicowane obszary za pomocą pipet Pasteura z wyciągniętego szkła. Obszary, które powinny zostać usunięte, obejmują struktury przypominające kratery lub torbiele w centrum kolonii oraz wszelkie obszary, w których komórki zostały oddzielone od kolonii i spłaszczone i wydają się migrować na zewnątrz.</li>
	<li>Inkubować w temperaturze 37 °C pod kapturem hodowlanym, aż granice kolonii staną się jaśniejsze i zaczną się odrywać (zwykle około 5-7 minut). Wyrzuć dispase. Przemyć 1 ml H-ESM i wyrzucić.</li>
	<li>W 1 ml H-ESM użyj podnośnika komórkowego (skrobaka przypominającego szpatułkę) do zebrania kolonii i zebrania w 15 ml probówce Eppendorf. Spłukać 1 ml H-ESM i dodać do tubki. Wirować z prędkością 1,000 rcf przez 4 minuty i usunąć supernatant.</li>
	<li>Zawiesić osad w 1 ml wstępnie ogrzanej pożywki wzrostowej (mTESR1 lub Nutristem). Unikaj zbytniego rozbijania grudek - pipeta w górę i w dół mniej niż 6-8 razy. Określ, ile komórek należy posiać i usuń zbędne komórki (zwykle rozcieńczenie 1:4 lub 1:5), np. na 2 płytki w stosunku 1:5 usuń 600 μl, a następnie dodaj 1,6 ml świeżej pożywki.</li>
	<li>Usuń Matrigel z płytek. Układaj komórki kropla po kropli, równomiernie rozprowadzając na talerzu. Unikaj nadmiernego potrząsania rurką, ponieważ spowoduje to przesuwanie się komórek w kierunku środka.</li>
	<li>Umyj probówkę 1 ml pożywki i podziel na płytki. Ostateczna objętość w każdej płytce powinna wynosić 1,5 -2 ml.</li>
	<li>Zmieniaj podłoże codziennie, z wyjątkiem dnia po pasażu. Chociaż idealna jest codzienna zmiana pożywki, czasami może to być zmieniane z częstotliwością raz na dwa dni, jeśli nie minęły więcej niż 2-3 dni od ostatniego pasażu bez wpływu na pluripotencję lub potencjał różnicowania.</li>
	<li>Jeśli linia komórkowa musi zostać zamrożona, zamiast tego ponownie zawiesić w 1-2 ml mFreSR zamrażarki za pomocą pipety 2 ml i umieścić 1 ml/kriowial. Umieścić fiolki w kriopojemniku w temperaturze -80 °C i przenieść do ciekłego azotu w ciągu 3-4 dni.</li>
</ol>
Uwaga: Ręczna mikrodysekcja komórek iPS musi być wykonana pod mikroskopem stereoskopowym. Stacja robocza do zapłodnienia in vitro (IVF) (np. stacja robocza IVF firmy KSystem) zintegrowana ze stereomikroskopem umożliwia manipulowanie komórkami w sterylnych warunkach, gdy są one przechowywane na ogrzewanej powierzchni. Jeśli nie jest to możliwe, mikroskop stereoskopowy można przenieść pod zwykłą pokrywę z przepływem laminarnym.
2. Agregacja ciał embrionalnych i indukcja serca
<ol>
	<li>Przygotować pożywkę EBM-20 zgodnie z poniższą tabelą.
	<table border="1" fo:keep-together.within-page="zawsze">
		<tbody>
			<tr>
				<td>EBM-20</td>
				<td>KOŃCOWE STĘŻENIE</td>
				<td>NA 500 ml</td>
			</tr>
			<tr>
				<td>Surowica płodowa bydlęca (pochodzenie z Ameryki Południowej)</td>
				<td>20%</td>
				<td>Pojemność 100 ml</td>
			</tr>
			<tr>
				<td>Aminokwasy endogenne MEM</td>
				<td>0,1 mM</td>
				<td>Pojemność 5 ml</td>
			</tr>
			<tr>
				<td>Penicylina - streptomycyna</td>
				<td>100U/ml - 0,1 mg/ml</td>
				<td>Pojemność 5 ml</td>
			</tr>
			<tr>
				<td>GlutaMAX 100X</td>
				<td>0,1 mM</td>
				<td>Pojemność 5 ml</td>
			</tr>
			<tr>
				<td>2-merkaptoetanol</td>
				<td>50uM</td>
				<td>450 μl</td>
			</tr>
			<tr>
				<td>DMEM/F12</td>
				<td>-</td>
				<td>Pojemność 385 ml</td>
			</tr>
		</tbody>
	</table>
	 
	Stosowanie FBS pochodzących z Ameryki Południowej ma kluczowe znaczenie dla określenia skuteczności różnicowania: zastosowanie innych rodzajów surowic może wpływać na proces różnicowania. Aby przygotować kompletny EBM-20, dodaj kwas askorbinowy (AA) do końcowego stężenia 50 μg/ml. Kompletne podłoże wzrostowe można przechowywać w temperaturze 4 °C nie dłużej niż jeden tydzień.</li>
	<li>Zbierz kolonie iPS zgodnie z powyższym opisem (kroki od 1.6 do 1.9).</li>
	<li>Delikatnie zawiesić w 1 ml EBM-20 za pomocą pipety 2 ml. Unikaj zbytniego rozbijania grudek - pipetuj w górę i w dół nie więcej niż 2-3 razy, sprawdzając wielkość kolonii pod mikroskopem stereoskopowym. Płytka na płytkach o bardzo niskim mocowaniu w stosunku 1:1 (np. w przypadku naczynia 35 mm należy użyć 1 dołka z płytki 6-dołkowej). Opłucz probówkę 1 ml EBM-20 i dodaj do talerza.</li>
</ol>
Uwaga: Wielkość kolonii wpływa na proces różnicowania, kontrolując skuteczność i czas indukcji serca. Wykazano, że agregacja EB o jednorodnej wielkości zmniejsza zmienność obserwowaną podczas różnicowania.
<ol start="4">
	<li>W dniu 3 zmień EBM-20 raz za pomocą mikroskopu, aby uniknąć usunięcia EBs. Trzymaj pipetę blisko krawędzi płytki i usuń medium.</li>
	<li>W 7 dniu należy przestawić EB na płytki pokryte 0,1% żelatyną i uprzednio umieszczone w temperaturze 37 °C na 30 minut. W razie potrzeby żelatynę można usunąć, a płytki pozostawić pod kapturem do hodowli komórkowych O/N. Dodać 35-40 EB na szalkę 35 mm.</li>
	<li>Sprawdzaj EB pod kątem obszarów bicia i zmieniaj EBM-20 dwa razy w tygodniu. Zaznacz miejsca, w których znajdują się obszary dudnienia na górze pokrywy naczynia, aby ułatwić ich lokalizację pod mikroskopem stereoskopowym. Obszary kontraktacji powinny pojawić się po około 10-20 dniach.</li>
	<li>Gdy pojawią się obszary ze spontanicznym skurczem, zmień pożywkę na EBM-2 (przygotuj jako EBM-20, zamiast tego z 2% FBS) i wyizoluj je zgodnie z opisem poniżej w sekcji 3.</li>
	<li>Kontynuuj sprawdzanie innych obszarów do ubijania i zmieniaj podłoże dwa razy w tygodniu, aż obszary ubijania będą potrzebne do dalszych eksperymentów.</li>
</ol>
Uwaga: Efektywność procesu różnicowania zależy w dużym stopniu od kilku czynników, z których najbardziej krytyczne to specyficzne linie komórkowe i partia surowicy używana do indukowania różnicowania serca. Aby uzyskać najwyższą skuteczność, należy przetestować linie komórkowe pod kątem potencjału kardiomiogennego i różne partie surowicy.
3. Izolacja i kultura obszarów pokonania
<ol>
	<li>Pokryj płytki 12-dołkowe (powierzchnia 4cm2) lub płytki będące przedmiotem zainteresowania fibronektyną o stężeniu 5 μg/cm2, rozcieńczoną w PBS, aby uzyskać objętość wystarczającą do całkowitego pokrycia całej powierzchni (łącznie 300 μl na basenik w płytkach 12-dołkowych). Przechowywać bez przykrycia w kapturze do hodowli komórkowych i pozostawić do wyschnięcia. Talerze można owijać i przechowywać w temperaturze 4 °C O/N.</li>
	<li>W razie potrzeby usunąć obszar ubijania za pomocą szklanej pipety Pasteura i skalpela. Przenieść na płytki pokryte fibronektyną za pomocą pipety o pojemności 1 ml.</li>
	<li>Dodać 1 ml EBM-2.</li>
	<li>Skreślić tabliczkę, aby wskazać obszary, z których usunięto komórki i zmienić podłoże. Talerze można przechowywać do 1 miesiąca, ponieważ inne obszary mogą później zacząć bić.</li>
</ol>
Uwaga: Jeśli potrzebne są mniejsze grudki, kilkakrotnie pipetuj eksplantowany obszar w górę i w dół pod mikroskopem stereoskopowym, aż rozpadnie się na mniejsze kawałki. Spowoduje to powstanie klastrów składających się z kilku bijących komórek (patrz film 3).
<ol start="5">
	<li>Zmieniaj podłoże dwa razy w tygodniu, aż będzie gotowe do analiz.</li>
</ol>
Uwaga: Kardiomiocyty uzyskane z tego protokołu posiadają podobne do płodowych cechy morfologiczne i funkcjonalne; dojrzewanie do fenotypu dorosłego można uzyskać poprzez wydłużenie czasu w hodowli w celu dalszego różnicowania tych komórek.
4. Izolacja i analiza pojedynczych komórek bijących
<ol>
	<li>Szkiełka dwukomorowe (powierzchnia 4cm2) lub inne odpowiednie podłoża pokryć fibronektyną o stężeniu 5 μg/cm2 rozcieńczoną w wystarczającej ilości PBS, aby pokryć całą powierzchnię hodowli. Jeśli używany jest szklany nośnik, pokryj lamininą i fibronektyną (5 μg/cm2 każdy).</li>
	<li>Usunąć obszar ubijania pipetą/skalpelem Pasteura z płytek z sekcji 3.</li>
	<li>Za pomocą pipety o pojemności 1 ml przenieść komórki do probówki o pojemności 15 ml zawierającej 500 μl kolagenazy II (480 j./ml w PBS z Mg i Ca) i inkubować przez 15 minut w temperaturze 37 °C, potrząsając probówką jeden raz podczas inkubacji.</li>
	<li>Pipetować w górę i w dół za pomocą pipety o pojemności 200 μl. Jeśli pozostaną jakieś grudki, przenieś do świeżej kolagenazy II i powtórz krok 4.3.</li>
	<li>Powtarzaj krok 4.4, aż nie pozostaną żadne duże grudki.</li>
	<li>Inaktywuj kolagenazę za pomocą 3 ml EBM-2 (bez AA). Dętkę można następnie pozostawić pod maską w podgrzewanym stojaku, aż inne rurki będą gotowe. Wirować przy 1,000 rcf przez 4 min.</li>
	<li>Zawiesić osad w 1 ml 0,25% trypsyny/EDTA (rozcieńczony z 0,5% wywaru w 1X PBS) i inkubować w temperaturze 37 °C przez 5 minut. Połączyć frakcje mineralizacji z tej samej próbki początkowej.</li>
	<li>Dezaktywuj trypsynę za pomocą 4 ml EBM-2 (bez AA). Przepuścić komórki przez igłę 18G na strzykawce o pojemności 2,5 ml nie więcej niż 7 razy. Wirować przy 1,000 rcf przez 4 min.</li>
	<li>Zawiesić osad komórkowy w 1 ml EBM-2 na dołek i płytkę. Komórki można wykorzystać do analiz funkcjonalnych i morfologicznych 2-3 dni po posiewie.</li>
</ol>

<ol><li>Di Pasquale, E., Latronico, M. V., Jotti, G. S., Condorelli, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lentiviral+vectors+and+cardiovascular+diseases%3A+a+genetic+tool+for+manipulating+cardiomyocyte+differentiation+and+function%5BTitle%5D)+AND+%22Gene+Therapy%22%5BJournal%5D)">Lentiviral vectors and cardiovascular diseases: a genetic tool for manipulating cardiomyocyte differentiation and function.</a> Gene Therapy. 19, 642-648 (2012).</li>
<li>Laflamme, M. A., Murry, C. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Heart+regeneration%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Heart regeneration.</a> Nature. 473, 326-335 (2011).</li>
<li>Mummery, C. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differentiation+of+human+embryonic+stem+cells+and+induced+pluripotent+stem+cells+to+cardiomyocytes%3A+a+methods+overview%5BTitle%5D)+AND+%22Circulation+Research%22%5BJournal%5D)">Differentiation of human embryonic stem cells and induced pluripotent stem cells to cardiomyocytes: a methods overview.</a> Circulation Research. 111, 344-358 (2012).</li>
<li>Wu, S. M., Chien, K. R., Mummery, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Origins+and+fates+of+cardiovascular+progenitor+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Origins and fates of cardiovascular progenitor cells.</a> Cell. 132, 537-543 (2008).</li>
<li>Thomson, J. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Embryonic+stem+cell+lines+derived+from+human+blastocysts%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Embryonic stem cell lines derived from human blastocysts.</a> Science. 282, 1145-1147 (1998).</li>
<li>Takahashi, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Induction+of+pluripotent+stem+cells+from+adult+human+fibroblasts+by+defined+factors%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Induction of pluripotent stem cells from adult human fibroblasts by defined factors.</a> Cell. 131, 861-872 (2007).</li>
<li>Yu, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Induced+pluripotent+stem+cell+lines+derived+from+human+somatic+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Induced pluripotent stem cell lines derived from human somatic cells.</a> Science. 318, 1917-1920 (2007).</li>
<li>Yamanaka, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+fresh+look+at+iPS+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">A fresh look at iPS cells.</a> Cell. 137, 13-17 (2009).</li>
<li>Josowitz, R., Carvajal-Vergara, X., Lemischka, I. R., Gelb, B. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Induced+pluripotent+stem+cell-derived+cardiomyocytes+as+models+for+genetic+cardiovascular+disorders%5BTitle%5D)+AND+%22Curr.+Opin.+Cardiol%22%5BJournal%5D)">Induced pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes as models for genetic cardiovascular disorders.</a> Curr. Opin. Cardiol. 26, 223-229 (2011).</li>
<li>Park, I. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Disease-specific+induced+pluripotent+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Disease-specific induced pluripotent stem cells.</a> Cell. 134, 877-886 (2008).</li>
<li>Carvajal-Vergara, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Patient-specific+induced+pluripotent+stem-cell-derived+models+of+LEOPARD+syndrome%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Patient-specific induced pluripotent stem-cell-derived models of LEOPARD syndrome.</a> Nature. 465, 808-812 (2012).</li>
<li>Moretti, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Patient-specific+induced+pluripotent+stem-cell+models+for+long-QT+syndrome%5BTitle%5D)+AND+%22N.+Engl.+J.+Med%22%5BJournal%5D)">Patient-specific induced pluripotent stem-cell models for long-QT syndrome.</a> N. Engl. J. Med. 363, 1397-1409 (2010).</li>
<li>Yazawa, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Using+induced+pluripotent+stem+cells+to+investigate+cardiac+phenotypes+in+Timothy+syndrome%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Using induced pluripotent stem cells to investigate cardiac phenotypes in Timothy syndrome.</a> Nature. 471, 230-234 (2011).</li>
<li>Itzhaki, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Modeling+of+catecholaminergic+polymorphic+ventricular+tachycardia+with+patient-specific+human-induced+pluripotent+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+the+American+College+of+Cardiology%22%5BJournal%5D)">Modeling of catecholaminergic polymorphic ventricular tachycardia with patient-specific human-induced pluripotent stem cells.</a> Journal of the American College of Cardiology. 60, 990-1000 (2012).</li>
<li>Jung, C. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dantrolene+rescues+arrhythmogenic+RYR2+defect+in+a+patient-specific+stem+cell+model+of+catecholaminergic+polymorphic+ventricular+tachycardia%5BTitle%5D)+AND+%22EMBO+Molecular+Medicine%22%5BJournal%5D)">Dantrolene rescues arrhythmogenic RYR2 defect in a patient-specific stem cell model of catecholaminergic polymorphic ventricular tachycardia.</a> EMBO Molecular Medicine. 4, 180-191 (2012).</li>
<li>Sun, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Patient-specific+induced+pluripotent+stem+cells+as+a+model+for+familial+dilated+cardiomyopathy%5BTitle%5D)+AND+%22Science+Translational+Medicine%22%5BJournal%5D)">Patient-specific induced pluripotent stem cells as a model for familial dilated cardiomyopathy.</a> Science Translational Medicine. 4, 130ra147(2012).</li>
<li>Kehat, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+embryonic+stem+cells+can+differentiate+into+myocytes+with+structural+and+functional+properties+of+cardiomyocytes%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Clinical+Investigation%22%5BJournal%5D)">Human embryonic stem cells can differentiate into myocytes with structural and functional properties of cardiomyocytes.</a> The Journal of Clinical Investigation. 108, 407-414 (2001).</li>
<li>Cao, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ascorbic+acid+enhances+the+cardiac+differentiation+of+induced+pluripotent+stem+cells+through+promoting+the+proliferation+of+cardiac+progenitor+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Research%22%5BJournal%5D)">Ascorbic acid enhances the cardiac differentiation of induced pluripotent stem cells through promoting the proliferation of cardiac progenitor cells.</a> Cell Research. 22, 219-236 (2012).</li>
<li>Takahashi, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ascorbic+acid+enhances+differentiation+of+embryonic+stem+cells+into+cardiac+myocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Circulation%22%5BJournal%5D)">Ascorbic acid enhances differentiation of embryonic stem cells into cardiac myocytes.</a> Circulation. 107, 1912-1916 (2003).</li>
<li>Moretti, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Patient-specific+induced+pluripotent+stem-cell+models+for+long-QT+syndrome%5BTitle%5D)+AND+%22N.+Engl.+J.+Med%22%5BJournal%5D)">Patient-specific induced pluripotent stem-cell models for long-QT syndrome.</a> N. Engl. J. Med. 363, 1397-1409 (2011).</li>
<li>Watanabe, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+ROCK+inhibitor+permits+survival+of+dissociated+human+embryonic+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">A ROCK inhibitor permits survival of dissociated human embryonic stem cells.</a> Nature Biotechnology. 25, 681-686 (2007).</li>
</ol>

Brak interesów finansowych do ujawnienia.

Pluripotencjalne komórki macierzyste mają potencjał do spontanicznego różnicowania się w CM, aczkolwiek z niską wydajnością i dużą zmiennością między liniami. Opracowanie nowatorskich metod indukcji skupiło się zatem na poprawie wydajności procesu i przejściu na bardziej zdefiniowane protokoły. Jednak większość z tych nowych metod różnicowania jest dość złożona, wymagająca skomplikowanych warunków hodowli, dokładnej kontroli czasu i stężenia odczynników oraz leczenia drogimi cytokinami i czynnikami wzrostu. Ponadto różni...

Historycznie rzecz biorąc, badanie genetycznych i molekularnych mechanizmów napędzających rozwój człowieka i choroby opierało się na generowaniu genetycznie modyfikowanych modeli zwierzęcych. Jednak wielu ludzkich fenotypów nie udaje się z powodzeniem replikować u myszy, głównie z powodu różnic biologicznych istniejących między tymi dwoma gatunkami. Z drugiej strony dostęp do tkanek ludzkich może być ograniczony i często nie pozwala na uzyskanie wystarczającej ilości materiału do pogłębionych badań eksperymentalnych. Dziedzina biologii sercowo-naczyniowej cierpi na oba te ograniczenia: fizjologia ludzkiego serca znacznie różni się od fizjologii myszy, a znaczna ilość tkanki serca jest dostępna tylko po sekcji zwłok lub podczas operacji serca. Znalezienie optymalnego źródła różnicowania funkcjonalnych ludzkich CM stało się zatem centralnym tematem biologii sercowo-naczyniowej i włożono wiele wysiłku, aby rozwiązać ten problem. Zaproponowano różne typy komórek, w tym mioblasty szkieletowe, lokalne komórki macierzyste serca, komórki jednojądrzaste szpiku kostnego, progenitory śródbłonka i mezenchymalne komórki macierzyste. Jednak dane uzyskane przy użyciu tych komórek nie były spójne 4.
Pierwsze 5 i przełomowe odkrycie indukowanych pluripotencjalnych komórek macierzystych (iPS) przez Yamanakę i Thomsona 6,7 później zdawały się dostarczać rozwiązań: komórki te mają zdolność do wzrostu w nieskończoność i potencjał do powstania wszystkich pochodnych komórkowych trzech listków rozrodczych, w tym CM. Zastosowanie komórek iPS ma jeszcze inne zalety: ponieważ pochodzą z autologicznych komórek dorosłych, mają ten sam genom co osoba lub pacjent, od którego pochodzą. Pozwalają one zatem na opracowanie modeli in vitro, które ułatwiają badanie chorób genetycznych człowieka i mechanizmów ich rozwoju. Ze względu na tę cechę, komórki iPS mogą również przezwyciężyć problemy związane z odrzuceniem immunologicznym i kwestiami etycznymi 8. Z tych powodów, mimo że ESC nadal stanowią złoty standard w dziedzinie biologii komórek macierzystych, naukowcy na całym świecie skłaniają się obecnie bardziej ku technologii komórek iPS.
Komórki iPS są teraz wykorzystywane do modelowania ludzkich chorób in vitro dla różnych schorzeń, w tym wrodzonych zaburzeń sercowo-naczyniowych 9,10. Ostatnio przeprowadzono zastosowanie modelowania chorób z komórek iPS w monogenowych zaburzeniach serca (tj. zespołach wydłużonego odstępu QT, katecholaminergicznym polimorficznym częstoskurczu komorowym) oraz patologiach, w których wady serca są częścią złożonego fenotypu (np. zespoły lamparta i tymotki, kardiomiopatia rozstrzeniowa). Doniesienia te potwierdziły, że specyficzne dla pacjenta komórki iPS, które są różnicowane w CM, wykazują podobne cechy fenotypowe i funkcjonalne jak choroba in vivo.
Jednakże, wciąż istnieje wiele wyzwań związanych z poprawą skuteczności indukowania komórek iPS do linii serca. Spontaniczne wytwarzanie CM z ludzkich ESC poprzez tworzenie agregatów zwanych ciałami embrionalnymi (EB) okazało się skuteczne 17. Od czasu tego odkrycia zaproponowano wiele innych metod. Wiele grup znacznie zwiększyło skuteczność protokołu różnicowania i przeszło w kierunku chemicznie zdefiniowanych i wolnych od produktów zwierzęcych odczynników do hodowli (patrz Mummery, C., et al., Circulation Research (2012) w celu kompleksowego przeglądu wszystkich istniejących metod 3).
Niemniej jednak, klasyczna metoda oparta na agregacji EB nadal jest najczęściej stosowana do przeprowadzania badań funkcjonalnych i badania mechanizmów chorobowych. Proponowany przez nas protokół opiera się na agregacji komórek iPS w EB i hodowli w obecności surowicy i kwasu askorbinowego, co, jak wykazano, wzmacnia proces różnicowania serca i pozytywnie wpływa na dojrzewanie tych komórek 18,19. W tym artykule szczegółowo omówimy tę metodologię i pokażemy, jak wykorzystać linie komórkowe iPS bez karmienia do generowania specyficznych dla pacjenta CM pochodzących z iPS.

<table><tbody><tr><td colspan="4">Media i odczynniki</td></tr><tr><td>Human ESC-qualified Matrix</td><td>BD Biosciences</td><td>354277</td><td>Rozmrozić butelkę o pojemności 5 ml w temperaturze 4 & C na lodzie O/N, podwielokrotność we wstępnie schłodzonych krioprobówkach na lodzie, zgodnie z instrukcją rozcieńczania w karcie katalogowej i przechowywać w temperaturze -20 °; C .</td></tr><tr><td>Fibronektyna, z ludzkiego osocza, 0,1% roztwór</td><td>Sigma</td><td>F0896-2MG</td><td>Stężenie robocze: 5 &mu; g / cm2</td></tr><tr><td>Laminin</td><td>Sigma</td><td>L2020-1MG</td><td>Stężenie robocze: 5 &mu; g/cm2</td></tr><tr><td>PBS (bez Mg i Ca), 10X</td><td>Lonza</td><td>BE17-515F</td><td></td></tr><tr><td>PBS (z Mg i Ca), 10X</td><td>Bio Sera</td><td>XC-S2067/500</td><td></td></tr><tr><td>Dispase II, proteaza obojętna, stopień II</td><td>Roche</td><td>4942078001</td><td>Zapas: 10 mg/ml w DMEM-F12 w temperaturze -20 &deg; C, roztwór roboczy: 1 mg / ml w PBS (bez Mg / Ca)</td></tr> <tr><td>Trypsyna / EDTA, 0,5%</td> <td>Sigma</td><td>T3924</td><td></td></tr><tr><td>Kolagenaza typu 2</td><td>Worthington</td><td>4176</td><td>Rozcieńczony do 480 U / ml (np. 1,6 mg / ml) w PBS z Mg i Ca</td></tr><tr><td>DMEM-F12</td><td>Life Technologies</td><td>21331-020</td><td></td></tr><tr><td>Nokaut DMEM</td><td>Life Technologies</td><td>10829-018</td><td></td></tr><tr><td>Serum nokautujące Zamiennik (KSR)</td><td>Life Technologies</td><td>10828-028</td><td>Rozmrażanie przy 4 stopniach; C, podwielokrotność i przechowywać w temperaturze -20 & deg; C</td></tr><tr><td>F&#8211; Surowica bydlęca (pochodzenie Ameryka Południowa)</td><td>Invitrogen</td><td>10270-106</td><td>Partie należy przebadać pod kątem ich potencjału kardiogennego. Rozmrażanie w 4 & stopni; C, inaktywacja termiczna w temperaturze 56 &; C przez 30 min, podwielokrotność i przechowywać w temperaturze -20 &; C</td></tr><tr><td>PenStrep, penicylina-Streptomycyna, 100X</td><td>Life Technologies</td><td>15140-122</td><td></td></tr><tr><td>GlutaMAX, 100X</td><td>Life Technologies</td><td>35050-038</td><td></td></tr><tr><td>MEM NEAA, 100X</td><td>Suplement Invitrogen</td><td>11140-135</td><td></td></tr><tr><td>N2, 100X</td><td>Life Technologies</td><td>17502-048</td><td></td></tr><tr><td>B27 suplement, 50X</td><td>Life Technologies</td><td>12587-010</td><td></td></tr><tr><td>2-mercapt&#8211; thanol</td><td>Invitrogen</td><td>31350-010</td><td></td></tr><tr><td>Żelatyna, ze skóry wieprzowej</td><td>Sigma</td><td>G1890-100G</td><td>Stęż 1% w wodzie, przechowuj w temperaturze -20 °C. Rozcieńczyć do 0,1% w PBS i przechowywać w temperaturze 4 &deg; C</td></tr><tr><td>mTeSR1</td><td>Stem Cell Technologies</td><td>5850</td><td>Połącz suplement 5X z podłożem podstawowym, podwielokrotnością i przechowuj w temperaturze -20 stopni Celsjusza. Nie przechowywać pełnego podłoża w temperaturze 4 & stopni; C przez ponad 1 tydzień</td></tr><tr><td>Nutristem hESC XF</td><td>Stemgent from Biological Industries</td><td>05-100-1A</td><td>Rozmrozić w temperaturze 4 & C O/N, podwielokrotność i przechowywać w temperaturze -20 &deg; C do momentu użycia. Podwielokrotności mogą być utrzymywane w temperaturze 4 stopni C nie dłużej niż tydzień.</td></tr><tr><td>mFreSR</td><td>Stem Cell Technologies</td><td>5853</td><td></td></tr><tr><td>Kwas askorbinowy</td><td>Sigma</td><td>A4544-25G</td><td>Przygotować bulion w ilości 10 mg/ml w wodzie. Przechowuj podwielokrotności w temperaturze -20 &deg; C w ciemności. Dodaj do EBM w końcowym stężeniu (500X)</td></tr><tr><td colspan="4">Plasticware</td></tr><tr><td>35 mm Naczynia hodowlane</td><td>Becton Dickinson</td><td>353001</td><td></td></tr><tr><td>Skrobak komórkowy</td><td>Corning Incorporated</td><td>3008</td><td></td></tr><tr><td>12-dołkowe Becton</td><td>Dickinson</td><td>353043</td><td></td></tr><tr><td>Szkiełka 2-dołkowe Permanox</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>177437</td><td></td></tr><tr><td>Szkiełka szklane 2-dołkowe Thermo</td><td>Fisher Scientific</td><td>177380</td><td></td></tr><tr><td>Płytki 6-dołkowe, bardzo niska powierzchnia mocowania</td><td>Igła Corning Incorporated</td><td>3471</td><td></td></tr><tr><td>18G</td><td>Pipety Pasteura Becton Dickinson</td><td>304622</td><td></td></tr><tr><td>Szklane, 230 mm</td> STRZYKAWKA <td>VWR International</td><td>612-1702</td><td></td></tr><tr><td>2,5 ml</td><td>Becton Dickinson</td><td>300188</td><td></td></tr><tr><td colspan="4">Equipments</td></tr><tr><td>IVF Workstation</td><td>KSystem, by Nikon</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Nikon SMZ1500 Stereomikroskop</td><td>Nikon</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

generowanie ludzkich kardiomiocytów: protokół różnicowania od indukowanych przez człowieka pluripotencjalnych komórek macierzystych bez karmienia

Generation of Human Cardiomyocytes: A Differentiation Protocol from Feeder-free Human Induced Pluripotent Stem Cells

Aby zbadać zdarzenia napędzające rozwój serca i określić mechanizmy molekularne prowadzące do chorób mięśnia sercowego u ludzi, konieczne jest najpierw wygenerowanie funkcjonalnych ludzkich kardiomiocytów (CM). Wykorzystanie tych komórek w badaniach nad lekami i toksykologią byłoby również bardzo korzystne, umożliwiając walidację przedkliniczną nowych cząsteczek farmakologicznych stosowanych w leczeniu chorób serca na komórkach pochodzenia ludzkiego. Spośród możliwych źródeł CM, indukowane pluripotencjalne komórki macierzyste (iPS) są jednymi z najbardziej obiecujących, ponieważ mogą pochodzić bezpośrednio z łatwo dostępnych tkanek pacjenta i posiadają wewnętrzną zdolność do tworzenia wszystkich typów komórek w organizmie 1. Zaproponowano kilka metod różnicowania komórek iPS w CM, począwszy od klasycznego podejścia do agregacji ciał zarodkowych (EBs), a skończywszy na chemicznie zdefiniowanych protokołach 2,3. W tym artykule proponujemy protokół oparty na EBs i pokazujemy, w jaki sposób można wykorzystać tę metodę do wydajnego generowania funkcjonalnych komórek podobnych do CM z komórek iPS bez zasilania.

W naszych badaniach wygenerowaliśmy CM z kilku linii komórek iPS. Linie te zostały początkowo wytworzone na warstwie syderowej MEF, a następnie niezwłocznie przeniesione na Matrigel z użyciem zdefiniowanego medium (mTESR1 lub Nutristem). Wykorzystano różne testy w celu weryfikacji zachowania właściwości morfologicznych, ekspresji markerów typowych dla komórek pluripotencjalnych (OCT-4, SSEA4 i TRA1-60) oraz ich stabilności genomowej (Rycina 1).
Indukcja w kierunku linii kardio...

Pluripotencjalne komórki macierzyste, zarówno embrionalne, jak i indukowane pluripotencjalne komórki macierzyste (iPS), stanowią cenne źródło ludzkich zróżnicowanych komórek, w tym kardiomiocytów. Tutaj skupimy się na indukcji komórek iPS w sercu, pokazując, jak wykorzystać je do uzyskania funkcjonalnych ludzkich kardiomiocytów za pomocą protokołu opartego na ciałach embrionalnych.

Generowanie ludzkich kardiomiocytów: protokół różnicowania od indukowanych przez człowieka pluripotencjalnych komórek macierzystych bez karmienia

In order to investigate the events driving heart development and to determine the molecular mechanisms leading to myocardial diseases in humans, it is ...

Ogólnym celem niniejszej procedury jest różnicowanie ludzkich kardiomiocytów z ludzkich komórek iPS hodowanych w warunkach bez fibroblastów pokarmowych. Osiąga się to poprzez uprzednie wysianie komórek iPS na płytki o ultraniskiej adhezji w celu utworzenia ciał embrionalnych. Drugim krokiem procedury jest przeniesienie powstałych ciał embrionalnych do naczyń pokrytych żelatyną.Po pojawieniu się obszarów kurczliwych, są one ręcznie wycinane pod mikroskopem stereoskopowym i wysiewane na płytki pokryte fibronektyną. W celu dalszego różnicowania, ostatnim krokiem jest uzyskanie pojedynczych kardiomiocytów poprzez trawienie enzymatyczne kurczliwych skupisk. Ostatecznie wyniki mogą wykazać różnicowanie komórek przypominających kardiomiocyty, które wykazują ekspresję typowych markerów strukturalnych, takich jak troponina sercowa, co potwierdza mikroskopia immunofluorescencyjna.Metoda ta może pomóc w odpowiedzi na kluczowe pytania z zakresu biologii układu sercowo-naczyniowego, takie jak mechanizmy napędzające różnicowanie i dysfunkcję kardiomiocytów podczas rozwoju serca oraz w przebiegu chorób na poziomie ludzkiego kardiomiocytu. Jest to niezwykle interesująca technika, ponieważ umożliwi

generation-human-cardiomyocytes-differentiation-protocol-from-feeder

Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

Wytwarzanie ludzkich kardiomiocytów: Protokół różnicowania z ludzkich komórek pluripotencjalnych indukowanych bez komórek żywicielskich

Opracowaliśmy protokół indukcji kardioblastów bezpośrednio z pluripotencjalnych ludzkich embrionalnych komórek macierzystych utrzymywanych w ściśle określonych warunkach z użyciem małych cząsteczek, co umożliwia pozyskanie dużej ilości ludzkich progenitorów serca oraz funkcjonalnych kardiomiocytów do regeneracji układu sercowo-naczyniowego.

Efektywne otrzymywanie prekursorów kardiologicznych i kardiomiocytów ludzkich z pluripotencjalnych ludzkich embrionalnych komórek macierzystych z wykorzystaniem indukcji małocząsteczkowej

Artykuł opisuje szczegółową metodologię skutecznego różnicowania ludzkich pluripotencjalnych komórek macierzystych w kardiomiocyty poprzez selektywne modulowanie szlaku Wnt, a następnie analizę markerów referencyjnych za pomocą cytometrii przepływowej w celu oceny jednorodności i tożsamości populacji.

Wysoka skuteczność różnicowania ludzkich pluripotencjalnych komórek macierzystych do kardiomiocytów i charakterystyka za pomocą cytometrii przepływowej

Tutaj opisujemy solidny protokół do pozyskiwania ludzkich kardiomiocytów, który łączy modulowane małymi cząsteczkami różnicowanie serca i oczyszczanie kardiomiocytów za pośrednictwem deprywacji glukozy, umożliwiając produkcję oczyszczonych kardiomiocytów dla celów modelowania chorób sercowo-naczyniowych i badań przesiewowych leków.

Otrzymywanie wysoce oczyszczonych kardiomiocytów z ludzkich indukowanych pluripotencjalnych komórek macierzystych przy użyciu różnicowania modulowanego małymi cząsteczkami i późniejszego głodu glukozy

Generowanie kardiomiocytów z pluripotencjalnych komórek macierzystych in vitro umożliwia dostęp do dużych ilości tkanki serca in vitro dla nauk podstawowych i zastosowań klinicznych.  Protokół ten wykorzystuje czynnik przedsionkowy Grem2 zarówno do zwiększenia liczby uzyskanych kardiomiocytów, jak i do wytworzenia kardiomiocytów o fenotypie przedsionkowym.

Różnicowanie kardiomiocytów przedsionkowych od pluripotencjalnych komórek macierzystych za pomocą antagonisty BMP Grem2

Tutaj prezentujemy solidny, szybki i skalowalny protokół różnicowania kardiomiocytów dla ludzkich pluripotencjalnych komórek macierzystych (hPSC). Kardiomiocyty uzyskane przy użyciu tej metody na dużą skalę mogą zapewnić wystarczającą liczbę komórek do ich skutecznego wykorzystania w modelowaniu chorób sercowo-naczyniowych u ludzi, wysokoprzepustowych badaniach przesiewowych leków i potencjalnie zastosowaniach klinicznych.

Produkcja kardiomiocytów na dużą skalę z ludzkich pluripotencjalnych komórek macierzystych przy użyciu wysoce powtarzalnego protokołu różnicowania opartego na małych cząsteczkach

Prezentujemy trzy nowatorskie i bardziej efektywne protokoły różnicowania ludzkich indukowanych pluripotencjalnych komórek macierzystych na kardiomiocyty, komórki śródbłonka i komórki mięśni gładkich oraz metodę dostarczania, która poprawia wszczepianie przeszczepionych komórek poprzez połączenie iniekcji komórek z dostarczaniem cytokin za pośrednictwem łatki.

Pluripotencjalne komórki serca pochodzące z komórek macierzystych do naprawy mięśnia sercowego

Elektrofizjologiczna charakterystyka kardiomiocytów pochodzących z ludzkich pluripotencjalnych komórek macierzystych (hPSC-CMs) jest kluczowa dla modelowania chorób serca i określania odpowiedzi na leki. Protokół ten dostarcza informacji niezbędnych do dysocjacji i płytki hPSC-CM na matrycach wieloelektrodowych, pomiaru ich potencjału pola oraz metody analizy odstępów QT i RR.

Analiza elektrofizjologiczna ludzkich kardiomiocytów pochodzących z pluripotencjalnych komórek macierzystych (hPSC-CM) przy użyciu macierzy wieloelektrodowych (MEA)

Tutaj prezentujemy metodę efektywnego wykorzystania potencjału różnicowania serca młodych źródeł ludzkich mezenchymalnych komórek macierzystych w celu generowania funkcjonalnych, kurczących się, kardiomiocytów komórek in vitro.

In vitro Różnicowanie ludzkich mezenchymalnych komórek macierzystych w funkcjonalne komórki podobne do kardiomiocytów

Tutaj opisujemy skalowalną metodę, wykorzystującą prostą kombinację Activiny A i nadekspresji Id1 za pośrednictwem lentiwirusa, do generowania pierwszych komórek progenitorowych serca podobnych do pola serca i kardiomiocytów komorowych z ludzkich pluripotencjalnych komórek macierzystych.

Generacja pierwszych sercopodobnych progenitorów serca i kardiomiocytów komorowych z ludzkich pluripotencjalnych komórek macierzystych

Ten artykuł zawiera zestaw protokołów do rozwoju ludzkich sieci indukowanych pluripotencjalnych kardiomiocytów pochodzących z komórek macierzystych (hiPSC-CM) hodowanych na wielodołkowych płytkach MEA w celu odwracalnego elektroportowania błony komórkowej do pomiarów potencjału czynnościowego. Nagrania o wysokiej przepustowości są uzyskiwane z tych samych lokalizacji komórkowych wielokrotnie przez kilka dni.

Sieci kardiomiocytów pochodzące z ludzkich iPSC na wielodołkowych układach mikroelektrod do powtarzalnych zapisów potencjału czynnościowego

Tutaj prezentujemy protokół do solidnego generowania i rozbudowy ludzkich kardiomiocytów z komórek jednojądrzastych krwi obwodowej pacjenta.

Wytwarzanie i ekspansja ludzkich kardiomiocytów z komórek jednojądrzastych krwi obwodowej pacjenta

Poznaj protokół różnicowania ludzkich kardiomiocytów z komórek iPS przy użyciu agregacji ciał zarodkowych. Ta metoda umożliwia uzyskanie funkcjonalnych komórek sercowych do badań kardiologicznych.

Generowanie ludzkich kardiomiocytów: protokół różnicowania od indukowanych przez człowieka pluripotencjalnych komórek macierzystych bez karmienia (Wideo) | JoVE Journal

Generowanie ludzkich kardiomiocytów: protokół różnicowania od indukowanych przez człowieka pluripotencjalnych komórek macierzystych bez karmienia

Przeglądaj więcej filmów