Generowanie ludzkich kardiomiocytów: protokół różnicowania od indukowanych przez człowieka pluripotencjalnych komórek macierzystych bez karmienia

Ogólnym celem tej procedury jest odróżnienie ludzkich kardiomiocytów od ludzkich komórek IPS hodowanych w warunkach wolnych od kardiozy. Osiąga się to poprzez pierwsze posiew komórek IPS w bardzo niskich płytkach mocujących w celu utworzenia ciał zarodkowych. Drugim etapem zabiegu jest przeniesienie uformowanych ciał zarodkowych do szalek pokrytych żelatyną.

Kiedy pojawiają się obszary kurczące się, są one ręcznie wycinane pod mikroskopem stereoskopowym i umieszczane na naczyniach pokrytych fibronektyną. W celu dalszego różnicowania ostatnim krokiem jest uzyskanie pojedynczych kardiomiocytów poprzez trawienie enzymatyczne kurczących się klastrów. Ostatecznie wyniki mogą wykazać różnicowanie komórek podobnych do kardiomiocytów, które wyrażają typowe markery strukturalne, tj. troponinę sercową za pomocą mikroskopii immunofluorescencyjnej.

Metoda ta może pomóc odpowiedzieć na kluczowe pytanie w dziedzinie biologii sercowo-naczyniowej, takie jak mechanizm napędzający różnicowanie i dysfunkcję układu krążenia podczas rozwoju układu krążenia oraz choroby na poziomie ludzkich kardiomiocytów. Jest to bardzo interesująca technika, ponieważ pozwala na wytwarzanie kardiomiocytów in vitro od pacjentów i osób ludzkich. A w drugim przypadku pozwala na rekapitulację choroby w probówce, dzięki czemu nowe leki mogą być eksperymentowane in vitro przed przejściem do in vivo.

Eksperymentowanie Rozpocznij od zlewających się kultur komórkowych IPS wyhodowanych na 35-milimetrowych płytkach pokrytych matrycą. Zastąp pożywkę wzrostową jednym mililitrem PBS zawierającym miligram diss. Zbadaj komórki za pomocą szklanych pipet z sondą.

Usuń obszary ze zróżnicowanymi komórkami, takie jak struktury przypominające krater lub torbielowate w centrum kolonii. Usuń również wszelkie obszary, w których komórki oddzieliły się, spłaszczyły i wydają się migrować na zewnątrz. Teraz inkubuj pozostałe komórki w temperaturze 37 stopni Celsjusza pod kapturem hodowlanym, aż granice kolonii staną się jaśniejsze i zaczną się odłączać.

Zwykle zajmuje to od pięciu do siedmiu minut. W tym momencie usuń roztwór dispa i umyj komórki jednym mililitrem HESM. Następnie wyrzuć roztwór myjący.

W świeżym mililitrze HESM użyj podnośnika komórkowego, aby zebrać kolonie. Zbierz kolonie do 15-mililitrowej probówki. Następnie przepłucz komórki kolejnym mililitrem HESM i wiruj je w tempie 1000 razy G przez cztery minuty.

Następnie przystąp do posiewania komórek na matrycy i codziennie zmieniaj pożywkę podczas hodowli. Zacznij od zebrania niezróżnicowanych kolonii IPS, jak opisano w poprzedniej sekcji. Po odizolowaniu niezróżnicowanych populacji, delikatnie zawiesić je w jednym mililitrze EBM 20.

Używając pipety o pojemności dwóch mililitrów, nie rozbijaj zbytnio grudek komórek. Ogranicz pipetowanie do dwóch lub trzech cykli. Sprawdź wielkość kolonii pod stereoskopem między pociągnięciami.

Kiedy wszystkie kolonie są mniej więcej tej samej wielkości, nie wymagają dalszego mieszania. Teraz umieść komórki na płytkach o bardzo niskim mocowaniu, wypełniając jedną sześciodołkową płytkę na każdą płytkę zebranych komórek. Nie zapomnij przepłukać probówki jednym mililitrem EBM 20 i rozprowadzić płukanie na płytce.

Po trzecim dniu inkubacji należy zmienić pożywkę za pomocą mikroskopu, aby uniknąć usunięcia ciał zarodków. Pipetę należy trzymać blisko krawędzi płytki. Siódmego dnia przenieś ciała zarodków na płytki pokryte 0,1% żelatyną ogrzaną w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez 30 minut.

Dodaj 35 do 40 ciał zarodków do każdej 35-milimetrowej szalki w dwóch mililitrach pożywki. Podczas hodowli. Zmieniaj podłoże regularnie dwa razy w tygodniu.

Sprawdź ciała zarodków pod kątem obszarów bicia i zaznacz, gdzie znajdują się obszary koralików. Na wierzchu naczynia przykrywki powinny pojawić się obszary skurczu koralików po około 10 do 20 dniach. Kiedy pojawią się obszary ze spontanicznym skurczem, zmień ich pożywkę na EBM dwa Po pojawieniu się obszarów kurczących się, kontynuuj hodowlę i monitorowanie innych obszarów na płytce przez okres do miesiąca.

W sumie. W EBM drugim Niedobór procesu różnicowania jest silnie zależny od kilku czynników, z których najbardziej krytycznymi są określone linie komórkowe i partia surowicy używana do indukowania różnicowania sercowo-naczyniowego. Aby uzyskać najwyższą skuteczność, przetestuj kilka linii pod kątem potencjału kardiogennego i różne partie surowicy: Rozpocznij od nałożenia powłoki 12.

Płytki studzienkowe z pięcioma mikrogramami fibronektyny na centymetr kwadratowy w PBS 300 mikrolitrów na studzienkę powinny całkowicie pokryć powierzchnię każdej studzienki. Pozostawić płytki do wyschnięcia bez przykrycia w kapturze do hodowli komórkowych. Aby usunąć obszar perełkowania kultury komórkowej, użyj wyciągniętej szklanej pipety i skalpela.

Następnie za pomocą pipety o pojemności jednego mililitra przenieś cztery do pięciu zacisków do każdej studzienki płytki pokrytej fibronektyną. Po wykonaniu wszystkich zbiorów dodaj jeden mililitr EBM dwa do załadowanych studzienek na płytce zbiorczej, zaznacz obszary, z których usunięto komórki. Następnie zmień pożywkę i włóż płytkę z powrotem do okapu hodowlanego.

Jeśli wymagane są mniejsze grudki dudnienia pod mikroskopem stereoskopowym, przepuść eksplantowane obszary przez pipetę. W ten sposób powstają małe skupiska zawierające kilka bijących komórek. W kulturze.

Zmieniaj pożywkę dwa razy w tygodniu, aż będą gotowe do analizy. Najpierw przygotuj dwukomorowe szkiełka o powierzchni czterech centymetrów kwadratowych, pokrywając je 20 mikrogramami fibronektyny rozcieńczonej w wystarczającej ilości PBS, aby pokryć powierzchnię. Jeśli używany jest szklany nośnik, dodaj dodatkowe 20 mikrogramów lamininy.

Wyizoluj obszar kultury koralików, jak opisano wcześniej. Za pomocą pipety o pojemności jednego mililitra przenieś komórki do 15-mililitrowej probówki zawierającej 500 mikrolitrów probówki z kolagenazą. Inkubować komórki przez 15 minut i raz wstrząsnąć probówką podczas inkubacji.

Po 15 minutach przenieś komórki przez pipetę o pojemności 200 mikrolitrów, aby usunąć grudki, jeśli jakieś grudki pozostały. Przenieś komórki do świeżej kolagenazy drugiej i powtórz inkubację, gdy nie pozostaną żadne duże grudki. Zakończ trawienie, dodając trzy mililitry EBM, dwa bez kwasu sojowego, z których każdy jest przygotowany.

Przechowuj probówki w podgrzewanym stojaku pod maską, a następnie odwiruj je w temperaturze 1000 razy G przez cztery minuty w temperaturze pokojowej. Po odwirowaniu należy wykonać zawiesinę frakcji komórkowych z tej samej próbki początkowej w mililitrze 0,25% trypsyny EDTA w PBS. Następnie inkubować zawiesinę przez pięć minut w podgrzanym bloku, dezaktywować trypsynę czterema mililitrami E BM dwa bez kwasu sojowego.

Następnie przepuść komórki przez igłę o rozmiarze 18 na strzykawce o pojemności 2,5 mililitra do siedmiu razy, aż pod mikroskopem nie będą widoczne żadne duże grudki. Następnie odwiruj komórki w temperaturze 1000 razy G przez cztery minuty. Teraz ponownie zawieś osad komórek w E BM dwa i umieść je na dwóch szkiełkach komorowych.

Komórki będą gotowe do analiz po dwóch, trzech dniach inkubacji. CMS zostały wygenerowane z kilku linii komórkowych IPS. Linie te zostały początkowo wygenerowane na warstwie podającej metamfetaminę i natychmiast umieszczone na matrycy przy użyciu zdefiniowanego medium.

Komórki wykazywały morfologię podobną do ludzkiego ESC z jasnymi krawędziami fazowymi i wydatnymi jądrami. Analiza immunofluorescencyjna wykazała, że komórki IPS prawidłowo wyrażały czynnik transkrypcyjny T cztery i wyrażały antygen powierzchniowy TRA one 60. Analiza metryczna cytofluorometryczna potwierdziła ekspresję typowych powierzchniowych antygenów pluripotencji, SS EEA four i TRA one 60.

Strategia bramkowania jest pokazana w lewym scatterie. Przeprowadzono również analizę kariotypu komórek IP FS hodowanych na żelu matrycowym. Indukcja do linii serca została wywołana przez agregację komórek IPS w ebs, wraz z hodowlą w obecności określonego rodzaju surowicy.

A ponieważ kwas sorbinowy obszary kurczenia się stanowiły od 20 do 35% całkowitej hodowli, w zależności od użytej linii komórkowej. Kurczące się CMS wyizolowano z tych regionów przez trawienie enzymatyczne i przeanalizowano pod kątem ekspresji białek. R-T-P-C-R znalazł ekspresję specyficznych dla serca kanałów jonowych ulegających ekspresji w komórkach bijących pochodzących z IPS, ale nie w komórkach niebijących.

Kanały te obejmowały kanał alfa, podjednostkę kanału wapniowego zależnego od napięcia, podjednostkę alfa kanału sodowego bramkowanego napięciem typu piątego, kanał bramkowany napięciem potasowym podrodziny KQT, podobnie jak i obie formy miozyny. Analiza immunofluorescencji łańcuchów ciężkich wykazała, że pojedyncze kardiomiocyty pochodzące z IPS wyrażały białka strukturalne, alfa sarkomerykę, aktynę, sercową troponinę I i specyficzne dla serca połączenie, koneksję 43. W końcu technika ta naprawdę utorowała drogę do modelowania chorób mięśnia sercowego in vitro i pozwala na eksperymentowanie z lekami w warunkach ludzkich bez wstrzykiwania leku do ludzkiego ciała.

Po obejrzeniu tego filmu powinieneś dobrze zrozumieć, jak utrzymać komórki IPS w swobodnych, wolnych warunkach i różnicować je w kardiomiocyty za pomocą metody opartej na agregacji ciał zarodków.