Name: System modelowy Caenorhabditis elegans do badania amylopatii (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-05-17T13:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 33 s
Description: Poznaj metody badania toksyczności amyloidu beta w neuronach C. elegans przy użyciu testów chemotaksji i hodowli pierwotnej. Technika ta pozwala ocenić funkcję neuronalną oraz testować działanie leków neuroprotekcyjnych.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Dziękujemy dr Shuang Liu za krytyczną lekturę manuskryptu. Konstrukt PCL12 był prezentem od dr Christophera D. Linka. Praca ta została wsparta dwoma grantami National Science Foundation (0842708 i 1026958) oraz grantem AHA (09GRNT2250529) dla FS.

1. Konstrukcja transgenicznych nicieni
<ol>
	<li>Transformacja.
	<ol>
		<li>Przygotowanie podłoży do iniekcji. Nanieść kroplę gorącej, 2% agarozy rozpuszczonej w wodzie na szklaną lamellkę. Szybko nałożyć drugą lamellkę na kroplę i lekko ją stuknąć. Po zastygnięciu agarozy rozsunąć lamellki, a przygotowane podłoże wysuszyć w piecu próżniowym w temperaturze 80 °C przez noc (O/N).</li>
		<li>Wytwarzanie pipet. Do wyciągania kapilar borokrzemianowych o średnicy zewnętrznej/wewnętrznej (O.D./I.D.) 1/0,5 mm używamy wyciągacza Sutter P-97 z włóknem. Pipety są formowane z zamkniętą końcówką, która zostaje otwarta na późniejszym etapie.</li>
		<li>Przygotowanie mieszaniny do iniekcji. Przygotować mieszaninę do iniekcji zawierającą interesujące DNA (20 ng/μl na konstrukt) oraz puste DNA plazmidowe do końcowego stężenia 150 ng/μl. Odwirować mieszaninę do iniekcji w celu usunięcia wszelkich zanieczyszczeń. Krok ten jest kluczowy, ponieważ zanieczyszczenia obniżają wydajność transformacji. Przenieść górne 5 μl (osady i inne zanieczyszczenia gromadzą się na dnie) do nowej probówki przeznaczonej do iniekcji.</li>
		<li>Napełnianie mieszaniną do iniekcji metodą kapilarną. Zanurzyć końcówkę pipety w mieszaninie do iniekcji. Zazwyczaj 0,5 μl jest wystarczające do iniekcji 100 nicieni.</li>
		<li>Przygotowanie pipety do iniekcji. Umieścić pipetę w uchwycie mikromanipulatora i otworzyć jej końcówkę, pocierając ją o krawędź lamellki zamocowanej na szkiełku podstawowym lub alternatywnie o osad na podłożu agarowym. Jest to kluczowy etap, ponieważ zbyt duże końcówki uszkadzają nicienia, a zbyt małe łatwo się zatykają. Jakość otwartej końcówki można ocenić po jej kształcie, a przede wszystkim po szybkości przepływu. Szybkość przepływu można ocenić na podstawie wielkości pęcherzyków wypływających z otwartej końcówki zanurzonej w kropli oleju halowęglowego 700 w odpowiedzi na ciśnienie iniekcyjne.</li>
		<li>Przeniesienie nicieni na podłoże do iniekcji. Nanieść kroplę oleju halowęglowego 700 na podłoże do iniekcji i przenieść kilka nicieni (1 lub 2 dla osób początkujących) do oleju. Użyć igły do nicieni, aby docisnąć je do podłoża, aż przylgną do agarozy. Nicienie powinny być ustawione w rzędach, stronami brzusznymi skierowanymi w tym samym kierunku. Unikać dotykania głowy nicienia. Jeśli po kilku próbach nicienie nie przylegają do podłoża, należy je zastąpić nowym podłożem lub zwiększyć grubość i/lub stężenie agarozy.</li>
		<li>Wprowadzenie pipety do nicienia. Przesuwając stolik, ustawić nicienia pod pipetą. Umieścić pipetę w rdzeniu gonady, ponieważ jej cytoplazma jest wspólna dla wielu jąder komórek linii zarodkowej. Zwiększa to prawdopodobieństwo dostarczenia wstrzykniętego DNA do wielu potomstwach. Pipeta powinna leżeć niemal równolegle do nicienia (kąt ~15°-25°). Docisnąć pionowo końcówkę pipety do ciała nicienia, aż skóra zostanie wciśnięta. Następnie delikatnie stuknąć w manipulator, aby wprowadzić końcówkę do środka. Dla uzyskania najlepszych wyników należy wstrzyknąć DNA do obu gonad.</li>
		<li>Iniekcja roztworu DNA. Przyłożyć ciśnienie do pipety, aż gonada spuchnie. Przerwać przepływ i zdjąć nicienia z pipety. Sprawdzić przepływ w igle, a następnie przejść do następnego nicienia i powtórzyć etapy iniekcji.</li>
		<li>Regeneracja nicieni: Dodać kroplę (~10 μl) buforu regeneracyjnego na nicienie i inkubować, aż zaczną pływać. Dodać taką samą objętość M9, odczekać, aż nicienie wznowią pływanie i powtórzyć czynność kilka razy, aż roztwór będzie składał się głównie z M9. Przenieść pojedynczo nicienie na wysiane płytki.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Integracja.
	<ol>
		<li>Umieścić 40 zdrowych, dobrze odżywionych nicieni w stadium L4 na świeżej płytce.</li>
		<li>Naświetlać promieniami γ dawką 4 000 rad przez 40 min. Przenieść naświetlone nicienie (P0) na świeże płytki wysiane szczepem OP50 (4 nicienie/płytka). Alternatywnie nicienie można naświetlać dawką UV 300 J/m2.</li>
		<li>Przenieść 10-20 transformantów F1 z każdej płytki na oddzielne płytki, opisując płytki zgodnie z pochodzeniem z P0.</li>
		<li>Wyodrębnić 2-4 transformantów F2 dla każdego F1 na oddzielne płytki. Sprawdzić potomstwo F3 pod kątem 100% transmisji markera transformacji. Zazwyczaj 1-3% potomstwa naświetlonego nicienia wykaże zdarzenie integracji.</li>
		<li>Utworzyć banki trzech lub więcej niezależnych linii transformantów.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
2. Testy behawioralne
<ol>
	<li>Synchronizacja wieku.
	<ol>
		<li>Hodować nicienie na standardowych płytkach NGM 10 cm + E. coli OP50 aż do uzyskania dużej populacji dorosłych osobników z jajami (3-5 dni).</li>
		<li>Zebrać nicienie do probówek Falcon 50 ml, zawieszając je w 1 ml buforu M9.</li>
		<li>Dodać 5 ml buforu M9 i wirować przy 450 x g przez 3 min. Odlać nadsącz. Powtórzyć 3-4x.</li>
		<li>Po ostatnim wirowaniu usunąć nadsącz i dodać do osadu z nicieni 10 objętości zasadowego roztworu podchlorynu (świeżo wymieszane 0,5 M NaOH, 1% podchlorynu). Inkubować w RT przez ok. 10 min. Reakcję lizy można monitorować, umieszczając kroplę mieszaniny na szkiełku nakrywnym i badając nicienie pod mikroskopem. Reakcję należy przerwać, gdy rozpadnie się około 80% nicieni.</li>
		<li>Przerwać reakcję lizy, dodając taką samą objętość sterylnego buforu do jaj.</li>
		<li>Zebrać jaja (oraz resztki ciał) poprzez wirowanie przy 450 x g przez 5 min.</li>
		<li>Przemyć jaja sterylnym buforem do jaj 2-3x.</li>
		<li>Inkubować jaja O/N w buforze M9, a następnie wysiać je na standardowe płytki NGM.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Test chemotaksji.
	<ol>
		<li>Przygotować kilka kawałków agaru o wymiarach ok. 0,5x0,5x0,5 cm. Agar osadzamy na płytce 10 cm, z której następnie wycinamy kostki agaru.</li>
		<li>Namoczyć kostkę agaru w roztworze zawierającym wybrany atraktant (w stężeniach nasycających lub bliskich nasyceniu) przez 2 h. Typowymi atraktantami są lizyna (0,5 M) i biotyna (0,2 M).</li>
		<li>Umieścić kostkę agaru na 10-cm płytce testowej, na której zaznaczono miejsce na punkt testowy i punkt kontrolny (Rysunek 1A). Pozostawić O/N w celu wyrównania i uformowania gradientu (Rysunek 1B). Przygotować 5 płytek do jednego eksperymentu.</li>
		<li>Przed eksperymentem dodać 10 μl 20 mM NaN3 (środka znieczulającego) do każdego punktu.</li>
		<li>Umieścić 20 zsynchronizowanych wiekowo nicieni w centrum płytki. Umieścić płytkę w inkubatorze w temperaturze 20 °C.</li>
		<li>Po 1 h policzyć zwierzęta w punktach testowym i kontrolnym, a następnie obliczyć indeks chemotaksji (C.I.) według następującego wzoru: <img alt="Równanie do obliczania indeksu konkurencyjnego (C.I.) z wykorzystaniem wartości testowych i kontrolnych, przedstawienie formuły." fo:content-width=".863in" fo:src="/files/ftp_upload/50435/50435eq1highres.jpg" src="/files/ftp_upload/50435/50435eq1.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Równanie 1"> gdzie N, Ntest i NCnt. oznaczają odpowiednio całkowitą liczbę zwierząt, liczbę zwierząt w punkcie testowym oraz liczbę zwierząt w punkcie kontrolnym.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
3. Podstawowa hodowla komórek embrionalnych
<ol>
	<li>Przeprowadzić lizę nicieni zgodnie z opisem w sekcji synchronizacji wieku.</li>
	<li>Zatrzymać reakcję lizy poprzez dodanie takiej samej objętości sterylnego buforu do jaj i wirować przy 450 x g przez 5 min. Ostrożnie odlać nadsącz, uważając, aby nie zgubić osadu z jajami. Powtórzyć 2-3 krotnie lub do momentu, aż nadsącz stanie się klarowny.</li>
	<li>Resuspendować osad z jajami (i resztkami tkanek) w 2 ml sterylnego buforu do jaj i dodać 2 ml sterylnej 60% sacharozy w buforze do jaj. Mieszać roztwór ręcznie lub za pomocą wortexa aż do całkowitego resuspendowania jaj (ponieważ mają one tendencję do tworzenia grudek podczas wirowania).</li>
	<li>Wirować przy 450 x g przez 15 min.</li>
	<li>Ostrożnie przenieść nadsącz (zawierający jaja) do sterylnej probówki. Odrzucić osad zawierający resztki tkanek i inne produkty uboczne lizy.</li>
	<li>Usunąć resztkową sacharozę poprzez resuspendowanie jaj w buforze do jaj i wirowanie przy 450 x g przez 5 min. Ostrożnie zebrać i odlać nadsącz. Powtórzyć 3 krotnie.</li>
	<li>W komorze z laminarnym przepływem powietrza resuspendować osad z jajami w sterylnym buforze do jaj zawierającym 1 U/ml chitynazy w RT w celu strawienia skorup jaj. Po 30 min rozpocząć monitorowanie reakcji (pod inwertowanym mikroskopem do hodowli komórkowych). Każda partia chitynazy ma nieco inną aktywność. Zazwyczaj trawienie kończy się w ciągu 1 hr.</li>
	<li>Gdy chitynaza strawi około 70-80% skorup jaj, dodać CM-15 (pożywka do hodowli komórkowych L-15 zawierająca 10% płodowej surowicy bydlęcej, 50 U/ml penicyliny i 50 μg/ml streptomycyny). Rozdzielić komórki za pomocą strzykawki z igłą 27 G. Przefiltrować zawiesinę komórkową przez filtr 5.0 μm, aby usunąć nienaruszone embriony, grudki komórek oraz larwy.</li>
	<li>Ssedymentować rozdzieloną zawiesinę komórkową poprzez wirowanie przy 450 x g przez 15 min. Usunąć nadsącz i resuspendować osad w pożywce do hodowli komórkowych CM-15.</li>
	<li>Wysiać rozdzielone komórki na szkiełka zakrywkowe uprzednio pokryte lektyną arachidową (0.1 mg/ml) rozpuszczoną w wodzie. Uwaga: komórki muszą przylgnąć do podłoża, aby mogły ulec różnicowaniu.</li>
	<li>Komórki można utrzymywać w RT (16-20 °C) w powietrzu przez ponad 2 tygodnie.</li>
</ol>

<ol><li>Hardy, J., Allsop, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Amyloid+deposition+as+the+central+event+in+the+aetiology+of+Alzheimer%27s+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+in+Pharmacological+Sciences%22%5BJournal%5D)">Amyloid deposition as the central event in the aetiology of Alzheimer's disease.</a> Trends in Pharmacological Sciences. 12 (10), 383-388 (1991).</li>
<li>Kotzbauer, P. T., Trojanowsk, J. Q., Lee, V. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lewy+body+pathology+in+Alzheimer%27s+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Molecular+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Lewy body pathology in Alzheimer's disease.</a> Journal of Molecular Neuroscience. 17 (2), 225-232 (2001).</li>
<li>Greenberg, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inclusion+body+myositis%3A+review+of+recent+literature%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Neurology+and+Neuroscience+Reports%22%5BJournal%5D)">Inclusion body myositis: review of recent literature.</a> Current Neurology and Neuroscience Reports. 9 (1), 83-89 (2009).</li>
<li>Revesz, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sporadic+and+familial+cerebral+amyloid+angiopathies%5BTitle%5D)+AND+%22Brain+Pathology%22%5BJournal%5D)">Sporadic and familial cerebral amyloid angiopathies.</a> Brain Pathology. 12 (3), 343-357 (2002).</li>
<li>Hartmann, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Distinct+sites+of+intracellular+production+for+Alzheimer%27s+disease+A+beta40%2F42+amyloid+peptides%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Medicine%22%5BJournal%5D)">Distinct sites of intracellular production for Alzheimer's disease A beta40/42 amyloid peptides.</a> Nature Medicine. 3 (9), 1016-1020 (1997).</li>
<li>Ohnishi, S., Takano, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Amyloid+fibrils+from+the+viewpoint+of+protein+folding%5BTitle%5D)+AND+%22Cellular+and+Molecular+Life+sciences%3A+CMLS%22%5BJournal%5D)">Amyloid fibrils from the viewpoint of protein folding.</a> Cellular and Molecular Life sciences: CMLS. 61 (5), 511-524 (2004).</li>
<li>C. elegans II. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=%22Cold+Spring+Harbor+Monograph%22">Cold Spring Harbor Monograph</a>. DL, R. iddle, et al. 1, M. 33, Cold Spring Harbor Laboratory Press. Cold Spring Harbor. 1222(1997).</li>
<li>Cotella, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Toxic+role+of+k%2B+channel+oxidation+in+Mammalian+brain%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Neuroscience%3A+the+official+journal+of+the+Society+for+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Toxic role of k+ channel oxidation in Mammalian brain.</a> The Journal of Neuroscience: the official journal of the Society for Neuroscience. 32 (12), 4133-4144 (2012).</li>
<li>Link, C. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Expression+of+human+beta-amyloid+peptide+in+transgenic+Caenorhabditis+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Expression of human beta-amyloid peptide in transgenic Caenorhabditis elegans.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 92 (20), 9368-9372 (1995).</li>
<li>Cai, S. Q., Sesti, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Oxidation+of+a+potassium+channel+causes+progressive+sensory+function+loss+during+aging%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Oxidation of a potassium channel causes progressive sensory function loss during aging.</a> Nature Neuroscience. 12 (5), 611-617 (2009).</li>
<li>Yu, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Guanylyl+cyclase+expression+in+specific+sensory+neurons%3A+a+new+family+of+chemosensory+receptors%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Guanylyl cyclase expression in specific sensory neurons: a new family of chemosensory receptors.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 94, 3384-3387 (1997).</li>
<li>Bargmann, C. I., Horvitz, H. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chemosensory+neurons+with+overlapping+functions+direct+chemotaxis+to+multiple+chemicals+in+C.+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Chemosensory neurons with overlapping functions direct chemotaxis to multiple chemicals in C. elegans.</a> Neuron. 7 (5), 729-742 (1991).</li>
<li>Caserta, T. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Q-VD-OPh%2C+a+broad+spectrum+caspase+inhibitor+with+potent+antiapoptotic+properties%5BTitle%5D)+AND+%22Apoptosis+%3A+an+international+journal+on+programmed+cell+death%22%5BJournal%5D)">Q-VD-OPh, a broad spectrum caspase inhibitor with potent antiapoptotic properties.</a> Apoptosis : an international journal on programmed cell death. 8 (4), 345-352 (2003).</li>
<li>Christensen, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+primary+culture+system+for+functional+analysis+of+C.+elegans+neurons+and+muscle+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">A primary culture system for functional analysis of C. elegans neurons and muscle cells.</a> Neuron. 33 (4), 503-514 (2002).</li>
</ol>

Autorzy oświadczają, że nie mają konkurencyjnych interesów finansowych.

Tutaj opisujemy podejście łączone do badania komórkowych i molekularnych aspektów amylopatii przy użyciu C. elegans. Zalety tego podejścia to: 1) niski koszt. C.elegans jest utrzymywany na normalnej szalce Petriego obsianej bakteriami, w temperaturze pokojowej. 2) Potężna genetyka. Zwierzęta transgeniczne można uzyskać w ciągu kilku miesięcy, a szeroki wachlarz sekwencji promotorowych jest dostępny do napędzania ekspresji pożądanego genu w określonych neuronach. 3) Prosty, dobrze scharakteryzowany układ...

Amyloid beta (Aβ) to peptyd składający się z 36-43 aminokwasów, który powstaje po sekwencyjnym rozszczepieniu białka prekursorowego amyloidu (APP) przez β i γ sekretazy 1. Sekretaza γ przetwarza C-końcowy koniec peptydu Aβ i jest odpowiedzialna za jego zmienne długości 5. Najczęstszymi formami Aβ są Aβ40 i Aβ42, przy czym ta ostatnia jest częściej związana ze stanami patologicznymi, takimi jak AD 5. W wysokich stężeniach Aβ tworzy β-arkusze, które agregują się, tworząc fibryle amyloidowe 6. Złogi włókienek są głównym składnikiem blaszek starczych otaczających neurony. Uważa się, że zarówno blaszki maziowe, jak i dyfuzyjne, nieblaszkowane oligomery Aβ stanowią podstawowe formy chorobotwórcze Aβ.
Laboratoryjne badanie amylopatii neuronalnych komplikuje fakt, że te warunki postępują z czasem. Dlatego ważne jest, aby opracować genetycznie podatne modele zwierzęce - uzupełniające myszy - o krótkiej długości życia. Modele te mogą być wykorzystane do wyjaśnienia konkretnych aspektów amylopatii - zazwyczaj komórkowych i molekularnych - a dzięki swojej prostocie pomagają uchwycić istotę problemu. Robak Caenorhabditis elegans falls należy do tej kategorii. Ma krótką żywotność, ~ 20 dni, a ponadto podstawowe procesy komórkowe, w tym regulacja ekspresji genów, transport białek, łączność neuronalna, synaptogeneza, sygnalizacja komórkowa i śmierć są podobne do ssaków 7. Unikalne cechy robaka to silna genetyka i brak systemu naczyń krwionośnych, co umożliwia badanie uszkodzeń neuronów niezależnie od uszkodzeń naczyń krwionośnych. Z drugiej strony, brak mózgu ogranicza stosowanie C. elegans do badania wielu aspektów neurodegeneracji. Ponadto w tym organizmie nie można przeprowadzić reprodukcji i identyfikacji anatomicznego rozmieszczenia zmian chorobowych. Inne ograniczenia obejmują trudności w ocenie zarówno różnic w profilach ekspresji genów, jak i upośledzenie złożonego zachowania i funkcji pamięci. Tutaj opisujemy metody generowania modeli amylopatii C. elegans.

<table><tbody><tr><td colspan="4"><silny>1. NGM</td></tr><tr><td>Chlorek sodu</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S5886</td><td>3 g</td></tr><tr><td>Agar bakteriologiczny</td><td>AMRESCO</td><td>J637</td><td>17 g</td></tr><tr><td>Bacto-pepton</td><td>AMRESCO</td><td>J636</td><td>2,5 g</td></tr><tr><td>Woda</td><td></td><td></td> destylowana <td>Doprowadzić do 975 ml</td></tr><tr> <td colspan="4">Sterylizowane w autoklawie, następnie dodaj następujące elementy i dobrze wymieszaj</td></tr><tr><td>: Siarczan</td> <td>magnezuSigma-Aldrich</td><td>M2643</td><td>1 ml 1 M bulionu</td></tr><tr><td>Chlorek wapnia</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C5670</td><td>1 ml 1 M bulionu</td></tr><tr><td>Cholesterol</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C3045</td><td>1 ml 5 mg / ml bulionu</td></tr><tr><td></td><td></td> (w etanolu) <td>Bufor fosforanu potasu</td><td>25 ml 1M zapasu</td></tr><tr><td colspan="4">2. Bufor fosforanu potasu</td></tr><tr><td>Fosforan potasu jednozasadowy</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P5655</td><td>108,3 g</td></tr><tr><td>Fosforan potasu dwuzasadowy</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P3786</td><td>35,6 g</td></tr><tr><td>Woda</td><td></td><td></td> destylowana <td>Doprowadzić do 1 L</td></tr><tr><td colspan="4">Sterylizowane przez autoklawowanie</td></tr><tr><td colspan="4">3. M9 bufor</td></tr><tr><td>Fosforan potasu jednozasadowy</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P5655</td><td>3 g</td></tr><tr><td>Fosforan sodu dwuzasadowy</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S5136</td><td>6 g</td></tr><tr><td>Chlorek sodu</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S5886</td><td>5 g</td></tr><tr><td>Siarczan magnezu</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M2643</td><td>1 ml bulionu 1 M</td></tr><tr><td>Woda</td><td></td><td></td> destylowana <td>Doprowadzić do 1 l</td></tr><tr><td colspan="4">Sterylizowane przez autoklawowanie</td></tr><tr><td colspan="4">4. Bufor jaj (pH 7,3, 340 mOsm)</td></tr><tr><td>Chlorek sodu</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S5886</td><td>118 mM</td></tr><tr><td>Chlorek potasu</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P5405</td><td>48 mM</td></tr><tr><td>Chlorek wapnia</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C5670</td><td>2 mM</td></tr><tr><td>Chlorek magnezu</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M4880</td><td>2 mM</td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP310</td><td>25 mM</td></tr><tr>Woda <td></td><td></td><td>destylowana</td><td>Doprowadź do 1 L</td></tr><tr><td colspan="4">Sterylizowane przez autoklawowanie</td></tr><tr><td colspan="4">5. CM-15</td></tr><tr><td>L-15 pożywka hodowlana</td><td>Gibco</td><td>11415</td><td>450 ml</td></tr><tr><td>Płodowa surowica bydlęca</td><td>Gibco</td><td>10437-028</td><td>50 ml</td></tr><tr><td>Penicylina</td><td>Gibco</td><td>15140</td><td>50 jednostek/ml</td></tr><tr><td>Streptomycyna</td><td>Gibco</td><td>15140</td><td>50 g/ml</td></tr><tr><td colspan="4">Dostosuj do 340 mOsm z sacharozą, a następnie sterylnie przefiltruj do autoklawowanych butelek i przechowuj w temperaturze 4 &stopni; C</td></tr><tr><td colspan="4"><silny>6. Inne odczynniki< / mocny></td></tr><tr><td>olej Halocarbon 700</td><td>Produkty halowęglowe</td><td>9002-83-9</td><td></td></tr><tr><td>5 &mu; m Filtr strzykawkowy Acrodisc PALL</td><td>Co.</td><td>4199</td><td></td></tr><tr><td>Chitynaza</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C6137-5UN</td><td></td></tr><tr><td>Lektyna (orzechy ziemne)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>L0881-10MG</td><td></td></tr><tr><td>Wodorotlenek sodu</td><td>Fisher Scientific</td><td>S320</td><td></td></tr><tr><td>Lizyna</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>L5501</td><td></td></tr><tr><td>Biotyna</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>B4639</td><td></td></tr><tr><td>Roztwór</td> <td>podchlorynu soduSigma-Aldrich</td><td>425044</td><td></td></tr><tr><td>Azydek sodu</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>71289</td><td></td></tr><tr><td>Sacharoza</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S0389</td><td></td></tr></tbody></table>

system modelowy caenorhabditis elegans do badania amylopatii

A Caenorhabditis elegans Model System for Amylopathy Study

Amylopatia to termin opisujący nieprawidłową syntezę i akumulację beta amyloidu (Aβ) w tkankach w czasie. Aβ jest cechą charakterystyczną choroby Alzheimera (AD) i występuje w otępieniu z ciałami Lewy'ego, zapaleniu mięśni inkluzyjnych i mózgowej angiopatii amyloidowej 1-4. Amylopatie rozwijają się stopniowo z czasem. Z tego powodu proste organizmy o krótkiej długości życia mogą pomóc w wyjaśnieniu molekularnych aspektów tych schorzeń. W tym miejscu opisujemy eksperymentalne protokoły badania neurodegeneracji zależnej od Aβ przy użyciu robaka Caenorhabditis elegans. W ten sposób konstruujemy transgeniczne robaki, wstrzykując DNA kodujące ludzkie Aβ42 do syncytialnych gonad dorosłych hermafrodytów. Linie transformacyjne są stabilizowane przez integrację wywołaną mutagenezą. Nicienie są zsynchronizowane z wiekiem poprzez zbieranie i wysiewanie jaj. Funkcja neuronów wyrażających Aβ42 jest testowana w odpowiednich testach behawioralnych (testy chemotaksji). Pierwotne kultury neuronalne uzyskane z zarodków są wykorzystywane do uzupełniania danych behawioralnych i testowania neuroprotekcyjnego działania związków antyapoptotycznych.

W naszych protokołach badamy wpływ ludzkiego oligomeru Aβ42 na funkcję neuronalną 8. Fragment kodujący ludzki Aβ42 oraz sztuczną sekwencję peptydowego sygnału wektora Fire pPD50.52 został namnożony z konstruktu PCL12 9 przy użyciu starterów wprowadzających miejsca restrykcyjne dla endonukleazy Sma 1 na końcach. Następnie fragment ten wstawiono do konstruktu zawierającego 2 481-pb sekwencję promotora flp-6 w wektorze Fire pPD95.75 pomiędzy unikalne miejsce Sma 1 10...

Opisujemy metody badania aspektów amylopatii u robaka C. elegans. Pokazujemy, jak konstruować robaki wyrażające ludzkie Aβ42 w neuronach i jak testować ich funkcję w testach behawioralnych. Dalej pokazujemy, jak uzyskać pierwotne hodowle neuronów, które można wykorzystać do badań farmakologicznych.

System modelowy Caenorhabditis elegans do badania amylopatii

Amylopathy is a term that describes abnormal synthesis and accumulation of amyloid beta (A&beta;) in tissues with time. A&beta; is a hallmark of ...

Ogólnym celem tej procedury jest ocena wpływu toksyczności beta-amyloidu na funkcje i przeżywalność neuronów. Jest to realizowane poprzez konstrukcję transgenicznych nicieni C. elegans wykazujących ekspresję peptydu beta-amyloidu z reporterem GFP w neuronach sensorycznych SE. Następnie, za pomocą testu chemotaksji, ocenia się konsekwencje behawioralne ekspresji beta-amyloidu w neuronach SE.Trzecim krokiem jest otrzymanie kultur pierwotnych neuronów SE, a następnie poddanie hodowlanych neuronów działaniu czynników farmakologicznych, takich jak Q-V-D-O-P-H, w celu zahamowania toksycznego działania amyloidu beta. Ostatecznie wyniki mogą wykazać wpływ toksyczności amyloidu beta na funkcje i przeżywalność neuronów SE za pomocą testów behawioralnych i farmakologicznych. Ta metoda może pomóc w odpowiedzi na kluczowe pytania dotyczące neurodegeneracji, takie jak wyjaśnienie konkretnych mechanizmów komórkowych i molekularnych.Mechanizmy neurotoksycznego działania oligomerów beta-amyloidu. Procedury zaprezentuje dr Zing Dwan, postdok z mojego laboratorium. Do transformacji wymagane są podkładki do wstrzykiwania z 2% agrosy. Należy nanieść kroplę gorącej agrosy rozpuszczonej w wodzie na szkla

a-caenorhabditis-elegans-model-system-for-amylopathy-study

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Neuronauka

System modelu Caenorhabditis elegans do badań nad amilopatią

Intensywnie badany nicień Caenorhabditis elegans może zostać zmodyfikowany transgenicznie w celu ekspresji ludzkiego peptydu β-amyloidu (Aβ). Indukowana ekspresja Aβ w mięśniach C. elegans prowadzi do szybkiego, powtarzalnego fenotypu paraliżu, który może być wykorzystany do monitorowania terapii modulujących toksyczność Aβ.

Oznaczanie toksyczności β-amyloidu z wykorzystaniem transgenicznego modelu C. elegans

Aby zbadać związek między homeostazą białek, stresem i starzeniem się, monitorowaliśmy zmiany w fałdowaniu białek, śledząc dysfunkcję białek, lokalizację białek w komórce i stabilność białek na poziomie organizmu, komórkowym i białkowym, używając genetycznie wykonalnego metazoanu Caenorhabditis elegans jako systemu modelowego.

Wykorzystanie Caenorhabditis elegans jako systemu modelowego do badania homeostazy białek w organizmie wielokomórkowym

Tutaj prezentujemy nicienia Caenorhabditis elegans jako wszechstronny model gospodarza do badania interakcji mikrobiologicznych.

Nicienie Caenorhabditis elegans - wszechstronny model in vivo do badania interakcji gospodarz-mikroorganizm

Ten protokół opisuje metodę uprawy Caenorhabditis elegans na dużą skalę na stałych podłożach. Jako alternatywa dla hodowli płynnej, protokół ten pozwala na uzyskanie parametrów o różnych skalach pod uprawą płytkową. Zwiększa to porównywalność wyników poprzez pominięcie różnic morfologicznych i metabolicznych między hodowlą pożywek płynnych i stałych.

Hodowla Caenorhabditis elegans na dużych obszarach na płytkach: przygotowanie próbki do badania zmian metabolicznych w cukrzycy

Produkty translacyjne związane z powtarzalnością, niezależne, są wyłaniającymi się cechami patogennymi kilku powtarzających się chorób opartych na ekspansji. Celem opisanego protokołu jest ocena toksyczności spowodowanej przez te peptydy przy użyciu testów behawioralnych i komórkowych w systemie modelowym C. elegans.

Pomiar toksyczności peptydów RAN u C. elegans

Tutaj przedstawiamy i opisujemy szeroko dostępne metodologie wykorzystujące niektóre wszechstronne modele nicieni, w tym nekrozę wywołaną hiperaktywowanym kanałem jonowym i neurotoksyczność wywołaną agregatem białkowym, do monitorowania i analizowania komórkowych i molekularnych podstaw chorób neurodegeneracyjnych związanych z wiekiem.

Modelowanie chorób neurodegeneracyjnych związanych z wiekiem w Caenorhabditis elegans

Ten protokół opisuje dwa czułe testy do rozróżniania między łagodnym, umiarkowanym i ciężkim upośledzeniem motorycznym w modelach stwardnienia zanikowego bocznego C. elegans, z ogólną użytecznością dla szczepów C. elegans, ze zmienioną ruchliwością.

Ocena upośledzenia motorycznego w modelach stwardnienia zanikowego bocznego C. elegans

W tym artykule pokazujemy, jak używać siedmiopunktowego systemu punktacji do konsekwentnego ilościowego określania zmian w morfologii dendrytów neuronów dopaminergicznych u C. elegans. System ten jest przeznaczony do analiz testów neurodegeneracji dopaminergicznej z wykorzystaniem genetycznych, chemicznych i opartych na wieku modeli zaburzeń neurodegeneracyjnych.

Kwantyfikacja poziomów zmian morfologicznych i zwyrodnień neuronów dopaminergicznych u Caenorhabditis elegans

Tutaj prezentujemy protokół oceny neuroprotekcyjnych aktywności testowych związków u Caenorhabditis elegans, w tym agregacji poliglutaminy, śmierci neuronów i zachowania chemounikania, a także przykładowej integracji wielu fenotypów.

Caenorhabditis elegans jako modelowy system do odkrywania związków bioaktywnych przeciwko neurotoksyczności za pośrednictwem poliglutaminy

Przedstawiono podejścia do testowania działania leków przeciwpsychotycznych (APD) w Caenorhabditis elegans. Opisano testy do testowania wpływu leku na rozwój i żywotność oraz na szybkość pompowania gardła. Metody te mają również zastosowanie w eksperymentach farmakogenetycznych z klasami leków innymi niż APD.

Metody badania mechanizmów działania leków przeciwpsychotycznych w Caenorhabditis elegans

Poznaj metody badania toksyczności amyloidu beta w neuronach C. elegans przy użyciu testów chemotaksji i hodowli pierwotnej. Technika ta pozwala ocenić funkcję neuronalną oraz testować działanie leków neuroprotekcyjnych.

System modelowy Caenorhabditis elegans do badania amylopatii

Przeglądaj więcej filmów