System modelowy Caenorhabditis elegans do badania amylopatii

Ogólnym celem tej procedury jest ocena wpływu toksyczności beta amyloidu na funkcję neuronów i przeżycie. Osiąga się to poprzez najpierw skonstruowanie transgenicznych robaków elegancji C wyrażających peptyd beta amyloidu z reporterem GFP w neuronach czuciowych SE. Następnie behawioralne konsekwencje ekspresji beta amyloidu w neuronach SE ocenia się za pomocą testu chemotaksji.

Trzecim krokiem jest uzyskanie pierwotnych kultur neuronów SE, a następnie potraktowanie hodowanych neuronów środkami farmakologicznymi, takimi jak Q-V-D-O-P-H, w celu stłumienia toksycznego działania beta-amyloidu. Ostatecznie wyniki mogą pokazać wpływ toksyczności beta amyloidu na funkcję neuronów SE i przeżycie za pomocą testów behawioralnych i farmakologicznych. Metoda ta może pomóc odpowiedzieć na kluczowe pytania dotyczące neurodegeneracji, takie jak wyjaśnienie określonych mechanizmów komórkowych i molekularnych.

Podstawowe neurotoksyczne działanie oligomerów beta amyloidu. Procedury zademonstruje dr Zing Dwan, doktor habilitowany z mojego laboratorium Do transformacji wymagane są 2% podkładki iniekcyjne agros. Umieść kroplę gorącego arosu rozpuszczonego w wodzie na szklanym szkiełku nakrywkowym i szybko umieść drugie szkiełko nakrywkowe na kropli i lekko ją postukaj.

Podczas przygotowywania mieszanki iniekcyjnej należy pamiętać o odśrodkowaniu i przeniesieniu górnych pięciu mikrolitrów, wolnych od zanieczyszczeń i innych zanieczyszczeń, do świeżej probówki w celu załadunku iniekcyjnego, mieszanki iniekcyjnej i pustego plazmidu do pipety iniekcyjnej za pomocą działania kapilarnego. Pół mikrolitra zwykle wystarcza do wstrzyknięcia 100 robaków, aby poszerzyć otwór w pipecie iniekcyjnej, pocierać jej końcówką o krawędź szkiełka nakrywkowego zamontowanego na szkiełku podstawowym Olej węglowy Halo 700. Jakość otworu ma kluczowe znaczenie.

Ocenia się go na podstawie kształtu końcówki, a co najważniejsze, na podstawie natężenia przepływu, ocenianego na podstawie przepływu i wielkości pęcherzyków tworzących się na końcówce pipety w odpowiedzi na ciśnienie wtrysku. Teraz umieść kroplę 700 olejku węglowego hallow na podkładce iniekcyjnej i przenieś kilka robaków do podkładki. Użyj kilofa, aby wepchnąć robaki na podkładkę, aż przylgną do aros.

Robaki powinny być ustawione w rzędach z wyrównanymi brzusznymi bokami. Unikaj dotykania ich głów. Jeśli po kilku próbach robaki nie przylgną do podkładki, wypróbuj świeżą podkładkę lub zwiększ grubość agros lub stężenie podkładki.

Teraz włóż pipetę do robaka. Najpierw przesuń stolik, aby umieścić robaka pod pipetą, a następnie . Umieść pipetę obok środkowego rdzenia gonady.

Ponieważ jego cytoplazma jest wspólna dla wielu jąder komórek rozrodczych, zwiększa to prawdopodobieństwo przekazania wstrzykniętego DNA potomstwu. Pipeta powinna leżeć prawie równolegle do robaka. Po trzecie, przesuń końcówkę pionowo w kierunku ciała, aż skóra zostanie przygnębiona.

Na koniec delikatnie postukaj w manipulator, aby wywołać włożenie końcówek. Teraz wstrzyknij roztwór DNA. Naciskaj pipetę, aż gonada pęcznieje.

Następnie zatrzymaj przepływ i wyciągnij ślimak z pipety. Przetestuj przepływ igieł, a następnie wstrzyknij pozostałe gonady przed przejściem do następnego robaka. Po wstrzyknięciach dodaj około 10 mikrolitrów buforu regeneracyjnego do robaków i poczekaj, aż zaczną pływać.

Po pływaniu dodaj równą objętość bufora M nine. Gdy robaki wznowią pływanie, kontynuuj dodawanie M dziewięć, aż roztwór będzie w większości M dziewięć. Teraz przenieś każdego robaka na siedzącą płytę.

Zbierz robaki GR w jednym mililitrze bufora M nine w 50-mililitrowej tubie sokoła. Następnie, używając buforu M nine, umyj robaki przez wielokrotne wirowanie i wymianę roztworu, aż M nine będzie czysty po umyciu. Następnie dodaj 10 objętości zasadowego roztworu podchlorynu do.

Granulowane robaki wysiadują robaki w temperaturze pokojowej, aż około czterech piątych z nich zostanie złamanych, co zwykle zajmuje 10 minut. Monitorować reakcję, pobierając podwielokrotności do obejrzenia pod mikroskopem. Zatrzymaj reakcję, dodając równą objętość sterylnego buforu jajowego.

Następnie zebrać jaja i tusze przez odwirowanie w stężeniu 450 G przez pięć minut. Delikatnie usunąć supernatant. Dodać z powrotem równą objętość buforu jaj i ponownie odwirować probówkę o sile 450 G przez pięć minut.

Powtarzaj procedurę, aż bufor będzie czysty. Teraz wysiaduj jaja przez noc w buforze M nine, a następnego dnia wysiewaj je na standardowych płytkach NGM. Przygotuj kilka kostek agaru, około pół centymetra z boku.

Namocz kawałki agaru w roztworze zawierającym pożądany atraktant na dwie godziny. Umieść kawałek agaru na 10-centymetrowej płytce testowej, na której zaznaczono położenie miejsca testowego i punktu kontrolnego. Przygotuj pięć takich talerzy na eksperyment.

Pozwól płytkom uformować gradient chemiczny, pozostawiając je na noc w temperaturze 20 stopni Celsjusza następnego dnia. Przed eksperymentem dodaj 10 mikrolitrów 20-milimolowego azydku sodu do każdego miejsca na płytkach. Działa to jak środek znieczulający.

Rozpocznij eksperyment od umieszczenia 20 zsynchronizowanych ze sobą robaków na środku płytki, a następnie umieść płytkę w inkubatorze o temperaturze 20 stopni Celsjusza na godzinę. Po godzinie policz zwierzęta w teście nad punktami kontrolnymi i oblicz wskaźnik CI. Po lizie robaków gr i oczyszczeniu jaj i tusz, jak opisano wcześniej, ponownie zawiesić je w dwóch mililitrach sterylnego buforu jaj i dodać dwa mililitry sterylnej 60% sacharozy do buforu jaj.

Następnie wymieszaj probówkę ręcznie lub wirowo, aż jajka zostaną całkowicie zawieszone. Odwirować zawieszone jaja w temperaturze 450 razy G przez 15 minut. Następnie ostrożnie zebrać supernatant wypełniony jajami i wyrzucić podniebienie w celu usunięcia pozostałości sacharozy, ponownie zawiesić jaja w buforze jaj i odwirować je w temperaturze 450 G przez pięć minut.

Delikatnie zebrać i wyrzucić supernatant, a następnie powtórzyć proces czyszczenia trzy razy przy okapie. Użyj sterylnego buforu do jaj zawierającego jedną jednostkę na mililitr chitynazy w celu ponownego zawieszenia jaj w granulkach. Pozwól jajom trawić się w temperaturze pokojowej przez 30 minut, a następnie zacznij monitorować reakcję pod mikroskopem odwróconych kultur komórkowych.

Gdy 70 do 80% skorupek jaj zostanie strawionych, dodaj pięć mililitrów kompletnej pożywki hodowlanej L 15 lub CM 15. Aby wyizolować komórki, należy je rozdzielić tak, aby nie tworzyły grudek, kilkakrotnie przepuszczając je przez igłę o rozmiarze 27. Teraz przepuść roztwór przez strzykawkę z filtrem o grubości pięciu mikronów.

Zawiesinę zdysocjowanych komórek osadzać przez odwirowanie w temperaturze 450 G przez 15 minut. Następnie usunąć supernatant i ponownie zawiesić granulowane komórki w CM 15. Aby upewnić się, że komórki są zdysocjowane, sprawdź zawiesinę pod mikroskopem.

Na koniec pokryj zdysocjowane komórki na wcześniej pokrytych szkiełkach nakrywkowych. Dzięki lektynie z orzeszków ziemnych komórki można utrzymywać w temperaturze pokojowej z normalnym powietrzem przez ponad dwa tygodnie. Korzystając z opisanych technik transformacji, transgeniczny robak został skonstruowany w celu ekspresji ludzkiego Beta 42 w neuronach SE, neuronach, które wykrywają rozpuszczalne w wodzie atraktanty, takie jak biotyna, za pomocą testu chemotaksji.

Przetestowano siedmiodniowe transgeniczne robaki. Kontrolni nie mieli problemów ze znalezieniem biotyny. W przeciwieństwie do tego, tylko kilka robaków wyrażających beta 42 mogło znaleźć miejsce atraktantu.

Indeks chemotaksji dla biotyny wynosił 0,68 w porównaniu z 0,12 dla robaków kontrolnych i eksperymentalnych odpowiednio po trzech do czterech dniach. Nastąpił również niewielki, ale zauważalny spadek indeksu. Wyhodowany neuron SER po czterech dniach nadal wykazuje ekspresję GFP po dziewięciu dniach życia.

Jednak fluorescencja GFP zniknęła i podejrzewano, że apoptoza testuje tę teorię. Pierwotne neurony SER A przygotowano zgodnie z opisem i uzupełniono inhibitorem kaspazy o szerokim spektrum działania. Zgodnie z oczekiwaniami, leczenie zatrzymało utratę fluorescencji, potwierdzając, że ekspresja ludzkiego A beta 42 wyzwala apoptozę w neuronach A SER.

Po obejrzeniu tego filmu powinieneś dobrze zrozumieć, jak konstruować eleganckie transgeniczne robaki, badać je w esejach behawioralnych i jak uzyskać pierwotną kulturę od Ambrose'a.