Name: System modelowy Caenorhabditis elegans do badania amylopatii (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-05-17T13:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 33 s
Description: Poznaj metody badania toksyczności amyloidu beta w neuronach C. elegans przy użyciu testów chemotaksji i hodowli pierwotnej. Technika ta pozwala ocenić funkcję neuronalną oraz testować działanie leków neuroprotekcyjnych.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Dziękujemy dr Shuang Liu za krytyczną lekturę manuskryptu. Konstrukt PCL12 był prezentem od dr Christophera D. Linka. Praca ta została wsparta dwoma grantami National Science Foundation (0842708 i 1026958) oraz grantem AHA (09GRNT2250529) dla FS.

1. Konstrukcja transgenicznych nicieni
<ol>
	<li>Transformacja.
	<ol>
		<li>Przygotowanie podłoży do iniekcji. Nanieść kroplę gorącej, 2% agarozy rozpuszczonej w wodzie na szklaną lamellkę. Szybko nałożyć drugą lamellkę na kroplę i lekko ją stuknąć. Po zastygnięciu agarozy rozsunąć lamellki, a przygotowane podłoże wysuszyć w piecu próżniowym w temperaturze 80 °C przez noc (O/N).</li>
		<li>Wytwarzanie pipet. Do wyciągania kapilar borokrzemianowych o średnicy zewnętrznej/wewnętrznej (O.D./I.D.) 1/0,5 mm używamy wyciągacza Sutter P-97 z włóknem. Pipety są formowane z zamkniętą końcówką, która zostaje otwarta na późniejszym etapie.</li>
		<li>Przygotowanie mieszaniny do iniekcji. Przygotować mieszaninę do iniekcji zawierającą interesujące DNA (20 ng/μl na konstrukt) oraz puste DNA plazmidowe do końcowego stężenia 150 ng/μl. Odwirować mieszaninę do iniekcji w celu usunięcia wszelkich zanieczyszczeń. Krok ten jest kluczowy, ponieważ zanieczyszczenia obniżają wydajność transformacji. Przenieść górne 5 μl (osady i inne zanieczyszczenia gromadzą się na dnie) do nowej probówki przeznaczonej do iniekcji.</li>
		<li>Napełnianie mieszaniną do iniekcji metodą kapilarną. Zanurzyć końcówkę pipety w mieszaninie do iniekcji. Zazwyczaj 0,5 μl jest wystarczające do iniekcji 100 nicieni.</li>
		<li>Przygotowanie pipety do iniekcji. Umieścić pipetę w uchwycie mikromanipulatora i otworzyć jej końcówkę, pocierając ją o krawędź lamellki zamocowanej na szkiełku podstawowym lub alternatywnie o osad na podłożu agarowym. Jest to kluczowy etap, ponieważ zbyt duże końcówki uszkadzają nicienia, a zbyt małe łatwo się zatykają. Jakość otwartej końcówki można ocenić po jej kształcie, a przede wszystkim po szybkości przepływu. Szybkość przepływu można ocenić na podstawie wielkości pęcherzyków wypływających z otwartej końcówki zanurzonej w kropli oleju halowęglowego 700 w odpowiedzi na ciśnienie iniekcyjne.</li>
		<li>Przeniesienie nicieni na podłoże do iniekcji. Nanieść kroplę oleju halowęglowego 700 na podłoże do iniekcji i przenieść kilka nicieni (1 lub 2 dla osób początkujących) do oleju. Użyć igły do nicieni, aby docisnąć je do podłoża, aż przylgną do agarozy. Nicienie powinny być ustawione w rzędach, stronami brzusznymi skierowanymi w tym samym kierunku. Unikać dotykania głowy nicienia. Jeśli po kilku próbach nicienie nie przylegają do podłoża, należy je zastąpić nowym podłożem lub zwiększyć grubość i/lub stężenie agarozy.</li>
		<li>Wprowadzenie pipety do nicienia. Przesuwając stolik, ustawić nicienia pod pipetą. Umieścić pipetę w rdzeniu gonady, ponieważ jej cytoplazma jest wspólna dla wielu jąder komórek linii zarodkowej. Zwiększa to prawdopodobieństwo dostarczenia wstrzykniętego DNA do wielu potomstwach. Pipeta powinna leżeć niemal równolegle do nicienia (kąt ~15°-25°). Docisnąć pionowo końcówkę pipety do ciała nicienia, aż skóra zostanie wciśnięta. Następnie delikatnie stuknąć w manipulator, aby wprowadzić końcówkę do środka. Dla uzyskania najlepszych wyników należy wstrzyknąć DNA do obu gonad.</li>
		<li>Iniekcja roztworu DNA. Przyłożyć ciśnienie do pipety, aż gonada spuchnie. Przerwać przepływ i zdjąć nicienia z pipety. Sprawdzić przepływ w igle, a następnie przejść do następnego nicienia i powtórzyć etapy iniekcji.</li>
		<li>Regeneracja nicieni: Dodać kroplę (~10 μl) buforu regeneracyjnego na nicienie i inkubować, aż zaczną pływać. Dodać taką samą objętość M9, odczekać, aż nicienie wznowią pływanie i powtórzyć czynność kilka razy, aż roztwór będzie składał się głównie z M9. Przenieść pojedynczo nicienie na wysiane płytki.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Integracja.
	<ol>
		<li>Umieścić 40 zdrowych, dobrze odżywionych nicieni w stadium L4 na świeżej płytce.</li>
		<li>Naświetlać promieniami γ dawką 4 000 rad przez 40 min. Przenieść naświetlone nicienie (P0) na świeże płytki wysiane szczepem OP50 (4 nicienie/płytka). Alternatywnie nicienie można naświetlać dawką UV 300 J/m2.</li>
		<li>Przenieść 10-20 transformantów F1 z każdej płytki na oddzielne płytki, opisując płytki zgodnie z pochodzeniem z P0.</li>
		<li>Wyodrębnić 2-4 transformantów F2 dla każdego F1 na oddzielne płytki. Sprawdzić potomstwo F3 pod kątem 100% transmisji markera transformacji. Zazwyczaj 1-3% potomstwa naświetlonego nicienia wykaże zdarzenie integracji.</li>
		<li>Utworzyć banki trzech lub więcej niezależnych linii transformantów.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
2. Testy behawioralne
<ol>
	<li>Synchronizacja wieku.
	<ol>
		<li>Hodować nicienie na standardowych płytkach NGM 10 cm + E. coli OP50 aż do uzyskania dużej populacji dorosłych osobników z jajami (3-5 dni).</li>
		<li>Zebrać nicienie do probówek Falcon 50 ml, zawieszając je w 1 ml buforu M9.</li>
		<li>Dodać 5 ml buforu M9 i wirować przy 450 x g przez 3 min. Odlać nadsącz. Powtórzyć 3-4x.</li>
		<li>Po ostatnim wirowaniu usunąć nadsącz i dodać do osadu z nicieni 10 objętości zasadowego roztworu podchlorynu (świeżo wymieszane 0,5 M NaOH, 1% podchlorynu). Inkubować w RT przez ok. 10 min. Reakcję lizy można monitorować, umieszczając kroplę mieszaniny na szkiełku nakrywnym i badając nicienie pod mikroskopem. Reakcję należy przerwać, gdy rozpadnie się około 80% nicieni.</li>
		<li>Przerwać reakcję lizy, dodając taką samą objętość sterylnego buforu do jaj.</li>
		<li>Zebrać jaja (oraz resztki ciał) poprzez wirowanie przy 450 x g przez 5 min.</li>
		<li>Przemyć jaja sterylnym buforem do jaj 2-3x.</li>
		<li>Inkubować jaja O/N w buforze M9, a następnie wysiać je na standardowe płytki NGM.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Test chemotaksji.
	<ol>
		<li>Przygotować kilka kawałków agaru o wymiarach ok. 0,5x0,5x0,5 cm. Agar osadzamy na płytce 10 cm, z której następnie wycinamy kostki agaru.</li>
		<li>Namoczyć kostkę agaru w roztworze zawierającym wybrany atraktant (w stężeniach nasycających lub bliskich nasyceniu) przez 2 h. Typowymi atraktantami są lizyna (0,5 M) i biotyna (0,2 M).</li>
		<li>Umieścić kostkę agaru na 10-cm płytce testowej, na której zaznaczono miejsce na punkt testowy i punkt kontrolny (Rysunek 1A). Pozostawić O/N w celu wyrównania i uformowania gradientu (Rysunek 1B). Przygotować 5 płytek do jednego eksperymentu.</li>
		<li>Przed eksperymentem dodać 10 μl 20 mM NaN3 (środka znieczulającego) do każdego punktu.</li>
		<li>Umieścić 20 zsynchronizowanych wiekowo nicieni w centrum płytki. Umieścić płytkę w inkubatorze w temperaturze 20 °C.</li>
		<li>Po 1 h policzyć zwierzęta w punktach testowym i kontrolnym, a następnie obliczyć indeks chemotaksji (C.I.) według następującego wzoru: <img alt="Równanie do obliczania indeksu konkurencyjnego (C.I.) z wykorzystaniem wartości testowych i kontrolnych, przedstawienie formuły." fo:content-width=".863in" fo:src="/files/ftp_upload/50435/50435eq1highres.jpg" src="/files/ftp_upload/50435/50435eq1.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Równanie 1"> gdzie N, Ntest i NCnt. oznaczają odpowiednio całkowitą liczbę zwierząt, liczbę zwierząt w punkcie testowym oraz liczbę zwierząt w punkcie kontrolnym.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
3. Podstawowa hodowla komórek embrionalnych
<ol>
	<li>Przeprowadzić lizę nicieni zgodnie z opisem w sekcji synchronizacji wieku.</li>
	<li>Zatrzymać reakcję lizy poprzez dodanie takiej samej objętości sterylnego buforu do jaj i wirować przy 450 x g przez 5 min. Ostrożnie odlać nadsącz, uważając, aby nie zgubić osadu z jajami. Powtórzyć 2-3 krotnie lub do momentu, aż nadsącz stanie się klarowny.</li>
	<li>Resuspendować osad z jajami (i resztkami tkanek) w 2 ml sterylnego buforu do jaj i dodać 2 ml sterylnej 60% sacharozy w buforze do jaj. Mieszać roztwór ręcznie lub za pomocą wortexa aż do całkowitego resuspendowania jaj (ponieważ mają one tendencję do tworzenia grudek podczas wirowania).</li>
	<li>Wirować przy 450 x g przez 15 min.</li>
	<li>Ostrożnie przenieść nadsącz (zawierający jaja) do sterylnej probówki. Odrzucić osad zawierający resztki tkanek i inne produkty uboczne lizy.</li>
	<li>Usunąć resztkową sacharozę poprzez resuspendowanie jaj w buforze do jaj i wirowanie przy 450 x g przez 5 min. Ostrożnie zebrać i odlać nadsącz. Powtórzyć 3 krotnie.</li>
	<li>W komorze z laminarnym przepływem powietrza resuspendować osad z jajami w sterylnym buforze do jaj zawierającym 1 U/ml chitynazy w RT w celu strawienia skorup jaj. Po 30 min rozpocząć monitorowanie reakcji (pod inwertowanym mikroskopem do hodowli komórkowych). Każda partia chitynazy ma nieco inną aktywność. Zazwyczaj trawienie kończy się w ciągu 1 hr.</li>
	<li>Gdy chitynaza strawi około 70-80% skorup jaj, dodać CM-15 (pożywka do hodowli komórkowych L-15 zawierająca 10% płodowej surowicy bydlęcej, 50 U/ml penicyliny i 50 μg/ml streptomycyny). Rozdzielić komórki za pomocą strzykawki z igłą 27 G. Przefiltrować zawiesinę komórkową przez filtr 5.0 μm, aby usunąć nienaruszone embriony, grudki komórek oraz larwy.</li>
	<li>Ssedymentować rozdzieloną zawiesinę komórkową poprzez wirowanie przy 450 x g przez 15 min. Usunąć nadsącz i resuspendować osad w pożywce do hodowli komórkowych CM-15.</li>
	<li>Wysiać rozdzielone komórki na szkiełka zakrywkowe uprzednio pokryte lektyną arachidową (0.1 mg/ml) rozpuszczoną w wodzie. Uwaga: komórki muszą przylgnąć do podłoża, aby mogły ulec różnicowaniu.</li>
	<li>Komórki można utrzymywać w RT (16-20 °C) w powietrzu przez ponad 2 tygodnie.</li>
</ol>

<ol><li>Hardy, J., Allsop, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Amyloid+deposition+as+the+central+event+in+the+aetiology+of+Alzheimer%27s+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+in+Pharmacological+Sciences%22%5BJournal%5D)">Amyloid deposition as the central event in the aetiology of Alzheimer's disease.</a> Trends in Pharmacological Sciences. 12 (10), 383-388 (1991).</li>
<li>Kotzbauer, P. T., Trojanowsk, J. Q., Lee, V. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lewy+body+pathology+in+Alzheimer%27s+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Molecular+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Lewy body pathology in Alzheimer's disease.</a> Journal of Molecular Neuroscience. 17 (2), 225-232 (2001).</li>
<li>Greenberg, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inclusion+body+myositis%3A+review+of+recent+literature%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Neurology+and+Neuroscience+Reports%22%5BJournal%5D)">Inclusion body myositis: review of recent literature.</a> Current Neurology and Neuroscience Reports. 9 (1), 83-89 (2009).</li>
<li>Revesz, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sporadic+and+familial+cerebral+amyloid+angiopathies%5BTitle%5D)+AND+%22Brain+Pathology%22%5BJournal%5D)">Sporadic and familial cerebral amyloid angiopathies.</a> Brain Pathology. 12 (3), 343-357 (2002).</li>
<li>Hartmann, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Distinct+sites+of+intracellular+production+for+Alzheimer%27s+disease+A+beta40%2F42+amyloid+peptides%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Medicine%22%5BJournal%5D)">Distinct sites of intracellular production for Alzheimer's disease A beta40/42 amyloid peptides.</a> Nature Medicine. 3 (9), 1016-1020 (1997).</li>
<li>Ohnishi, S., Takano, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Amyloid+fibrils+from+the+viewpoint+of+protein+folding%5BTitle%5D)+AND+%22Cellular+and+Molecular+Life+sciences%3A+CMLS%22%5BJournal%5D)">Amyloid fibrils from the viewpoint of protein folding.</a> Cellular and Molecular Life sciences: CMLS. 61 (5), 511-524 (2004).</li>
<li>C. elegans II. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=%22Cold+Spring+Harbor+Monograph%22">Cold Spring Harbor Monograph</a>. DL, R. iddle, et al. 1, M. 33, Cold Spring Harbor Laboratory Press. Cold Spring Harbor. 1222(1997).</li>
<li>Cotella, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Toxic+role+of+k%2B+channel+oxidation+in+Mammalian+brain%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Neuroscience%3A+the+official+journal+of+the+Society+for+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Toxic role of k+ channel oxidation in Mammalian brain.</a> The Journal of Neuroscience: the official journal of the Society for Neuroscience. 32 (12), 4133-4144 (2012).</li>
<li>Link, C. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Expression+of+human+beta-amyloid+peptide+in+transgenic+Caenorhabditis+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Expression of human beta-amyloid peptide in transgenic Caenorhabditis elegans.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 92 (20), 9368-9372 (1995).</li>
<li>Cai, S. Q., Sesti, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Oxidation+of+a+potassium+channel+causes+progressive+sensory+function+loss+during+aging%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Oxidation of a potassium channel causes progressive sensory function loss during aging.</a> Nature Neuroscience. 12 (5), 611-617 (2009).</li>
<li>Yu, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Guanylyl+cyclase+expression+in+specific+sensory+neurons%3A+a+new+family+of+chemosensory+receptors%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Guanylyl cyclase expression in specific sensory neurons: a new family of chemosensory receptors.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 94, 3384-3387 (1997).</li>
<li>Bargmann, C. I., Horvitz, H. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chemosensory+neurons+with+overlapping+functions+direct+chemotaxis+to+multiple+chemicals+in+C.+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Chemosensory neurons with overlapping functions direct chemotaxis to multiple chemicals in C. elegans.</a> Neuron. 7 (5), 729-742 (1991).</li>
<li>Caserta, T. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Q-VD-OPh%2C+a+broad+spectrum+caspase+inhibitor+with+potent+antiapoptotic+properties%5BTitle%5D)+AND+%22Apoptosis+%3A+an+international+journal+on+programmed+cell+death%22%5BJournal%5D)">Q-VD-OPh, a broad spectrum caspase inhibitor with potent antiapoptotic properties.</a> Apoptosis : an international journal on programmed cell death. 8 (4), 345-352 (2003).</li>
<li>Christensen, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+primary+culture+system+for+functional+analysis+of+C.+elegans+neurons+and+muscle+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">A primary culture system for functional analysis of C. elegans neurons and muscle cells.</a> Neuron. 33 (4), 503-514 (2002).</li>
</ol>

Autorzy oświadczają, że nie mają konkurencyjnych interesów finansowych.

Tutaj opisujemy podejście łączone do badania komórkowych i molekularnych aspektów amylopatii przy użyciu C. elegans. Zalety tego podejścia to: 1) niski koszt. C.elegans jest utrzymywany na normalnej szalce Petriego obsianej bakteriami, w temperaturze pokojowej. 2) Potężna genetyka. Zwierzęta transgeniczne można uzyskać w ciągu kilku miesięcy, a szeroki wachlarz sekwencji promotorowych jest dostępny do napędzania ekspresji pożądanego genu w określonych neuronach. 3) Prosty, dobrze scharakteryzowany układ...

Amyloid beta (Aβ) to peptyd składający się z 36-43 aminokwasów, który powstaje po sekwencyjnym rozszczepieniu białka prekursorowego amyloidu (APP) przez β i γ sekretazy 1. Sekretaza γ przetwarza C-końcowy koniec peptydu Aβ i jest odpowiedzialna za jego zmienne długości 5. Najczęstszymi formami Aβ są Aβ40 i Aβ42, przy czym ta ostatnia jest częściej związana ze stanami patologicznymi, takimi jak AD 5. W wysokich stężeniach Aβ tworzy β-arkusze, które agregują się, tworząc fibryle amyloidowe 6. Złogi włókienek są głównym składnikiem blaszek starczych otaczających neurony. Uważa się, że zarówno blaszki maziowe, jak i dyfuzyjne, nieblaszkowane oligomery Aβ stanowią podstawowe formy chorobotwórcze Aβ.
Laboratoryjne badanie amylopatii neuronalnych komplikuje fakt, że te warunki postępują z czasem. Dlatego ważne jest, aby opracować genetycznie podatne modele zwierzęce - uzupełniające myszy - o krótkiej długości życia. Modele te mogą być wykorzystane do wyjaśnienia konkretnych aspektów amylopatii - zazwyczaj komórkowych i molekularnych - a dzięki swojej prostocie pomagają uchwycić istotę problemu. Robak Caenorhabditis elegans falls należy do tej kategorii. Ma krótką żywotność, ~ 20 dni, a ponadto podstawowe procesy komórkowe, w tym regulacja ekspresji genów, transport białek, łączność neuronalna, synaptogeneza, sygnalizacja komórkowa i śmierć są podobne do ssaków 7. Unikalne cechy robaka to silna genetyka i brak systemu naczyń krwionośnych, co umożliwia badanie uszkodzeń neuronów niezależnie od uszkodzeń naczyń krwionośnych. Z drugiej strony, brak mózgu ogranicza stosowanie C. elegans do badania wielu aspektów neurodegeneracji. Ponadto w tym organizmie nie można przeprowadzić reprodukcji i identyfikacji anatomicznego rozmieszczenia zmian chorobowych. Inne ograniczenia obejmują trudności w ocenie zarówno różnic w profilach ekspresji genów, jak i upośledzenie złożonego zachowania i funkcji pamięci. Tutaj opisujemy metody generowania modeli amylopatii C. elegans.

<table><tbody><tr><td colspan="4"><silny>1. NGM</td></tr><tr><td>Chlorek sodu</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S5886</td><td>3 g</td></tr><tr><td>Agar bakteriologiczny</td><td>AMRESCO</td><td>J637</td><td>17 g</td></tr><tr><td>Bacto-pepton</td><td>AMRESCO</td><td>J636</td><td>2,5 g</td></tr><tr><td>Woda</td><td></td><td></td> destylowana <td>Doprowadzić do 975 ml</td></tr><tr> <td colspan="4">Sterylizowane w autoklawie, następnie dodaj następujące elementy i dobrze wymieszaj</td></tr><tr><td>: Siarczan</td> <td>magnezuSigma-Aldrich</td><td>M2643</td><td>1 ml 1 M bulionu</td></tr><tr><td>Chlorek wapnia</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C5670</td><td>1 ml 1 M bulionu</td></tr><tr><td>Cholesterol</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C3045</td><td>1 ml 5 mg / ml bulionu</td></tr><tr><td></td><td></td> (w etanolu) <td>Bufor fosforanu potasu</td><td>25 ml 1M zapasu</td></tr><tr><td colspan="4">2. Bufor fosforanu potasu</td></tr><tr><td>Fosforan potasu jednozasadowy</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P5655</td><td>108,3 g</td></tr><tr><td>Fosforan potasu dwuzasadowy</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P3786</td><td>35,6 g</td></tr><tr><td>Woda</td><td></td><td></td> destylowana <td>Doprowadzić do 1 L</td></tr><tr><td colspan="4">Sterylizowane przez autoklawowanie</td></tr><tr><td colspan="4">3. M9 bufor</td></tr><tr><td>Fosforan potasu jednozasadowy</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P5655</td><td>3 g</td></tr><tr><td>Fosforan sodu dwuzasadowy</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S5136</td><td>6 g</td></tr><tr><td>Chlorek sodu</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S5886</td><td>5 g</td></tr><tr><td>Siarczan magnezu</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M2643</td><td>1 ml bulionu 1 M</td></tr><tr><td>Woda</td><td></td><td></td> destylowana <td>Doprowadzić do 1 l</td></tr><tr><td colspan="4">Sterylizowane przez autoklawowanie</td></tr><tr><td colspan="4">4. Bufor jaj (pH 7,3, 340 mOsm)</td></tr><tr><td>Chlorek sodu</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S5886</td><td>118 mM</td></tr><tr><td>Chlorek potasu</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P5405</td><td>48 mM</td></tr><tr><td>Chlorek wapnia</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C5670</td><td>2 mM</td></tr><tr><td>Chlorek magnezu</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M4880</td><td>2 mM</td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP310</td><td>25 mM</td></tr><tr>Woda <td></td><td></td><td>destylowana</td><td>Doprowadź do 1 L</td></tr><tr><td colspan="4">Sterylizowane przez autoklawowanie</td></tr><tr><td colspan="4">5. CM-15</td></tr><tr><td>L-15 pożywka hodowlana</td><td>Gibco</td><td>11415</td><td>450 ml</td></tr><tr><td>Płodowa surowica bydlęca</td><td>Gibco</td><td>10437-028</td><td>50 ml</td></tr><tr><td>Penicylina</td><td>Gibco</td><td>15140</td><td>50 jednostek/ml</td></tr><tr><td>Streptomycyna</td><td>Gibco</td><td>15140</td><td>50 g/ml</td></tr><tr><td colspan="4">Dostosuj do 340 mOsm z sacharozą, a następnie sterylnie przefiltruj do autoklawowanych butelek i przechowuj w temperaturze 4 &stopni; C</td></tr><tr><td colspan="4"><silny>6. Inne odczynniki< / mocny></td></tr><tr><td>olej Halocarbon 700</td><td>Produkty halowęglowe</td><td>9002-83-9</td><td></td></tr><tr><td>5 &mu; m Filtr strzykawkowy Acrodisc PALL</td><td>Co.</td><td>4199</td><td></td></tr><tr><td>Chitynaza</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C6137-5UN</td><td></td></tr><tr><td>Lektyna (orzechy ziemne)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>L0881-10MG</td><td></td></tr><tr><td>Wodorotlenek sodu</td><td>Fisher Scientific</td><td>S320</td><td></td></tr><tr><td>Lizyna</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>L5501</td><td></td></tr><tr><td>Biotyna</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>B4639</td><td></td></tr><tr><td>Roztwór</td> <td>podchlorynu soduSigma-Aldrich</td><td>425044</td><td></td></tr><tr><td>Azydek sodu</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>71289</td><td></td></tr><tr><td>Sacharoza</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S0389</td><td></td></tr></tbody></table>

system modelowy caenorhabditis elegans do badania amylopatii

A Caenorhabditis elegans Model System for Amylopathy Study

Amylopatia to termin opisujący nieprawidłową syntezę i akumulację beta amyloidu (Aβ) w tkankach w czasie. Aβ jest cechą charakterystyczną choroby Alzheimera (AD) i występuje w otępieniu z ciałami Lewy'ego, zapaleniu mięśni inkluzyjnych i mózgowej angiopatii amyloidowej 1-4. Amylopatie rozwijają się stopniowo z czasem. Z tego powodu proste organizmy o krótkiej długości życia mogą pomóc w wyjaśnieniu molekularnych aspektów tych schorzeń. W tym miejscu opisujemy eksperymentalne protokoły badania neurodegeneracji zależnej od Aβ przy użyciu robaka Caenorhabditis elegans. W ten sposób konstruujemy transgeniczne robaki, wstrzykując DNA kodujące ludzkie Aβ42 do syncytialnych gonad dorosłych hermafrodytów. Linie transformacyjne są stabilizowane przez integrację wywołaną mutagenezą. Nicienie są zsynchronizowane z wiekiem poprzez zbieranie i wysiewanie jaj. Funkcja neuronów wyrażających Aβ42 jest testowana w odpowiednich testach behawioralnych (testy chemotaksji). Pierwotne kultury neuronalne uzyskane z zarodków są wykorzystywane do uzupełniania danych behawioralnych i testowania neuroprotekcyjnego działania związków antyapoptotycznych.

W naszych protokołach badamy wpływ ludzkiego oligomeru Aβ42 na funkcję neuronalną 8. Fragment kodujący ludzki Aβ42 oraz sztuczną sekwencję peptydowego sygnału wektora Fire pPD50.52 został namnożony z konstruktu PCL12 9 przy użyciu starterów wprowadzających miejsca restrykcyjne dla endonukleazy Sma 1 na końcach. Następnie fragment ten wstawiono do konstruktu zawierającego 2 481-pb sekwencję promotora flp-6 w wektorze Fire pPD95.75 pomiędzy unikalne miejsce Sma 1 10...

Opisujemy metody badania aspektów amylopatii u robaka C. elegans. Pokazujemy, jak konstruować robaki wyrażające ludzkie Aβ42 w neuronach i jak testować ich funkcję w testach behawioralnych. Dalej pokazujemy, jak uzyskać pierwotne hodowle neuronów, które można wykorzystać do badań farmakologicznych.

System modelowy Caenorhabditis elegans do badania amylopatii

Amylopathy is a term that describes abnormal synthesis and accumulation of amyloid beta (A&beta;) in tissues with time. A&beta; is a hallmark of ...

Ogólnym celem tej procedury jest ocena wpływu toksyczności beta-amyloidu na funkcje i przeżywalność neuronów. Jest to realizowane poprzez konstrukcję transgenicznych nicieni C. elegans wykazujących ekspresję peptydu beta-amyloidu z reporterem GFP w neuronach sensorycznych SE. Następnie, za pomocą testu chemotaksji, ocenia się konsekwencje behawioralne ekspresji beta-amyloidu w neuronach SE.Trzecim krokiem jest otrzymanie kultur pierwotnych neuronów SE, a następnie poddanie hodowlanych neuronów działaniu czynników farmakologicznych, takich jak Q-V-D-O-P-H, w celu zahamowania toksycznego działania amyloidu beta. Ostatecznie wyniki mogą wykazać wpływ toksyczności amyloidu beta na funkcje i przeżywalność neuronów SE za pomocą testów behawioralnych i farmakologicznych. Ta metoda może pomóc w odpowiedzi na kluczowe pytania dotyczące neurodegeneracji, takie jak wyjaśnienie konkretnych mechanizmów komórkowych i molekularnych.Mechanizmy neurotoksycznego działania oligomerów beta-amyloidu. Procedury zaprezentuje dr Zing Dwan, postdok z mojego laboratorium. Do transformacji wymagane są podkładki do wstrzykiwania z 2% agrosy. Należy nanieść kroplę gorącej agrosy rozpuszczonej w wodzie na szklaną lamelkę, szybko nałożyć na kroplę drugą lamelkę i lekko ją dotknąć.Podczas przygotowywania mieszaniny do iniekcji należy pamiętać o odwirowaniu i przeniesieniu górnych 5 µL, wolnych od zanieczyszczeń i innych drobin, do nowej probówki w celu przygotowania ładunku do iniekcji; następnie należy naciągnąć mieszaninę iniekcyjną oraz pusty plazmid do pipety iniekcyjnej za pomocą działania kapilarnego. Zazwyczaj 0,5 µL wystarcza do iniekcji 100 nicieni. Aby poszerzyć otwór w pipiecie iniekcyjnej, należy potrzeć jej końcówkę o krawędź szkiełka nakrywnego zamontowanego na szkiełku przedmiotowym w oleju Halocarbon 700. Jakość wykonania otworu jest krytyczna.Ocenia się go po kształcie końcówki, a przede wszystkim po szybkości przepływu, określanej na podstawie strumienia oraz wielkości pęcherzyków powietrza tworzących się na końcówce pipety w odpowiedzi na ciśnienie wtrysku. Teraz nanieś kroplę oleju węglowego 700 na podkładkę do wtrysku i przenieś kilka nicieni na podkładkę. Użyj igły do nicieni, aby docisnąć je do podkładki, aż przylegną do powierzchni.Robaki powinny być zorientowane w rzędach z wyrównanymi stronami brzuszna. Należy unikać dotykania ich głów. Jeśli po kilku próbach robaki nie przykleją się do podkładki, należy spróbować użyć nowej podkładki lub zwiększyć grubość agarozy bądź stężenie podkładki.Teraz wprowadź pipetę do organizmu nicienia. Najpierw przesuń stolik, aby ustawić nicienia pod pipetą. Następnie ustaw pipetę obok rdzenia centralnego gonady.Ponieważ cytoplazma jest wspólna dla wielu jąder komórek płciowych, zwiększa to prawdopodobieństwo przekazania wstrzykniętego DNA potomstwu. Pipeta powinna znajdować się niemal równolegle do nicienia. Po trzecie, przesuń końcówkę pionowo w kierunku ciała, aż do uciśnięcia skóry.Na koniec delikatnie stuknij manipulator, aby doprowadzić do wprowadzenia końcówek. Teraz wstrzyknij roztwór DNA. Naciskaj tłok pipety, aż gonad spuchnie.Następnie należy zatrzymać przepływ i zdjąć nicienia z pipety. Należy sprawdzić przepływ przez igłę, a następnie wstrzyknąć pozostałe gonady, zanim przejdzie się do kolejnego nicienia. Po wykonaniu wstrzyknięć należy dodać do nicieni około 10 µL buforu regeneracyjnego i odczekać, aż zaczną pływać.Gdy zaczną pływać, należy dodać taką samą objętość buforu M9. Kiedy nicienie wznowią pływanie, należy kontynuować dodawanie M9, aż roztwór będzie składać się głównie z M9. Następnie każdy nicień należy przenieść na przygotowaną płytkę.Zebrać nicienie GR w 1 ml buforu M9 do probówki typu Falcon o pojemności 50 ml. Następnie, używając buforu M9, przemyć nicienie poprzez wielokrotne wirowanie i wymianę roztworu, aż do momentu, gdy bufor M9 po przemyciu będzie klarowny. Następnie dodać 10 objętości podstawowego roztworu podchlorynu do nicieni.Osadzone nicienie inkubuje się w temperaturze pokojowej do momentu, aż około cztery piąte z nich ulegną rozbiciu, co zazwyczaj trwa 10 minut. Reakcję monitoruje się poprzez pobieranie alikwotów do obserwacji pod mikroskopem. Reakcję zatrzymuje się poprzez dodanie równiej objętości sterylnego buforu do jaj.Następnie zebrać jaja i resztki organizmów poprzez wirowanie przy 450 G przez pięć minut. Ostrożnie usunąć nadsącz. Dodać taką samą objętość buforu do jaj i ponownie odwirować próbkę przy 450 G przez pięć minut.Powtarzać procedurę do czasu, aż bufor stanie się klarowny. Następnie inkubować jaja przez noc w buforze M9, a następnego dnia wysiać je na standardowe płytki NGM. Przygotować kilka kostek agaru o boku około pół centymetra.Namaczaj kawałki agaru w roztworze zawierającym wybrany atraktant przez dwie godziny. Umieść kawałek agaru na 10 centymetrowej płytce testowej, na której zaznaczono miejsce na punkt testowy oraz punkt kontrolny. Przygotuj pięć takich płytek na każdy eksperyment.Pozostaw płytki w temperaturze 20 °C przez noc, aby umożliwić utworzenie się gradientu chemicznego. Przed rozpoczęciem eksperymentu dodaj 10 µL 20 mM azotku sodu do każdego punktu na płytkach. Substancja ta pełni rolę środka znieczulającego.Rozpocznij eksperyment, umieszczając 20 zsynchronizowanych pod względem wieku nicieni w centrum płytki, a następnie umieść płytkę w inkubatorze w temperaturze 20 °C na jedną godzinę. Po godzinie policz zwierzęta na obszarach testowych oraz kontrolnych i oblicz wskaźnik CI. Po lizie nicieni gr oraz oczyszczeniu jaj i resztek tkanek zgodnie z wcześniejszym opisem, zawieś je ponownie w 2 mL sterylnego buforu do jaj i dodaj 2 mL sterylnej 60% sacharozy w buforze do jaj.Następnie wymieszać zawartość probówki ręcznie lub za pomocą wierzchołkowego mieszalnika (vortex) aż do całkowitego resuspensowania jaj. Wirować resuspensowane jaja z prędkością 450 ×g przez 15 minut. Następnie ostrożnie zebrać znad osadu supernatant zawierający jaja, a osad usunąć w celu pozbycia się pozostałości sacharozy. Jaja resuspensować w buforze do jaj i wirować z prędkością 450 ×g przez pięć minut.Ostrożnie zebrać i usunąć nadsącz, a następnie powtórzyć proces płukania trzykrotnie w komorze z laminarnym przepływem powietrza. Do resuspensji osadu z jaj użyć sterylnego buforu do jaj zawierającego jedną jednostkę na mililitr chitynazy. Pozostawić jaja do trawienia w temperaturze pokojowej przez 30 minut, a następnie rozpocząć monitorowanie reakcji pod odwróconym mikroskopem do hodowli komórkowych.Gdy od 70 do 80% skorupek jaj zostanie strawionych, należy dodać pięć mililitrów pełnej pożywki L 15 lub CM 15. Aby wyizolować komórki, należy je zdysocjować, aby zapobiec tworzeniu się agregatów, przepuszczając zawiesinę kilka razy przez igłę o rozmiarze 27G. Następnie należy przefiltrować roztwór za pomocą strzykawki z filtrem o wielkości oczek 5 µm.Odwiruj zawiesinę rozdzielonych komórek przy 450 G przez 15 minut, aby uzyskać osad. Następnie usuń supernatant i resuspender komórki w CM 15. Aby upewnić się, że komórki zostały rozdzielone, sprawdź zawiesinę pod mikroskopem.Na koniec wysiej zdysocjowane komórki na wcześniej pokryte szkiełka podstawkowe. Przy użyciu lektyny arachidowej komórki można utrzymywać w temperaturze pokojowej w normalnym powietrzu przez ponad dwa tygodnie. Korzystając z opisanych technik transformacji, stworzono robaka transgenicznego wykazującego ekspresję ludzkiego Beta 42 w neuronach a SE, czyli neuronach wykrywających rozpuszczalne w wodzie atraktanty, takich jak biotyna, przy użyciu testu chemotaksji.Przeprowadzono badania na siedmiodniowych robakach transgenicznych. Grupy kontrolne bez problemu odnalazły biotynę. W przeciwieństwie do nich, tylko niewielka liczba robaków wykazujących ekspresję beta 42 była w stanie odnaleźć punkt z atraktantem.Wskaźnik chemotaksji w przypadku biotyny wyniósł 0,68, w porównaniu do 0,12 dla nicieni kontrolnych i doświadczalnych odpowiednio w trzecim lub czwartym dniu. Odnotowano również niewielki, lecz wykrywalny spadek wskaźnika. Hodowany neuron A SER w czwartym dniu, wciąż wykazujący ekspresję GFP po dziewięciu dniach życia.Jednakże fluorescencja GFP zanikła, co nasunęło podejrzenie o wystąpieniu apoptozy; aby przetestować tę teorię, przygotowano pierwotne neurony A SER zgodnie z opisem i uzupełniono je o inhibitor kaspaz o szerokim spektrum. Zgodnie z oczekiwaniami, zastosowana terapia zatrzymała utratę fluorescencji, potwierdzając, że ekspresja ludzkiego A beta 42 wywołuje apoptozę w neuronach A SER.Po obejrzeniu tego filmu powinni Państwo posiadać wiedzę na temat tego, jak skonstruować eleganckie nicienie transgeniczne, badać je w testach behawioralnych oraz jak uzyskać kulturę pierwotną z Ambrose.

a-caenorhabditis-elegans-model-system-for-amylopathy-study

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Neuronauka

System modelu Caenorhabditis elegans do badań nad amilopatią

Intensywnie badany nicień Caenorhabditis elegans może zostać zmodyfikowany transgenicznie w celu ekspresji ludzkiego peptydu β-amyloidu (Aβ). Indukowana ekspresja Aβ w mięśniach C. elegans prowadzi do szybkiego, powtarzalnego fenotypu paraliżu, który może być wykorzystany do monitorowania terapii modulujących toksyczność Aβ.

Oznaczanie toksyczności β-amyloidu z wykorzystaniem transgenicznego modelu C. elegans

Aby zbadać związek między homeostazą białek, stresem i starzeniem się, monitorowaliśmy zmiany w fałdowaniu białek, śledząc dysfunkcję białek, lokalizację białek w komórce i stabilność białek na poziomie organizmu, komórkowym i białkowym, używając genetycznie wykonalnego metazoanu Caenorhabditis elegans jako systemu modelowego.

Wykorzystanie Caenorhabditis elegans jako systemu modelowego do badania homeostazy białek w organizmie wielokomórkowym

Tutaj prezentujemy nicienia Caenorhabditis elegans jako wszechstronny model gospodarza do badania interakcji mikrobiologicznych.

Nicienie Caenorhabditis elegans - wszechstronny model in vivo do badania interakcji gospodarz-mikroorganizm

Ten protokół opisuje metodę uprawy Caenorhabditis elegans na dużą skalę na stałych podłożach. Jako alternatywa dla hodowli płynnej, protokół ten pozwala na uzyskanie parametrów o różnych skalach pod uprawą płytkową. Zwiększa to porównywalność wyników poprzez pominięcie różnic morfologicznych i metabolicznych między hodowlą pożywek płynnych i stałych.

Hodowla Caenorhabditis elegans na dużych obszarach na płytkach: przygotowanie próbki do badania zmian metabolicznych w cukrzycy

Produkty translacyjne związane z powtarzalnością, niezależne, są wyłaniającymi się cechami patogennymi kilku powtarzających się chorób opartych na ekspansji. Celem opisanego protokołu jest ocena toksyczności spowodowanej przez te peptydy przy użyciu testów behawioralnych i komórkowych w systemie modelowym C. elegans.

Pomiar toksyczności peptydów RAN u C. elegans

Tutaj przedstawiamy i opisujemy szeroko dostępne metodologie wykorzystujące niektóre wszechstronne modele nicieni, w tym nekrozę wywołaną hiperaktywowanym kanałem jonowym i neurotoksyczność wywołaną agregatem białkowym, do monitorowania i analizowania komórkowych i molekularnych podstaw chorób neurodegeneracyjnych związanych z wiekiem.

Modelowanie chorób neurodegeneracyjnych związanych z wiekiem w Caenorhabditis elegans

Ten protokół opisuje dwa czułe testy do rozróżniania między łagodnym, umiarkowanym i ciężkim upośledzeniem motorycznym w modelach stwardnienia zanikowego bocznego C. elegans, z ogólną użytecznością dla szczepów C. elegans, ze zmienioną ruchliwością.

Ocena upośledzenia motorycznego w modelach stwardnienia zanikowego bocznego C. elegans

W tym artykule pokazujemy, jak używać siedmiopunktowego systemu punktacji do konsekwentnego ilościowego określania zmian w morfologii dendrytów neuronów dopaminergicznych u C. elegans. System ten jest przeznaczony do analiz testów neurodegeneracji dopaminergicznej z wykorzystaniem genetycznych, chemicznych i opartych na wieku modeli zaburzeń neurodegeneracyjnych.

Kwantyfikacja poziomów zmian morfologicznych i zwyrodnień neuronów dopaminergicznych u Caenorhabditis elegans

Tutaj prezentujemy protokół oceny neuroprotekcyjnych aktywności testowych związków u Caenorhabditis elegans, w tym agregacji poliglutaminy, śmierci neuronów i zachowania chemounikania, a także przykładowej integracji wielu fenotypów.

Caenorhabditis elegans jako modelowy system do odkrywania związków bioaktywnych przeciwko neurotoksyczności za pośrednictwem poliglutaminy

Przedstawiono podejścia do testowania działania leków przeciwpsychotycznych (APD) w Caenorhabditis elegans. Opisano testy do testowania wpływu leku na rozwój i żywotność oraz na szybkość pompowania gardła. Metody te mają również zastosowanie w eksperymentach farmakogenetycznych z klasami leków innymi niż APD.

Metody badania mechanizmów działania leków przeciwpsychotycznych w Caenorhabditis elegans

Poznaj metody badania toksyczności amyloidu beta w neuronach C. elegans przy użyciu testów chemotaksji i hodowli pierwotnej. Technika ta pozwala ocenić funkcję neuronalną oraz testować działanie leków neuroprotekcyjnych.

System modelowy Caenorhabditis elegans do badania amylopatii

Przeglądaj więcej filmów