Rekonstytucja kanału Kv do błon lipidowych w badaniach strukturalnych i funkcjonalnych

Ogólnym celem tej procedury jest dostarczenie szczegółowego opisu technik funkcjonalnego i strukturalnego badania wpływu lipidów na białka błonowe. Osiąga się to poprzez pierwsze wyrażenie i oczyszczenie kanału potasowego bramkowanego napięciem. Drugim krokiem jest rekonstytucja kanału jonowego.

Następnie wykonywany jest zapis elektryczny z kanałów jonowych w dwuwarstwach lipidowych do badania funkcjonalnego kanału jonowego. Ostatnim etapem jest krystalizacja kanałów jonowych w membranie w celu określenia struktury. Ostatecznie testy biochemiczne, metoda elektrofizjologiczna i badanie krystalograficzne elektronów są wykorzystywane do badania wpływu lipidów na ruch czujnika napięcia kanałów jonowych.

Ogólnie rzecz biorąc, osoby nowe w tej metodzie będą miały trudności z powodu wielu szczegółów technicznych w rekonstytucji białek i zapisach biologicznych. Mam nadzieję, że ten film, proces pomoże Ci przejść przez całą procedurę i odnieść sukces. Demonstracja całej procedury zostanie przeprowadzona przez dr Hui Jima z mojego laboratorium.

Przed przygotowaniem lipidów znajdowała się jednorazowa szklana probówka o pojemności 14 mililitrów, szklana probówka ze śrubą i szklana strzykawka o pojemności 250 mikrolitrów z chloroformem. Następnie przenieś 10 mililitrów chloroformu do probówki. Aby przygotować liposomy POPE i POPG, przenieś 3,75 miligrama POPE i 1,25 miligrama POPG w chloroformie do szklanej probówki z zakręcaną nakrętką.

Wysuszyć lipidy pod ciągłym strumieniem argonu, gdy nie pozostaje widoczny chloroform. Wypróbuj lipid dalej w próżni pokojowej przez godzinę. Następnie dodaj 440 mikrolitrów buforu o niskiej zawartości soli lub wody do wysuszonego wiru lipidowego.

Rurka do nawilżania lipidów. Zawiesina lipidowa powinna wyglądać na białawą i jędrną. Następnie sonikować zawiesinę lipidową w lodowatej kąpieli, sonikować, aż roztwór pęcherzyków stanie się przezroczysty.

Następnie w 50 mikrolitrach trzech molowych chlorków potasu i 10 mikrolitrach 0,5 mola DM do mieszaniny, tak aby końcowa zawiesina lipidowa miała 300 milimolowy chlorek potasu i 10 milimolowy DM, inkubować roztwór w rotatorze przez dwie godziny w temperaturze pokojowej, aby umożliwić utworzenie komórek M zmieszanych z detergentem lipidowym. Po inkubacji zawiesina powinna stać się nieco bardziej mętna z powodu wywołanego detergentem zespolenia małych pęcherzyków ELLA. Gdy białko jest skoncentrowane do więcej niż dwóch miligramów na mililitr, dodaj wymienione składniki, mieszaninę detergentów lipidowych, aby uzyskać jeden mililitr końcowej objętości.

Następnie inkubuj mieszaninę detergentu białkowo-lipidowego w szklanej probówce w rotatorze przez kolejne dwie godziny. Preparat KVAP w mieszaninie z detergentem rozpuszczonym DTaP lub DOGS, jest podobny do preparatu lipidowego dla pęcherzyka P-O-P-E-P-O-P-G. Jednak sonikacja uwodnionych lipidów w małe pęcherzyki trwa dłużej niż w przypadku lipidów P-O-P-E-P-P-P-G, pęcherzyki DOGS mogą powoli łączyć się ze sobą i tworzyć małe oleiste kropelki, aby całkowicie rozpuścić dote lub DOGS.

Sonikowane pęcherzyki miesza się z 10 milimolowymi DM i 40 milimolowymi beta og. Mieszanina detergentów lipidowych jest inkubowana przez noc w temperaturze pokojowej, a mieszanina powinna być dość klarowna i nie powinna zawierać żadnych małych cząstek ani kropelek. Następnie wymieszaj białko KVAP z rozpuszczonym detergentem DTaP lub DOGS w stosunku białka do lipidów mniejszym lub równym jeden do 10.

Mieszaninę lipidów z detergentem białkowym pozostawia się do inkubacji w temperaturze pokojowej przez dwie do trzech godzin z ciągłą rotacją orbitalną. Aby zademonstrować powolne usuwanie detergentów, które mają stosunkowo wysoki CMC, takich jak DM i Beta og. Najpierw przygotuj dwulitrowy bufor do dializy na każdy mililitr mieszaniny.

Następnie wytnij odpowiednią długość rurki do dializy i umyj ją wodą demineralizowaną, aby sprawdzić i upewnić się, że nie ma wycieku w przewodach. Następnie załaduj mieszaninę detergentu z lipidami białkowymi do rurki dializy. Clamp oba końce rurki z minimalną przestrzenią pozostawioną nad roztworem.

Umieścić załadowany przewód na płytce mieszającej w buforze do dializy, tak aby przewód obracał się powoli w roztworze. Wymieniać bufor dializacyjny raz na osiem godzin. Teraz przygotuj kulki polistyrenowe do usunięcia detergentów o niskim CMC, najpierw skrzydełkując 0,5 grama suchych kulek.

Następnie włóż je do 50-mililitrowej probówki Corning i dodaj 20 mililitrów metanolu, sonikuj roztwór w kąpieli Sonicate przez pięć minut, aby usunąć uwięzione pęcherzyki i spędź na kulkach w temperaturze 5 000 RP przez pięć minut, po czym całkowicie zdekantuj metanol i powtórz mycie etanolem i wodą mili Q. Następnie umyte kulki przechowuj w 20% etanolu w temperaturze czterech stopni Celsjusza i przed użyciem zmień je na bufor bez detergentów. Oszacuj ilość detergentów w mieszaninie detergentów z lipidami białkowymi, która ma być poddana obróbce, i oblicz ilość kulek potrzebnych do usunięcia detergentów.

Zważ mokre kulki bez nadmiaru wody i dodaj je bezpośrednio do mieszanki białkowej i odczekaj co najmniej 15 do 20 minut, aby kulki były w pełni skuteczne. Aby usunąć 8,7 miligrama DDM w jednym mililitrze roztworu, łącznie 87 miligramów kulek polistyrenowych, takich jak kulki bio, SM dwa dzieli się na pięć równych porcji. Mieszać mieszaninę detergentów z lipidami białkowymi z każdą frakcją przez 20 do 30 minut ze stałą rotacją od końca do końca w temperaturze pokojowej.

Zakręć kulkami, a następnie przenieś supernatant do następnej frakcji kulek i powtarzaj do końca. Na tym etapie zacznij od oczyszczenia szklanej probówki i bursztynowej fiolki za pomocą zakrętki z teflonem i zestawu szklanych strzykawek z chloroformem. Następnie wysuszyć bursztynową fiolkę pod strumieniem argonu.

Następnie przenieś 0,75 miligrama POPE i 0,25 miligrama POPG w chloroformie do fiolki z żarem i odparuj chloroform za pomocą argonu. Następnie dodaj 0,2 mililitra pentanu do fiolki, aby rozpuścić wysuszone lipidy i całkowicie wysuszyć, aby usunąć resztki chloroformu. Następnie dodaj 50 mikrolitrów dekanu do fiolki, aby rozpuścić wysuszony lipid.

Teraz pomaluj okrągły otwór na cylindrycznej powierzchni dwuwarstwowej miseczki lipidami, nie wprowadzając do otworu roztworu lipidowego. Poczekaj od jednej do dwóch minut, aż dekada całkowicie odparuje, aby wykonać nagrania elektryczne z kanałów KVAP w lipidach warstwami. Włóż kubek do komory nagrywania, włóż mostki solne i podłącz elektrody po obu stronach kubka do nagrywania.

Dodaj roztwór torbieli do otworów elektrod oraz roztwór CYS i trans do zewnętrznych i wewnętrznych kubków w komorze. Następnie dostosuj przesunięcie potencjału między dwiema stronami kubka do mniej niż dwóch miliwoltów, a następnie pomaluj lipid w poprzek otworu w nakrętce. Poczekaj, aż membrana rozrzedzi się i stanie się względnie stabilna.

Gdy tylko membrana stanie się stabilna. Wystrzel 0,5 do jednego mikrolitra kanału zawierającego pęcherzyki, umieszczając cienki koniec końcówki pipety P dwie tuż nad otworem. Pęcherzyki opadają przez otwór na dno kubka.

Do testowania kanałów KVAP w dwuwarstwie. Krótki impuls o napięciu 80 miliwoltów jest dostarczany z potencjału podtrzymania minus 80 miliwoltów ze względu na szybką inaktywację i powolny powrót do zdrowia po aktywacji w długim odstępie czasu, około 120 sekund dla kanałów w membranach PEPG jest podawany między dwoma impulsami. Gdy prąd wygląda na dobry pod względem wielkości, zrównoważ stężenia jonów w roztworach po obu stronach membrany, dodając dodatkowe sole jonowe po stronie o niskim stężeniu.

Oto obraz ujemnie zabarwionego kryształu 2D, w środku optymalizacji kryształu. Kryształy były barwione 6% fosą amonową, pH 6,4 plus 0,5% triozy ze względu na cukier, czasami gromadziły się ze sobą. Czarne kwadratowe pole oznacza tutaj obszar, który powoduje powstanie wzoru dyfrakcyjnego z plamkami dyfrakcyjnymi.

Idąc do około 20 angstremów, tutaj jest obraz kriogeniczny EM kryształu 2D z próbki podobnej do tej pokazanej wcześniej. Próbka została zmieszana z 3% TLO i zamrożona przez bezpośrednie zanurzenie i zobrazowana pod kriogenicznym EM na 50 000 pokładów. Oczywiste jest, że w upakowaniu kryształów występowały miejscowe defekty.

Oto kolejny obraz cryo-EM jeszcze bardziej zoptymalizowanego kryształu. Okaz został osadzony w 0,75% garbnikach i 10% witach drzewnych, a zdjęcie zostało wykonane w 50 000 x. Proste linie w ciasnym upakowaniu sugerowały, że kanały były dobrze uporządkowane w tego typu kryształach, podczas gdy dwie czarne strzałki oznaczają kwadratowe wektory.

Mam nadzieję, że po obejrzeniu tego filmu będziesz miał dobre wyczucie, jak prawidłowo obchodzić się z lipidami i białkiem, a ten film, mam nadzieję, pomoże ci skuteczniej badać działanie białka lipidowego w błonie.