Name: Rekonstytucja kanału Kv do błon lipidowych w badaniach strukturalnych i funkcjonalnych (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-07-13T13:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 22 s
Description: Poznaj metodę rekonstytucji kanałów Kv do błon lipidowych w celu badań strukturalnych i funkcjonalnych. Technika ta umożliwia analizę wpływu lipidów na białka błonowe oraz badanie ruchu czujnika napięcia.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Badania nad KvAP w laboratorium Jiang uzyskały znaczącą pomoc od laboratorium dr Rodericka MacKinnona na Uniwersytecie Rockefellera. Specjalne podziękowania kierujemy do dr Kathlynn Brown i Michaela McQuire'a za ich rady i pomoc w naszych eksperymentach z wykorzystaniem fagów. Prace te były wspierane przez granty z NIH (GM088745 i GM093271 do Q-XJ) oraz AHA (12IRG9400019 do Q-XJ).

<ol><li>Alberts, B., et al. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aAlberts%2C+B+%22Molecular+Biology+of+the+Cell%22">Molecular Biology of the Cell</a>. , 5th edition, Galand Science. New York. (2007).</li>
<li>Lee, A. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((How+lipids+and+proteins+interact+in+a+membrane%3A+a+molecular+approach%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Biosyst%22%5BJournal%5D)">How lipids and proteins interact in a membrane: a molecular approach.</a> Mol. Biosyst. 1, 203(2005).</li>
<li>Lee, A. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((How+lipids+affect+the+activities+of+integral+membrane+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Biochim.+Biophys.+Acta%22%5BJournal%5D)">How lipids affect the activities of integral membrane proteins.</a> Biochim. Biophys. Acta. 1666, 62(2004).</li>
<li>Anderson, R. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+caveolae+membrane+system%5BTitle%5D)+AND+%22Annu.+Rev.+Biochem%22%5BJournal%5D)">The caveolae membrane system.</a> Annu. Rev. Biochem. 67, 199(1998).</li>
<li>Simons, K., Vaz, W. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Model+systems%2C+lipid+rafts%2C+and+cell+membranes%5BTitle%5D)+AND+%22Annu.+Rev.+Biophys.+Biomol.+Struct%22%5BJournal%5D)">Model systems, lipid rafts, and cell membranes.</a> Annu. Rev. Biophys. Biomol. Struct. 33, 269(2004).</li>
<li>Edidin, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+state+of+lipid+rafts%3A+from+model+membranes+to+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Annu.+Rev.+Biophys.+Biomol.+Struct%22%5BJournal%5D)">The state of lipid rafts: from model membranes to cells.</a> Annu. Rev. Biophys. Biomol. Struct. 32, 257(2003).</li>
<li>Kapoor, R., Kim, J. H., Ingolfson, H., Andersen, O. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Preparation+of+Artificial+Bilayers+for+Electrophysiology+Experiments%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis.+Exp%22%5BJournal%5D)">Preparation of Artificial Bilayers for Electrophysiology Experiments.</a> J. Vis. Exp. (20), e1033(2008).</li>
<li>Zheng, H., Liu, W., Anderson, L. Y., Jiang, Q. X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lipid-dependent+gating+of+a+voltage-gated+potassium+channel%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Commun%22%5BJournal%5D)">Lipid-dependent gating of a voltage-gated potassium channel.</a> Nat. Commun. 2, 250(2011).</li>
<li>Schmidt, D., Jiang, Q. X., MacKinnon, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Phospholipids+and+the+origin+of+cationic+gating+charges+in+voltage+sensors%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Phospholipids and the origin of cationic gating charges in voltage sensors.</a> Nature. 444, 775(2006).</li>
<li>Ruta, V., Jiang, Y., Lee, A., Chen, J., MacKinnon, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functional+analysis+of+an+archaebacterial+voltage-dependent+K%2B+channel%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Functional analysis of an archaebacterial voltage-dependent K+ channel.</a> Nature. 422, 180(2003).</li>
<li>Jiang, Q. X., Gonen, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+influence+of+lipids+on+voltage-gated+ion+channels%5BTitle%5D)+AND+%22Curr.+Opin.+Struct.+Biol%22%5BJournal%5D)">The influence of lipids on voltage-gated ion channels.</a> Curr. Opin. Struct. Biol. , 3408884(2012).</li>
<li>Artimo, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((ExPASy%3A+SIB+bioinformatics+resource+portal%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">ExPASy: SIB bioinformatics resource portal.</a> Nucleic Acids Res. 40, W597(2012).</li>
<li>Cladera, J., Rigaud, J. L., Villaverde, J., Dunach, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Liposome+solubilization+and+membrane+protein+reconstitution+using+Chaps+and+Chapso%5BTitle%5D)+AND+%22Eur.+J.+Biochem%22%5BJournal%5D)">Liposome solubilization and membrane protein reconstitution using Chaps and Chapso.</a> Eur. J. Biochem. 243, 798(1997).</li>
<li>Levy, D., Bluzat, A., Seigneuret, M., Rigaud, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+systematic+study+of+liposome+and+proteoliposome+reconstitution+involving+Bio-Bead-mediated+Triton+X-100+removal%5BTitle%5D)+AND+%22Biochim.+Biophys.+Acta%22%5BJournal%5D)">A systematic study of liposome and proteoliposome reconstitution involving Bio-Bead-mediated Triton X-100 removal.</a> Biochim. Biophys. Acta. 1025, 179(1990).</li>
<li>Young, H. S., Rigaud, J. L., Lacapere, J. J., Reddy, L. G., Stokes, D. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((How+to+make+tubular+crystals+by+reconstitution+of+detergent-solubilized+Ca2%28%2B%29-ATPase%5BTitle%5D)+AND+%22Biophys.+J%22%5BJournal%5D)">How to make tubular crystals by reconstitution of detergent-solubilized Ca2(+)-ATPase.</a> Biophys. J. 72, 2545(1997).</li>
<li>Levy, D., Gulik, A., Bluzat, A., Rigaud, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reconstitution+of+the+sarcoplasmic+reticulum+Ca%282%2B%29-ATPase%3A+mechanisms+of+membrane+protein+insertion+into+liposomes+during+reconstitution+procedures+involving+the+use+of+detergents%5BTitle%5D)+AND+%22Biochim.+Biophys.+Acta%22%5BJournal%5D)">Reconstitution of the sarcoplasmic reticulum Ca(2+)-ATPase: mechanisms of membrane protein insertion into liposomes during reconstitution procedures involving the use of detergents.</a> Biochim. Biophys. Acta. 1107, 283(1992).</li>
<li>Cohen, F. S., Zimmerberg, J., Finkelstein, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fusion+of+phospholipid+vesicles+with+planar+phospholipid+bilayer+membranes.+II.+Incorporation+of+a+vesicular+membrane+marker+into+the+planar+membrane%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+General+Physiology%22%5BJournal%5D)">Fusion of phospholipid vesicles with planar phospholipid bilayer membranes. II. Incorporation of a vesicular membrane marker into the planar membrane.</a> The Journal of General Physiology. 75, 251(1980).</li>
<li>Fuks, B., Homble, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Permeability+and+electrical+properties+of+planar+lipid+membranes+from+thylakoid+lipids%5BTitle%5D)+AND+%22Biophysical+Journal%22%5BJournal%5D)">Permeability and electrical properties of planar lipid membranes from thylakoid lipids.</a> Biophysical Journal. 66, 1404(1994).</li>
<li>Hanke, W., Schlue, W. -R. Planar Lipid Bilayers. Methods and Applications. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aHanke%2C+W+%22Biological+Techniques%22">Biological Techniques</a>. Sattelle, D. B. , Academic Press, Inc. San Diego. 133(1993).</li>
<li>Tien, H. T. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aTien%2C+HT+%22Bilayer+lipid+membranes+%28BLM%29.+Theory+and+Practice%22">Bilayer lipid membranes (BLM). Theory and Practice</a>. , Marcel Dekker, Inc. New York. 655-65 (1974).</li>
<li>Pagano, R. E., Ruysschaert, J. M., Miller, I. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+molecular+composition+of+some+lipid+bilayer+membranes+in+aqueous+solution%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Membrane+Biology%22%5BJournal%5D)">The molecular composition of some lipid bilayer membranes in aqueous solution.</a> The Journal of Membrane Biology. 10, 11(1972).</li>
<li>Henn, F. A., Thompson, T. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Properties+of+lipid+bilayer+membranes+separating+two+aqueous+phases%3A+composition+studies%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Properties of lipid bilayer membranes separating two aqueous phases: composition studies.</a> Journal of Molecular Biology. 31, 227(1968).</li>
<li>Tao, X., MacKinnon, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functional+analysis+of+Kv1.2+and+paddle+chimera+Kv+channels+in+planar+lipid+bilayers%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Mol.+Biol%22%5BJournal%5D)">Functional analysis of Kv1.2 and paddle chimera Kv channels in planar lipid bilayers.</a> J. Mol. Biol. 382, 24(2008).</li>
<li>Cohen, F. S., Akabas, M. H., Zimmerberg, J., Finkelstein, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Parameters+affecting+the+fusion+of+unilamellar+phospholipid+vesicles+with+planar+bilayer+membranes%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Parameters affecting the fusion of unilamellar phospholipid vesicles with planar bilayer membranes.</a> The Journal of Cell Biology. 98, 1054(1984).</li>
<li>Smith, G. P., Petrenko, V. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Phage+Display%5BTitle%5D)+AND+%22Chem.+Rev%22%5BJournal%5D)">Phage Display.</a> Chem. Rev. 97, 391-39 (1997).</li>
<li>McGuire, M. J., Li, S., Brown, K. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biopanning+of+phage+displayed+peptide+libraries+for+the+isolation+of+cell-specific+ligands%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol.+Biol%22%5BJournal%5D)">Biopanning of phage displayed peptide libraries for the isolation of cell-specific ligands.</a> Methods Mol. Biol. 504, 291(2009).</li>
<li>Rigaud, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Membrane+proteins%3A+functional+and+structural+studies+using+reconstituted+proteoliposomes+and+2-D+crystals%5BTitle%5D)+AND+%22Braz.+J.+Med.+Biol.+Res%22%5BJournal%5D)">Membrane proteins: functional and structural studies using reconstituted proteoliposomes and 2-D crystals.</a> Braz. J. Med. Biol. Res. 35, 753(2002).</li>
<li>Chami, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Use+of+octyl+beta-thioglucopyranoside+in+two-dimensional+crystallization+of+membrane+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Struct.+Biol%22%5BJournal%5D)">Use of octyl beta-thioglucopyranoside in two-dimensional crystallization of membrane proteins.</a> J. Struct. Biol. 133, 64(2001).</li>
<li>Kuhlbrandt, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Two-dimensional+crystallization+of+membrane+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Q.+Rev.+Biophys%22%5BJournal%5D)">Two-dimensional crystallization of membrane proteins.</a> Q. Rev. Biophys. 25, 1(1992).</li>
<li>Rigaud, J. L., Levy, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reconstitution+of+membrane+proteins+into+liposomes%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Enzymol%22%5BJournal%5D)">Reconstitution of membrane proteins into liposomes.</a> Methods Enzymol. 372, 65(2003).</li>
<li>Walz, T., Grigorieff, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Electron+Crystallography+of+Two-Dimensional+Crystals+of+Membrane+Proteins%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Struct.+Biol%22%5BJournal%5D)">Electron Crystallography of Two-Dimensional Crystals of Membrane Proteins.</a> J. Struct. Biol. 121 (2), 142(1998).</li>
<li>Signorell, G. A., Kaufmann, T. C., Kukulski, W., Engel, A., Remigy, H. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Controlled+2D+crystallization+of+membrane+proteins+using+methyl-beta-cyclodextrin%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Struct.+Biol%22%5BJournal%5D)">Controlled 2D crystallization of membrane proteins using methyl-beta-cyclodextrin.</a> J. Struct. Biol. 157, 321(2007).</li>
<li>Vink, M., Derr, K., Love, J., Stokes, D. L., Ubarretxena-Belandia, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+high-throughput+strategy+to+screen+2D+crystallization+trials+of+membrane+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Struct.+Biol%22%5BJournal%5D)">A high-throughput strategy to screen 2D crystallization trials of membrane proteins.</a> J. Struct. Biol. 160, 295(2007).</li>
<li>Iacovache, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+2DX+robot%3A+a+membrane+protein+2D+crystallization+Swiss+Army+knife%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Struct.+Biol%22%5BJournal%5D)">The 2DX robot: a membrane protein 2D crystallization Swiss Army knife.</a> J. Struct. Biol. 169, 370(2010).</li>
</ol>

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Rekonstytucja kanałów KvAP w różnych błonach została wykorzystana w kilku badaniach 8-10. Podążając za ideą zapewnienia dystrybucji lipidów między micelami mieszanymi detergentowo-lipidowymi a micelami mieszanymi białka/detergentu/lipidów, jesteśmy w stanie osiągnąć prawie całkowitą rekonstytucję KvAP w błonach zbudowanych z bardzo różnych lipidów. Każdy tetrameryczny kanał KvAP potrzebuje ~100 cząsteczek lipidów, aby w pełni pokryć swoją domenę transbłonową. Podstawowym wymogiem jest umożliwienie wystarczając...

Komórki wymieniają materiały i informacje ze swoim otoczeniem poprzez funkcje określonych białek błonowych 1. Białka błonowe w błonach komórkowych działają jako pompy, kanały, receptory, enzymy wewnątrzbłonowe, łączniki i wsporniki strukturalne w błonach. Mutacje, które wpływają na białka błonowe, są związane z wieloma chorobami człowieka. W rzeczywistości wiele białek błonowych jest głównymi celami leków, ponieważ są one ważne i łatwo dostępne w błonach komórkowych. Dlatego bardzo ważne jest zrozumienie struktury i funkcji różnych białek błonowych w błonach i umożliwienie opracowania nowych metod łagodzenia szkodliwych skutków zmutowanych białek w chorobach człowieka.
Lipidy otaczają wszystkie białka błonowe zintegrowane w dwuwarstwach 2, 3. W błonach eukariotycznych wiadomo, że różne typy lipidów są zorganizowane w mikrodomeny 4, 5. Wykazano, że wiele białek błonowych jest rozmieszczonych w tych mikrodomenach, a także w masywnej fazie płynnej błon 3, 6. Mechanizm leżący u podstaw organizacji mikrodomen i dostarczania do nich białek błonowych oraz fizjologiczne znaczenie takich dystrybucji są oczywiście ważne, ale pozostają słabo poznane. Jedną z głównych trudności technicznych w badaniu wpływu lipidów na białka błonowe jest niezawodna rekonstytucja biochemicznie oczyszczonych białek błonowych w błonach o dobrze kontrolowanym składzie lipidowym, tak aby prawie wszystkie odtworzone białka były funkcjonalne 7. W ciągu ostatnich kilku lat opracowaliśmy metody rekonstytucji prototypowego kanału potasowego bramkowanego napięciem z A. pernix (KvAP) do różnych systemów membranowych do badań strukturalnych i funkcjonalnych 8-10. Dane od innych i od nas razem wykazały, że lipidy są prawdopodobnie wyznacznikiem zmian konformacyjnych domen wyczuwających napięcie kanału jonowego bramkowanego napięciem i mogą kształtować struktury niektórych z tych kanałów 11. W następnym przedstawimy szczegółowy opis naszych metod i zaoferujemy kluczowe wskazówki techniczne, które prawdopodobnie zapewnią pomyślne odtworzenie naszych wyników, a także rozszerzenie naszych metod na badania innych białek błonowych.

<table><tbody><tr><td>Trypton</td><td>RPI Corp.</td><td>T60060</td><td></td></tr><tr><td>Ekstrakt drożdżowy</td><td>RPI Corp.</td><td>Y20020</td><td></td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Fisher</td><td>S271-3</td><td></td></tr><tr><td>Tris Base</td><td>RPI Corp.</td><td>T60040</td><td></td></tr><tr><td>Chlorek potasu</td><td>Fisher</td><td>BP366-500</td><td></td></tr><tr><td>n-Dodecyl-&#946;-D-Maltoside</td><td>Affymetrix</td><td>D322S</td><td>Zol-grade</td></tr><tr><td>n-oktyl-&#946;-D-glukozyd </td><td>Affymetrix</td><td>O311</td><td>Ana-grade</td></tr><tr><td>Aprotinin</td><td>RPI Corp.</td><td>A20550-0.05</td><td></td></tr><tr><td>Leupeptin</td><td>RPI Corp.</td><td>L22035-0.025</td><td></td></tr><tr><td>Pepstatyna A</td><td>RPI Corp.</td><td>P30100-0.025</td><td></td></tr><tr><td>PMSF</td><td>SIGMA</td><td>P7626</td><td></td></tr><tr><td>Dnase I</td><td>Roche</td><td>13407000</td><td></td></tr><tr><td>Bio-Bead SM-2</td><td>Bio-Rad</td><td>152-3920</td><td></td></tr><tr><td>HEPES</td><td>RPI Corp.</td><td>H75030</td><td></td></tr><tr><td>POPE</td><td>Avanti Lipidy polarne</td><td>850757C</td><td></td></tr><tr><td>POPG</td><td>Lipidy polarne Avanti</td><td>840457C</td><td></td></tr><tr><td>PSY</td><td>Lipidy polarne Avanti</td><td>870314C</td><td></td></tr><tr><td>DMPC </td><td>Lipidy polarne Avanti</td><td>850345C</td><td></td></tr><tr><td>Biotyna-DOPE </td><td>Lipidy polarne Avanti</td><td>870282C</td><td></td></tr><tr><td>DOTAP</td><td>Lipidy</td> <td>polarne Avanti890890C</td><td></td></tr><tr><td>NeutrAvidin koraliki agarozowe </td><td>Piercenet</td><td>29200</td><td></td></tr><tr><td>Rurki do dializy</td><td>Spectrum Laboratories, Inc</td><td>132-570</td><td></td></tr><tr><td>Pentane</td><td>Fisher</td><td>R399-1</td><td></td></tr><tr><td>Decane</td><td>TCI America</td><td>D0011</td><td></td></tr><tr><td>MTS-PEG5000</td><td>Toronto Research Cemicals</td><td>M266501</td><td></td></tr></tbody></table>

rekonstytucja kanału kv do błon lipidowych w badaniach strukturalnych i funkcjonalnych

Reconstitution of a Kv Channel into Lipid Membranes for Structural and Functional Studies

Aby zbadać interakcję lipid-białko w sposób redukcjonistyczny, konieczne jest włączenie białek błonowych do błon o dobrze zdefiniowanym składzie lipidowym. Badamy zależne od lipidów efekty bramkowania w prototypowym kanale potasowym bramkowanym napięciem (Kv) i opracowaliśmy szczegółowe procedury odtwarzania kanałów w różnych systemach błonowych. Nasze procedury rekonstytucji uwzględniają zarówno indukowaną detergentem fuzję pęcherzyków, jak i fuzję miceli białkowo-detergentowych z micelami mieszanymi lipidami/detergentami, a także znaczenie osiągnięcia równowagi rozkładu lipidów między micelami białkowymi/detergentowo-lipidowymi i mieszanymi detergentami/lipidami. Nasze dane sugerowały, że wprowadzenie kanałów w pęcherzykach lipidowych jest stosunkowo losowe w orientacjach, a skuteczność rekonstytucji jest tak wysoka, że w eksperymentach frakcjonowania nie zaobserwowano wykrywalnych agregatów białkowych. Wykorzystaliśmy zrekonstytuowane kanały do określenia stanów konformacyjnych kanałów w różnych lipidach, zarejestrowania aktywności elektrycznej niewielkiej liczby kanałów włączonych w płaskie dwuwarstwy lipidowe, badania przesiewowego pod kątem ligandów specyficznych dla konformacji z biblioteki peptydów wyświetlanych przez fagi i wspierania wzrostu kryształów 2D kanałów w błonach. Opisane tutaj procedury rekonstytucji mogą być dostosowane do badania innych białek błonowych w dwuwarstwach lipidowych, zwłaszcza do badania wpływu lipidów na eukariotyczne kanały jonowe bramkowane napięciem.

Ogólny przebieg eksperymentów mających na celu oczyszczenie kanału KvAP do poziomu homogeniczności biochemicznej przedstawiono na Rysunku 1A. Typowe próbki pobrane podczas ekspresji i oczyszczania białka pokazano na żelu SDS-PAGE na Rysunku 1B. Białko po oczyszczaniu metodą IMAC jest stosunkowo czyste. Wydajność uzyskania kanału KvAP wynosi około 1,0 mg/Liter hodowli.
Solubilizację pęcherzyków lipidowych za pomocą detergentów należy opracować dla każdej pary l...

Opisano procedury całkowitego odtworzenia prototypu kanału potasowego bramkowanego napięciem do błon lipidowych. Odtworzone kanały nadają się do testów biochemicznych, zapisów elektrycznych, badań przesiewowych ligandów i badań krystalograficznych elektronów. Metody te mogą mieć ogólne zastosowanie w badaniach strukturalnych i funkcjonalnych innych białek błonowych.

Rekonstytucja kanału Kv do błon lipidowych w badaniach strukturalnych i funkcjonalnych

To study the lipid-protein interaction in a reductionistic fashion, it is necessary to incorporate the membrane proteins into membranes of well-defined ...

Ogólnym celem niniejszej procedury jest przedstawienie szczegółowego opisu technik służących do funkcjonalnych i strukturalnych badań wpływu lipidów na białka błonowe. Jest to realizowane poprzez ekspresję i oczyszczanie bramkowanego napięciem kanału potasowego, a w drugim etapie poprzez rekonstytucję kanału jonowego.Następnie, w celu badania funkcji kanałów jonowych, przeprowadza się rejestrację elektryczną z kanałów jonowych w dwuwarstwach lipidowych. Ostatnim krokiem jest krystalizacja kanałów jonowych w błonie w celu wyznaczenia ich struktury. Ostatecznie, do zbadania wpływu lipidów na ruch sensora napięcia w kanałach jonowych wykorzystuje się testy biochemiczne, metodę elektrofizjologiczną oraz badania krystalografii elektronowej.Zazwyczaj osoby rozpoczynające pracę z tą metodą napotykają trudności ze względu na liczne szczegóły techniczne związane z rekonstytucją białek i rejestracją bioelektryczną. Mamy nadzieję, że ten film i przedstawiony proces pomogą Państwu przejść przez całą procedurę i osiągnąć sukces. Demonstracja pełnego toku postępowania zostanie przeprowadzona przez dr. Hui Jima z mojego laboratorium.Przed przygotowaniem lipidów przygotowano jednorazową szklaną probówkę o pojemności 14 ml, szklaną probówkę z nakrętką oraz szklaną strzykawkę o pojemności 250 µl z chloroformem. Następnie do probówki przeniesiono 10 ml chloroformu. Aby przygotować liposomy POPE i POPG, do szklanej probówki z nakrętką przeniesiono 3,75 mg POPE oraz 1,25 mg POPG w chloroformie.Osusz lipidy pod ciągłym strumieniem argonu, aż do całkowitego odparowania chloroformu. Następnie poddaj lipidy dalszemu suszeniu w próżni laboratoryjnej przez jedną godzinę. Następnie do osuszonych lipidów w probówce dodaj 440 µL buforu niskosolonego lub wody.Probówka do hydratacji lipidów. Zawiesina lipidowa powinna mieć białawy, mętny wygląd. Następnie poddaj zawiesinę lipidową sonikacji w kąpieli z lodem, aż roztwór pęcherzyków stanie się przezroczysty.Następnie do mieszaniny dodaje się 50 µL 3 M chlorku potasu oraz 10 µL 0,5 M DM, tak aby końcowa zawiesina lipidowa zawierała 300 mM chlorku potasu i 10 mM DM; roztwór inkubuje się w rotatorze przez dwie godziny w temperaturze pokojowej, aby umożliwić formowanie się mieszanych miceli lipidowo-detergentowych. Po inkubacji zawiesina powinna stać się lekko mętna z powodu indukowanej detergentem fuzji małych pęcherzyków ELLA. Gdy stężenie białka przekroczy 2 mg/mL, należy dodać wymienione składniki oraz mieszaninę lipidowo-detergentową, aby uzyskać końcową objętość 1 mL.Następnie inkubuj mieszaninę białka, lipidów i detergentu w probówce szklanej w rotatorze przez kolejne dwie godziny. Przygotowanie KVAP w mieszaninie z detergentem solubilizującym DTaP lub DOGS jest analogiczne do przygotowania lipidów dla pęcherzyków P-O-P-E-P-O-P-G. Jednakże sonikacja uwodnionych lipidów w celu uzyskania małych pęcherzyków wymaga więcej czasu niż w przypadku lipidów P-O-P-E-P-O-P-G; pęcherzyki DOGS mogą powoli łączyć się ze sobą, tworząc małe kropelki tłuszczu, aby całkowicie solubilizować dote lub DOGS.Sonikowane pęcherzyki miesza się z 10 milimolarnym DM i 40 milimolarną beta og. Mieszaninę lipid-detergent inkubuje się przez noc w temperaturze pokojowej; mieszanina powinna być dość klarowna, bez drobnych cząsteczek lub kropel. Następnie białko KVAP miesza się z solubilizowanym detergentem DTaP lub DOGS w stosunku białka do lipidów mniejszym lub równym 1:10.Mieszaninę białka, detergentu i lipidów inkubuje się w temperaturze pokojowej przez dwie do trzech godzin przy ciągłym wytrząsaniu orbitalnym. Aby zademonstrować powolne usuwanie detergentów o stosunkowo wysokiej wartości CMC, takich jak DM i Beta og, należy najpierw przygotować dwa litry buforu do dializy na każdy jeden mililitr mieszaniny.Następnie odciąć odpowiedni odcinek rurki do dializy i przemyć go wodą DI, aby sprawdzić i upewnić się, że rurka nie jest nieszczelna. W następnym kroku wprowadzić mieszaninę białka, lipidów i detergentu do rurki do dializy. Zacisnąć oba końce rurki, pozostawiając minimalną przestrzeń nad roztworem.Umieść napełnioną rurkę na mieszadle magnetycznym w buforze do dializy w taki sposób, aby rurka powoli obracała się w roztworze. Wymieniaj bufor do dializy raz na osiem godzin. Następnie przygotuj kuleczki polistyrenowe do usuwania detergentów o niskim CMC, odważając najpierw 0,5 g suchych kuleczek.Następnie umieścić je w 50 ml probówce Corning i dodać 20 ml metanolu, po czym poddać roztwór sonikacji w kąpieli. Sonikować przez pięć minut w celu usunięcia pęcherzyków powietrza, a następnie wirować koraliki przy 5 000 RPM przez pięć minut. Po tym zabiegu całkowicie odlać metanol i powtórzyć proces płukania z użyciem etanolu oraz wody Milli-Q. Następnie przechowywać wypłukane koraliki w 20% etanolu w temperaturze 4 °C i przed użyciem przenieść je do buforu bez detergentu. Oszacować ilość detergentów w mieszaninie białkowo-lipidowo-detergentowej przeznaczonej do obróbki i obliczyć ilość koralików niezbędną do usunięcia detergentów.Zważ mokre kuleczki, usuwając nadmiar wody, a następnie dodaj je bezpośrednio do mieszaniny białek i odczekaj co najmniej 15–20 minut, aż kuleczki osiągną pełną skuteczność. Aby usunąć 8,7 mg DDM w jednym mililitrze roztworu, łącznie 87 mg kuleczek polistyrenowych, takich jak bio-beads SM-2, dzieli się na pięć równych porcji. Mieszaninę białek, lipidów i detergentu inkubuje się z każdą frakcją przez 20–30 minut przy stałej rotacji end-over-end w temperaturze pokojowej.Odwiruj kuleczki, następnie przenieś nadsącz do kolejnej frakcji kuleczek i powtarzaj tę czynność do końca. Na tym etapie należy rozpocząć od oczyszczenia chloroformem szklanej probówki, bursztynowej fiolki z nakrętką z powierzchnią teflonową oraz zestawu szklanych strzykawek. Następnie wysusz bursztynową fiolkę strumieniem argonu.Następnie przenieś 0,75 mg POPE i 0,25 mg POPG w chloroformie do fiolki z bursztynowego szkła i odparuj chloroform za pomocą argonu. Po tym dodaj do fiolki 0,2 ml pentanu, aby rozpuścić wysuszone lipidy, a następnie wysusz całkowicie w celu usunięcia pozostałości chloroformu. Następnie dodaj do fiolki 50 µL decanu, aby rozpuścić wysuszone lipidy.Następnie należy pokryć warstwą lipidów otwór w powierzchni cylindrycznej kubka dwuwarstwowego, uważając, aby roztwór lipidowy nie przedostał się do wnętrza otworu. Odczekać od jednej do dwóch minut do całkowitego odparowania dekadanu, aby móc przeprowadzić pomiary elektryczne kanałów KVAP w dwuwarstwach lipidowych. Włożyć kubek do komory pomiarowej, umieścić mostki solne i podłączyć elektrody do obu stron kubka pomiarowego.Napełnij otwory elektrod roztworem cyst, a zewnętrzne i wewnętrzne kubki w komorze roztworami CYS i trans. Następnie dostrój offset potencjału między dwiema stronami kubka do wartości poniżej dwóch miliwoltów, a następnie nanieś lipidy na otwór w zakrętce. Odczekaj, aż membrana się zwęzi i stanie się względnie stabilna.Gdy tylko membrana stanie się stabilna, nanieś od 0,5 do 1 µL zawiesiny pęcherzyków z kanału, pozycjonując wąski koniec końcówki pipety P2 bezpośrednio nad otworem. Pęcherzyki opadną przez otwór na dno naczynia.Aby przetestować kanały KVAP w dwuwarstwie, podaje się krótki impuls 80 mV z potencjału trzymania wynoszącego -80 mV. Ze względu na szybką inaktywację i wolny powrót do stanu przed aktywacją, pomiędzy dwoma impulsami stosuje się długi odstęp czasowy, wynoszący około 120 s dla kanałów w membranach PEPG. Gdy amplituda prądu będzie odpowiednia, należy zrównoważyć stężenia jonów w roztworach po obu stronach membrany poprzez dodanie dodatkowych soli jonowych po stronie o niskim stężeniu.Oto obraz kryształu 2D barwionego negatywnie, wykonany w trakcie optymalizacji kryształów. Kryształy barwiono 6% azotianem amonu, pH 6.4 oraz 0.5% triozą, ponieważ ze względu na obecność cukru czasami nakładały się one na siebie. Czarna ramka wyznacza obszar, z którego powstaje wzór dyfrakcyjny z plamkami dyfrakcyjnymi.Przy rozdzielczości około 20 angstrom przedstawiony jest obraz cryo EM kryształu 2D z próbki podobnej do tej pokazanej wcześniej. Preparat zmieszano z 3%TLOs, zamrożono metodą bezpośredniego zanurzenia i obrazowano za pomocą cryo EM przy 50 000 powiększeniu. Wyraźnie widać, że w upakowaniu kryształu występowały lokalne defekty.Oto kolejne zdjęcie krio-EM dodatkowo zoptymalizowanego kryształu. Próbka została zatopiona w 0,75% tanin i 10% tree hellos, a obraz wykonano przy powiększeniu 50 000 x. Proste linie w gęstym upakowaniu sugerują, że kanały w tym typie kryształów były dobrze uporządkowane, natomiast dwie czarne strzałki wskazują wektory kwadratowe.Po obejrzeniu tego filmu mam nadzieję, że nabiorą Państwo odpowiedniej wiedzy na temat prawidłowego obchodzenia się z lipidami i białkami, a materiał ten pomoże Państwu w bardziej efektywnym badaniu oddziaływań białek lipidowych w błonie.

reconstitution-kv-channel-into-lipid-membranes-for-structural

Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

Odtworzenie kanału Kv w błonach lipidowych w celu przeprowadzenia badań strukturalnych i funkcjonalnych

Przekształcanie funkcjonalnych białek błonowych w gigantyczne liposomy o określonym składzie jest potężnym podejściem w połączeniu z elektrofizjologią patch-clamp. Jednak konwencjonalna produkcja gigantycznych liposomów może być niezgodna ze stabilnością białka.  Opisujemy protokoły wytwarzania gigantycznych liposomów z czystych lipidów lub małych liposomów zawierających kanały jonowe.

Preparat liposomów olbrzymich do obrazowania i elektrofizjologii patch-clamp

Rekonstytucja białka transbłonowego, KvAP, w gigantyczne pęcherzyki jednowarstwowe (GUVs) jest demonstrowana dla dwóch metod odwodnienia i ponownego nawodnienia — elektroformacji i pęcznienia wspomaganego żelem. W obu metodach małe jednowarstwowe pęcherzyki zawierające białko są łączone ze sobą, tworząc GUV, które można następnie badać za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej i elektrofizjologii patch-clamp.

Rekonstytucja białka transbłonowego, kanału jonowego bramkowanego napięciem, KvAP, w gigantycznych pęcherzykach jednowarstwowych do badań mikroskopowych i patch clamp

Opisana tutaj jest szybka i skuteczna procedura funkcjonalnego odtwarzania oczyszczonego dzikiego i zmutowanego białka CFTR, które zachowuje aktywność tego kanału chlorkowego, który jest wadliwy w mukowiscydozie. Wypływ jodku z odtworzonych proteoliposomów, w którym pośredniczy CFTR, umożliwia badanie aktywności kanałów i wpływu małych cząsteczek.

Pomiary funkcjonalnej rekonstytucji i aktywności kanałowej oczyszczonego białka CFTR typu dzikiego i zmutowanego

Ten artykuł opisuje konkretne metody uzyskiwania biochemicznych ilości TRPV1 rozpuszczonego w detergentach do analizy spektroskopowej. Połączone protokoły zapewniają narzędzia biochemiczne i biofizyczne, które można dostosować w celu ułatwienia badań strukturalnych i funkcjonalnych kanałów jonowych ssaków w środowisku kontrolowanym przez błonę.

Oczyszczanie i rekonstytucja TRPV1 do analizy spektroskopowej

Ten protokół opisuje techniki używane do określania struktur kanałów jonowych za pomocą mikroskopii krioelektronowej, w tym system bakulowirusa używany do efektywnej ekspresji genów w komórkach ssaków przy minimalnym wysiłku i toksyczności, ekstrakcję białek, oczyszczanie i kontrolę jakości, przygotowanie siatki próbek i badanie przesiewowe, a także zbieranie i przetwarzanie danych.

Ekspresja i oczyszczanie ludzkiego wrażliwego na lipidy kanału kationowego TRPC3 do oznaczania strukturalnego za pomocą mikroskopii krioelektronowej pojedynczych cząstek

W tym manuskrypcie demonstrujemy eksperymentalne techniki hermetyzacji cytoszkieletu F-aktyny w gigantyczne jednowarstwowe pęcherzyki lipidowe (zwane również liposomami) oraz metodę tworzenia warstwy F-aktyny naśladującej korę mózgową na wewnętrznej wlotce błony liposomowej.

In vitro Rekonstrukcja cytoszkieletu aktynowego w gigantycznych pęcherzykach jednowarstwowych

Rekonstytucja bez komórek była kluczowym narzędziem do zrozumienia montażu cytoszkieletu, a prace w ostatniej dekadzie ustaliły podejścia do badania dynamiki septyny w systemach minimalnych. Przedstawiono tutaj trzy uzupełniające się metody obserwacji montażu septyny w różnych kontekstach membranowych: dwuwarstwy płaskie, podpory sferyczne i podpory prętowe.

Rekonstrukcja zespołu septyny na błonach w celu zbadania właściwości i funkcji biofizycznych

W niniejszym opracowaniu opisano procedurę stosowaną w Grupie Biologii Strukturalnej i Funkcjonalnej Białek Błonowych Caffreya w celu ręcznego przygotowania prób krystalizacji białek błonowych w mezofazach lipidowych.

Krystalizacja białek błonowych do wyznaczania struktury z wykorzystaniem mezofaz lipidowych

Ocena prób krystalizacji dwuwymiarowej (2D) w celu utworzenia uporządkowanych macierzy białek błonowych jest niezwykle istotnym i trudnym zadaniem w krystalografii elektronowej. Opisujemy tutaj nasze podejście do przesiewania i identyfikacji kryształów 2D, głównie małych białek błonowych o masie w zakresie 15 – 90kDa.

Ocena prób krystalizacji dwuwymiarowej małych białek błonowych do badań biologii strukturalnej metodą krystalografii elektronowej

Przedstawimy sposób badania wpływu pojedynczej mutacji punktowej na funkcję kanału jonowego.

Mutageneza i analiza funkcjonalna kanałów jonowych heterologicznie eksprymowanych w komórkach ssaków

Poznaj metodę rekonstytucji kanałów Kv do błon lipidowych w celu badań strukturalnych i funkcjonalnych. Technika ta umożliwia analizę wpływu lipidów na białka błonowe oraz badanie ruchu czujnika napięcia.

Rekonstytucja kanału Kv do błon lipidowych w badaniach strukturalnych i funkcjonalnych

Przeglądaj więcej filmów